专利名称：一种治疗乙肝的药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种治疗乙肝的药物，尤其是涉及以中草药为原料制备的治疗乙肝的中成药。
背景技术：
乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的、以肝脏炎性病变为主并可引起多器官损害的一种传染性疾病。据世界卫生组织(WHO)统计，全球乙型肝炎感染者约3.5亿。全球每年死于肝癌的人数达100万之多，而约有80％的肝癌患者与HBV有关，HBV携带者发生肝癌的危险性比非携带者高100倍。我国是乙型肝炎高流行区，50％～70％的人群受过HBV的感染，约8％～12％的人群为HBV的携带者，其中乙型肝炎患者有300万。因此，乙型肝炎是中国重大的公共卫生问题之一。
乙型肝炎的发病机理复杂，特别是慢性乙型肝炎，发病机制至今尚不十分清楚，尽管目前已有HBV疫苗以及干扰素等各种抗病毒药物，但其疗效均不理想。迄今为止，仍缺少非常有效的治疗药物及方法。因此，开发研制新的有效低毒抗HBV药物具有重要应用价值。祖国医学有其独特的辨证论治理论体系和丰富的临床经验，中医药治疗慢性乙型肝炎确有一定的疗效。相对其他药物，中药的不良反应较小，可长期服用，而且价格低廉。
顶头马兰系爵床科植物肖鸡笼Taraphochlamys affinis(Griff)Bremekhu(Strobilanthes affinis(griff)Y.C.Tang)的干燥地上部分。它与白花蛇舌草等中药组成复方六月青胶囊(LYQC)。本发明人长期大量的研究发现，LYQC能有效保护四氯化碳、对乙酰氨基酚、D-半乳糖胺所致小鼠急性化学性肝损伤；明显抑制体外血清中HBsAg、HBeAg；显著对抗体内及体外HBV，且毒性较低。实验结果表明，本发明有可能为急性和慢性病毒性乙型肝炎、肝纤维化、乙型肝炎病毒携带者提供新的疗效较好的药物。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种新的有效治疗乙肝的中草药的组合物，解决乙肝治疗效果差的问题。发明人在多年大量实验研究的基础上经反复实践，得到本组合物。
本发明采取的技术方案 本组合物以如下重量配比的原料制成顶头马兰15g、白花蛇舌草15g、栀子花根15g、半枝莲15g、天胡荽15g、垂盆草15g。
一、复方六月青胶囊制备 取白花蛇舌草、栀子花根分别粉碎成粗粉，按生药材6倍量加入80％的乙醇，充分湿润，浸渍48小时，浸渍液另器收集，静置12小时，滤过，得浸渍液；药渣与顶头马兰、半枝莲、天胡荽、垂盆草四味药加水煎煮2次，每次2小时，第一次加水10倍量，第二次加水8倍量，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.10～1.15(60℃)，放冷至室温，加乙醇使含醇量达70％，静置24小时以上，取上清液，与上述浸渍液合并，减压回收乙醇至无醇味，并继续浓缩至相对密度1.25～1.30(60℃)的稠膏，稠膏(加适量的淀粉置于托盘底部)，干燥，粉碎，加淀粉适量、1％的药用滑石粉和1％的硬脂酸镁混合均匀，充填胶囊，分装，即得。
二、药效学研究 1、观察对化学性肝损伤的保护作用及其机制的研究。
2、观察对实验性病毒性肝炎的治疗作用。
3、体外抗病毒作用。
4、对免疫功能的影响。
5、抗肝炎和肝纤维化的研究(1)对四氯化碳(CCl4)致大鼠肝纤维化的保护作用；(2)体外对氧自由基的清除作用；(3)对大鼠原代肝细胞损伤的保护作用；(4)对静止期肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)的影响。
本发明人长期大量的研究发现，LYQC能有效保护四氯化碳、对乙酰氨基酚、D-半乳糖胺所致小鼠急性化学性肝损伤；明显抑制体外血清中HBsAg、HBeAg；显著抑制体内及体外HBV，且毒性较低。研究表明，本发明能为急性和慢性病毒性乙型肝炎、肝纤维化、乙型肝炎病毒携带者提供新的疗效较好的药物。
