专利名称：谷胱甘肽增强用组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有促进谷胱甘肽细胞内合成的成分的组合物。同时，本发明涉及谷胱甘肽增强用；促进-谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽还原酶、胱氨酸膜输送载体载体的产生用；抗紫外线用和/或美白用；因促进谷胱甘肽细胞内合成而防御、修复细胞损伤损伤用；肝脏、肾脏、肺机能改善或治疗用；用于过氧化脂质蓄积引起的疾患；白内障用；预防和/或治疗老化用的各种组合物，另外还涉及含有促进谷胱甘肽细胞内合成成分的药物、皮肤外用剂、营养辅助食品、功能性食品、健康食品、特定保健用食品、美容食品等食品。
背景技术：
谷胱甘肽是广泛分布于生物体内的抗氧化剂，是由半胱氨酸、谷氨酸及甘氨酸组成的三肽。作为生物体内主要的还原剂，以巯基(SH)为作用部位，在与各种氧化还原代谢相关的细胞防御、异物代谢、及修复等过程中担负着重要作用。谷胱甘肽作为谷胱甘肽过氧化酶的基质，使生物体内产生的过氧化氢或过氧化脂质等过氧化物无毒化，而自身则被氧化，以此发挥着生物体免受氧化损伤损伤(例如上述过氧化物或自由基等)的作用。
在氧化促进物和抗氧化能机制的平衡中，当前者处于优势时产生氧化应激状态。于是当氧化应激状态或异物过剩出现时，生物体内的谷胱甘肽消耗枯竭，正常的细胞功能便不能维持。由于细胞内谷胱甘肽浓度的低下而引起的疾病有紫外线暴晒引起的细胞的损伤、炎症、黑色化、褐斑、雀斑的形成、急性或慢性酒精性肝功障碍、肝脏病、慢性肾功能不全、吸烟等引起的肺疾患、特发性肺纤维症、白内障、缺血性心疾患、帕金森氏病、阿尔查默病、胃溃疡、成人呼吸器官障碍症候群、免疫功能不全、骨髓形成不全、后天性免疫功能不全症候群、潜伏性病毒感染症、以及伴随生理年龄增加的老化现象、癌症等。
对于上述列举的细胞内谷胱甘肽浓度低下引起的疾病的治疗一般应用谷胱甘肽制剂。但是经口服用谷胱甘肽，由于无法达到预期的作用于脏器的效果。利用注射剂治疗要比口服效果好，但是又有伴随疼痛、必须门诊治疗等一些问题。由于细胞内谷胱甘肽的量与细胞内存在的半胱氨酸量有依存关系，近年公开了一些能增加细胞内半胱氨酸量的含硫化合物(特开平01-26516号公报、特开平02-45420号公报、特开平05-301811号公报、特开平08-319242号公报)。例如N-乙酰半胱氨酸、L-2-氧代四氢噻唑-2-羧酸、谷胱甘肽酯等。但是、这些化合物也不能达到十分满意的作用于脏器的效果。
已知使谷氨酸和半胱氨酸缩合的酶、-谷氨酰半胱氨酸合成酶的表达量及活性是另一个决定细胞内谷胱甘肽量的主要因素。该酶的活性和表达量受到如热休克、溃疡坏死因子(TNF-)、淋巴可溶物质1类细胞因子、胰岛素或糖皮质激素类激素、重金属、与细胞增殖或细胞周期相关的因子等各种主要因素的调节。另外，该酶的基因5’末端区域存在抗氧化剂应答序列(antioxidant response elements)，具有对于抗氧化物质应答的序列。详细的原理还未完全明了，但有文献报道把作为食品抗氧化剂应用的丁基羟基茴香醚给小鼠服用，可以使谷胱甘肽浓度上升并能预防光气诱导的肺浮肿(Inhal.Toxical.1999，11(9)，855-871页)。但是历来所知的维生素C、甘露醇、氨基酸(组氨酸等)等抗氧化剂或橄榄提取物(特开2000-128765、特开2001-181632、特开2001-26518)、橄榄提取物的水解物(特开平09-78061号公报)等抗氧化剂具有谷胱甘肽增强作用并没有报道，另外根据这一作用机理用其预防和治疗上面列举的疾病也没有具体的报道。
发明内容
为了使低下的谷胱甘肽浓度得以恢复，历来的技术是使用用于向细胞内供给半光氨酸的含硫化合物，但这一技术对于谷胱甘肽浓度未出现低下的细胞，含硫化合物却不能进入，就不能促进有效的谷胱甘肽的生成。因此，对于紫外线暴晒、吸烟、酒精类饮食等预计消耗谷胱甘肽的情况下的身体障碍的预防、通过使谷胱甘肽浓度高于正常水平以对疾病进行治疗时就不能得到十分满意的效果。
本发明的目的是提供一种谷胱甘肽增强用组合物，所述谷胱甘肽增强用组合物可以提高生物体内的谷胱甘肽浓度，对谷胱甘肽缺乏引起的各种脏器机能低下或种种障碍、疾患的预防和治疗，通过提高谷胱甘肽浓度高于正常水平而能够有效治疗，并且其安全性高。
本发明人等为了解决上述课题而锐意研究的结果发现2-(3，4-二羟基苯基)乙醇(以下称DPE)具有促进谷胱甘肽细胞内合成的作用，以这一知识为基础完成了本发明。
即本发明涉及如下组合物1.一种谷胱甘肽增强用组合物，至少含有从2-(3，4-二羟基苯基)乙醇或其配糖体、含有2-(3，4-二羟基苯基)乙醇或其配糖体的植物、该植物提取物、该植物的水解物、或该植物提取物的水解物(但橄榄及其提取物除外)中选择的一种。
2.一种组合物，至少含有从2-(3，4-二羟基苯基)乙醇或其配糖体、含有2-(3，4-二羟基苯基)乙醇或其配糖体的植物、该植物提取物、该植物的水解物、或该植物提取物的水解物(但橄榄及其提取物除外)中选择的一种并至少用于-谷氨酰半胱氨酸合成酶产生促进用、谷胱甘肽还原酶产生促进用、及胱氨酸膜输送载体产生促进用中的一种用途。
3.一种抗紫外线用和/或美白用组合物，至少含有作为谷胱甘肽增强成分的2-(3，4-二羟基苯基)乙醇或其配糖体中的一种。
4.一种抗紫外线用和/或美白用组合物，至少含有从2-(3，4-二羟基苯基)乙醇或其配糖体、含有2-(3，4-二羟基苯基)乙醇或其配糖体的植物、该植物提取物、该植物的水解物、或该植物提取物的水解物(但橄榄及其提取物除外)中选择的一种。
5.一种谷胱甘肽缺乏引起的疾患的预防用和/或治疗用组合物，至少含有从2-(3，4-二羟基苯基)乙醇或其配糖体、含有2-(3，4-二羟基苯基)乙醇或其配糖体的植物、该植物提取物、该植物的水解物、或该植物提取物的水解物(但橄榄及其提取物除外)中选择的一种。
6.一种氧化应激状态引起的疾患的预防用和/或治疗用组合物，至少含有从2-(3，4-二羟基苯基)乙醇或其配糖体、含有2-(3，4-二羟基苯基)乙醇或其配糖体的植物、该植物提取物、该植物的水解物、或该植物提取物的水解物(但橄榄及其提取物除外)中选择的一种。
7.一种通过促进谷胱甘肽细胞内合成的细胞损伤防御用和/或细胞损伤修复用组合物，至少含有从2-(3，4-二羟基苯基)乙醇或其配糖体、含有2-(3，4-二羟基苯基)乙醇或其配糖体的植物、该植物提取物、该植物的水解物、或该植物提取物的水解物(但橄榄及其提取物除外)中选择的一种。
8.一种肝脏机能改善用或肝脏疾患预防用和/或治疗用组合物，至少含有从2-(3，4-二羟基苯基)乙醇或其配糖体、含有2-(3，4-二羟基苯基)乙醇或其配糖体的植物、该植物提取物、该植物的水解物、或该植物提取物的水解物(但橄榄及其提取物除外)中选择的一种。
9.一种肾脏机能改善用或肾脏疾患预防用和/或治疗用组合物，至少含有从2-(3，4-二羟基苯基)乙醇或其配糖体、含有2-(3，4-二羟基苯基)乙醇或其配糖体的植物、该植物提取物、该植物的水解物、或该植物提取物的水解物(但橄榄及其提取物除外)中选择的一种。
10.一种过氧化脂质等过氧化物或自由基引起的疾患的预防用和/或治疗用组合物，至少含有从2-(3，4-二羟基苯基)乙醇或其配糖体、含有2-(3，4-二羟基苯基)乙醇或其配糖体的植物、该植物提取物、该植物的水解物、或该植物提取物的水解物(但橄榄及其提取物除外)中选择的一种。
11.一种肺机能改善用或肺疾患预防用和/或治疗用组合物，至少含有从2-(3，4-二羟基苯基)乙醇或其配糖体、含有2-(3，4-二羟基苯基)乙醇或其配糖体的植物、该植物提取物、该植物的水解物、或该植物提取物的水解物(但橄榄及其提取物除外)中选择的一种。
12.一种白内障的预防用和/或治疗用组合物，至少含有从2-(3，4-二羟基苯基)乙醇或其配糖体、含有2-(3，4-二羟基苯基)乙醇或其配糖体的植物、该植物提取物、该植物的水解物、或该植物提取物的水解物(但橄榄及其提取物除外)中选择的一种。
13.一种老化的预防用和/或治疗用组合物，至少含有从2-(3，4-二羟基苯基)乙醇或其配糖体、含有2-(3，4-二羟基苯基)乙醇或其配糖体的植物、该植物提取物、该植物的水解物、或该植物提取物的水解物(但橄榄及其提取物除外)中选择的一种。
