抗血栓形成化合物的制作方法

专利名称：抗血栓形成化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的抗血栓形成化合物、包含该化合物为活性成分的药物组合物及所述化合物在药物制备中的用途。
丝氨酸蛋白酶是血凝级联中起重要作用的酶。重要的丝氨酸蛋白酶是Xa因子，它催化凝血酶原转化成凝血酶。凝血酶是血凝级联中最后的丝氨酸蛋白酶。凝血酶的主要功能是裂解纤维蛋白原以产生纤维蛋白单体，纤维蛋白会交联成不溶的凝胶。另外，凝血酶通过活化该级联早期中的V和VIII因子来调节其自身生成。凝血酶在细胞水平也具有重要作用，它作用于特异性受体而使血小板凝聚、内皮细胞活化并使成纤维细胞增殖。因此凝血酶在止血和血栓形成中起着中枢调节作用。
在丝氨酸蛋白酶合成抑制剂的开发过程中，最近有报道，合成的NAPAP-戊糖偶联物(conjugate)作为抗血栓形成物质具有直接抗凝血酶活性和ATIII介导的抗Xa活性(ATIII抗凝血酶III)的双重特性(Bioorg.Med.Chem.Lett.1999，9(14)，2013-8)。虽然该报道中的抗血栓形成物质可能是一种令人感兴趣的化合物，但是由于其戊糖残基中的高硫酸盐含量，使之与HIT交叉反应和被PF4中和有关(Thromb.Haem.增刊，1997，p363，PD1485)。
现已发现，式(I)化合物是具有优良和有益双重特性的抗血栓形成剂。式(I)化合物具有药理学感兴趣的半衰期，可用于每天一次的治疗，并且几乎不被PF4中和。此外，出血的风险也较低。总之，式(I)化合物具有多种有吸引力的药理学性质。
式(I)或其药用盐、前药或其溶剂化物 其中R独立地为SO3-或CH3；间隔基为链长为13-25个原子、优选为16-22和最优选为19个原子的柔性隔离基；戊糖残基的电荷由荷正电的抗衡离子抵消；和戊糖残基中硫酸盐基团的总数为4、5或6。
本发明的化合物可用于治疗和预防与凝血酶介导的以及与凝血酶有关的疾病。这包括其中血凝级联被激活的血栓形成和前血栓形成病症，其中包括但不限于深静脉血栓形成、肺栓塞、血栓性静脉炎、血栓形成或者栓塞形成的动脉阻塞、血管成形术或者血栓溶解期间或者之后的动脉再闭塞、动脉损伤或者侵入性心脏术后的再狭窄、手术后的静脉血栓形成或者栓塞、急性或者慢性的动脉粥样硬化、中风、心肌梗死、癌和肿瘤转移和神经变性疾病。本发明化合物还可用作透析和手术中所需的体外血循环的抗凝血剂。
本发明化合物还可用作体外抗凝血剂。
式(I)化合物在具有动脉征兆的抗血栓形成方面特别有用。
本发明化合物优选其中戊糖残基具有以下结构的化合物 间隔基的化学性质对本发明化合物的抗血栓形成活性并无显著影响。然而，本发明化合物的间隔基是柔性的，即表示间隔基不含刚性元素，例如不饱和键或者环状结构。本领域技术人员可容易地设计出适宜的间隔基。优选间隔基包含至少一个-(CH2CH2O)-单元。更优选间隔基包含三个-(CH2CH2O)-单元。最优选的间隔基是*-(CH2CH2O)3-(CH2)2-NH-C(O)-(CH2)3-NH-C(O)-CH2-，其中用*表示的端基与戊糖残基链接。
优选式I化合物为式(Ia)化合物，其中p是1-5，n是1-5和m是1或2。最优选化合物是式(Ia)化合物，其中p是3，n是3和m是1。 荷正电抗衡离子指H+、Na+、K+、Ca2+等。优选式(I)化合物是其钠盐形式。
术语“前药”，指其中脒基部分的氨基被例如羟基或者(1-6C)烷氧羰基保护的本发明化合物。
本发明溶剂化物包括水合物。
本发明中以游离碱形式出现的化合物可从其药用盐形式的反应混合物中分离出来。用有机或者无机酸对式(I)游离碱进行处理也可获得可药用盐，所述有机或者无机酸例如氯化氢、溴化氢、碘化氢、硫酸、磷酸、醋酸、丙酸、羟基乙酸、马来酸、丙二酸、甲磺酸、富马酸、丁二酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸和抗坏血酸等。
本发明化合物具有手性碳原子，因此可以纯对映体、或对映体的混合物、或者包含非对映体的混合物的形式获得。采用本领域中已知技术，例如对从旋光酸和外消旋混合物中得到的盐进行结晶，或者用手性柱色谱法，均可获得纯对映体。对于非对映体，可采用正相或者反相柱。
