一种治疗乙肝的药物的制作方法

专利名称：一种治疗乙肝的药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种治疗乙型肝炎的药物，具体说是治疗乙型肝炎的中药制剂。
中国专利公开CN 1194849A公开了一种治疗乙肝的中成药-乙肝转阴散，主要包括五味子、丹参、赤芍、当归、黄芪、水蛭、全虫等原料，该药治疗急慢性乙肝的总有效率为84.64％。
中国专利公开CN 1179323A公开了一种治疗乙肝病的中药剂及其制备方法。该药组分主要包括党参、黄芪、白芍、丹参片、千日红、凤尾草等，具有清热解毒、疏肝醒脾、理气止痛、祛瘀生新、清除体内病毒、促进肝细胞再生等功效。

发明内容
本发明是在同一申请人的发明专利ZL93 101758.0基础上的改进发明。因此，本发明的目的是提供一种有效治疗乙型肝炎的药物，经动物试验证实，本发明的药物具有显著的保肝、促进肝再生、促进肝脏BSP排泄功能、增强免疫功能等作用，能够显著抑制乙型肝炎表面抗原和e抗原以及显著抑制鸭乙型肝炎病毒感染。
本发明的药物由以下原料制成(按重量份计)蚂蚁150-450黄芪20-60参10-30枸杞子1030 黄精10-30丹参30-90白术10-30 地黄30-90赤芍10-30当归10-30 蒲公英30-90 虎杖15-45秦艽10-30 苍术10-30猪苓10-30陈皮10-30 山楂10-30六神曲10-30麦芽10-30 青皮10-30本发明药物的制备方法为将上述原料粉碎成细粉，过筛，混匀，每1千克粉末加炼蜜250-300克与适量的水，制成水蜜丸，干燥，即可得到。
或者，用下面的方法制备本发明的药物将人参粉碎成细粉，过筛；丹参用乙醇(优选90％)回流提取二次，第一次2小时左右，第二次1.5小时左右，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇，得到丹参提取液；白术、当归、苍术、陈皮、青皮提取挥发油，蒸馏后的水溶液另器收集；药渣与其余蚂蚁等十三味及上述乙醇提取后的丹参药渣，加水煎煮两次，第一次2小时，第二次1.5小时，滤过，合并滤液，滤液浓缩至适量，放置至室温，缓缓搅拌下加乙醇使含醇量达60％左右，静置，滤过，滤液回收乙醇；合并该滤液，丹参提取液及上述水溶液，减压浓缩成相对密度为1.35-1.40(50℃)的清膏，加入上述人参细粉混匀，低温干燥，粉碎，制成颗粒，干燥，加入上述挥发油，混匀，装入胶囊即得。
附图简述

图1是试验三中的第一批实验的鸭血清DHBV-DNA斑点杂交放射自显影照片。
图2是试验三中的第二批实验的鸭血清DHBV-DNA斑点杂交放射自显影照片。
图3是试验三中的第三批实验的鸭血清DHBV-DNA斑点杂交放射自显影照片。
当然，可以将本发明药物制成任何一种适合于临床上应用的剂型，例如丸剂、散剂、口服液、浓缩丸等。试验一 本发明药物的药效学研究以CCl4或D-半乳糖胺所致实验性急慢性肝损伤和卡介苗所致免疫性肝损伤，灌服本药可使异常升高的ALT、AST活力下降，并减轻肝脂肪变性、水肿、坏死的范围和程度；能促进肝细胞再生，降低小鼠BSP的滞留量；同时对巨噬细胞吞噬、T淋巴细胞转化、溶血素抗体生成等细胞与体液免疫，亦有增强作用。
试验目的本药临床试验对乙型肝炎有一定疗效，现通过动物试验，观察对肝损伤病理模型和机体免疫功能的影响。
试验材料1、动物小白鼠有昆明种，NIH种，本所繁殖，BALB/C种小鼠与C57BL/6种小鼠，购自中国医科院药物研究所。Wistar种大白鼠，本所繁殖。
2、药物本发明药物；联苯双酯滴丸，锦州市制药厂，930420批；乙肝宁冲剂由长沙九芝堂制药厂生产；批号9504210；盐酸左旋咪唑，上海延安制药厂生产，批号930107；龟令集，山西中药厂，9110060批；冻干卡介苗，卫生部生物制品研究所，3940308批。
一、保肝作用1、对小鼠四氯化碳急性肝损伤的作用昆明种小白鼠50只，体重20±2g，雌雄兼用，随机分为5组。1组正常对照，2组灌服生理盐水，3、4组分别灌服本发明药物8g/kg、4g/kg的水混悬液，5组灌服联苯双酯0.2kg/kg的水混悬液，每日一次，连续给予6日。于末次给药后1小时，后4组分别腹腔注射0.2％CCl4油溶液10ml/kg。禁食不禁水20小时后，各组小鼠眼眶静脉采血，按改良的赖氏法测定丙氨酸氨基转换酶(ALT)，并摘取肝脏做病理形态学检查。
从表1可见，各给药组都可使病理性升高的ALT明显降低(P＜0.01)，显微镜下看到肝小叶结构基本清晰，肝细胞仅见轻度浊肿，肝窦略窄，散在点状坏死灶，而CCl4模型组则肝细胞大部分空泡变性或广泛浊肿，多数散在点片状坏死灶，个别血管周围形成大片状浸润，汇管区炎细胞浸润明显。
表1对小鼠CCl4急性肝损伤的降酶作用