本发明是对广西民族特色天然药物资源进行挖掘整理，将为中草药的深度开发提供新思路，对促进我国中草药产业现代化具有重大意义。为急性和慢性病毒性乙型肝炎、肝纤维化、乙型肝炎病毒携带者的治疗提供一种新的天然药物制剂。
具体实施例方式 一、复方六月青胶囊颗粒制备 取白花蛇舌草15g、栀子花根15g，分别粉碎成粗粉，按生药材6倍量加入80％的乙醇180ml，充分湿润，浸渍48小时，浸渍液另器收集，静置12小时，滤过，得浸渍液；药渣与顶头马兰15g、半枝莲15g、天胡荽15g、垂盆草15g加水煎煮2次，每次2小时，第一次加水10倍量900ml，第二次加水8倍量720ml，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.10～1.15/60℃，放冷至室温，加乙醇使含醇量达70％，静置24小时以上，取上清液，与上述浸渍液合并，减压回收乙醇至无醇味，并继续浓缩至相对密度1.25～1.30/60℃的稠膏。
稠膏，干燥，粉碎，得干膏7.9g，加0.04g淀粉、0.08g药用滑石粉、0.08g硬脂酸镁混合均匀，充填1#空心胶囊，每粒装0.45g，分装，即得。
二、药效学研究 1、复方六月青胶囊对急、慢性化学性肝损伤的保护作用 (1)复方六月青胶囊对小鼠CCl4、AP、D-Gal急性肝损伤的保护作用 采用小鼠CCl4、AP、D-Gal急性肝损伤为动物模型，联苯双酯为阳性对照药。结果显示，复方六月青胶囊能明显地降低ALT和AST活性，升高肝脏Cyt.P450及Cyt.b5的含量，减轻肝脏急性病理性损伤程度。实验结果还显示复方六月青胶囊低、中、高三种剂量与药理效应之间有着一定的量效关系。结果见表1～3。
表1 LYQC对CCL4急性肝损伤ALT、AST和肝药酶的影响(
n＝10) 注与CCL4组比较*P＜0.05，**P＜0.01 表2 LYQC对AP急性肝损伤ALT、AST和肝药酶的影响(
n＝10) 注与AP组比较*P＜0.05，**P＜0.01 表3 LYQC对D-Gal急性肝损伤ALT、AST和肝药酶的影响(
n＝10) 注与D-Gal组比较*P＜0.05，**P＜0.01 (4)复方六月青胶囊体外对HBsAg、HBeAg的抑制作用 测定复方六月青胶囊在不同浓度、不同的时间分别与HBsAg或HBeAg阳性血清孵育，用ELISA法测定HBsAg或HBeAg的滴度，结果显示12mg/ml以上浓度的复方六月青胶囊均对HBsAg或HBeAg具有显著的抑制作用；6mg/ml以上浓度分别在8h、16h后对HBsAg具有显著的抑制作用，在4h、8h、16h对HBeAg具有显著的抑制作用。结果见表4～5。
表4 LYQC在体外对HBsAg的抑制作用(
n＝10) 注与阳性血清组比较*P＜0.05，**P＜0.01 表5 LYQC在体外对HBeAg的抑制作用(
n＝10) 注与阳性血清组比较*P＜0.05，**P＜0.01 2、复方六月青胶囊体内抗鸭乙型肝炎病毒的作用 采用1日龄广西麻鸭感染DHBV，13天后用PCR法筛选出DHBV强阳性鸭。随机分成5组复方六月青胶囊高、中、低3个剂量组、以生理盐水灌胃的模型组和以阿昔洛韦(ACV)灌胃的阳性对照组。每组10只，各组雏鸭均灌胃14天。于用药前(T0)、用药7天(T7)、14天(T14)及停药后3天(P3)分别采血，采用FQ-PCR法检测血清DHBV DNA的含量，用ELISA法测定血清HBsAg或HBeAg的滴度，同时检测血清的转氨酶(ALT，AST)及肝组织病理变化。