14.根据上述1、2、4～13中任一项所述的组合物，其中含有2-(3，4-二羟基苯基)乙醇或其配糖体的植物至少是橄榄(Olea europaea)、野芝麻(Lamium album)、Euphrasia officinalis、桃(Prunus persica)、罗汉果(Momordica grosvenorii)、地黄(Rehmannia glutinosa)、Plantagopsyllium、车前(Plantago asiatica)、Echinaces angustifolia、樱花(Prunusspp)、Plantago ovata、郁李(Prunus japonica Thunb)、苦苣苔(Conandronramondioides Siebold et Zucc)、梅(Prunus mume)、杏(Prunusarmeniaca)、金木犀(Osmanthus fragrans)、小球藻(Chlorella vulgaris)、野鸡冠花(Celosia argentea L.)、天明精(Carpesium abrotanoides)、米楮(Ballota nigra)、草苁蓉(Boschniakia rossica)、大叶醉鱼草(Buddlejadavidii)、Castanopsis cuspidata var.sieboldii、肉苁蓉(Cistanche salsa)、蛇苔(Conocephalum conicum)、Digitails lanata、黄花毛地黄(Digitalislutea)、毛地黄(Digitalis purpurea)、Digitalis sp、连翘(Forsythiasuspensa)、金钟花(Forsythia viridissima)、秦皮(Fraxinus japonica)、花白蜡树(Fraxinus ornus)、里白(Gleichenia glauca)、羊膜草(Hemiphragma heterophyllum)、毛茉莉(Jasminum multiforum)、马缨丹(Lantana camara)、天人草(Leucosceptrum japonicum)、日本毛女贞(Ligustrum japonicum)、女贞(Ligustrum obtusifolium)、吊石苣苔(Lysionotus pauciflorus)、日本厚朴树(Magnolia obovata)、夜花(Nyctanthes arbor-tristis)、银木犀(Osmanthus asiaticus)、Penstemonprocerus、松蒿(Phtheirospermum japonicum)、大车前(Plantago major)、灰叶稠李(Prunus grayana)、里白栎(Quercus stenophylla)、Ramondamyconi、甘露子(Stachys sieboldii)、暴马丁香(Syringa reticulata)、丁香花(Syringa vulgaris)、茉莉(Jasminum sambac、Jasminum offinale)、女贞子(Ligustrum lucidum)、马鞭草(Verbena officinalis L.)、苦瓜(Momordica charantia L.)、阿拉伯婆婆纳(Veronica persica)中的一种。
15.根据上述1～14中任一项所述的组合物，其中所述组合物至少含有作为半胱氨酸供给源的含硫化合物、含有半胱氨酸和/或胱氨酸的蛋白质、含有半胱氨酸及/或胱氨酸的酵母、以及维生素中的一种。
16.根据上述1～15中任一项所述的组合物，其中，所述组合物是经口用或非经口用。
17.根据上述1～15中任一项所述的组合物，其中，所述组合物是皮肤外用。
18.根据上述1～17中任一项所述的组合物，其中，所述组合物是药物。
19.根据上述1～15中任一项所述的组合物，其中，所述组合物是食品。
20.根据上述19中所述的食品，其中，所述食品是营养辅助食品、功能性食品、健康食品、特定保健食品或美容食品。
以下详细说明本发明本发明中发现的有效成分2-(3，4-二羟基苯基)乙醇如下面化学式(1)所示。
作为配糖体可以列举出与单糖类、二糖类、三糖类等的配糖体，构成这种配糖体的糖可列举出阿洛糖、半乳糖、葡萄糖等。
具体可列举出2-(3，4-二羟基苯基)乙醇-1-O- -D-阿洛糖苷、2-(3，4-二羟基苯基)乙醇-3’-O- -D-半乳糖苷、2-(3，4-二羟基苯基)乙醇-1-O- -D-葡萄糖苷(参照下面化学式(2))、2-(3，4-二羟基苯基)乙醇-3’-O- -D-葡萄糖苷(参照下面化学式(3))、2-(3，4-二羟基苯基)乙醇-4’-O- -D-葡萄糖苷(参照下面化学式(4))等。
作为由天然物中得到2-(3，4-二羟基苯基)乙醇的方法，如由橄榄中(Olea europaea)提取。作为含有DPE或其配糖体的植物可列举出野芝麻(Lamium album)、Euphrasia officinalis、桃(Prunus persica)、罗汉果(Momordica grosvenorii)、地黄(Rehmannia glutinosa)、Plantago psyllium、车前(Plantago asiatica)、Echinaces angustifolia、樱花(Prunus spp)、Plantagoovata、郁李(Prunus japonica Thunb)、苦苣苔(Conandron ramondioidesSiebold et Zucc)、梅(Prunus mume)、杏(Prunus armeniaca)、金木犀(Osmanthus fragrans)、小球藻(Chlorella vulgaris)、野鸡冠花(Celosiaargentea L.)、天明精(Carpesium abrotanoides)、米楮(Ballota nigra)、草苁蓉(Boschniakia rossica)、大叶醉鱼草(Buddleja davidii)、Castanopsiscuspidata var.sieboldii、肉苁蓉(Cistanche salsa)、蛇苔(Conocephalumconicum)、Digitails lanata、黄花毛地黄(Digitalis lutea)、毛地黄(Digitalispurpurea)、Digitalis sp、连翘(Forsythia suspensa)、金钟花(Forsythiaviridissima)、秦皮(Fraxinus japonica)、花白蜡树(Fraxinus ornus)、里白(Gleichenia glauca)、羊膜草(Hemiphragma heterophyllum)、毛茉莉(Jasminum multiforum)、马缨丹(Lantana camara)、天人草(Leucosceptrumjaponicum)、日本毛女贞(Ligustrum japonicum)、女贞(Ligustrumobtusifolium)、吊石苣苔(Lysionotus pauciflorus)、日本厚朴树(Magnoliaobovata)、夜花(Nyctanthes arbor-tristis)、银木犀(Osmanthus asiaticus)、Penstemon procerus、松蒿(Phtheirospermum japonicum)、大车前(Plantagomajor)、灰叶稠李(Prunus grayana)、里白栎(Quercus stenophylla)、Ramondamyconi、甘露子(Stachys sieboldii)、暴马丁香(Syringa reticulata)、丁香花(Syringa vulgaris)、茉莉(Jasminum sambac、Jasminum offinale)、女贞子(Ligustrum lucidum)、马鞭草(Verbena officinalis L.)、苦瓜(Momordicacharantia L.)、阿拉伯婆婆纳(Veronica persica)等。
另外含有DPE或其配糖体的植物可列举出属于如下科的植物。
玄参科巾着草属Calceolaria hypericina、Calceolaria sp、茶茱萸科茶茱萸属Cassinopsis sinensis、Cassinopsis madagascariensis、Cassinopsis sp、肉苁蓉属列当科肉苁蓉(Cistanche salsa)、马鞭草科大青属Clerodendrumjohnstonii、Clerodendrum myricoides、玄参科毛地黄属Digitalis ferrugineassp、Digtalis grandiflora、Digtalis grandiflora ssp.ferruginea、木犀科白蜡树属Fraxinus angustifolia、苦枥木(Fraxinus insularis)、尖果白蜡树(Fraxinusoxycarba)、木犀科茉莉属Jasminum amplexicaule、多花素馨(Jasminumpolyanthum)、兔耳草科兔耳草属Lagotis stolonifera、唇形科益母草属灰白益母草(Leonurus glaucens)、木犀科女贞属Ligustrum pedunculare、Ligustrum purpurascens、Ligustrum spp、苦苣苔科吊石苣苔属吊石苣苔(Lysionotus paucidlorus)、唇形科欧夏至草属Marrubium allysson、葫芦科苦瓜属Momordica balsamina、列当科列当属Orobanche arenaria、玄参科马先蒿属皱褶马先蒿(Pedicularis plicata)、半扭卷马先蒿(Pedicularissemitorta)、穗花马先蒿(Pedicularis spicata)、红斑马先蒿(Pedicularisstriata)、Pedicularis striata pall ssp.Arachnoidea。