与模型组比较，***P＜0.012、对小鼠D-半乳糖胺盐酸盐(D-Gal)急性肝损伤的影响昆明种小白鼠60只，18-22g，雌雄兼有，随机分为6组，1、2组生理盐水，3、4、5组分别给予本药8g/kg、4g/kg、2g/kg的水混悬液，6组给予联苯双酯0.2g/kg的水悬液，均为每日灌胃1次，共6次。末次灌胃后1小时，后5组腹腔注射D-Gal 0.65g/kg生理盐水液。20小时后，眼眶静脉丛采血，取血清测ALT与AST(门冬氨酸氨基转换酶)。剖取肝脏，固定，送病理检查。
从表2可见，模型组的ALT与AST，和正常对照组比较，显著升高，说明肝功能受到严重损害。与模型组比较，本药高、中剂量组可使ALT与AST明显降低(P＜0.01)，低剂量组亦显著降低ALT的活力。
病理组织学结果显示，高、中、低剂量用药组小鼠肝之病理改变基本上与正常对照组相同，与D-GAL模型组相比，肝细胞的损伤程度明显减轻。
表2 对小鼠D-GAL急性肝损伤的降酶作用

与模型组比较，***P＜0.01，P＞0.05表3 对小鼠半乳糖胺肝损伤病变的影响

3、对小鼠免疫性肝损伤的影响取雌性BALB/C小鼠50只，体重22±2g，随机分为5组。除正常对照组给予同体积生理盐水外，其余4组给每鼠尾静脉注射冻干卡介苗2.5mg，溶解为0.2ml。同时分别灌服生理盐水或药液，每日1次，共12日。末次给药后，给每鼠静脉注射细菌内毒素5000Eu(0.2ml)，正常对照组注射生理盐水。16小时后，眼眶静脉丛采血，分离血清，测ALT与AST。剖取肝脏固定，进行病理检查。结果显示，本药高低剂量均可降低异常升高的ALT与AST活性(表4)，说明对免疫性肝损伤也有同样保护作用。
病理组织学结果显示，本发明药物高、低剂量组可不同程度减少肝细胞点、片状坏死、水肿、增生和炎性细胞浸润，其作用与阳性对照药联苯双酯相似。
表4 对小鼠免疫性肝损伤转氨酶活力的影响

与模型对照组比较**P＜0.05，***P＜0.01表5 对小鼠免疫性肝损伤组织病变的影响


4、对大鼠四氯化碳慢性肝损伤的影响大白鼠49只，体重150-200g，♂25只，♀24只。随机分为6组，即本药高、中、低剂量，阳性对照药乙肝宁冲剂，生理盐水和正常对照组。每日灌胃给药1次，共8周(56日)。除正常对照组外，其余5组给药期间每隔3日于每鼠颈背皮下注射40％CCl4油溶液3ml/kg，首次量为5ml/kg。末次给药24小时后，眼眶静脉丛采血，分离血清，测总蛋白、白蛋白含量，ALT、AST活性。断头处死，取每只大鼠同一叶部位的肝组织，固定，送病理切片检查。
结果显示，本药各剂量可使异常升高的ALT活力有明显降低，但对升高的AST只有高剂量表现降低之效，对总蛋白和白蛋白的有增加的趋势，但与对照组比较无显著性差异(P＞0.05)。
表6 对慢性肝损伤大鼠血清转氨酶与蛋白质的影响

与模型组比较，***P＜0.01，**P＜0.05，*P＞0.05
肝组织切片镜检所见(表7)，与模型组比较，给药组肝细胞的脂肪变性，水肿和坏死，明显较少和较轻。
表7 对CCl4慢性肝损伤大鼠组织病变的影响

二、本发明药物对小鼠肝再生能力的影响昆明种小鼠，18-22g，♂♀各半，随机分为5组，即对照组，联苯双酯(200mg/kg)，本药高剂量组(8g/kg)、中剂量组(4g/kg)和低剂量组(2g/kg)。于实验第一天1.5％巴比妥纳麻醉(ip)切除肝左叶包扎后im邻氯青霉素钠。次日开始给药，共给药三日，末次给药1小时后，称重，处死，称肝重，并固定标本，显微镜检计数新生细胞数，计算肝再生度及肝脏系数。结果见表8。