实验结果表明与模型组比较，阳性对照组与复方六月青胶囊高、中剂量组用药2W(T14)后，均可使麻鸭血清DHBV DNA拷贝数显著降低(P＜0.01)，抑制作用有明显的量效和时效反应关系；停药3d(P3)后，复方六月青胶囊低剂量组和阳性对照组血清DHBV DNA有反跳现象，而复方六月青胶囊中、高剂量组血清DHBV DNA没有反跳现象。复方六月青胶囊体内抗DHBV DNA的作用强于阳性对照药物ACV，其中复方六月青胶囊高剂量组抑制效果最佳。说明复方六月青胶囊抑制DHBV DNA的作用与其剂量大小和作用时间有一定的关系。用药前后血清ALT，AST和血清DHBsAg，DHBeAg的OD值变化与DNA滴度改变相似；其抗病毒效果与剂量大小和时间有一定的关系。此外，鸭肝脏病理学检查发现复方六月青胶囊对DHBV引起肝损伤有显著的保护作用。
实验结果提示复方六月青胶囊体内有显著的抗HBV的作用。结果见表6～10。
表6治疗前后鸭血清DHBV DNA水平比较(
n＝10 Copy/ml) 注与模型组比较，*P＜0.05；**P＜0.01 表7 LYQC对鸭血清DHBsAg表达的抑制作用(
n＝10 OD) 注与模型组比较，*P＜0.05；**P＜0.01 表8 LYQC对鸭血清DHBeAg表达的抑制作用(
n＝10 OD) 注与模型组比较，*P＜0.05；**P＜0.01 表9 LYQC对鸭血清谷丙转氨酶(ALT)的影响(
n＝10 U/L) 注与模型组比较，*P＜0.05；**P＜0.01 表10 LYQC对鸭血清谷草转氨酶(AST)的影响(
n＝10 U/L) 注与模型组比较，*P＜0.05；**P＜0.01 3、复方六月青胶囊体外抗乙型肝炎病毒(HBV)的作用 采用MIT法检测复方六月青胶囊对HBV基因转染的HepG2.2.15细胞的半数毒性浓度(TC50)；采用直接加药法和血清药理学法进行实验，在最大无毒浓度(TC0)和10％含药血清基础上观察不同浓度药物作用于HepG2.2.15细胞后，分别在第72h和144h收集细胞培养上清液，采用FQ-PCR法检测上清液HBV DNA的含量，ELISA法测定上清液HBsAg，HBeAg的滴度。
实验结果表明①复方六月青胶囊对HepG2.2.15细胞毒性较低，TC50为3.070mg/ml，TC0为0.945mg/ml；②与空白对照组相比较，阳性对照药物3TC和复方六月青胶囊在最大无毒浓度下作用72h和144h后，对HepG2.2.15细胞HBV DNA具有显著的抑制作用，均可使HepG2.2.15细胞上清液中HBV DNA的拷贝数降低(P＜0.05，P＜0.01)，且随着药物浓度和作用时间的增加，其抑制作用逐渐增强，呈现一个明显的量效和时效反应关系。其中复方六月青胶囊在0.8mg/ml时抑制率最高，分别为74.7％，74.9％；③与空白对照组相比较，阳性对照药物ACV和复方六月青胶囊含药血清作用72h，144h后，均可使HepG2.2.15细胞上清液中HBV DNA的拷贝数降低(P＜0.05、P＜0.01)，对HBV DNA有着很明显的抑制作用。且随着药物浓度和作用时间的增加，其抑制作用逐渐增强，呈现一个明显的量效和时效反应关系。复方六月青胶囊含药血清体外抗HBV DNA的作用强于阳性对照药物ACV，其中复方六月青胶囊高剂量组抑制效果最佳(P＜0.01)；④与空白对照组相比较，阳性对照药物3TC和复方六月青胶囊在最大无毒浓度下作用72h，144h后，对HepG2.2.15细胞HBsAg的分泌具有显著的抑制作用，均可使HepG2.2.15细胞上清液中HBsAg的拷贝数降低(P＜0.05，P＜0.01)，且随着药物浓度和作用时间的增加，其抑制作用逐渐增强，呈现一个明显的量效和时效反应关系。其中复方六月青胶囊在0.8mg/ml时抑制率最高，分别为50.1％，55.3％；⑤与空白对照组相比较，阳性对照药物ACV和复方六月青胶囊含药血清作用72h，144h后，均可抑制HepG2.2.15细胞上清液中HBsAg的分泌(P＜0.05、P＜0.01)。且随着药物浓度和作用时间的增加，其抑制作用逐渐增强，呈现一个明显的量效和时效反应关系。复方六月青胶囊含药血清体外抑制HBsAg分泌的作用强于阳性对照药物ACV，其中复方六月青胶囊高剂量组抑制率最高，分别达到44.6％和49.1％；⑥TI均大于2，为高效低毒的抗HBV药物。