玄参科钓钟柳属Penstemon crandallii、唇形科糙苏属Phlomis linearis、车前科车前属Plantago crassifolia、Plantago hostifolia、Plantago myosuros、Plantago sp、马鞭草科豆腐柴属Premna corymbosa var.obtusifolia、攀援臭黄荆(Premna subscandens)、唇形科Prostanthera melissifolia、玄参科玄参属Scrophularia nodosa、Scrophularia scopolii、唇形科水苏属Stachyslavandulifolia、Stachys officinalis、木犀科丁香属Syringa sp、唇形科香科科属Teucrium chamaedrys、Teucrium polium、玄参科毛蕊花属Verbascumspinosum、玄参科婆婆纳属Veronica bellidioides、Veronica fuhsii、另外还有管花肉苁蓉(Cistanche tubulosa)、Markhamia lutea、Newbouldia laevis、Numerous plant spp.、Orthocarpus densiflorus(Orobanchaceae)、Retziacapensis、Salvadora calotropis、Sanango racemosum、Strobilanthus sp、Trichomanes reniforme。
上述植物的叶、茎、芽、花、木质部、木皮部(树皮)等地上部，及根、块茎等地下部，种子、树脂等含有DPE或其配糖体的部位都可以利用。
上述植物可以其本身、提取物、提取物的水解物、或植物的水解物的形式使用。
作为本发明中使用的由天然物中得到DPE的提取方法，可以举出如下方法，即，橄榄叶干燥后的干燥物、其粉碎物、橄榄叶压榨后得到的榨汁等以适当的溶剂提取，根据不同情况进行水解处理、并利用滤过等方法除去不溶部分，从该提取液除去溶剂后，利用柱色谱等通常的精制手段得到目的物。同时进行生物分析，优选以细胞内谷胱甘肽的活性为指标进行精制。作为用于提取的溶剂可以列举出甲醇、乙醇、丙醇、1，3-丁二醇等醇类；乙醚；丙酮；乙酸乙酯；己烷；环己烷；二氯甲烷；氯仿等有机溶剂以及水等。这些溶剂既可以单独使用、也可以两种以上混合使用。提取条件没有特别的限定，例如温度可以是5～95℃、优选15～85℃或常温均可以很好地提取。
压力可以是常压、加压、减压。
提取时间根据选定的溶剂有所不同，可以是数分钟到数小时、通过反复提取、振荡提取、延长提取时间等方法可以提高提取效率。
另外、水解的情况可列举出利用酯酶等酶的分解、利用乳酸菌或酵母等微生物的分解、利用盐酸、硫酸、乙酸、磷酸、枸橼酸、乳酸、酒石酸、富马酸、苹果酸等酸的分解、氢氧化钠、氢氧化钾等碱的分解。水解条件没有特别限定，但在使用酶或微生物的情况下需符合所使用的酶或微生物的最适温度、pH值、一般在10～55℃、pH3～8、5～24小时的条件下进行水解。在用酸或碱进行水解的情况，通常在2-15重量％的浓度、常温～60℃、时间0.5～24小时的条件下进行水解。
这些提取物或水解物根据需要调节pH后、利用冷冻干燥、减压蒸馏、减压·真空干燥、喷雾干燥等众所周知的方法可以得到浓缩干燥物。对于精制处理的方法没有特别的限定，例如可以利用正相及反相色谱精制、重结晶、再沉淀、脱色处理、脱臭处理等方法相互结合进行精制。
利用化学合成方法也可以得到上述化合物。例如将四氢呋喃(THF)和四氢锂铝(LiAlH4)冷却至0度，在搅拌下用20～30分钟时间加入3，4-二羟基苯基乙酸(3，4-dihydroxyphenylacetic acid)，缓慢升温回流6小时。反应液冷却后、向滤液中加入蒸馏水和10％盐酸终止反应。然后用乙酸乙酯提取，减压蒸去溶剂得到干燥物。该干燥物利用硅胶柱色谱精制得到DPE。
所得DPE例如与四乙酰-α-溴葡萄糖反应，加入蚁酸调至酸性，所得沉淀离心分离回收浓缩，以五氧化二磷为脱水剂在真空干燥器中干燥后、溶于无水甲醇，加入28％甲醇钠甲醇溶液进行脱乙酰化处理。
然后向该溶液中加入6N的盐酸中和，滤纸滤过不溶物，分别以甲醇和水清洗，清洗液与滤液合并浓缩干燥得到粗DPE配糖体(DPE苷)。之后，粗DPE配糖体以ODS柱色谱分离，减压浓缩后以核磁共振(NMR)确定结构，分别鉴定为2-(3，4-二羟基苯基)乙醇-1-O- -D-葡萄糖苷(DPE-1-O- -D-Glucopyranocide)(CAS；76873-99-9)、2-(3，4-二羟基苯基)乙醇-3’-O- -D-葡萄糖苷(DPE-3’-O- -D-Glucopyranocide)(CAS；142542-89-0)、2-(3，4-二羟基苯基)乙醇-4’-O- -D-葡萄糖苷(DPE-4’-O- -D-Glucopyranocide)(CAS；54695-80-6)。
植物中的、植物提取物中的、植物或植物提取物的水解物中的、进而提取物、水解物的精制产物中的、化学合成的DPE或其配糖体均可用于本发明。
DPE或其配糖体具有显著的促进细胞内谷胱甘肽合成的作用，可以作为谷胱甘肽增强剂使用。另外这一谷胱甘肽增强剂可以通过与作为半胱氨酸供给源的含硫化合物、含有半胱氨酸和/或胱氨酸的蛋白质、含有半胱氨酸和/或胱氨酸的酵母、以及维生素C、维生素E、烟酰胺、泛酸钙等维生素类并用而发挥更优良的效果。
谷胱甘肽是存在于植物、微生物以及全部哺乳动物的各组织中的生物体内抗氧化剂，已知具有还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽两种。在谷胱甘肽过氧化酶和谷胱甘肽还原酶的作用下，谷胱甘肽通过所谓的氧化还原循环调整其氧化还原状态，维持作为抗氧化物质的机能。谷胱甘肽发挥各种机能的必要部位是作为其组成部分的半胱氨酸的巯基。另外，已知的谷胱甘肽一般的作用可列举出1)保护蛋白质内的巯基；2)清除自由基；3)作为半胱氨酸的储藏形态的作用；4)调节DNA合成或免疫机能类基本的细胞过程(Phamocol.Ther.1991.52，287-305页、Raven.Press，New york.1988.401-417页、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1990.87，3343-3347页、Exp.Cell.Res.1997.232，435-438页)。
谷胱甘肽消耗枯竭或者缺乏的主要原因被认为是平时发生的活性氧引起的氧化应激状态，以及放射线、紫外线、酒精、化学物质、药物、或重金属等原因引起，日常处于这些危险状态下就有可能发展为上述谷胱甘肽机能失调疾病。另外，一般情况下，谷胱甘肽的合成水平随着年龄的增加而降低。
例如肺疾病的一种即急性呼吸窘迫症候群中，多数情况下其患者的谷胱甘肽的水平降低，因此产生了发生肺细胞氧化损伤的氧化应激状态。
与谷胱甘肽相关联的疾病可列举出紫外线暴露引起的细胞损伤、皮肤粗糙、炎症、黑色化、褐斑、雀斑的生成、过量饮酒导致的急性或慢性酒精肝损伤、生体异物或放射线引起的肝损伤、药物、重金属及化学物质引起的肝损伤、肝功能不全、肝炎、紫外线引起的免疫力降低或自身免疫疾病、过敏性疾病、后天性免疫不全症候群等免疫疾病、吸烟引起的肺疾病、慢性肾功能不全、癌化及伴随生理学年龄增长的老化现象、缺血性心脏疾病、粉瘤性动脉硬化症、毛细血管障碍性溶血性贫血、心肌梗塞、心绞痛、脑梗塞、脑动脉硬化症、贫血等各种动脉硬化症性疾病、白内障、脑及神经变性疾病(脑缺血、肌肉萎缩性侧索硬化症、阿尔查默病、帕金森氏病、亨廷顿舞蹈病)、成人呼吸器官障碍症候群、骨髓形成不全、糖尿病、肾硬变、高血压、肥胖、潜在性病毒感染症、胃溃疡等。
通过促进谷胱甘肽的合成，可以使肝脏、肺、肾脏、皮肤、脑等各脏器内细胞的谷胱甘肽水平增加。
DPE或其配糖体具有促进细胞内谷胱甘肽合成的作用、在对谷胱甘肽减少、缺乏、枯竭而引起的疾病的预防和治疗中发挥作用。
谷胱甘肽增强用组合物对谷胱甘肽缺乏或枯竭引起的疾病、活性氧等导致的氧化应激状态引起的疾病、急性或慢性酒精肝损伤、肝功能不全、肝炎等肝脏疾病、肾脏疾病、过氧化脂质等过氧化物或自由基引起的疾病、吸烟引起的肺疾病、白内障、老化等的预防、治疗以及肝机能改善、肾机能改善、肺机能改善等脏器机能的改善均有效。