A切除肝重B再生后肝重0.31为切除肝重与原肝重之比表8 本发明药物对小鼠再生肝重的影响(X±SD)


与对照组比较，*P＞0.05，**P＜0.05。
由表8可见，本发明药物有促进肝再生的趋势，使肝再生度有一定提高，但统计不显著(P＞0.05)，联苯双酯与其作用相似，联苯双酯与本发明药物均可使小鼠肝脏小叶中新生细胞数明显增多，核分裂相增多，与对照组比较有显著性意义(P＜0.05)。
三、对小鼠肝脏BSP排泄功能的影响昆明种小鼠，体重20±1.2g，随机分为5组本发明药物高(8g/kg)、中(4g/kg)、低(2g/kg)三个剂量组，联苯双酯组(200mg/kg)和空白对照组。灌胃给药3日，每日一次。末次给药后1小时，尾iv BSP(磺溴酞钠)100mg/kg(用生理盐水配成1％溶液，0.2ml/10g)，iv后15分钟，眼眶静脉丛采血，离心。取0.1ml血清，加0.01mol/LHCl 5ml，用UV-240型分光光度计于520nm处测吸收值(OD)，再加入2mol/L NaOH一滴，测OD；两次OD之差值，即为BSP在血中的储留量，结果见表9。
结果可见，本发明药物高、中、低剂量组均有促进肝脏排泄，BSP滞留值均比对照组低。
表9 本发明药物对肝脏排泄BSP功能的影响

与对照组比较，**P＜0.05，***P＜0.01四、对免疫功能的影响1、对小鼠碳粒廓清速率的影响取昆明种小鼠48只，20±2g，分5组。即本药高(8g/kg)、中(4g/kg)、低(2g/kg)三个剂量组，左旋咪唑组和对照组。每日灌胃给药1次，共7次。末次给药后24小时，尾静脉注射印度墨汁生理盐水稀释液10ml/kg。注射后2和20分钟，从眼眶静脉丛采血20u1，加入0.1％碳酸钠溶液2ml中，摇匀。用UV-240型分光光度计于680nm波长处测定吸收度；计算廓清指数K和吞噬指数α。结果可见，本药高剂量能够明显提高小鼠血中碳粒异物的清除速率，中、低剂量对碳廓清指数的增加虽不显著，但按单位重量校正的吞噬指数则有明显提高(P＜0.05)，说明本药有增强网状内皮系统吞噬功能的作用。(表10)表10 对小鼠碳粒廓清速率的影响

与对照组比较，***P＜0.01，**P＜0.05，*P＞0.052、对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响昆明种小白鼠100只，雄性，22±2g，随机分为10组。每日灌胃给药1次，共10日。第6～10组于给药第7、9两日，分别腹腔注射环磷酰胺70mg/kg。各组鼠给药第10日下午腹腔注射5％鸡红细胞生理盐水0.5ml，16小时后颈椎脱臼法处死小鼠，注入2ml生理盐水于腹腔内，轻揉腹部。2分钟后腹部正中剪开，用吸管吸出腹腔液约0.5ml，滴于载玻片上，置37℃孵箱内30分钟，用生理盐水洗去未贴片的细胞，凉干。用1∶1丙酮甲醇液固定，姬姆萨瑞氏液染色，油镜下计数200个巨噬细胞中吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数和被吞噬的鸡红细胞总数，算出吞噬百分率及吞噬指数。
结果见表11、12。本药各剂量均能明显增强正常小鼠巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数，对于环磷酰胺抑制的免疫功能低下鼠，本药亦能提高腹腔巨噬细胞吞噬率和吞噬指数，只有低剂量和阳性对照药龟令集对吞噬指数的增加，统计无明显意义的差别。
表11 对正常大鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

与对照组比较，**P＜0.05，***P＜0.01表12 对环磷酰胺抑制鼠吞噬功能的影响


与对照组比较，*P＞0.05，**P＜0.05，***P＜0.013、对小鼠迟发型变态反应(DTH)的影响取NIH种小白鼠50只，雌雄各半，18～22g。随机分为本药高、中、低剂量，左旋咪唑和生理盐水等5组。每日灌胃给药1次，共8次。给药第3日用20％羊红细胞生理盐水悬液(SRBC)0.2ml，给每鼠尾静脉注射致敏，末次给药后以40％SRBC0.02ml，注入每鼠左后足跖；以同体积生理盐水注入右后足跖作为对照。经24小时后，用游标卡尺测量左右足跖的厚度，其差值愈大者表示机体细胞免疫的功能愈强，从表13看出，本药各剂量均可显著增加左后足跖的厚度，提示对T淋巴细胞的功能有增强的作用。
表13 对大鼠迟发型变态反应的影响