首先，对式II NAPAP类似物的羧基进行活化，然后加入包含胺基的戊糖-间隔基残基(式III)，再任选对脒基脱保护，即可制得本发明化合物。 式II化合物中的羧基可活化成混合酸酐或者更优选为活化的酯，例如N-羟基琥珀酰亚胺、五氟苯酚或者1-羟基苯并三唑的酯。在偶联步骤中，式II中的苄脒基部分可以是未保护的(R’＝R″＝H)，或者任选经氨基甲酸酯基团保护，优选经烯丙氧基羰基(R’和/或R″是H2C＝CH-CH-C(O)O)或者苄氧基羰基(R’和/或R″为PhCH2-C(O)O)保护。可在相对温和条件除去烯丙氧基羰基和苄氧基羰基保护基。在弱亲核试剂例如吗啉或者丙二酸酯存在下，可用Pd除去烯丙氧基羰基基团。可在例如氢/Pd(C)条件下，除去苄氧基羰基基团。另外，可采用苄脒的合成前体，例如N-烷氧基苄脒或者N-苄氧基苄脒(R’＝H，R″＝烷氧基或者苄氧基)。采用例如氢化的还原条件，可将所述合成前体转变为苄脒(例如Fujii，T等，Chem.Pharm.Bull.，39，301，1991和Fujii，T等，Chem.Pharm.Bull.，42，1231，1994)。
苄脒前体优选为1，2，4-氧杂二唑啉-5-酮(1，2，4-oxadiazolin-5-one)(-R’-R”-＝-C(O)O-)。经氢化，该前体可转变为苄脒(Bolton，R.E.等，Tetrahedron Letters，Vol 36，No25，1995，4471-4474页)。
式II化合物可采用本领域已知的方法以许多种方式制得。EP0513543中描述了一种制备式II化合物的方法，其中R’＝R″＝H，n为3和m为1。采用本技术领域熟知的肽片段偶联技术，从其中脒经烯丙氧基羰基或者苄氧基羰基保护的式IV化合物，即可制得其中的脒经例如烯丙氧基羰基或者苄氧基羰基保护的式II化合物。例如，式IV氨基甲酸酯可由相应的脒制得(式IV，R’＝R″＝H，如Weller，T等的描述，J.Med.Chem.39，3119，1996)。 采用化合物V(EP0513543描述)，用O-烷基羟胺或者O-苄基羟胺处理该氰基化合物，再经酸性条件除去叔丁基酯，即可制得式II的N-烷氧基苄脒和N-苄氧基苄脒化合物。或者，于酸性条件下先除去式V中的叔丁基酯得到化合物VI，再将该氰基化合物与O-烷基羟胺或者O-苄基羟胺反应，即可制得式II的N-烷氧基苄脒和N-苄氧基苄脒化合物。
采用本领域已知的肽片段偶联技术，由其中-R’-R″-＝-C(O)O-的式IV化合物，即可制得其中-R’-R″-＝-C(O)O-(即1，2，4-氧杂二唑啉-5-酮基团)的式II化合物。
采用如EP0649854描述的方法，可合成式III的氨基-低聚糖-间隔基残基。按本领域已知技术例如WO99/25720描述的方法，可制备本发明化合物的糖残基。
按本领域已知的肽片段偶联-或缩合技术，例如叠氮化方法、混合酸酐方法、活化酯方法或者优选为碳化二亚胺法，尤其是加入催化和外消旋抑制化合物例如N-羟基琥珀酰亚胺和N-羟基苯并三唑，即可采用上述方法中的一个工艺步骤肽偶联制备本发明化合物。有关综述参见肽的分析、合成和生物学，卷3，E.Gross和J.Meienhofer编辑(Academic出版社，纽约，1981)和Bodanszky，M.；肽合成原理，Springer-Verlag，1984。
在合成过程中，化合物中的胺官能团可用N-保护基保护，所述保护基在化学中通常用于α-氨基的保护，例如叔丁氧羰基(Boc)基团、苄氧羰基(Z)、9-芴甲氧羰基(Fmoc)基团或者邻苯二甲酰(Phth)基团。可采用不同方法除去保护基，这取决于那些保护基的性质。通常在酸性条件和清除剂存在下进行脱保护。有关氨基保护基及其清除方法的综述参见上述肽的分析、合成和生物学，卷3，并进一步参见Greene，T.W.和Wuts，P.G.M.在有机合成中的保护基，John Wiley & Sons公司1991中的描述。
本发明化合物可经肠内或者非肠道途径给药。这些化合物及其组合物所需的精确剂量和用法，取决于用药的个体受试者对其的需要、患病程度或者临床医生的需要和判断。通常，与更取决于吸收的其他给药方法相比，非肠道给药的剂量较低。然而，人的每日剂量优选为0.001-100毫克每公斤体重，更优选为0.01-10毫克每公斤体重。