“谷胱甘肽缺乏或枯竭引起的疾病”是指过量饮酒导致的急性或慢性酒精肝损伤、生体异物或放射线引起的肝损伤、药物、重金属及化学物质引起的肝损伤、肝功能不全、肝炎、紫外线引起的免疫力降低或自身免疫疾病、过敏性疾病、后天性免疫不全症候群等免疫疾病、缺血性心疾病、白内障、脑及神经变性疾病(脑缺血、肌肉萎缩性侧索硬化症、阿尔查默病、帕金森氏病、亨廷顿舞蹈病)、成人呼吸器官障碍症候群、骨髓形成不全、糖尿病、肾硬变、高血压、肥胖、潜在性病毒感染症、胃溃疡等。
“氧化应激状态引起的疾病”是指紫外线暴露引起的细胞损伤、皮肤老化、炎症、黑色化、褐斑、雀斑的生成、吸烟引起的肺疾病、慢性肾功能不全、白内障、缺血性心脏疾病、胃溃疡、癌化及伴随生理学年龄增长的老化现象。
“过氧化脂质等过氧化物或自由基引起的疾病”是指缺血性心脏疾病、毛细血管障碍性溶血性贫血、心肌梗塞、心绞痛、脑梗塞、脑动脉硬化症、脑缺血等各种动脉硬化症性疾病的所谓血管系疾病。另外还有皮肤粗糙等。
“作为半胱氨酸供给源的含硫化合物”是指分子内含有巯基的化合物，也可以使用通过蛋氨酸转硫反应而衍生的非半胱氨酸基质的物质。例如，作为含有巯基的化合物可列举出谷胱甘肽、乙酰化谷胱甘肽、谷胱甘肽酯类、谷胱甘肽盐酸盐、谷胱甘肽磷酸盐、谷胱甘肽硫酸盐等谷胱甘肽或其衍生物、半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸、盐酸半胱氨酸、硫酸半胱氨酸、磷酸半胱氨酸等半胱氨酸或其衍生物、巯基乙醇、巯基乙酸、巯基戊酮酸、硫代乳酸铵、氨基硫代乳酸单乙醇酯等，作为非半胱氨酸基质可以列举出L-2-氧代四氢噻唑-2-羧酸盐、胱氨酸等，但也不全限于此。
“半胱氨酸和/或含有半胱氨酸的蛋白质或酵母”可列举出乳清、蛋白、血清白蛋白、乳清白蛋白、角蛋白、羽毛提取物、人毛提取物或含有1％以上谷胱甘肽的酵母、如面包酵母或班替串酵母，但也不全限于此。
“维生素类”是指维生素B1(硫胺素)、维生素B2(核黄素)、维生素B6、维生素B12、维生素A类、维生素C(抗坏血酸)、维生素D类、维生素E类、维生素K类、泛酸、泛酸钙、生物素、叶酸、尼克酰胺、烟酸等和这些维生素类的衍生物。
“抗紫外线用和/或美白用组合物”表示对既成褐斑、雀斑显示淡化作用的组合物。褐斑、雀斑是黑色素形成过剩沉积下来的结果。所以，历来的技术都是通过探索与黑色素形成有密切关系的酪氨酸酶的阻碍物希望抑制黑色素的生成。但是，本发明的作用机理与上述技术不同，是通过促进细胞内谷胱甘肽的合成而发挥作用。黑色素分为黑色的真黑素和淡赤褐色的褐黑素两种，细胞内的谷胱甘肽作用于黑色素生成过程的褐色素生成经路。向产生色素细胞添加谷胱甘肽、可使褐黑素的比率升高，具有细胞淡色化作用，这一结果已有实验性文献报道(J.Invest.Dermatol.1989.93，100-107页)。另外已知谷胱甘肽可以使维生素C由氧化型浓色黑色素向还原型淡色黑色素转变作用亢进。已有临床报道可以改善既成褐斑、雀斑等的色素沉积。(临皮，1967.21(7)，725-729页)。利用谷胱甘肽增强作用，可以改善既成的褐斑、雀斑的色素沉积，使其颜色变淡。
另外需要特别书写的是，DPE作为抗氧化物质已经众所周知(FoodChem Toxicol.1994，32(1)，31-36页)，本发明中“细胞损伤防御用及/或细胞损伤修复用组合物”所提到的DPE或其配糖体是对由紫外线或致癌物质等外因引起的由细胞外生成的活性氧或自由基等的攻击，通过促进细胞内谷胱甘肽的合成，间接地发挥减轻或修复细胞膜等受到攻击而造成的损伤的作用，与历来的抗氧化物质通过直接消去生成的活性氧而发挥作用不同。
DPE或其配糖体由于具有促进-谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽还原酶、胱氨酸膜输送载体的产生的作用，因此可以作为-谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽还原酶、胱氨酸膜输送载体的产生促进用组合物的有效成分加以利用。而且DPE或其配糖体，与从含有半胱氨酸和/或胱氨酸的蛋白质以及酵母、以及由维生素群中选择至少一种合并使用，可以作为-谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽还原酶、胱氨酸膜输送载体的产生促进用组合物。
-谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽还原酶、胱氨酸膜输送载体在其各自被编码的基因的控制区域中有共同的一致序列。这一序列被认为是所谓的抗氧化剂应答序列(RTGACnnnGC)Nrf2或c-Jun等复制因子通过这一序列协同作用控制基因表达并构筑生物体防御系统(蛋白质核酸酶.1999，44(15)，2370-2376页)。另外受这一序列控制的酶还可列举出谷胱甘肽硫转移酶、葡萄糖6-磷酸脱氢酶、铁蛋白、谷胱甘肽泵(GS-X泵)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶等。
-谷氨酰半胱氨酸合成酶是作为谷胱甘肽的构成氨基酸谷氨酸和半胱氨酸在结合时，在镁的存在下进行催化的酶。由于谷胱甘肽对该酶有反馈阻碍作用，该酶的活性因此被认为是谷胱甘肽合成的限速阶段。
谷胱甘肽还原酶是与NAD(P)H相关的不可逆还原氧化型谷胱甘肽的酶。该酶被认为在借助谷胱甘肽的细胞内氧化还原状态的形成中发挥重要的作用。
胱氨酸膜输送载体是存在于细胞膜的膜蛋白，对于碱性氨基酸，特别是硫的给予体之一的胱氨酸以及谷氨酸有着较高的特异性。其担负着交换输送半胱氨酸和谷氨酸，释放出细胞内的谷氨酸、摄取细胞外的胱氨酸的功能。输送到细胞内的胱氨酸经由半胱氨酸与谷胱甘肽的生成相关联。近年已经明确，称为xCT的50kDa胱氨酸膜输送载体被克隆，与已知的作为淋巴球活性抗原的4F2抗原重链(4F2hc)形成杂二聚体，与胱氨酸的输送相关。
本发明的谷胱甘肽增强用组合物可以作为食品、经口用或非经口用药物等使用。
作为上述的食品是指营养辅助食品、功能性食品、健康食品、特定保健食品或美容食品等。
作为药物的给药方法，经口或非经口给药均可，非经口给药时有直肠内给药、注射等方法。给药时可以与合适的固体或液体医药用无毒载体混合，以惯用的医药制剂形态给药。作为制剂的形态，可列举出粉末、散剂、颗粒、片剂、胶囊等固形剂，溶液剂、混悬剂、乳剂等液体剂形，冷冻干燥剂等，这些剂型可以常规手段进行调制。作为医药用无毒载体可以列举出葡萄糖、乳糖、蔗糖、淀粉、甘露醇、糊精、脂肪酸甘油酯、聚乙二醇、羟乙烯淀粉、乙二醇、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、氨基酸、明胶、白蛋白、水、生理盐水等。根据需要也可以适当添加稳定剂、湿润剂、乳化剂、结合剂、等渗化剂等的添加剂。另外，作为食品也可以与果汁等的饮料配合。
DPE或其配糖体的有效给药量可根据给药对象的年龄、体重、症状、给药途径、给药时间、剂型等进行适宜选择，例如经口用情况下、成人一日优选给药0.01～1000mg、特别优选的量为1～100mg。当药物中含有作为半胱氨酸供给源的含硫化合物或含有半胱氨酸和/或胱氨酸的蛋白质或酵母时，成人一日优选给药5～5000mg，特别优选的量为50～500mg。当含有维生素类时，应根据各维生素的一日必要量进行适宜配合。例如维生素C成人一日量为10～2000mg，特别优选量为30～1000mg。这时一日分数次给药为好。
含有DPE或其配糖体的植物体、植物提取物、植物体或其提取物的水解物的有效给药量应根据给药对象的年龄、体重、症状、给药途径、给药时间、制剂形态、素材的活性强度等进行适宜的选择，在经口服用时，植物提取物的水解物的给药量，例如橄榄叶的水解物的情况，一日的优选量为0.01～5000mg、特别优选量为1～300mg。另外，当与作为半胱氨酸供给源的含硫化合物或含有半胱氨酸和/或胱氨酸的蛋白质或酵母配合使用时，对于半胱氨酸一日优选量为5～5000mg、特别优选量为50～500mg。一日分数次给药为好。对于维生素，应根据各维生素的一日必要量进行适宜配合。例如维生素C成人一日量为10～2000mg，特别优选量为300～1000mg。尼克酰胺成人的一日量为0.1～100mg，特别优选量为5～30mg。这时一日分数次给药为好。
此外，当本发明中谷胱甘肽增强用组合物作为皮肤外用物时，可将其归为药事法中的化装品、医药外用品、医药品等。可用于乳液、面霜、洗剂类皮肤护理类制品、软膏等。其剂型没有特别的限定，可以选择水溶液系、可溶化系、乳化系、粉末系、油液系、胶体系、软膏系、喷雾系、水油两相系、水油粉三相系等。