与盐水组比较，***P＜0.014、对小鼠脾脏T淋巴细胞增殖反应的影响取C57种小鼠50只，20±2g，雌雄各半，随机分成5组。分别灌服药液或生理盐水，每日1次，共7日。末次给药后次日，颈动脉放血处死小鼠，无菌取脾，制备脾细胞悬液。用0.155M的NH4Cl液溶解红细胞，Hanks液洗2次，最后用RPMI1640完全营养液(含10％小牛血清)重悬浮，调整细胞浓度为2.5×106/ml，经台盼兰排斥试验，活细胞在95％以上。
取此浓度的脾细胞悬液加入96孔平底板中，每份样品加6个孔，每孔含5×105个细胞。分别加入4ug/孔的ConA，并设空白对照。混匀，置37℃，5％CO2孵箱中培养72小时。终止培养前6小时，每孔分别加入1μ Ci的3H-TdR，多头细胞收集器收集细胞于玻璃纤维滤膜上，液闪计数仪测量cpm值。
结果显示本药各剂量均可促进有丝分裂原ConA刺激的T淋巴细胞的转化，提高其增殖反应(表14)。
表14 对小鼠T淋巴细胞增殖反应的影响

与对照组比较，***P＜0.015、对小鼠溶血素抗体生成的影响取NIH种小白鼠50只，雌雄各半，随机分为5组本药高(8g/kg)、中(4g/kg)、低(2g/kg)剂量，左旋咪唑(0.01g/kg)和生理盐水组。每日灌胃给药1次，共7日。第2次给药后，每鼠腹腔注射羊红细胞生理盐水悬液0.2ml致敏。本次给药后1小时，眼眶静脉丛采血，按文献方法(李仪奎，中药药理实验方法学，1991，159)测定OD值，并计算半数溶血值(HC50)。结果显示，本药高、中剂量均可明显增加溶血素抗体的生成，其作用不及左旋咪唑。(表15)表15 对小鼠溶血素抗体生成的影响