实验结果提示复方六月青胶囊在体外具有直接抗HBV作用，为高效低毒的抗HBV药物。结果见表11～16。
表11 LYQC对HepG2.2.15细胞的细胞毒作用(
n＝6) 表12 药物作用后细胞上清中HBV DNA含量(
n＝3) 注与空白组比较，*P＜0.05；**P＜0.01 表13 含药血清作用后细胞上清中HBV DNA含量(
n＝3) 注与空白组比较，*P＜0.05；**P＜0.01 表14 LYQC对HepG2.2.15细胞系HBsAg，HBeAg表达的抑制作用(
n＝3) 注与空白组比较，*P＜0.05；**P＜0.01 表15含药血清对细胞上清中的HBsAg，HBeAg表达的抑制作用(
n＝3) 注与空白组比较，*P＜0.05；**P＜0.01 表16 LYQC在HepG2.2.15细胞培养中对HBsAg，HBeAg的IC50及TI 5、抗肝炎和肝纤维化的研究 5.1 CCl4慢性肝损伤实验 除正常对照组外，各给药组每周2次皮下注射8％CCl4油溶液5ml·kg-1，以诱导慢性肝损伤；给予正常饮食。8周后空腹取血进行生化测定，并取部分肝脏用生理盐水制成10％肝匀浆测HYP、MDA、GSH含量，取部分肝脏用10％甲醛固定作病理检查。实验结果(1)造模各组给予CCl4后血清ALT、AST均显著升高(P＜0.01或P＜0.05)，血清TP、ALB则显著降低，给予复方六月青胶囊后均能使ALT、AST显著下降，对TP、ALB降低则无影响。(2)模型组大鼠肝组织Hyp含量显著升高，而各治疗组Hyp含量明显低于模型组(P＜0.01或P＜0.05)。(3)模型组大鼠肝组织MDA含量显著升高，GSH含量显著降低，而各治疗组MDA含量明显低于模型组(P＜0.01或P＜0.05)，各治疗组GSH含量与模型组相比无明显差异。(4)HE染色标本观察，复方六月青胶囊组大鼠肝小叶结构清晰完整，肝细胞呈多面体形，肝板条索状以肝小叶中央静脉为中心向周围呈放射状排列，未见纤维组织异常增生。
5.2对CCl4诱导大鼠原代肝细胞损伤的保护作用 5.2.1大鼠原代肝细胞的分离及原代培养 大鼠用20％乌拉坦腹腔麻醉后，固定四肢，腹部消毒后，无菌操作下，打开腹腔，将肠管推向左侧，暴露门静脉和下腔静脉，小心分离穿线各一根，门静脉穿刺静脉留置针，退出针芯，结扎牢固。将留置管连接输液管，开启电子蠕动泵，灌流37℃预热D-Hank’s液，流速15ml·min-1，迅速剪开下腔静脉放血。同时打开胸腔暴露并结扎上腔静脉。灌流约10min后，肝脏颜色呈黄白色。下腔静脉插入硅胶管，结扎牢固。改用含0.05％IV型胶原酶的Hanks液(37℃预热)15ml·min-1，约15min后，肝脏软化，压之凹陷不易恢复，迅速取下完整肝脏，连同含胶原酶灌流液置于平皿中，剔除肝包膜，轻柔摆动肝组织，让细胞慢慢游离出来，200目筛过滤得细胞悬液。600r·min-1离心，弃上清，沉淀加1640培养液吹打混匀，800r·min-1离心，共洗涤两次。用血球计数板(台盼蓝拒染法)测定细胞活率及细胞密度。用1640培养液调整细胞密度为5×105·ml-1，肝细胞活力大于90％。将上述肝细胞悬液加入96孔和24孔培养板中，置37℃，5％CO2培养箱中培养12h后，肝细胞贴壁生长，供试验用。
5.2.2对CCl4诱导肝细胞损伤的作用 精密吸取CCl4100μl，于10ml容量瓶中以DMSO助溶，DMSO终浓度为0.1％(体积分数)，1640全培养液定容，配制出终浓度为1％(体积分数)CCl4储备液。
维生素E作阳性对照，用少量DMSO溶解，加入到培养液后其终浓度为50μmol·ml-1。
取上述贴壁生长的肝细胞，设CCl4模型组、复方六月青胶囊组和空白对照组、维生素E组，每组至少设6个复孔。分别加入CCl4、不同浓度的复方六月青胶囊、维生素E和溶媒，继续培养24h后，收集培养上清检测AST、ALT活性；弃肝细胞培养上清，加入0.2mlTriton-100水溶液0.5ml，混匀，2500r·min-1离心10min，取上清测定肝细胞MDA和GSH含量，同时用MTT比色法，测定肝细胞的活率。