采用本发明化合物制备的药物，也可用于急性抗凝血疗法的辅助药物。在这种情况下，所述药物与其他对于治疗这样的病症是有利的化合物一起给药。
与适当的药用辅料混合后，可将所述药物压制成固体剂量单位，例如丸剂、片剂，或者加工成胶囊或者栓剂，所述辅料参见标准参考书例如Gennaro等在Remington药物学(第18版，Mack出版社，1990，尤其是第8部分药物制剂及其生产)中的描述。利用适当的可药用液体，将化合物制成例如用作注射制剂的溶液、悬浮液、乳剂形式，或者是用于鼻喷入的喷雾剂。
在剂量单位例如片剂的制造中，可以考虑采用常规添加剂例如填充剂、着色剂、聚合粘合剂等。通常，可采用不干扰活性物质作用的任何药用添加剂。
可与组合物联用给药的适当载体包括适量的乳糖、淀粉、纤维素衍生物等，或它们的混合物。
以下实施例将对本发明作进一步说明。
实施例1所用缩写Ac＝乙酰基Bn＝苄基DBU＝1，8-二氮二环(diazabicyclo)[5.4.0]十一碳-7-烯DCC＝二环己基碳二亚胺DMF＝N，N-二甲基甲酰胺Su＝琥珀酰亚胺基Me＝甲基TBTU＝2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸盐TEA＝三乙胺TFA＝三氟乙酸Z＝苄氧基羰基化合物的编号指示意

图1-7中的化合物。化合物3于50℃下，向化合物1(53.6g，143.6mmol)(R.Roy；W.K.C.Park；Q.Wu；S-N.Wang，Tetrahedron Lett.，1995，36(25)，4377-80)和化合物2(27.9g，89.3mmol)(S.J.Danishefsky；M.P.DeNinno；G.B.Philips；R.E.Zelle，Tetrahedron，EN，1986，42，11，2809-2819)在930ml的DMF中的搅拌溶液中，加入氢化钠(7.7g 60％分散液，192.2mmol)。1小时后，将反应混合物加热到120℃。搅拌5分钟后将反应混合物冷却到40℃，用水稀释并用二氯甲烷萃取3次。合并的有机层用水洗涤并真空浓缩，得到粗产物3(54g)。TLCRf＝0.23，乙醚100％。化合物4于-30℃下，向化合物3(89.3mmol)在800ml无水甲苯和800ml乙酸酐中的搅拌溶液中，滴加361.5ml硫酸在乙酸酐中的冷却溶液(16.5ml浓硫酸和345.0ml乙酸酐)。2小时后，反应混合物用240ml的TEA淬灭，并于室温下搅拌。向该溶液中加入碳酸氢钠水溶液(5％)并用乙酸乙酯萃取水层3次。合并的有机层用水洗两次并真空浓缩。重复该操作，得到粗品化合物4(53g)。TLCRf＝0.29，乙醚100％。化合物5于0℃下，向化合物4(89.3mmol)和乙硫醇(11.1ml，150.3mmol)在370ml无水甲苯中的搅拌溶液，滴加在甲苯中的BF3-乙醚合物(23.9ml BF3-乙醚合物和190ml甲苯)。在室温下搅拌16小时后，反应混合物用TEA和碳酸氢钠水溶液淬灭，并用乙酸乙酯萃取三次。合并的有机层用水洗涤并真空浓缩。粗产物用柱色谱法(甲苯/乙酸乙酯＝1/1-1/1，v/v)提纯，得到化合物5(21.4g)。TLCRf＝0.31，甲苯/乙酸乙酯＝4/6，v/v。化合物7在活化的4分子筛(7.6g)存在下，通氮气流，将供体5(15.0g，30.3mmol)和受体6(23.0g，30.3mmol)(WO99/25720)在无水乙醚/二氯甲烷(232ml，3/1，v/v)中的溶液搅拌30分钟。然后于-20℃，将1，3-二溴-5，5-二甲基乙内酰脲(5.5g，19.1mmol)和triflic酸(0.49ml，5.6mmol)在二氧杂环己烷/二氯甲烷(69.8mL，1/1，v/v)中的溶液，滴加到反应混合物中，用时75分钟。30分钟后，将TEA(5mL)加到反应混合物中，将反应混合物搅拌10分钟后过滤。滤液用硫代硫酸钠水溶液(10％)和碳酸氢钠水溶液(10％)洗涤并真空浓缩。产品用柱色谱法(在二氯甲烷中的0-5％丙酮)提纯，得到化合物7(19.6g)。TLCRf＝0.1，乙醚/庚烷＝8/2，v/v。化合物8于-26℃，向化合物7(19.5g，16.4mmol)在无水甲苯/乙酸酐(442ml，1/1，v/v)中的溶液中，滴加131.5mL硫酸在乙酸酐中的冷却溶液(11.5mL浓硫酸和120ml乙酸酐)。75分钟后，于-20℃加入TEA(73.5mL)。逐渐地加入水330ml，温度维持在25-30℃之间，使乙酸酐分解。搅拌16小时后，将混合物倾入800ml水中，并用甲苯萃取两次。合并的有机层用水洗涤并真空浓缩。粗产物经柱色谱法(甲苯/乙酸乙酯/乙醇＝96/2/2，v/v/v)提纯，得到化合物8，为白色泡沫(13.2g)。