与对照组比较，**P＞0.05，***P＜0.01试验二本发明药物在2215细胞内对乙型肝炎病毒表面抗原和e抗原的抑制作用材料与方法一、药物本发明药物为棕色粉末，实验时用培养液配成10mg/ml，0.45um滤膜除菌过滤。
二、2215细胞乙型肝炎病毒(HBV)DNA克隆转染人肝癌细胞(Hep G2)的2215细胞系，美国Mount Sinai医学中心构建，引进后自行传代培养。
试剂，Eagles MEM干粉，美国GIBCO公司产品；胎牛血清，美国Hyclone Lab公司产品；G-418(Geneticin)，MEM配制，美国Gibco公司产品；L-谷氨酰胺，京科化学试剂公司进口分装；HBsAg，HBeAg固相放射免疫测定盒，购自中国同位素公司北方免疫试剂研究所产品；青霉素、链霉素，华北制药厂。
实验用品及仪器培养瓶，丹麦Tunclon TM；培养板，96孔板，24孔板，美国Corning公司产品；二氧化碳孵箱，美国Shel-lab产品。
2215细胞培养液及试剂配制MEM培养液100ml含胎牛血清10％，3％谷氨酰胺1％，G148380/ml，青、链霉素各100u/ml，加1ml，用5NaHCO3调pH至7。
细胞消化液0.25％胰酶，用Hanks液配制。
四、实验方法(一)2215细胞培养在长满2215细胞的培养瓶内加0.25％胰酶，37℃消化3分钟，加培养液吹打，1∶3传代，10天长满，加入细胞计数板计数，配制成每毫升10万个细胞接种培养板，96孔板每孔0.2ml，24孔板每孔1ml，37℃5％CO2培养24小时，细胞长成单层后进行实验。
(二)药物对细胞毒性试验本发明药物用培养液配制成10mg/ml溶液，用2倍稀释至0.156mg/ml，加入96孔板细胞培养板，每浓度3孔，每4天换同浓度药液，设无药物细胞对照组。因药物有色素不能采用染色法，故以观察细胞病变为指标，8天显微镜下观察细胞病变，完全破坏为4，75％为3，50％为2，25％为1，无病变为0。计算每浓度药液平均细胞病变程度和抑制％。按Reed Meuench法计算TC50，TC0。 A＝log＜50％药物浓度 B＝log稀释倍数(三)药物对HBeAg、HBsAg抑制试验每毫升10万个2215细胞接种24孔细胞培养板，每孔1ml，37℃5％CO2培养24小时，加无毒浓度以下2倍稀释试验药液，5个稀释浓度分别为2.5mg/ml；1.25mg/ml；0.625mg/ml，0.3125mg/ml；0.156mg/ml，每浓度3孔，37℃5％CO2培养，每4天换原浓度药液培养，第8天时收获培养液，-20℃冰冻保存，三批实验同时测定HBeAg和HBsAg。实验设HBeAg、HBsAg阳性和阴性对照和细胞对照。
1、HBeAg、HbsAg测定用中国同位素公司北方免疫试剂研究所产品，固相放射免疫测定盒测定，方法见说明书，用γ-计数仪测定每孔cpm值。
2、药物效果计算计算细胞对照及每浓度cpm均值及标准差，P/N值和抑制百分率(％)，半数有效浓度(IC50)及治疗指数(TI)。
(3)计算药物抑制抗原半数有效浓度(IC50) A＝log＜50％药物浓度B＝log稀释倍数(4)本发明药物在2215细胞培养箱内对HBsAg和HBeAg的治疗指数(TI)，按其对细胞毒性指标细胞病变(TIc)计算。 (5)以t检验法计算各稀释浓度HBsAg、HBeAg和对照组间cpm的差别。
结果一、本发明药物在2215细胞培养中的细胞毒性为观察本发明药物对乙型肝炎病毒基因转染的人肝癌2215细胞的毒性，在接种2215细胞后24小时，加2倍稀释药液。实验自10mg/ml开始，7个稀释度分别为10；5；2.5；1.25；0.625；0.3125；0.156mg/ml每浓度3孔。4天换一次药液，维持8天，用显微镜观察细胞病变，按公式计算半数有毒浓度(TC50)和最大无毒浓度(TC0)，见表16。结果显微镜检CPE，TC50三批实验分别为5mg/ml、5mg/ml、5.57mg/ml，平均半数中毒浓度为5.19±0.33mg/ml；无毒剂量TC0为2.5mg/ml。
二、发明药物在2215细胞培养中对HBeAg和HBsAg表达的作用本发明药物 2.5mg/ml；1.25mg/ml；0.625mg/ml；0.3125mg/ml及0.156mg/ml加入2215细胞培养，第8天对HBeAg和HBsAg效果见表17、表18、表19。
1、对HBeAg的抑制率三批实验本发明药物各浓度组对2215细胞培养第8天上清液对HBeAg的平均抑制率(表19)分别为2.5mg/ml抑制62.5±3.2％、1.25mg/ml抑制49.3±3.6％、0.625mg/ml抑制37.8±7.5％、0.3125mg/ml抑制26±4.4％、0.156mg/ml抑制18.5±3.8％。三批实验的HBeAg P/N值2.5mg/ml为4.97±0.06，与对照组比较抑制8.4±1.3；1.25mg/ml为6.73±0.21，与对照组比较抑制6.6±1.14；0.625mg/ml为8.23±0.29，与对照组比较抑制5.1±1.48；0.3125mg/ml为9.83±0.5与对照组比较抑制3.5±0.87；0.156mg/ml为10.87±0.68，与对照组比较抑制2.47±0.71。三批实验IC50各为(表19)0.87mg/ml；0.86mg/ml；1.14mg/ml。平均0.96±0.16mg/ml。
2、对HBsAg的抑制率本发明药物三批实验各浓度组对HBsAg的平均抑制率(表18)分别为种2.5mg/ml抑制28.3±2.96％、1.25mg/ml抑制28.03±4.1％、0.625mg/ml抑制12.4±10.6％、0.3125mg/ml抑制10.6±5.0％、0.156mg/ml抑制6.2±4.8％。HBsAg P/N值2.5mg/ml为2.78±0.18，与对照组比较抑制1.07±0.12；1.25mg/ml为2.77±0.11，与对照组比较抑制1.08±0.18；0.625mg/ml为3.33±0.32与对照组比较抑制0.52±0.39；0.3125mg/ml为3.43±0.15，与对照组比较抑制0.42±0.19；0.156mg/ml为3.6±0.1，与对照组比较抑制0.25±0.19。三批实验IC50各为1.9；2.21和＞2.5mg/ml。平均＞2.21±0.3mg/ml。
3、治疗指数[TI](1)本发明药物在2215细胞培养内对HBeAg的治疗指数[TI]按期细胞病变计算，三批实验IC50值分别为5mg/ml，5mg/ml，5.57mg/ml，平均为5.1±0.33mg/ml。IC50分别为0.87；0.86；1.14mg/ml。平均0.96±0.16。TI各为5.97，6.03，4.55。平均5.52±0.84。
(2)本发明药物在2215细胞培养内对HBsAg的抑制％三批实验2.5mg/ml各为28％，31.4％和25.5％，1.25mg/ml各为31.7％；28.8％和23.6％，IC50分别为1.9；2.21和＞2.5mg/ml。治疗指数(TI)各为2.37，2.35和2.08。平均＜2.4±0.33。
表16、本发明药物在2215细胞培养内的毒性

表17 本发明药物在2215细胞中第8天对HBeAg的抑制作用(三比实验)

注实验组与对照组比较***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05表18 本发明药物在2215细胞中第8天对HBsAg的抑制作用(三批实验)