DPE或其配糖体在皮肤外用组合物中，其含量应根据症状的不同而进行适宜的选择，应为全重量的0.001～20％，优选量应为0.01～5％。此外，当含有作为半胱氨酸供给源的含硫化合物或含有半胱氨酸和/或胱氨酸的蛋白质或酵母时，对于半胱氨酸，其优选含有量应为重量比0.001～30％，特别优选量为重量比0.1～10％。维生素类应根据其一日必要量进行适宜配合。例如在维生素C的情况下，优选重量比为0.001～40％，特别优选重量比为0.1～10％。此时一日可以分1～4次涂布。
含有DPE或其配糖体的植物、植物提取物、植物提取物或植物水解物的在皮肤外用组合物中的含量应根据症状的不同而进行适宜的选择，在丁香花提取物的情况下重量比应为全重量的0.001～20％，优选重量比为0.01～5％。此外，当含有作为半胱氨酸供给源的含化合物或含有半胱氨酸和/或胱氨酸的蛋白质或酵母时，其优选含有量应为重量比0.001～30％，特别优选重量比为0.1～10％。维生素类应根据其一日必要量进行适宜配合。例如在维生素C的情况下，优选重量比为0.001～40％，特别优选重量比为0.1～10％。此时一日可以分1～4次涂布。
DPE或其配糖体作为化装品素材使用时，例如通过添加入小麦胚芽油或橄榄油中可以作为化装品素材加以利用。其含有量，例如相对于小麦胚芽油或橄榄油的质量，重量比为0.0001～20％，优选重量比为0.01～5％。
当含有DPE或其配糖体的植物、植物提取物、植物或植物提取物的水解物作为化装品素材使用时，例如通过把金木犀的提取物或提取物的水解物添加入小麦胚芽油或橄榄油中可以作为化装品素材加以利用。植物的提取物或提取物的水解物的含有量，例如相对于小麦胚芽油或橄榄油的质量，其重量比为0.1～60％，优选重量比为0.5～50％。
DPE或其配糖体的毒性较低，给大鼠每日1000mg/kg、100天长期口服，没有死亡例。
具体实施例方式
实施例以下列举实施例并具体说明，但本发明不仅限于此。
由植物提取及其水解野芝麻的地上部(Lamium album)、Euphrasia officinalis的地上部、车前草(全草)(Plantago psyllium)、桃叶(Prunus persica)、罗汉果实(Momordica grosvenorii)、车前子(种子)(Plantago psyllium)、地黄(根)(Rehmannia glutinosa)、车前全草(Plantago asiatica)、Echinacea angustifolia的花、樱花叶(Prunus spp)、Plantago ovata的种子、郁李的种子(Prunusjaponica Thunb)、苦苣苔全草(Conandron ramondioides Siebold et Zucc)、梅的果实(Prunus mume)、杏的种子(Prunus armeniaca)、金木犀的花(Osmanthus fragrans)、小球藻全藻(Chlorella vulgaris)、野鸡冠花的种子(Celosia argentea L.)、天明精的茎(Carpesium abrotanoides)、米楮的果实(Ballota nigra)、草苁蓉全草(Boschniakia rossica)、大叶醉鱼草的叶(Buddleja davidii)、Castanopsis cuspidata var.sieboldii的叶、肉苁蓉全草(Cistanche salsa)、蛇苔全藻(Conocephalum conicum)、Digitails lanata的叶、黄花毛地黄的叶(Digitalis lutea)、毛地黄的叶(Digitalis purpurea)、Digitalissp的叶、橄榄的叶(Olea europaea)、连翘果实(Forsythia suspensa)、金钟花的茎(Forsythia viridissima)、秦皮树皮(Fraxinus japonica)、花白蜡树树皮(Fraxinus ornus)、里白的地上部(Gleichenia glauca)、羊膜草全草(Hemiphragma heterophyllum)、毛茉莉全草(Jasminum multiforum)、马缨丹的叶(Lantana camara)、天人草全草(Leucosceptrum japonicum)、日本毛女贞的果实(Ligustrum japonicum)、女贞的果实(Ligustrumobtusifolium)、吊石苣苔全草(Lysionotus pauciflorus)、日本厚朴树皮(Magnolia obovata)、夜花全草(Nyctanthes arbor-tristis)、银木犀的花(Osmanthus asiaticus)、Penstemon procerus的叶、松蒿的茎(Phtheirospermum japonicum)、大车前全草(Plantago major)、灰叶稠李全草(Prunus grayana)、里白栎的叶(Quercus stenophylla)、Ramonda myconi的叶、甘露子的块茎(Stachys sieboldii)、暴马丁香的花(Syringa reticulata)、丁香花的叶(Syringa vulgaris)、茉莉全草(Jasminum sambac、Jasminumoffinale)、女贞子的种子(Ligustrum lucidum)、马鞭草全草(Verbenaofficinalis L.)、苦瓜的果实(Momordica charantia L.)、阿拉伯婆婆纳全草(Veronica persica)，各取500g加入99.5％乙醇溶液3升，室温下浸渍一晚提取，之后提取液在真空下减压浓缩，除去乙醇。
各提取物的干燥重量分别为50.5、10.4、40.1、20.3、40.3、68.8、72.1、52.6、43.3、46.1、36.8、29.7、36.8、34.6、20.2、25.4、34.2、78.7、40.6、26.8、15.7、39.3、50.8、60.9、110.0、40.7、30.6、30.4、22.3、77.8、40.8、80.7、53.6、44.6、29.6、44.7、50.1、72.3、35.6、43.6、60.4、25.6、80.6、59.4、66.9、37.5、48.8、60.1、57.6、10.2、21.9、19.6、8.03、45.6、32.3、36.9、28.4、37.0、43.4g然后为了得到水解物，通过在与上述操作相同的操作得到的植物提取物中，以1N硫酸调节pH至2，100℃搅拌1小时进行水解处理，然后以氢氧化钠中和，利用旋转蒸发器减压浓缩后，通过冷冻干燥得到水解物。
各植物水解物干燥重量分别为55.5、13.4、46.1、24.3、47.3、72.8、90.1、59.6、48.3、51.1、45.8、34.7、42.1、39.1、25.9、30.7、39.1、74.4、47.3、27.9、23.4、46.5、48.8、48.9、72.0、47.7、37.4、36.4、27.3、72.4、44.8、83.7、57.6、49.6、35.6、47.7、53.1、73.3、36.6、47.6、58.4、30.6、78.6、61.4、64.9、45.5、46.8、54.1、56.6、14.2、22.3、26.6、12.03、43.6、53.3、46.9、35.4、48.7、46.4g。得到的提取物及其水解物在使用前利用乙醇再调制为10mg/ml以供实验。
由植物中提取2-(3，4-二羟基苯基)乙醇(DPE)橄榄的叶(Olea europaea)、丁香花的叶(Syringa vulgaris)、金木犀叶(Osmanthus fragrans)各取1500g加入99.5％乙醇溶液7.5L，室温下浸渍一晚，提取后的提取液真空减压浓缩除去乙醇溶剂，各提取物干燥重量为300、285、264g。然后用甲醇以Sephahdex LH-20柱色谱进行分离，减压浓缩除去甲醇，干重分别为25、18、14g。然后以乙酸乙酯∶己烷混合液(3∶2)利用硅胶色谱进行分离，通过同样的操作得到干重分别为6、7、4g的粗馏分。粗馏分用甲醇再溶解后，进一步以13％的甲醇通过ODS柱色谱进行分离，减压浓缩后得到DPE分别为0.4、0.3、0.2g。
由植物提取物的水解物中提取DPE橄榄的叶、丁香花的叶、金木犀叶各取1500g加入99.5％乙醇溶液7.5L，室温下浸渍一晚，提取后，以1N硫酸调节提取液pH至2，100℃搅拌1小时进行水解处理。然后以氢氧化钠中和，真空减压浓缩后通过冷冻干燥得到橄榄、丁香花、金木犀叶溶剂提取物的水解物，干燥重量分别为345、384、322g。然后将水解物溶于甲醇，用Sephahdex LH-20柱色谱进行分离，减压浓缩除去甲醇得到粗馏分，干燥重量分别为87、71、55g。后以乙酸乙酯∶己烷混合液(3∶2)利用硅胶色谱进行分离，通过同样的操作得到干重分别为28、21、15g的粗馏分。粗馏分用以13％的甲醇通过ODS柱色谱进行分离，减压浓缩后得到DPE分别为2、2、1g。