TLCRf＝0.29，甲苯/乙醇＝9/1，v/v。化合物9于32℃下，向化合物8(13.2g，11.7mmol)在无水甲苯(66ml)中的溶液中加入吗啉(4.1ml，46.9mmol)。在32℃下搅拌42小时后，反应混合物冷却至室温并加入盐酸(17.6mL，4N)。混合物用水稀释并用乙酸乙酯萃取2次。合并的有机层用水洗涤2次，用硫酸钠干燥并真空浓缩后，得到粗品化合物9(12.6g)。
TLCRf＝0.32，甲苯/丙酮＝7/3，v/v。化合物12向化合物9(12.6g，11.6mmol)在二氯甲烷(114m)中的溶液加入三氯乙腈(3.5mL，34.9mmol)和DBU(52.2μL，0.35mmol)。室温下搅拌2小时后，将活化的4分子筛(24g)和受体11(8.9g，13.0mmol)(WO99/25720)在二氯甲烷(45mL)中的溶液加到反应混合物中。室温下搅拌30分钟后，将混合物冷却至-20℃，并滴加三氟甲磺酸三甲硅酯(405μL，2.1mmol)在二氯甲烷(100mL)中的溶液。室温下搅拌30分钟后，于-20℃加入碳酸氢钠并过滤反应混合物。将滤液倾入碳酸氢钠水溶液中，并用二氯甲烷萃取3次。合并的有机层用水洗涤2次并真空浓缩。产物用柱色谱法(1SiO2在乙醚中0-10％的丙酮；2SiO2甲苯/丙酮＝85/15-80/20，v/v；3RP-18水/乙腈＝2/8-0/10，v/v)纯化，得到纯化合物12(8.9g)。TLCRf＝0.37，甲苯/丙酮＝7/3，v/v。化合物14在连续氢气流下，搅拌化合物12(8.9g，5.1mmol)与10％的Pd/C(8.9g)在312mL的DMF和45mL水中的悬浮液。4.5小时后，过滤除去Pd/C催化剂。滤液浓缩成400mL，并在氢气流下用10％的Pd/C(1.5g)处理5.5小时。过滤除去催化剂。向滤液(900mL)中加入氢氧化钠水溶液(32mL，4N)。室温下搅拌4小时后，用1N的盐酸将化合物酸化成pH＝6.6，然后真空浓缩。粗产物在Sephadex G-25柱上用水洗脱进行脱盐。收集适宜级分并冻干，得到化合物14(4.0g)。化合物15将戊糖14(700mg，0.61mmol)溶于水(13.2mL)和DMF(3.3mL)中，并用N-(苄氧基羰基)琥珀酰亚胺(224mg，0.90mmol)和N-乙基吗啉(233μL，1.83mmol)处理。搅拌15分钟后，将反应混合物直接置于RP-18柱中，用10/0-7/3的水/乙腈洗脱。收集适宜的级分并浓缩，置于在水中的Dowex 50 WX4-H+离子交换柱上。真空浓缩洗脱物，得到纯的化合物15(482mg)。化合物16向化合物15(471mg，0.37mmol)在DMF(4.7mL)的溶液中加入三氧化硫-吡啶配合物(1.1g，6.6mmol)，混合物于30℃搅拌16小时。混合物冷却至室温，并滴入10％碳酸氢钠的冷却溶液中(16.7mL，19.9mmol)，然后室温下搅拌1小时。浓缩混合物并将其置于Sephadex G-25柱上用水洗脱。收集适宜的级分并浓缩，然后经过Dowex Na+HCRW2柱，用水洗脱。浓缩洗脱物并再溶于8.3mL的0.2N盐酸中，在4℃放置16小时。反应混合物用8mL的0.2N氢氧化钠中和，并置于Sephadex G-25柱上用水洗脱进行脱盐。收集适宜的级分并真空浓缩，得到纯的化合物16(840mg)。化合物17在连续氢气流下，搅拌化合物16(0.37mmol)和10％的Pd/C(820mg)在叔丁醇(85mL)和水(79mL)及几滴醋酸中的悬浮液。3小时后，过滤除去Pd/C催化剂，浓缩滤液并冻干，得到纯的化合物17(675mg)。4-[[4-[[(1R)-1-[[4-(氨基亚氨基甲基)苯基]甲基]-2-氧代-2-(1-哌啶基)乙基]氨基]-3-[[(4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯基)磺酰基]氨基]-1，4(S)-二氧丁基]氨基]-丁酸苄酯.