表19本发明药物在2215细胞培养内对HBeAg和HBsAg的抑制效果分析

结论一、本发明药物对2215细胞培养的毒性本发明药物加入2215细胞培养8天，以细胞病变为指标，三批实验平均半数毒性浓度(TC50)为5.19±0.33mg/ml。最大无毒浓度(TC0)为2.5mg/ml。
二、本发明药物在2215细胞培养内对HBeAg和HBsAg分泌的抑制作用本发明药物在2215细胞中培养8天，三批实验平均最大无毒浓度2.5mg/ml对HBeAg的抑制率为62.5±3.2，IC50为0.96±0.16mg/ml。治疗指数5.52±0.84。对HBsAg的抑制作用最大无毒浓度2.5mg/ml抑制率为28.3±2.96％，IC为2.21±0.3mg/ml，治疗指数为＜2.39±0.33。
三、目前临床用于治疗乙型肝炎病毒的阿糖腺苷单磷酸(Ara-AMP)、无环鸟苷(ACV)、磷甲酸(PFA)等在2215细胞中虽能抑制HBV-DNA，但对HBeAg表达抑制低于50％，不能计算IC50。本实验未用阳性对照药。
试验三 本发明药物在鸭体内对鸭乙型肝炎病毒感染的治疗效果为验证本发明药物体内抗肝炎病毒作用，本实验采用鸭乙型肝炎病毒感染雏鸭口服本发明药物进行治疗，观察其对鸭血清鸭乙型肝炎病毒DNA水平的影响，并与无环鸟苷(ACV)比较，同时观察了鸭口服本发明药物的毒性。
材料与方法(一)药物1、本发明药物2、阳性药物无环鸟苷(ACV)，购自武汉科益制药公司。
(二)鸭乙型肝炎病毒 鸭乙型肝炎病毒DNA(DHBV-DNA)强阳性血清，采自上海麻鸭，-70℃保存。
(三)动物1 日龄北京鸭，购自中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所养鸭场。
(四)试剂α-P-dCTP购自北京福瑞生物技术工程公司。缺口翻译盒购自Promega Co.；Sephadex G-50，Ficoll PVP购自瑞典Pharmacia公司；SDS西德Merck公司产品；鱼精DNA、牛血清白蛋白为中科院生物物理所产品；硝酸纤维素膜0.45um Amersham公司产品。
(五)实验方法1、鸭乙型肝炎病毒感染1日龄北京鸭经腿胫静脉注射山东麻鸭DHBV-DNA阳性鸭血清，每只0.2ml，在感染后天取血，分离血清，-70℃保存待检。
2、药物治疗试验DHBV感染雏鸭7天后随机分组进行。药物治疗试验，每组5-7只不等；给药组每批实验分3个剂量组，第1批分2、4和8g/kg组口服1天2次，10天。第2、3批实验分2.5、5、10g/kg组口服1天2次，10天。设病毒对照组(DHBV)，以生理盐水代替药物。阳性药用无环鸟苷(ACV)，口服给药100mg/kg，1天2次，10天；在感染后第7天即用药前(T0)，用药第5天(T5)，用药第10天(T10)和停药后第3天(P3)，自鸭胫静脉取血，分离血清，-70℃保存待检。
3、检测方法取上述待检鸭血清，每批同时点膜，测定鸭血清中DHBV-DNA水平的动态。按缺口翻译试剂盒说明书方法，用P标记DHBV-DNA探针，并作鸭血清斑点杂交，放射自显影膜片斑点，在酶标检测仪测定OD值(滤光片为490nm)，计算血清DHBV-DNA密度，以杂交斑点OD值作为标本DHBV-DNA水平值，结果见附图1、2和3。
(六)药效计算1、计算每组鸭不同时间血清DNA OD值的平均值(X±SD)并将每组鸭用药后不同时间(T5，T10)和停药后第3天(P3)血清DHBV-DNA水平与同组给药前(T0)OD值比较，采用配对t检验，计算t1、P1值。作统计学处理，分析差异的显著性，判断药物对病毒感染的抑制效果。
2、计算每组鸭用药后不同时间(T5、T10)和停药前第3天(P3)血清DHBV-DNA的抑制％，并作图，比较各组鸭血清HBV-DNA抑制率的动态。 3、将给药治疗组不同时间DHBV-DNA抑制率比较，采用成组t检验，作统计学处理，计算t2、P2值，分析差异的显著性，判断药效。
结果(一)1日龄北京鸭感染DHBV后，血清DHBV-DNA动态DHBV-DNA感染鸭口服生理盐水后DHBV-DNA全部阳性。病毒对照组18只雏鸭感染后第7天血清DHBV-DNA全部阳性，3批实验感染注射鸭乙型肝炎病毒，感染第7、12、17和20天血清DHBV-DNA水平第1、3批有上升趋势，第2批有下降趋势，但无显著性差异，为自然波动。
(二)阳性药无环鸟苷(ACV)对DHBV感染鸭血清DHBV-DNA的影响第3批实验 DHBV感染鸭口服阳性药无环鸟苷100mg/kg，1天2次，10天，结果见表1、表2。6只鸭，给药第5天(T5)和第10天(T10)，与给药前(T0)比较，配对统计明显下降，差别有非常显著性(P＜0.01)，说明有显著抑制DHBV作用，为阳性对照。停药后抑制％降低，有反跳现象，虽仍有一定抑制，但无统计学意义。
(三)本发明药物在DHBV感染鸭体内对鸭血清DHBV-DNA的影响三批实验结果见图1、2、3，表1、2及杂交照片1、2、3，结果表明1、第一批实验选用三个剂量组，分别为2、4和8g/kg组，在给药前(T0)与给药后第5天(T5)、第10天(T10)及停药后3天(P3)，取鸭血，分离血清，检测DHBV-DNA OD值，作自身配对比较。8g/kg组在给药后鸭血清OHBV-DNA OD值，与给药前比较，有明显的抑制作用，统计学显示有显著性意义(P＜0.05)，4和8g/kg组在停药后3天鸭血清DHBV-DNA的抑制％，与给药前比较(T0)比较，与病毒对照组成对比，有明显的抑制作用，统计学显示有显著或非常显著性意义(P＜0.01)，未见毒性反应。2g/kg组与感染对照组抑制％作成组分析，无显著差异。
2、第二批实验3个剂量组，分别为2.5，5和10g/kg组，结果表明2.5和5g/kg组在给药第10天鸭血清DHBV-DNA OD值，与给药前(T0)比较，有明显的抑制作用，统计学显示有显著性意义(P＜0.05)。10g/kg组在给药第10天和停药后3天鸭血清DHBV-DNA抑制％与病毒对照组成组对比，有非常明显的抑制作用，统计学显示有非常显著性意义(P＜0.01)。
3、第三批重复实验，结果表明2.5、5g/kg组在给药第5天鸭血清DHBV-DNA水平OD值与给药前比较有显著抑制(P＜0.05)。5、10g/kg组给药后第5天鸭血清DHBV-DNA的抑制％与病毒对照组成组对比，有显著或非常显著抑制。无环鸟苷100mg/kg1天2次，10天，在给药后第5天、10天都有非常显著抑制。停药后有反跳，与以往多次实验一致。
表20 本发明药物在鸭体内对DHBV-DNA OD值的抑制作用