DPE的化学合成将四氢呋喃(THF)(200ml)和四氢锂铝(LiAlH4)(5.12g0.13mol)冷却至0度，在搅拌下用20～30分钟时间加入3，4-二羟基苯基乙酸(3，4-dihydroxyphenylacetic acid)(7.6g0.045mol)，缓慢升温回流6小时。反应液冷却后，加入冰水(100ml)及10％的盐酸(100ml)使反应停止。然后用乙酸乙酯(100ml)反复进行3～4次提取操作，所得乙酸乙酯层以无水硫酸镁干燥后减压蒸去溶剂得到干燥物。该干燥物经硅胶柱色谱精致得DPE(4.5g)。
DPE的化学合成取实施例4所得DPE600mg，四乙酰-α-溴葡萄糖4g溶于50ml二甲基甲酰氨，加入2.7g碳酸钾，室温下搅拌反应一夜。将反应液倒在300g冰上，加入蚁酸使呈酸性，所得沉淀以1000×g离心分离15分钟加以回收。沉淀以蒸馏水洗一次后溶于甲醇再真空干燥。随后以五氧化二磷作为脱水剂在真空干燥器中干燥，然后溶于10ml无水甲醇并加入28％甲醇钠甲醇液1.6ml于室温下进行脱乙酰化反应20分钟。然后向溶液中加入6N的盐酸中和，滤纸滤过不溶物，分别以甲醇和水洗，清洗液与滤液合并浓缩干燥得到粗DPE配糖体573mg。之后，粗DPE配糖体以ODS柱色谱分离，减压浓缩后得到2-(3，4-二羟基苯基)乙醇-1-O- -D-葡萄糖苷(DPE-1-O- -D-Glucopyranocide)、2-(3，4-二羟基苯基)乙醇-3’-O- -D-葡萄糖苷(DPE-3’-O- -D-Glucopyranocide)、2-(3，4-二羟基苯基)乙醇-4’-O- -D-葡萄糖苷(DPE-4’-O- -D-Glucopyranocide)各177、214、166mg。
谷胱甘肽活性的测定CCD1059正常人皮肤纤维芽细胞(大日本制药株式会社制)1.5×105个接种于直径6厘米的培养皿(NUNC社制)中，在含有10％未分化牛犊血清(以下简称FBS)Dulbecco变法eagle培养液(DMEM)中，37℃、5％二氧化碳存在下培养3天。将覆盖率达到80％的细胞置换至含有0.5％牛犊血清(以下也简称为FBS)的DMEM培养液中，驯化24小时后吸除培养液，更换新的含有0.5％牛犊血清的DMEM培养液后，以乙醇溶解受试物质，分别添加实施例1中得到的植物提取物及其水解物以使最终浓度为100μg/ml，添加实施例3～4中得到的DPE及实施例5中得到的配糖体以使最终浓度为2.5、5、10、20μg/ml，培养24小时后回收细胞。代替受试物质只向细胞中添加乙醇以使最终浓度为1％的作为对照组，以其活性为1评价各受试物质与对照组相对比的活性。回收的细胞以超声波破碎，用偏磷酸除蛋白后，再次中和，作为谷胱甘肽测定用样品。谷胱甘肽测定按Baker等的方法进行(Anal.Biochem.1990，190，360-365页)。简单的说，向2-(N-甲酰基)乙磺酸缓冲液(MES buffer)中加入还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、谷胱甘肽还原酶及发色剂5，5’-二硫代(2-硝基安息香酸)(DTNB)，与测定用样品或标准曲线用的标品反应后，测定405nm处的吸光度作为谷胱甘肽的浓度。结果如表1及表2所示。通过表1及表2可知，与对照组相比，这些植物提取物及其水解物、DPE及DPE配糖体能够提高细胞内谷胱甘肽浓度。
表1谷胱甘肽活性(植物提取物及其水解物)
表2谷胱甘肽增强活性(化合物)
与含硫化合物(半胱氨酸)并用效果基本按照实施例6的方法进行实验，但为了添加任意浓度的含硫化合物，添加时的培养液使用没有含硫化合物的DMEM培养液(不含蛋氨酸、半胱氨酸、胱氨酸)。分别添加实施例1中得到的橄榄、连翘、金木犀、银木犀、丁香花的提取物及水解物使最终浓度为100μg/ml、添加实施例3～4中得到的DPE及实施例5中得到的配糖体使最终浓度为2.5μg/ml，3小时后添加调整pH至中性范围的作为含硫化合物的半胱氨酸使最终浓度为200、400μM。比较结果通过与只添加同量半胱氨酸的各对照组的比率算出(只添加半胱氨酸组中其最终浓度分别为200、400μM作为对照组，以各对照组的活性为1时通过与对照组对比评价各受试物质组的活性)。结果如表3所示。由表3可知这些植物的提取物及其水解物、DPE及DPE配糖体，可以通过添加作为含硫化合物的半胱氨酸使细胞内谷胱甘肽浓度依存半胱氨酸的浓度得以提高。由此可知这些植物的提取物及其水解物、DPE及DPE配糖体与含硫化合物协同作用与谷胱甘肽合成相关联。
表3与含硫化合物(半胱氨酸)并用效果
与含硫化合物(胱氨酸)并用效果基本按照实施例6的方法进行实验，但为了添加任意浓度的含硫化合物，添加时的培养液使用没有含硫化合物的DMEM培养液(不含蛋氨酸、半胱氨酸、胱氨酸)。分别添加实施例1中得到的橄榄、连翘、金木犀、银木犀、丁香花的提取物及水解物使最终浓度为100μg/ml、添加实施例3～4中得到的DPE及实施例5中得到的配糖体使最终浓度为10μg/ml，同时添加作为含硫化合物的胱氨酸使最终浓度为200μM。比较结果通过与只添加胱氨酸的各对照组的比率算出(只添加胱氨酸组作为对照组，以各对照组的活性为1时通过与对照组对比评价各受试物质组的活性)。结果如表4所示。由表4可知这些植物的提取物及其水解物、DPE及DPE配糖体可以通过添加作为含硫化合物的胱氨酸使细胞内谷胱甘肽浓度依存半胱氨酸的浓度得以提高。由此可知这些植物的提取物及其水解物、DPE及DPE配糖体与含硫化合物协同作用与谷胱甘肽合成相关联。
表4与含硫化合物(胱氨酸)并用效果
对肝细胞的作用clone 9人肝细胞(大日本制药株式会社制))8×106个接种于直径6厘米的培养皿中，在含有10％未分化牛犊血清FBS的DMEM培养液中，37℃、5％二氧化碳存在下培养3天。将覆盖率达到80％的细胞置换至含有0.5％FBS的DMEM培养液中，驯化24小时后吸除培养液，更换新的含有0.5％FBS的DMEM培养液后，以乙醇溶解受试物质，分别添加实施例1中得到的橄榄、连翘、金木犀、银木犀、丁香花的提取物及其水解物使最终浓度为100μg/ml、添加实施例3～4中得到的DPE及实施例5中得到的DPE配糖体使最终浓度为10μg/ml，并使培养液中的乙醇含有率在1％以下。代替受试物质只向细胞中添加乙醇使最终浓度为1％的作为对照组，以其活性为1评价各受试物质与对照组相对比的活性。添加24小时后回收细胞按实施例5的方法进行谷胱甘肽的测定。结果如表5所示。由表5可知通过添加本发明所发现的植物提取物及其水解物、DPE及DPE配糖体，相比于对照组可提高肝细胞内的谷胱甘肽浓度。
表5对肝细胞的作用
由于细胞内谷胱甘肽增强而对活性氧引起的细胞损伤的抵抗性CCD1059正常人皮肤纤维芽细胞(大日本制药株式会社制)8×104个接种于直径6厘米的培养皿中，在含有10％未分化牛犊血清(以下简称FBS)的DMEM培养液中，37℃、5％二氧化碳存在下培养1天。置换到含有0.5％FBS的DMEM培养液中后，分别添加实施例1中得到的橄榄、连翘、金木犀、银木犀、丁香花的提取物及其水解物使最终浓度为100μg/ml、添加实施例3～4中得到的DPE及实施例5中得到的DPE配糖体使最终浓度为20μg/ml，37℃预培养24小时使细胞内谷胱甘肽浓度升高。24小时后吸引除去培养液，在Hanks液中洗两次。为了评价本实验中由于谷胱甘肽浓度升高而减轻由于活性氧产生造成的影响，在预培养后完全除去本发明中发现的植物及其水解物、DPE及DPE配糖体。
清洗细胞后，将单线态氧发生剂玫瑰红溶于Hanks液使最终浓度为50μM，添加于细胞中，可见光下照射10分钟，使细胞暴露于单线态氧。细胞在Hanks液中的浸泡时间、可见光照射时间各组完全统一。暴露后，再次以Hanks液洗细胞，置换到含有10％FBS的DMEM培养液中，3天后以库尔特颗粒计数器计测细胞，比较活细胞数。以未暴露于单线态氧的非暴露群的细胞数为100％进行评价。结果如表6所示。由表6可知通过添加这些植物的提取物及其水解物、DPE及DPE配糖体、暴露于单线态氧的各组的生存率与无受试物质处置组(对照组)相比得到明显改善。由于暴露时除去了这些植物的提取物及其水解物、DPE及DPE配糖体、说明通过提高细胞内的谷胱甘肽浓度而减轻了由于活性氧产生造成的影响。
表6由于细胞内谷胱甘肽增强而对活性氧引起的细胞损伤的抵抗性
美白试验应用实施例1得到的野芝麻、Euphrasia officinalis、车前草、车前子、橄榄、连翘、苦苣苔、金木犀、银木犀、丁香花、马鞭草、苦瓜的提取物及其水解物、实施例3～4得到的DPE及实施例5得到的DPE配糖体通过以下试验测定黑色素抑制活性。