盐酸盐(18)在氮气氛下，向4-[[(1R)-1-[[4-(氨基亚氨基甲基)苯基]甲基]-2-氧代-2-(1-哌啶基)乙基]氨基]-3-[[(4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯基)磺酰]氨基]-4-氧代-(3S)-丁酸.盐酸盐(2.38g，3.96mmol)(Tetrahedron 51，12047-12068，1995)和苄基-(4-氨基丁酸)苯磺酸酯(1.52g，3.96mmol)(J.Am.Chem.Soc.105，5278-5284，1983)在DMF(40mL)中的溶液，加入N，N-二异丙基乙胺(0.689mL，3.96mmol)和四甲基苯并三唑基脲四氟硼酸盐(1.91g，5.94mmol)。用N，N-二异丙基乙胺将反应混合物的pH保持为6。室温下将反应混合物搅拌4天，浓缩后溶于乙酸乙酯中，用5％碳酸钠和0.1N盐酸洗涤，经硫酸镁干燥并浓缩。所得残余物溶于无水乙醇中(5mL)，用无水异丙醚沉淀，过滤后得到2.47g标题化合物18。
Rf＝0.8，乙酸乙酯/吡啶/醋酸/水＝88/31/18/7，v/v/v/v；Mass(ESI+)777.4[M+H]+。4-[[4-[[(1R)-1-[[4-(氨基亚氨基甲基)苯基]甲基]-2-氧代-2-(1-哌啶基)乙基]氨基]-3-[[(4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯基)磺酰]氨基]-1，4(S)-二氧丁基]氨基]-丁酸·盐酸盐(19)在连续氢气流下，搅拌18(2.42g，3.11mmol)和10％的Pd/C(400mg)在甲醇/水(40mL，3/1，v/v)中的悬浮液。8小时后，过滤反应混合物，浓缩滤液并用甲醇/甲苯(1/10，v/v)共蒸发3次。残余物溶于无水乙醇中(5mL)，用无水乙醚沉淀，过滤并干燥。将残余物溶于水后直接加到制备HPLC DeltaPak RP-C18上，梯度洗脱洗脱为20％A/60％B/20％C至20％A/14％B/66％C，以40mL/分钟的流速洗脱60分钟(A0.5M的磷酸盐缓冲液，pH为2.1；B水；C乙腈/水＝6/4)。产物为598mg。
Rt＝26.4分钟(3-10分钟20-43％C+20％A；10-50分钟43-66％C+20％A)，(A磷酸盐缓冲液pH为2.1；B水；C乙腈/水＝6/4，v/v)，分析HPLC supelcosil LC-18-DB；Mass(ESI+)687.2[M+H]+，(ESI-)685.2[M-H]。来源于化合物17和化合物19的化合物21向化合物19(40mg，58.3μmol)在DMF(800μL)中的溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺(9.0mg，78.1μmol)、DCC(18.5mg，89.7μmol)和1-羟基苯并三唑(8.8mg，65.1μmol)。反应混合物于室温下搅拌40小时。反应混合物经代卡利特(Dicalite)过滤，代卡利特用DMF(284μL)洗涤4次。向滤液中加入0.1M的Na2HPO4缓冲液(1936μL，pH＝7.5)和戊糖17(94.7mg，52.6μmol)。待搅拌30分钟后，混合物经代卡利特过滤、浓缩，并加到Sephadex G-50柱上，用乙腈/水(1/1，v/v)洗脱。收集适宜级分并浓缩，用Sephadex G-50柱色谱法(水)脱盐2次。收集适宜级分并冻干，得到偶联物21，为白色固体(95.8mg)。Mass(ESI+)＝2469，HPLCRt＝8.3分钟(15分钟，20-80％B，A＝水/乙腈8/2；B＝2M NaCl/乙腈8/2，v/v)，分析HPLC MonoQ HR 5。化合物22在氮气流下，将(R)-N-Boc(4-氰基苯基)丙氨酸(25.0g，86.1mmol)、哌啶(21.3mL，215.3mmol)和TBTU(41.5g，129.2mmol)在无水CH2Cl2(500mL)中的溶液于室温下搅拌2小时。反应混合物用0.2N盐酸、水、碳酸氢钠水溶液(饱和)及水连续洗涤。有机层经MgSO4干燥，再过滤并真空干燥。将产物溶于热乙酸乙酯(35mL)中，用庚烷(190mL)沉淀，过滤得到化合物22(27.75g)。