给药后不同时间(T5、T10、P3)OD值与同组给药前(T0)OD值比较(配对t检验)*P＜0.05，**P＜0.01。
表21 发明药物治疗组与病毒对照组在鸭体内对DHBV-DNA抑制率的比较

给药治疗组不同时间DHBV-DNA抑制率分别与病毒对照组相同时间DHBV-DNA抑制率比较(成组t检验)，*P＜0.05，**P＜0.01。临床试验一分治疗组和对照组，治疗组用本发明药物，对照组用乙肝养阴活血冲剂。随访一年后综合疗效治疗组治愈率为49.42％，有效率为39.38％，总有效率为88.80％，明显优于对照组(P＜0.05)，见表22表22 随访一年疗效分析

中医证候疗效总的治疗组口干苦、乏力、腹胀、胁痛、纳差、腰膝酸软、面色紫暗等症状的改善，其疗效优于对照组(P＜0.05)，见表23表23 治疗组与对照组中医主要症状积分比较

肝功能改善ALT、AST、SB治疗组与对照组治疗前后自身比较差异显著(P＜0.05)。肝功能复常率治疗组优于对照组，具有显著性差异(P＜0.05)，见表24表24 肝功能复常时间、复常率比较

HBV-MHBsAg阴转率治疗组为35.9％(服用2个疗程后)，HBeAg阴转率为58.7％，HBV-DNA阴转率为57.1％，与对照组比较均有显著性差异(P＜0.05)，见表25。
表25 对HBV-M阴转率的影响