应用来自小鼠瘤株的B16黑色素瘤细胞，以终浓度10％地添加FBS的最少基础培养液(MEM)培养，使该细胞浓度为3×103cell/ml向6孔板的各孔中接种6ml，在二氧化碳恒温培养箱内培养5天并更换培养液。分别添加实施例1中得到的植物提取物及其水解物100μg/ml、实施例3～4中得到的DPE及实施例5中得到的DPE配糖体20μg/ml，同样条件下持续培养3天后，清洗细胞通过刮刀处理剥离细胞，用月桂基硫酸钠(SDS)使其溶解，测定在475nm、260nm的吸光度，作为S475、S260。以未添加受试物质的培养液培养的细胞在475nm、260nm的吸光度作为C475、C260按式1计算黑色素抑制率。采用维生素C 3mM及曲酸3mM作为阳性对照。结果如表7及表8所示。由表7及表8可知，由于添加受试物质黑色素生成受到抑制，受试物质显示美白作用。
式1黑色素抑制率(％)＝1-[(S475/S260)/(C475/C260)]×100表7美白试验
表8美白试验(化合物)
利用Western-blotting法测定胱氨酸膜输送载体(xCT)产生能CCD1059正常人皮肤纤维芽细胞(大日本制药株式会社制)1.5×105个接种于直径6厘米的培养皿中，在含有10％未分化FBS的DMEM培养液中，37℃、5％二氧化碳存在下培养3天。细胞覆盖达到80％时置换到含有0.5％FBS的DMEM培养液中，驯化24小时后吸引除去培养液，置换到新的含有0.5％FBS的DMEM培养液中后，分别加入实施例1得到的橄榄、连翘、金木犀、银木犀、丁香花的提取物和水解物使最终浓度为100μg/ml、实施例3～4得到的DPE及实施例5得到的DPE配糖体使最终浓度为200μg/ml，并向培养液中添加乙醇使含有率在1％以下，24小时后回收细胞。代替受试物质，向细胞中只加入乙醇使最终浓度为1％作为对照组，设其活性为1时各受试物质组与对照组相比评价其活性。对于细胞回收，加入可溶化剂(0.5％NP-40、50mM Tris-HCl(pH7.5)、120mM NaCl、1mM Na3VO4)、4℃、振荡30分钟后，回收可溶化液15000rpm、离心30分钟除去细胞片。上清液以蒸馏水透析并冷冻干燥。
然后以400μl蒸馏水溶解，蛋白定量后按Lowry法对样品间的蛋白量进行补正。向其中加入任意量的样品缓冲液、作为Western-blotting用样品。样品中的蛋白质以SDS-PAGE进行分离后，复制至硝酸纤维素膜上。复制后的硝酸纤维素膜以封闭液(含有5％脱脂奶的PBS)浸泡，室温下封闭1小时。以清洗液[含有0.1％牛血清白蛋白及0.05％聚环氧乙烷(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯的PBS]清洗后，浸泡于一次抗体(以清洗液调制成1mg/ml的对xCT的多克隆抗体)中室温下反应一夜。清洗后，浸泡于二次抗体(以清洗液调制成1mg/ml的生物素化抗兔免疫球蛋白G)中，室温下反应1小时。清洗后浸泡于酶溶液(以清洗液调制成1mg/ml的碱性磷酸酶卵白素D)中，室温下反应1小时。清洗后浸泡于基质液[BCIP/NBTsubstrate kit](VECTOR ABORATORIES社制)中，室温下反应15分钟。反应结束后用图象解析软件ImageMaster 1D测定发色强度(AMERSHAMPHARMACIA BIOTECH社制))。
用Western-blotting法测定细胞提取物xCT产生能的结果如表9所示。通过表9可知与对照组相比，这些植物提取物及其水解物、DPE和DPE配糖体可以使xCT的表达亢进。
表9利用Western-blotting法测定胱氨酸膜输送载体(xCT)产生能
RT-PCR(Reverse transcriptase-polymerase chain reaction)测定-谷氨酰半光氨酸合成酶的产生促进活性CCD1059正常人皮肤纤维芽细胞(大日本制药株式会社制)1.5×105个播种于直径6厘米的培养皿(Nunk社制)中，在含有10％未分化FBS的DMEM培养液中，37℃、5％二氧化碳存在下培养3天。细胞覆盖达到80％时置换到含有0.5％FBS的DMEM培养液中，驯化24小时后吸引除去培养液，置换到新的含有0.5％FBS的DMEM培养液中后，分别加入实施例1得到的橄榄、连翘、金木犀、银木犀、丁香花的提取物和水解物使最终浓度为100μg/ml、实施例3～4得到的DPE及实施例5得到的DPE配糖体使最终浓度为200μg/ml，并向培养液中添加乙醇使含有率在1％以下，8小时后用TRIZOL试剂(lifetechoriental)按文献报道方法回收全RNA。
利用回收的全RNA，通过RT-PCR high(东洋纺)测定-谷氨酰半光氨酸合成酶mRNA及G3PDH mRNA的表达促进活性。G3PDH基因为已知的家务基因，由于通常在所有细胞中都会表达，被广泛地用做对照基因。对于-谷氨酰半光氨酸合成酶，PCR用引物分别采用5’-TGA AAC TCTGCA AGA GAA GGG G-3’及5’-GCT TCA TCT GGA AAG AGG G-3’，对于G3PDH，PCR引物分别采用5’-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3’及5’-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3’。对于-谷氨酰半光氨酸合成酶，PCR反应条件为94℃、7分钟处理后、94℃、1分钟、56℃、1分钟、74℃、1分钟反复操作35次，然后74℃处理10分钟，并于4℃保存。而对于G3PDH，PCR反应条件为94℃、7分钟处理后、94℃、1分钟、58℃、1分钟、74℃、1分钟反复操作20次，然后74℃处理10分钟，并于4℃保存。RT-PCR产物电泳后用溴化乙锭染色并用数码照相机照相、利用图象解析软件ImageMaster 1D(AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH社制)测定染色强度。以未添加受试物质(乙醇1％)为对照组，对于表达量的评价，以-谷氨酰半光氨酸合成酶mRNA的染色强度被G3PDH染色强度除得的值为1，对受试物质添加时的表达量进行比较研究。由表10可知，与对照组相比，这些植物的提取物及其水解物、DPE和DPE配糖体可使-谷氨酰半光氨酸合成酶的表达亢进。
表10RT-PCR(Reverse transcriptase-polymerase chain reaction)测定-谷氨酰半光氨酸合成酶的产生促进活性
以下列出处方例[片剂的制造]用实施例1得到的橄榄水解物和胱氨酸按常法制造如下组成的片剂(组成)(配合；重量％)橄榄水解物(干燥重量) 16胱氨酸16维生素C 20尼克酰胺 1纤维素20难消化性糊精 24蔗糖脂肪酸酯 3[片剂的制备]用实施例3～4得到的2-(3，4-二羟基苯基)乙醇和含有谷胱甘肽的酵母按常法制备如下组成的片剂(组成)(配合；重量％)2-(3，4-二羟基苯基)乙醇 10乳糖 62玉米淀粉 17guar gum 1含有谷胱甘肽的酵母10 按常法制备如下组成的果汁(组成) (配合；重量％)果糖葡萄糖液糖 5.00枸橼酸 10.4维生素C0.50香料 0.02色素 0.10丁香花提取物(干燥重量) 10.0蒸馏水 73.98[护肤制品(手霜)的制备]按常法制备如下组成的手霜(组成) (配合；重量％)异硬脂酸异丙酯 8.0荷荷芭油 6.0鲸蜡醇 8.0硬脂醇 2.0聚环氧乙烷月桂基醚 1.5丙二醇 6.0山梨糖醇 1.0对羟基苯甲酸酯 0.42-(3，4-二羟基苯基)乙醇0.8维生素E0.5维生素C1.0香料 0.1精制水 64.7产业上利用的可能性以上结果明确说明本发明的组合物有谷胱甘肽增强活性，能够使生物体内谷胱甘肽的供给量增加，对于由谷胱甘肽缺乏引起的疾病的预防及治疗、特别是急性或慢性酒精肝损伤或肝功能不全、肝炎等肝脏疾病，及肝功能的改善方面具有作用。而且可以用于活性氧导致的氧化应激状态引起的疾病，特别是暴露于紫外线引起的细胞损伤、炎症、黑色化、褐斑、雀斑、吸烟等引起的肺病、肺机能的改善、白内障、伴随生理学年龄增加的老化的预防或治疗。另外，与作为半胱氨酸供给源的含硫化合物或含有半胱氨酸和/或胱氨酸的蛋白质或酵母并用，可使谷胱甘肽增强活性飞跃性上升，因此本发明的组合物对上述疾病的预防或治疗有更加优良的效果。
序列表<110>株式会社芳凯尔<120>谷胱甘肽增强用组合物<130>PF23-035<150>JP2001-311914<151>2001-10-09<160>4<210>1<211>22<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成RNA<400>1tgaaactctg caagagaagg gg22<210>2<211>22<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成RNA<400>2gcttcatctg gaaagaggag gg 22<210>3<211>20<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成RNA<400>3accacagtcc atgccatcac 20<210>4<211>20<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成RNA<400>4tccaccaccc tgttgctgta 20