5.2.3实验结果 (1)对CCl4损伤肝细胞ALT和AST活性的影响CCl4损伤肝细胞后，促进肝细胞内酶的释放，模型组的ALT、AST水平较正常组明显升高，复方六月青胶囊能显著抑制CCl4损伤肝细胞后ALT、AST水平的上升，并呈明显的剂量依赖性。
(2)对CCl4损伤肝细胞MDA、GSH的影响CCl4损伤肝细胞后，肝细胞中的MDA明显升高，GSH则显著降低，复方六月青胶囊能显著提高CCl4损伤肝细胞中的GSH含量，和降低CCl4损伤肝细胞中的MDA含量，并呈明显的剂量依赖性。
(3)对CCl4损伤肝细胞活性的影响MTT法测定结果表明，CCl4损伤后模型组细胞活性明显下降，复方六月青胶囊能显著恢复和升高CCl4损伤肝细胞后的细胞活性，并呈明显的剂量依赖性。
实施例 取白花蛇舌草15kg、栀子花根15kg，分别粉碎成粗粉，按生药材6倍量加入80％的乙醇180升，充分湿润，浸渍48小时，浸渍液另器收集，静置12小时，滤过，得浸渍液；药渣与顶头马兰15kg、半枝莲15kg、天胡荽15kg、垂盆草15kg加水煎煮2次，每次2小时，第一次加水10倍量900升，第二次加水8倍量720升，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.10～1.15(60℃)，放冷至室温，加乙醇使含醇量达70％，静置24小时以上，取上清液，与上述浸渍液合并，减压回收乙醇至无醇味，并继续浓缩至相对密度1.25～1.30(60℃)的稠膏11.7kg。
稠膏，干燥，粉碎，得干膏7.9kg，加40g淀粉、80g药用滑石粉、80g硬脂酸镁混合均匀，充填1#空心胶囊，每粒装0.45g，分装，每瓶装54粒，即得。
临床应用适宜于急性和慢性病毒性乙型肝炎；肝纤维化；乙型肝炎病毒携带者。
服用方法每次6粒，一天3次。
权利要求
1.一种治疗乙肝的药物复方六月青胶囊，其特征在于以如下重量配比的中药制成顶头马兰15g、白花蛇舌草15g、栀子花根15g、半枝莲15g、天胡荽15g、垂盆草15g。
2.根据权利要求1所述的复方六月青胶囊，其特征在于复方六月青胶囊组合物用于治疗急性和慢性病毒性乙型肝炎、肝纤维化、乙型肝炎病毒携带者。
3.根据权利要求1所述的复方六月青胶囊，其胶囊制备方法为
取白花蛇舌草、栀子花根，分别粉碎成粗粉，按生药材6倍量加入80％的乙醇，充分湿润，浸渍48小时，浸渍液另器收集，静置12小时，滤过，得浸渍液；药渣与顶头马兰、半枝莲、天胡荽、垂盆草加水煎煮2次，每次2小时，第一次加水10倍量，第二次加水8倍量，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.10～1.15/60℃，放冷至室温，加乙醇使含醇量达70％，静置24小时以上，取上清液，与上述浸渍液合并，减压回收乙醇至无醇味，并继续浓缩至相对密度1.25～1.30/60℃的稠膏；
稠膏，干燥，粉碎，得干膏，加淀粉适量、1％的药用滑石粉、1％的硬脂酸镁混合均匀，充填胶囊，即得。
全文摘要
本发明以顶头马兰15g、白花蛇舌草15g、栀子花根15g、半枝莲15g、天胡荽15g、垂盆草15g组成复方六月青胶囊(LYQC)，旨在提供一种新的有效治疗乙肝的中草药组合物，解决乙肝治疗效果差的问题。经长期大量的研究发现，LYQC能有效保护四氯化碳、对乙酰氨基酚、D-半乳糖胺所致小鼠急性化学性肝损伤；明显抑制体外血清中HBsAg、HBeAg；显著抑制体内及体外HBV，且毒性较低。研究表明，本发明能为急性和慢性病毒性乙型肝炎、肝纤维化、乙型肝炎病毒携带者提供新的疗效较好的药物。
文档编号A61K36/185GK101199630SQ20071005036
公开日2008年6月18日 申请日期2007年10月22日 优先权日2007年10月22日
发明者黄仁彬, 蒋伟哲, 张士军, 江 李, 兴 林, 曦 刘, 黄权芳, 荣延平, 黄建春, 懿 孙, 谭宏棣, 军 林 申请人:黄仁彬