结果显示本发明药物对慢性迁延性肝炎的疗效92.2％，高于慢性活动性肝炎的81.3％，见表26表26 慢迁肝、慢活肝疗效分析

上述结果表明，本发明药物治疗慢性乙型病毒性肝炎，在抑制病毒复制、改善主要症状、肝功能复常率指标等方面显著优于对照组。临床试验二临床资料1、研究对象的选择标准慢性活动性、迁延性乙型肝炎(以下简称“慢活肝”，“慢迁肝”)的西医诊断标准按《中药新药临床研究指导原则(1993年第1辑)有关规定制定；中医辩证标准为神疲乏力、胁痛、低热、纳呆、口干、腰酸、头晕、耳鸣、目花、面色黯滞、苔黄或剥、舌质暗红或有淤斑，脉小弦或细弦，属气阴两虚、湿瘀阻络证。
2、一般资料按以上标准选择住院和门诊病例共400例。治疗组300例，其中住院患者258例，门诊患者42例，男性242例，女性58例，平均年龄38.6岁，平均病程2.8年，慢活肝197例，慢迁肝103例；对照组100例，其中住院患者81例，门诊患者19例，男性84例，女性16例，平均年龄38.5岁，平均病程2.9年，慢活肝75例，慢迁肝25例；两组以上各项目比较，经卡方检验结果显示差异无显著性统计学意义。
研究方法1、分组方法采用Casio(fx-3600p)计算器随机分组，分为治疗组、对照组；在1∶1对照试验中采用双盲法，2∶1对照试验中采用单盲法。
2、观察用药药物采用双模拟方法处理，使其安慰剂、观察药、对照药在外观上完全一致。观察药为本发明药物，对照药选用乙肝养血冲剂(卫药准字Z-60号)。
3、用药方法与用量治疗组给予本发明药物，口服，1日三次，每次12g，3个月为1疗程；并给予模拟对照药的安慰剂，口服，1日三次，每次12g。对照组给予乙肝养血冲剂，口服，1日三次，每次10g，3个月为1疗程；并给予观察药的安慰剂，口服，1日三次，每次12g。
4、观察项目(1)症状与体征采用评分的方法。
(2)一般体检项目与常规化验检查项目。
(3)血清SB、ALT、AST、总蛋白、A/G、血清HbsAg、抗-HBc、HbeAg、HBV-DNA等。
5、疗效标准依据《中药新药临床研究指导原则(1993年第1辑)有关内容规定制定。
结果与讨论研究结果显示，综合疗效治疗组基本治愈率为47.93％，有效率39.0％，总有效率为86.9％，明显优于对照组(P＜0.05)；主要中医证候疗效治疗组口干苦、腹胀、乏力、胁痛、纳差、头晕、耳鸣症状的改善优于对照组(P＜0.05)，而腰膝酸软、面色紫暗的改善与对照组比较无显著的统计学意义；肝功能改善ALT、AST、SB的治疗组与对照组治疗前后差值的组间比较有显著统计学意义(P＜0.05)；肝功能复常率治疗组ALT复常率为85.6％、AST复常率为82.1％，SB复常率为73.5％，优于对照组且有显著性差异(P＜0.05)；HBV-M治疗组HbeAg阴转率为44.9％，HBV-DNA阴转率为44.8％，与对照组比较均有显著性差异(P＜0.05)。本发明药物对慢性迁延性肝炎的疗效(90.6％)高于慢性活动性肝炎(80.6％)，有非常显著性差异(P＜0.01)。
研究结果表明，本发明药物对改善主要症状、肝功能复常、抑制病毒复制指标等方面均优于对照组。在观察过程中未发现慢性毒副作用。
权利要求
1.一种治疗乙型肝炎的药物，其特征在于它由按重量份计的以下组分制成蚂蚁150-450黄芪20-60参10-30枸杞子10-30黄精10-30丹参30-90白术10-30 地黄30-90赤芍10-30当归10-30 蒲公英30-90 虎杖15-45秦艽10-30 苍术10-30猪苓10-30陈皮10-30 山楂10-30六神曲10-30麦芽10-30 青皮10-30。
2.根据权利要求1的药物，其中各组分的重量配比为蚂蚁300黄芪40 人参20构杞子20 黄精20 丹参60白术20 地黄60 赤芍20当归20 蒲公英60 虎杖30秦艽20 苍术20 猪苓20陈皮20 山楂20 六神曲20麦芽20 青皮20
3.制备权利要求1的药物的方法，包括将所述原料粉碎成细粉，过筛，混匀，每1千克粉末加炼蜜250-300克与适量的水，制成水蜜丸，再干燥。
4.制备权利要求1的药物的方法，包括将人参粉碎成细粉，过筛；丹参用乙醇回流提取二次，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇，得到丹参提取液；白术、当归、苍术、陈皮、青皮提取挥发油，蒸馏后的水溶液另器收集；药渣与其余蚂蚁等十三味及上述乙醇提取后的丹参药渣，加水煎煮两次，滤过，合并滤液，滤液浓缩至适量，放置至室温，缓缓搅拌下加乙醇使含醇量达60％左右，静置，滤过，滤液回收乙醇；合并该滤液，丹参提取液及上述水溶液，减压浓缩成相对密度为1.35-1.40(50℃)的清膏，加入上述人参细粉混匀，低温干燥，粉碎，制成颗粒，干燥，加入上述挥发油，混匀，装入胶囊即得。
全文摘要
本发明涉及一种治疗乙型肝炎的药物,主要包括蚂蚁、黄芪、人参、枸杞子、黄精、丹参、白术、地黄、赤芍、当归、蒲公英、虎杖、秦艽、苍术、猪苓等原料。经临床试验证实,本发明药物的治愈率高达47.93－49.42%,总有效率为86.98%－88.80%。
文档编号A61P1/00GK1336233SQ0113095
公开日2002年2月20日 申请日期2001年8月28日 优先权日2001年8月28日
发明者王旭中 申请人:王旭中