专利名称：烟叶、可可提取物复合发酵香料的制备方法及其在重组烟叶中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组烟叶添加剂技术领域，具体是指一种烟叶、可可提取物复合发酵香料的制备方法及其在重组烟叶中的应用。
背景技术：
重组烟叶又称再造烟叶或均质烟叶，主要由烟末、碎片、烟梗或低次烟叶加入胶粘剂和其他添加剂等组成。国内现有的造纸法薄片生产工艺将烟叶和烟梗中的水溶性物质用水萃取，经固液分离后，固体部分经制浆后再制成纸基，而液体部分则浓缩后回涂到纸基 上。这种生产工艺在很大程度上只是一个原材料的物理重组过程，用该方法所得到的重组烟叶与作为原料的烟叶、烟梗化学组分差别不大。这样导致重组烟叶存在杂气重、刺激性大和口感不适等吸味缺陷，影响了重组烟叶在卷烟产品中的使用效果和添加量。国内通常的做法是采用加料的办法来改善部分不足之处，但这种传统的化学方法对重组烟叶质量的改善程度非常有限，难以解决重组烟叶质量的一些深层次的问题。烟用较多的烟草、天然植物类提取物一般采用传统方法制得，即采用单体烟叶或复配的叶组为原料通过水、醇提取或分子蒸馏得到，添加后对卷烟的改善有一定局限，改善程度有限，仍有刺激性大、杂气多的缺陷。可可豆(生豆)含水分5. 58%，脂肪50. 29%，含氮物质14. 19%，可可碱I. 55%，其他非氮物质13. 91%，淀粉8. 77%，粗纤维4. 93%，其灰分中含有磷酸40. 4%、钾31. 28%，氧化镁16.22%。可可豆中还含有咖啡因等神经中枢兴奋物质以及丹宁，丹宁与巧克力的色、香、味有很大关系。其中可可碱，咖啡因会刺激大脑皮质，消除睡意、增强触觉与思考力以及可调整心脏机能，又有扩张肾脏血管、利尿等作用。通过传统回流提取所制备的烟叶提取物浸膏，具有烟草固有特殊自然气息，香气纯正而留长，具有烟膏香，起增补烟香，增强口感提高品质的作用；可可提取物浸膏，具有纯正天然可可香气，丰富烟香；但同时，也具有增加刺激性、增加残留的负面效果。微生物在增殖过程中可产生庞大的高活性酶系，如多糖水解酶类、蛋白酶类、酯化酶类、氧化还原酶类及裂合酶类等，在酶促作用、化学作用及微生物体内复杂代谢的协同作用下，以烟叶、可可提取物为原料发生分解、降解、氧化、还原、聚合、偶联、转化等作用，形成复杂的低分子化合物，其中包括各种香味化合物，如醇类、醛类、酮类、酸类、脂类、酚类、吡喃类、吡啶类和萜烯类等，这些香气物质是烟草或用于烟草的添加剂的香气组分，对重组烟叶烟气进行特征强化、改善口感。采用微生物发酵技术生产天然烟用生物香料，天然绿色环保无害，工艺过程简单易操作，不产生有毒副产品、无污染等。目前，公开号为CN100394860C的中国发明专利公开了一种对癌发生具有抑制作用的可可豆和可可豆壳的提取物，该提取物是通过用50%丙酮提取可可豆，再用40%乙醇洗，然后用60%乙醇进行分级分离获得。将烟叶、可可提取后通过微生物发酵技术制备能降低刺激、丰富烟香的烟叶、可可提取物复合发酵香料及其在重组烟叶中的应用，还未见报道。
发明内容
本发明针对目前重组烟叶存在杂气重、刺激性大、烟气薄弱和口感不适等吸味缺陷，提供了一种烟叶、可可提取物复合发酵香料的制备方法及其在重组烟叶中的应用。本发明制成的由植生拉乌尔菌生物转化生成可可提取物复合发酵香料，使重组烟叶烟气质提升，增加可可气息与烘烤香气，降低烟气刺激，丰富烟香的烟叶可可提取物复合发酵香料，本发明提供一种植生拉乌尔菌,该菌株名为Raoultella planticola VP4-4,于2012年I月11日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2012005，植生拉乌尔菌Raoultella planticola VP4-4 CCTCC M 2012005的生物学特征是革兰氏阴性菌，能产酸、使牛奶液化并生成吲哚产生、赖氨酸脱羧酶实验呈阳性；鸟氨酸脱羧酶实验、 H2S产生、明胶液化呈阴性；能以单糖，多糖、酯类和氨基酸为唯一碳源生长，所述植生拉乌尔菌Raoultella planticola VP4-4的分子鉴定特征为其16SrRNA 序列全长 1408bp, 16S rRNA 序列与 Raoultella planticola 的相似度达到99.563%。