权利要求
1.一种谷胱甘肽增强用组合物，至少含有从2-(3，4-二羟基苯基)乙醇或其配糖体、含有2-(3，4-二羟基苯基)乙醇或其配糖体的植物、该植物提取物、该植物的水解物、或该植物提取物的水解物(但橄榄及其提取物除外)中选择的一种。
2.一种组合物，至少含有从2-(3，4-二羟基苯基)乙醇或其配糖体、含有2-(3，4-二羟基苯基)乙醇或其配糖体的植物、该植物提取物、该植物的水解物、或该植物提取物的水解物(但橄榄及其提取物除外)中选择的一种并至少用于-谷氨酰半胱氨酸合成酶产生促进用、谷胱甘肽还原酶产生促进用、及胱氨酸膜输送载体产生促进用中的一种用途。
3.一种抗紫外线用和/或美白用组合物，至少含有作为谷胱甘肽增强成分的2-(3，4-二羟基苯基)乙醇或其配糖体中的一种。
4.一种抗紫外线用和/或美白用组合物，至少含有从2-(3，4-二羟基苯基)乙醇或其配糖体、含有2-(3，4-二羟基苯基)乙醇或其配糖体的植物、该植物提取物、该植物的水解物、或该植物提取物的水解物(但橄榄及其提取物除外)中选择的一种。
5.一种谷胱甘肽缺乏引起的疾患的预防用和/或治疗用组合物，至少含有从2-(3，4-二羟基苯基)乙醇或其配糖体、含有2-(3，4-二羟基苯基)乙醇或其配糖体的植物、该植物提取物、该植物的水解物、或该植物提取物的水解物(但橄榄及其提取物除外)中选择的一种。
6.一种氧化应激状态引起的疾患的预防用及/或治疗用组合物，至少含有从2-(3，4-二羟基苯基)乙醇或其配糖体、含有2-(3，4-二羟基苯基)乙醇或其配糖体的植物、该植物提取物、该植物的水解物、或该植物提取物的水解物(但橄榄及其提取物除外)中选择的一种。
7.一种基于促进谷胱甘肽细胞内合成的细胞损伤防御用和/或细胞损伤修复用组合物，至少含有从2-(3，4-二羟基苯基)乙醇或其配糖体、含有2-(3，4-二羟基苯基)乙醇或其配糖体的植物、该植物提取物、该植物的水解物、或该植物提取物的水解物(但橄榄及其提取物除外)中选择的一种。
8.一种肝脏机能改善用或肝脏疾患预防用和/或治疗用组合物，至少含有从2-(3，4-二羟基苯基)乙醇或其配糖体、含有2-(3，4-二羟基苯基)乙醇或其配糖体的植物、该植物提取物、该植物的水解物、或该植物提取物的水解物(但橄榄及其提取物除外)中选择的一种。
9.一种肾脏机能改善用或肾脏疾患预防用和/或治疗用组合物，至少含有从2-(3，4-二羟基苯基)乙醇或其配糖体、含有2-(3，4-二羟基苯基)乙醇或其配糖体的植物、该植物提取物、该植物的水解物、或该植物提取物的水解物(但橄榄及其提取物除外)中选择的一种。
10.一种过氧化脂质等过氧化物或自由基引起的疾患的预防用和/或治疗用组合物，至少含有从2-(3，4-二羟基苯基)乙醇或其配糖体、含有2-(3，4-二羟基苯基)乙醇或其配糖体的植物、该植物提取物、该植物的水解物、或该植物提取物的水解物(但橄榄及其提取物除外)中选择的一种。
11.一种肺机能改善用或肺疾患预防用和/或治疗用组合物，至少含有从2-(3，4-二羟基苯基)乙醇或其配糖体、含有2-(3，4-二羟基苯基)乙醇或其配糖体的植物、该植物提取物、该植物的水解物、或该植物提取物的水解物(但橄榄及其提取物除外)中选择的一种。
12.一种白内障的预防用和/或治疗用组合物，至少含有从2-(3，4-二羟基苯基)乙醇或其配糖体、含有2-(3，4-二羟基苯基)乙醇或其配糖体的植物、该植物提取物、该植物的水解物、或该植物提取物的水解物(但橄榄及其提取物除外)中选择的一种。
13.一种老化的预防用和/或治疗用组合物，至少含有从2-(3，4-二羟基苯基)乙醇或其配糖体、含有2-(3，4-二羟基苯基)乙醇或其配糖体的植物、该植物提取物、该植物的水解物、或该植物提取物的水解物(但橄榄及其提取物除外)中选择的一种。
14.根据权利要求1、2、4～13中任一项所述的组合物，其中，含有2-(3，4-二羟基苯基)乙醇或其配糖体的植物至少是橄榄(Olea europaea)、野芝麻(Lamium album)、Euphrasia officinalis、桃(Prunus persica)、罗汉果(Momordica grosvenorii)、地黄(Rehmannia glutinosa)、Plantago psyllium、车前(Plantago asiatica)、Echinacea angustifolia、樱花(Prunus spp)、Plantagoovata、郁李(Prunus japonica Thunb)、苦苣苔(Conandron ramondioidesSiebold et Zucc)、梅(Prunus mume)、杏(Prunus armeniaca)、金木犀(Osmanthus fragrans)、小球藻(Chlorella vulgaris)、野鸡冠花(Celosiaargentea L.)、天明精(Carpesium abrotanoides)、米楮(Ballota nigra)、草苁蓉(Boschniakia rossica)、大叶醉鱼草(Buddleja davidii)、Castanopsiscuspidata var.sieboldii、肉苁蓉(Cistanche salsa)、蛇苔Conocephalumconicum、Digitails lanata、黄花毛地黄(Digitalis lutea)、毛地黄(Digitalispurpurea)、Digitalis sp、连翘(Forsythia suspensa)、金钟花(Forsythiaviridissima)、秦皮(Fraxinus japonica)、花白蜡树(Fraxinus ornus)、里白(Gleichenia glauca)、羊膜草(Hemiphragma heterophyllum)、毛茉莉(Jasminum multiforum)、马缨丹(Lantana camara)、天人草(Leucosceptrumjaponicum)、日本毛女贞(Ligustrum japonicum)、女贞(Ligustrumobtusifolium)、吊石苣苔(Lysionotus pauciflorus)、日本厚朴树(Magnoliaobovata)、夜花(Nyctanthes arbor-tristis)、银木犀(Osmanthus asiaticus)、Penstemon procerus、松蒿(Phtheirospermum japonicum)、大车前(Plantagomajor)、灰叶稠李(Prunus grayana)、里白栎(Quercus stenophylla)、Ramondamyconi、甘露子(Stachys sieboldii)、暴马丁香(Syringa reticulata)、丁香花(Syringa vulgaris)、茉莉(Jasminum sambac、Jasminum offinale)、女贞子(Ligustrum lucidum)、马鞭草(Verbena officinalis L.)、苦瓜(Momordicacharantia L.)、阿拉伯婆婆纳(Veronica persica)中的一种。
15.根据权利要求1～14中任一项所述的组合物，至少含有作为半胱氨酸供给源的含硫化合物、含有半胱氨酸和/或胱氨酸的蛋白质、含有半胱氨酸及/或胱氨酸的酵母、以及维生素中的一种。
16.根据权利要求1～15中任一项所述的组合物，其中，所述组合物是经口用或非经口用。
17.根据权利要求1～15中任一项所述的组合物，其中，所述组合物是皮肤外用。
18.根据权利要求1～16中任一项所述的组合物，其中，所述组合物是药物。
19.根据权利要求1～15中任一项所述的组合物，其中，所述组合物是食品。
20.根据权利要求19所述的食品，其中，所述食品是营养辅助食品、功能性食品、健康食品、特定保健食品或美容食品。
全文摘要
本发明提供一种谷胱甘肽增强用组合物，至少含有从2－(3，4－二羟基苯基)乙醇或其配糖体、含有2－(3，4－二羟基苯基)乙醇或其配糖体的植物、该植物提取物、该植物的水解物、或该植物提取物的水解物(但橄榄及其提取物除外)中选择的一种，进而，本发明还提供一种谷胱甘肽增强用组合物，除了上述之外，还至少含有作为半胱氨酸供给源的含硫化合物、含有半胱氨酸和/或胱氨酸的蛋白质、含有半胱氨酸及/或胱氨酸的酵母、以及维生素中的一种。
文档编号A61P1/16GK1564682SQ0281982
公开日2005年1月12日 申请日期2002年9月11日 优先权日2001年10月9日
发明者千场智寻, 内藤崇, 石渡潮路 申请人:株式会社芳凯尔