TLCRf＝0.58，庚烷/乙酸乙酯＝3/7，v/v。化合物23于80℃下，将化合物22(25.6g，71.7mmol)、盐酸羟胺(7.1g，101.8mmol)和三乙胺(16.8mL，120.5mmol)在无水乙醇(307mL)中的溶液搅拌4小时。混合物冷却至室温，形成晶体。滤出晶体，用乙醇和乙醚洗涤，经干燥器干燥得到化合物23(24.5g)。
TLCRf＝0.15，庚烷/乙酸乙酯＝3/7，v/v。化合物24于115℃下，将化合物23(24.5g，62.7mmol)和氯甲酸乙酯(7.2mL，75.3mmol)在无水吡啶(245mL)中的溶液搅拌2小时。反应混合物冷却至室温，倾入水中(1250mL)并用乙酸乙酯(500mL)萃取3次。合并的有机萃取相经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩，得到化合物24(24.3g)。
TLCRf＝0.42，CH2Cl2/MeOH 95/5，v/v。化合物25室温下，将化合物24(24.3g，58.4mmol)在无水CH2Cl2(122mL)和TFA(122mL)中的溶液搅拌2小时，并在甲苯存在下真空浓缩，得到化合物25(37.6g)。
TLCRf＝0.35，CH2Cl2/MeOH 8/2，v/v。化合物26于0℃下，将H-Asp-(OtBu)-OH(39g，206.35mmol)、4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰氯(62g，249.3mmol)和二异丙胺(89mL，635mmol)在DMF(950mL)及水(450mL)中的悬浮液搅拌3小时。将反应混合物倾入冰/水(5L)中，用乙醚洗涤2次，用盐酸(72ml，4N)酸化，再用乙酸乙酯萃取3次。合并的乙酸乙酯层经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩，得到化合物26(97.7g)。
TLCRf＝0.67，CH2Cl2/MeOH 8/2，v/v。化合物27将化合物25(33.5g)、化合物26(24.7g)、TBTU(36.8g，114.6mmol)和二异丙胺(27.2mL，194.1mmol)在无水DMF(670mL)中的溶液搅拌2小时，并真空浓缩。将残余物溶于乙酸乙酯(750mL)，用碳酸氢钠水溶液(5％，1250mL)和盐酸(0.1N，1250mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩，得到化合物27(33.8g)。
TLCRf＝0.88，CH2Cl2/MeOH 8/2，v/v。化合物28室温下，将化合物27(33.8g，48.3mmol)在无水CH2Cl2(170mL)和TFA(170mL)中的溶液搅拌2小时，并在甲苯存在下真空浓缩，得到化合物28(32.3g)。
TLCRf＝0.73，CH2Cl2/MeOH 8/2，v/v。化合物29室温下，将化合物28(32.3g)，H-GABA-OtBu.HCl(9.5g，48.4mmol)、TBTU(29.0g，90.5mmol)和二异丙胺(25.2mL，179.8mmol)在无水DMF(622mL)中的溶液搅拌2小时，并真空浓缩。将残余物溶于乙酸乙酯(840mL)，用碳酸氢钠水溶液(5％，1400mL)和盐酸(0.1N，1400mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。将残余物溶于乙醇(75mL)中，并缓慢加到搅拌的二异丙醚(2990mL)中，得到化合物29，为灰白色结晶(32.0g)。
TLCRf＝0.56，CH2Cl2/MeOH 9/1，v/v。化合物30室温下，将化合物29(3.0g，3.82mmol)在无水CH2Cl2(15mL)和TFA(15mL)中的溶液搅拌2小时，并在甲苯存在下真空浓缩。残余物在硅胶上用CH2Cl2/MeOH(0％-6％的MeOH)提纯，得到纯的化合物30(1.98g)。