本发明提供了一种烟叶、可可提取物复合发酵香料的制备方法，它包括以下步骤I)将烟叶粉碎至8(T100目，再将烟末、可可粉按质量比I : 0.5 2混合，混合物加入质量比为I : 3(T50的水，回流提取广3h后过滤，重复3次回流提取滤液，合并滤液，SP得烟叶、可可混合提取液，并灭菌；2)菌种活化将植生拉乌尔菌 Raoultella planticola VP4-4 CCTCC M 2012005接种到斜面培养基上，在25 38°C，静置培养24 72h后得到活化菌种，置于冰箱中；3)制备种子培养液将步骤2)中所得的斜面培养物，接种到种子培养基，在25 38°C条件下，10(Tl50r/min振荡培养24h 72h，连续转接I 3次，制得种子培养液；4)发酵将种子培养液按体积比1(T20%接种到上述步骤I)中的灭菌的烟叶、可可混合提取液，接种后的滤液的装罐量为30 40%，pH5 8，温度32 38°C，转速10(Tl50r/min，不避光条件下发酵3飞天，得到发酵液；5)将发酵液和95%乙醇按体积比I : 3 6，沉淀过夜，400(T8000r/min离心l(T20min，过滤后减压浓缩至相对密度为I. 10541. 2241的浸膏，即得烟叶、可可提取物复
合发酵浸膏。作为优选方案，所述步骤2)中，所述斜面培养基为麦芽糖120mL，葡萄糖20g/L，琼脂15g/L。作为优选方案，所述步骤3)中，所述种子液培养基组成为果糖50g/L，酵母粉10g/L，氯化钠5g/L。本发明还提供了一种根据权利要求2所得烟叶、可可提取物复合发酵香料的应用，所述烟叶可可提取物复合发酵香料作为天然烟草添加剂加入重组烟叶中，加入重组烟叶中烟叶、可可提取物复合发酵香料的质量比为0. 1、.3%。使重组烟叶烟气质提升，增加可可气息与烘烤香气，降低烟气刺激，丰富烟香，改善了重组烟叶刺激大、口感不适的吸味缺陷。
微生物在增殖过程中可产生庞大的高活性酶系，如多糖水解酶类、蛋白酶类、酯化酶类、氧化还原酶类及裂合酶类等，在酶促作用、化学作用及微生物体内复杂代谢的协同作用下，以烟叶、可可复合提取物为原料发生分解、降解、氧化、还原、聚合、偶联、转化等作用，形成复杂的低分子化合物，其中包括各种香味化合物，如醇类、醛类、酮类、酸类、脂类、酚类、吡喃类、吡啶类和萜烯类等，这些香气物质无疑也是烟草或用于烟草的添加剂的香气组分。本发明的优点是I、本发明以天然烟叶、可可复合提取物为唯一碳源、氮源、以及底物，容易让微生物酶体系利用来复合发酵产香，其烟叶可可提取物复合发酵香料具有天然环保无害优点。2、采用植生拉乌尔菌Raoultella planticola VP4-4 CCTCC M 2012005来发酵生产使重组烟叶烟气质提升，增加可可气息与烘烤香气，降低烟气刺激，丰富烟香的烟叶、可可提取物复合发酵香料，改善了重组烟叶刺激大、口感不适的吸味缺陷，能与其它烟用香精香料混合调配使用。 3、本发明方法工艺过程简单，原料为卷烟产品本源烟叶及能应用于卷烟中的可可香料，有工业化使用前景。
具体实施例方式下面列举一部分实施例对本发明的有关技术问题作进一步详细的描述，有必要在此指出以下具体实施例只是对本发明的进一步说明，不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明做出的一些非本质的修改和调整，仍属于本发明的保护范围。实施例I本发明的微生物植生拉乌尔菌Raoultella planticolaVP4_4 CCTCC M 2012005生物转化生产烟叶、可可提取物复合发酵香料的制备方法如下I)将烟叶粉碎至80目，再将烟末、可可粉按质量比I : 2混合，混合物加入质量比为I : 30的水，回流提取3h后过滤，重复3次回流提取滤液，合并滤液，即得烟叶、可可混合提取液，并灭菌；2)菌种活化将植生拉乌尔菌 Raoultella planticola VP4-4 CCTCC M 2012005接种到斜面培养基上，在25°C，静置培养24h后得到活化菌种，置于4°C冰箱中；所述斜面培养基为麦芽糖120mL，葡萄糖20g/L，琼脂15g/L。3)制备种子培养液将步骤2)中所得的斜面培养物，接种到种子培养基，在38°C条件下，100r/min振荡培养72h，连续转接3次，制得种子培养液；所述种子液培养基组成为果糖50g/L，酵母粉10g/L，氯化钠5g/L。