TLCRf＝0.56，CH2Cl2/MeOH 8/2，v/v。化合物31室温下，将化合物30(900mg，1.23mmol)、TBTU(396mg，1.23mmol)和二异丙胺(215μL，1.53mmol)在无水DMF(45mL)中的溶液搅拌2小时。加入化合物17(2.0g，1.11mmol)，搅拌4小时后，将混合物真空浓缩，得到化合物31(4.17g)。来源于化合物31的化合物21在连续氢气流下，将化合物31(4.17g)和10％的Pd/C(2.8g)在叔丁醇(28ml)和水(56ml)中的溶液搅拌过夜。过滤除去Pd/C催化剂，将滤液真空浓缩。残余物溶于水中并用Q-琼脂糖凝胶柱提纯。收集适宜级分，浓缩并用Sephadex G-25柱色谱法(水)脱盐。收集适宜级分并冻干，得到偶联物21，为白色固体(1.74g)。示意图1 示意图3 示意图4 示意图5 示意图6
实施例2通过下述测试方法测定本发明化合物的生物活性。I.抗凝血酶分析凝血酶(IIa因子)是血凝级联中的因子。
通过分光光度法，测定由凝血酶导致的生色底物S-2238水解的速率，评价本发明化合物的抗凝血酶活性。对抗凝血酶活性的分析在缓冲系统中进行，以确定待试化合物的IC50值。
测试介质氨丁三醇(Tromethamine)-NaCl-聚乙二醇6000(TNP)缓冲液参照化合物I 2581(Kahi)载体TNP缓冲液可用二甲亚砜、甲醇、乙醇、乙腈或叔丁醇增溶，这些溶剂在最终反应化合物中高达2.5％的浓度下不会产生副作用。
方法试剂*1.氨丁三醇-NaCl(TN)缓冲液；缓冲液细成氨丁三醇(Tris)6.057g(50mmol)，NaCl 5.844g(100mmol)，水加至1升。37℃下用HCl(10mmol/升)将溶液的pH调至7.4。2.TNP缓冲液将聚乙二醇6000溶于TN缓冲液中，浓度为3g/升。3.S-2238溶液将一瓶S-2238(25mg，Chromogenix；瑞典)溶于20ml TN缓冲液中，使其浓度为1.25mg/ml(2mmol/升)。4.凝血酶溶液人凝血酶(1000NIH单位/瓶，Enzyme Res.Lab.公司，美国)溶于TNP缓冲液中，配成50NIH单位/ml的贮备液。该溶液在使用前立即用TNP缓冲液稀释至浓度为30.2 NIH单位/ml。
*-使用的所有组分均为分析纯-水溶液采用超纯水(Milli-Q质量)。
制备待试化合物和参照化合物溶液将待试化合物和参照化合物溶于Milli-Q水中，配成浓度为10-2mol/升的贮备液。用载体对每一浓度进行梯度稀释，浓度为10-3、10-4和10-5mol/升。该分析使用包括贮备液的稀释液(在反应混合物中的终浓度分别为3×10-4；10-4；3×10-5；10-5；3×10-6；10-6；3×10-7和10-7mol/升)。
步骤室温下，用吸量管将0.075ml和0.025ml待试化合物溶液或参照化合物溶液或者载体分别加至微量滴定板的孔中，并分别用0.115ml和0.0165mlTNP缓冲液将这些溶液稀释。向每孔加入等分的0.030mlS-2238溶液，振荡下将滴定板置于恒温箱(Amersham)中在37℃下预热并预保温10分钟。预保温后，向每孔中加入0.030ml凝血酶溶液，使S-2238开始水解。将滴定板于37℃下保温(振荡30秒)。保温1分钟后，用动力学微量滴定板读数仪(Twinreader plus，FlowLaboratories)于405nm处测定每一试样的吸光度值，在90分钟内每2分钟测定一次。
将所有数据收集到具有数据处理程序(Biolise)的个人计算机中。对于每一化合物浓度(以mol/升反应混合物表示)及空白，以反应时间(分钟)对吸光度作图。
反应评价由分析曲线计算每一终浓度的最大吸光度。按照Hafner等的方法(Arzneim.-Forsch./Drug Res.1977；27(II)1871-3)，采用对数变换分析法计算IC50值(使空白的最大吸光度抑制50％的终浓度，以μmol/升表示)。
实施例1化合物的抗凝血酶活性IC50值为17nM。II.抗Xa因子分析活化因子X(Xa)是血凝级联中的因子。通过分光光度法测定由Xa导致的生色底物S-2222水解的速率，来评价本发明化合物的抗Xa活性。抗Xa活性的分析在缓冲系统中进行，以确定待试化合物的IC50值。