4)发酵将种子培养液按体积比20%接种到上述步骤I)中的灭菌的烟叶、可可混合提取液，接种后的滤液的装罐量为40%，pH5，温度32°C，转速100r/min，不避光条件下发酵5天，得到发酵液；5)将发酵液和95%乙醇按体积比I : 3，沉淀过夜，4000r/min离心20min，过滤后减压浓缩至相对密度为I. 1054的浸膏，即得烟叶、可可提取物复合发酵浸膏。实施例2本发明的微生物植生拉乌尔菌Raoultella planticolaVP4_4 CCTCC M 2012005生物转化生产烟叶、可可提取物复合发酵香料的制备方法如下I)将烟叶粉碎至100目，再将烟末、可可粉按质量比I : 0.5混合，混合物加入质量比为I : 50的水，回流提取Ih后过滤，重复3次回流提取滤液，合并滤液，即得烟叶、可可混合提取液，并灭菌；2)菌种活化将植生拉乌尔菌 Raoultella planticola VP4-4 CCTCC M 2012005接种到斜面培养基上，在38°C，静置培养72h后得到活化菌种，置于4°C冰箱中；所述斜面培养基为麦芽糖120mL，葡萄糖20g/L，琼脂15g/L。3)制备种子培养液将步骤2)中所得的斜面培养物，接种到种子培养基，在 25°C条件下，150r/min振荡培养24h，连续转接I次，制得种子培养液；所述种子液培养基组成为果糖50g/L，酵母粉10g/L，氯化钠5g/L。4)发酵将种子培养液按体积比10%接种到上述步骤I)中的烟叶、可可混合提取液，接种后的滤液的装罐量为30%，pH8，温度38°C，转速150r/min，不避光条件下发酵5天，得到发酵液；5)将发酵液和95%乙醇按体积比I : 6，沉淀过夜，8000r/min离心lOmin，过滤后减压浓缩至相对密度为1.2241的浸膏，即得烟叶、可可提取物复合发酵浸膏。实施例3本发明的微生物植生拉乌尔菌Raoultella planticolaVP4_4 CCTCC M 2012005生物转化生产烟叶、可可提取物复合发酵香料的制备方法如下I)将烟叶粉碎至90目，再将烟末、可可粉按质量比I : I混合，混合物加入质量比为I : 40的水，回流提取2h后过滤，重复3次回流提取滤液，合并滤液，即得烟叶、可可混合提取液，并灭菌；2)菌种活化将植生拉乌尔菌 Raoultella planticola VP4-4 CCTCC M 2012005接种到斜面培养基上，在28°C，静置培养72h后得到活化菌种，置于4°C冰箱中；所述斜面培养基为麦芽糖120mL，葡萄糖20g/L，琼脂15g/L。3)制备种子培养液将步骤2)中所得的斜面培养物，接种到种子培养基，在35°C条件下，100r/min振荡培养48h，连续转接2次，制得种子培养液；所述种子液培养基组成为果糖50g/L，酵母粉10g/L，氯化钠5g/L。4)发酵将种子培养液按体积比20%接种到上述步骤I)中的烟叶、可可混合提取液，接种后的滤液的装罐量为40%，pH6，温度32°C，转速120r/min，不避光条件下发酵3天，得到发酵液；5)将发酵液和95%乙醇按体积比I : 3，沉淀过夜，6000r/min离心20min，过滤后减压浓缩至相对密度为I. 1528的浸膏，即得烟叶、可可提取物复合发酵浸膏。实施例4本发明的微生物植生拉乌尔菌Raoultella planticolaVP4_4 CCTCC M 2012005生物转化生产烟叶、可可提取物复合发酵香料的制备方法如下I)将烟叶粉碎至100目，再将烟末、可可粉按质量比I : 0.5混合，混合物加入质量比为I : 35的水，回流提取3h后过滤，重复3次回流提取滤液，合并滤液，即得烟叶、可可混合提取液，并灭菌；2)菌种活化将植生拉乌尔菌 Raoultella planticola VP4-4 CCTCC M 2012005接种到斜面培养基上，在35°C，静置培养72h后得到活化菌种，置于4°C冰箱中；所述斜面培养基为麦芽糖120mL，葡萄糖20g/L，琼脂15g/L。3)制备种 子培养液将步骤2)中所得的斜面培养物，接种到种子培养基，在32°C条件下，100r/min振荡培养72h，连续转接2次，制得种子培养液；所述种子液培养基组成为果糖50g/L,酵母粉10g/L,氯化钠5g/L。4)发酵将种子培养液按体积比15%接种到上述步骤I)中的烟叶、可可混合提取液，接种后的滤液的装罐量为35%，pH6，温度33°C，转速150r/min，不避光条件下发酵5天，得到发酵液；5)将发酵液和95%乙醇按体积比I : 4,沉淀过夜,5500r/min离心IOmin,过滤后减压浓缩至相对密度为I. 