参照化合物戊糖Org 31540载体TNP缓冲液可用二甲亚砜、甲醇、乙醇、乙腈或叔丁醇增溶，这些溶剂在最终反应化合物中高达1％(DMSO)和2.5％(其他溶剂)的浓度下，不会产生副作用。
方法试剂*1.氨丁三醇-NaCl(TN)缓冲液；该缓冲液组成氨丁三醇(Tris)6.11g(50.4mmol)，NaCl 10.17g(174mmol)，聚乙二醇6000是3g/升，水加至1升。在37℃下用HCl(10mmol/升)将溶液的pH调至7.4。3.S-2222溶液将一瓶S-2222(25mg，Chromogenix；瑞典)溶于水中，使其浓度为0.375mg/ml(0.5mmol/升)。4.Xa溶液牛Xa因子人(71nKat/瓶；Chromogenix)溶于10ml TNP缓冲液中，再进一步用TNP缓冲液配成0.75nKat(1.5U)/ml。稀释液需新鲜配制。5.ATIII溶液人ATIII(Chromogenix)溶于水中，浓度为1U/ml，然后用3倍体积的TNP缓冲液稀释成0.25U/ml。6标准溶液5.7抗XaU/ml Org31540的贮备液用TNP缓冲液稀释成0.05U/ml。7待试样品将每一制剂溶于水中，并用TNP缓冲液稀释成0.05nmol/ml。对于每一制剂，配制9稀释度的溶液(稀释因子1.5)。
测定Xa活性室温下，用移液管将每一待试样品(0.05ml)加到微量滴定板的孔中。将AT-III溶液(0.05ml)加到每一试样中，微量滴定板用Vari-振动器振荡。加入AT-III溶液10分钟后，取等分的Xa溶液(0.05ml)加入每一孔中，并再次振荡滴定板。在加入Xa溶液刚好2分钟后，取0.1ml的S-2222溶液加入每一孔中，并再次振荡滴定板。采用12-槽吸量管加液。残余量的Xa催化S-2222的水解，分别于室温下保温2和22分钟后光度法测定水解速率。用Reader Microelisa，310C型(Organon Teknika，Oss，荷兰)于405nm测定每一样品的吸光度，并计算吸光度的增加值(ΔOD)。每一试样测定二次。其中每10份试样，包括一个空白(0.05mlTNP缓冲液)。
标准曲线用一定稀释度的标准样品配制等分标准溶液试样(Org31540试样的稀释因子是1.4)。所得标准试样(约12份试样)应包含0.01-0.05抗XaU/ml。每一操作中，均按上述″Xa活性测定″项下，每份标准试样取0.05ml测量至少3次。用最小二乘法，以
Log平均ΔOD(空白)-平均ΔOD(标准试样)平均ΔOD(标准试样)对log抗XaU/ml值作一直线，即可得到标准曲线。
反应评估采用标准曲线，测定每一试样的平均抗Xa活性(U/ml)。
实施例1化合物的抗Xa因子活性1012U/μmol。
权利要求
1.式(I)化合物或其药用盐、前药或其溶剂化物， 其中R独立地为SO3-或CH3；间隔基为链长为13-25个原子的柔性隔离基；戊糖残基的电荷由荷正电的抗衡离子抵消；和戊糖残基中硫酸盐基团的总数为4、5或6。
2.如权利要求1的化合物，其中戊糖残基具有以下结构
3.如权利要求1或2的化合物，其中间隔基的链长为16-22个原子。
4.如权利要求1-3任一项的化合物，其中间隔基的链长为19个原子。
5.如权利要求1-4任一项的化合物，其中间隔基为*-(CH2CH2O)3-(CH2)2-NH-C(O)-(CH2)3-NH-C(O)-CH2-，用*表示的端基与戊糖残基链接。
6.如权利要求1的化合物，具有以下结构
7.式I化合物的制备方法，包括苄脒基部分为1，2，4-氧杂二唑啉-5-酮基团形式的前体的步骤。
8.一种药物组合物，其中包含如权利要求1-6任一项的化合物和药用辅料。
9.用于治疗的权利要求1-6任一项化合物。
10.如权利要求1-6任一项的化合物在制备用于治疗或预防血栓形成或其他与凝血酶有关疾病的药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及式(I)化合物或其药用盐、前药或其溶剂化物，其中R独立地为SO
文档编号A61K31/702GK1407989SQ00816775
公开日2003年4月2日 申请日期2000年12月1日 优先权日1999年12月7日
发明者C·A·A·范伯伊克尔, C·M·特罗姆普, T·T·M·吉尔特森 申请人:阿克佐诺贝尔公司