6584的浸膏，即得烟叶、可可提取物复合发酵浸膏。实施例5发明人将上述烟叶可可提取物复合发酵香料按重组烟叶量0. 1%、0. 2%、0. 3%，分别添加到重组烟叶上。将重组烟叶装入密封袋中，放置烘箱中80°C恒温30min，至重组烟叶水分合适，卷制成烟支，放入恒温恒湿箱内22°C +1、相对湿度为60%+2%，平滑48h，请专家评吸小组评吸。对照为喷加相同量烟叶可可复合提取物的重组烟叶卷制的卷烟。经专家评吸小组反复评吸，认为本发酵烟叶提取物，与重组烟叶量比例为0. 1%、0. 2%时，具有使重组烟叶烟气质提升，增加可可气息与烘烤香气，降低烟气刺激，丰富烟香的优点，改善了重组烟叶刺激大、口感不适的吸味缺陷。表I.发酵烟叶提取物添加到重组烟叶中的感官评吸
权利要求
1.一种植生拉乌尔菌，该菌株名为Raoultella planticola VP4-4，保藏号为CCTCCM 2012005，植生拉乌尔菌 Raoultella planticola VP4-4 CCTCC M 2012005 的生物学特征是革兰氏阴性菌，能产酸、使牛奶液化并生成吲哚产生、赖氨酸脱羧酶实验呈阳性；鸟氨酸脱羧酶实验、H2S产生、明胶液化呈阴性；能以单糖，多糖、酯类和氨基酸为唯一碳源生长,其16SrRNA序列全长1408bp,其16S rRNA序列与Raoultella planticola的相似度达到 99. 563%。
2.一种烟叶、可可提取物复合发酵香料的制备方法，包括以下步骤 1)将烟叶粉碎至8(Γ100目，再将烟末、可可粉按质量比I: O. 5 2混合，混合物加入质量比为I : 3(Γ50的水，回流提取广3h后过滤，重复3次回流提取滤液，合并滤液，即得烟叶、可可混合提取液，并灭菌； 2)菌种活化将植生拉乌尔菌Raoultella planticola VP4-4 CCTCC M 2012005 接种到斜面培养基上，在25 38°C，静置培养24 72h后得到活化菌种，置于冰箱中； 3)制备种子培养液将步骤2)中所得的斜面培养物，接种到种子培养基，在25 38°C条件下，10(Tl50r/min振荡培养24tT72h，连续转接I 3次，制得种子培养液； 4)发酵将种子培养液按体积比1(Γ20%接种到上述步骤I)中的灭菌的烟叶、可可混合提取液，接种后的滤液的装罐量为30 40%，ρΗ5 8，温度32 38°C，转速10(Tl50r/min，不避光条件下发酵3飞天，得到发酵液； 5)将发酵液和95%乙醇按体积比I: 3 6，沉淀过夜，400(T8000r/min离心l(T20min，过滤后减压浓缩至相对密度为I. 105Π. 2241的浸膏，即得烟叶、可可提取物复合发酵浸膏。
3.根据权利要求2所述的一种降低刺激的发酵烟叶提取物的制备方法，其特征在于所述步骤2)中，所述斜面培养基为麦芽糖120mL， 葡萄糖20g/L,琼脂15g/L。
4.根据权利要求2所述的一种降低刺激的发酵烟叶提取物的制备方法，其特征在于所述步骤3)中，所述种子液培养基组成为果糖50g/L，酵母粉10g/L，氯化钠5g/L。
5.一种根据权利要求2所得烟叶、可可提取物复合发酵香料的应用，其特征在于所述烟叶可可提取物复合发酵香料作为天然烟草添加剂加入重组烟叶中，加入重组烟叶中烟叶、可可提取物复合发酵香料的质量比为O. Γ0. 3%。
全文摘要
本发明公开了一种烟叶、可可提取物复合发酵香料的制备方法及其在重组烟叶中的应用。该植生拉乌尔菌菌株名为Raoultella planticola VP4-4，保藏号为CCTCC M 2012005，其16SrRNA序列全长1408bp，其16S rRNA序列与Raoultella planticola的相似度达到99.563%。该方法是利用该菌株，通过菌种活化、制备种子培养液、发酵培养、转化发酵液，以得到烟叶、可可提取物复合发酵浸膏。本发明方法工艺过程简单，原料为卷烟产品本源烟叶及能应用于卷烟中的可可香料，有工业化使用前景。
文档编号A24B15/28GK102978127SQ201210326210
公开日2013年3月20日 申请日期2012年9月5日 优先权日2012年9月5日
发明者罗诚浩, 魏敏, 陈义坤, 李冉, 罗广丰 申请人:湖北中烟工业有限责任公司