专利名称：马鞭草提取物及其制法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及马鞭草的提取物及抗早孕和抗滋养细胞肿瘤的药物。
计划生育是我国的国策。由于目前尚无一种完善的避孕措施，故人工流产为避孕失败的一种必不可少的补救措施。据统计，我国每年约有1400万人次行人工流产术，人流虽然较安全、简便，但还有一定的并发症，对生殖道造成不同程度的机械损伤。抗早孕的化学药物有两种，一种为前列腺素(PG)，另一种为米非司酮(RU486)，两者合并应用有效率达88.8％。但由于该药价格较贵，合成工艺复杂；加之有较多的副反应，有时会引起不全流产乃至大出血。中草药是我国中医药学中的一大宝库，具有价格低、药源丰富之特点。自七十年代初开始对天花粉、旋复花等进行临床试验，并不断提纯。1987年以来应用结晶天花粉蛋白注射液抗早孕取得较好的效果，但孕妇需住院宫腔内给药，55.4％的病例有全身各种药物反应，病人较难接受，故而寻找一种理想的能替代人流术的药物是计划生育工作者的一项重要任务。中草药具有药源丰富、价格低的特点，虽然近年来有些临床应用的报道，但缺乏深入的研究。
滋养细胞肿瘤(包括绒毛膜癌和侵蚀性葡萄胎)是妇科较为常见的疾病，绝大多数患者为生育年龄的妇女。其病理学特点是增生的滋养细胞大片侵蚀子宫肌层及血管，早期发生全身转移，特别是肺转移及颅内转移，对妇女的健康及生命危害极大。50-60年代，此病的死亡率很高，文献统计绒毛膜癌的死亡率为90％以上，侵蚀性葡萄胎的死亡率在25％以上，并且大多患者因行子宫切除而丧失生育能力。自有效的化疗药物问世以后，使此病的死亡率显著下降。单纯化疗对于有生育要求患者而言是有利的，但近年来随着难治性、多药耐药性滋养细胞肿瘤的增多，常导致治疗失败。加之早期即可血行转移，局部手术达不到根治的目的。目前临床对恶性滋养细胞肿瘤的治疗仍以化疗为主，如5-Fu、5-MP、MTX等，化疗药物副作用大，耐药患者需多种药物同时反复注射，对造血、心、肝、肾功能造成严重的损伤。在我国医院收治的水泡状胎块(葡萄胎)患病率占妊娠总人数的0.6％，再次患病率增至3.74％，近年文献报道葡萄胎的恶变率为10％-20％之间。故而寻找一种抗滋养细胞肿瘤，抗耐药或延迟耐药的出现，预防良性葡萄胎恶变的有效药物是广大医药科技人员研究的热点。
目前，国内外对滋养细胞肿瘤的治疗仍为化疗、手术、放疗及免疫疗法，其中以化疗和手术疗法为主。大多研究内容为联合化疗药物的配伍，治疗剂量及用药时间的间隔。发掘祖国传统中药，寻找一种抗滋养层细胞肿瘤的有效药物研究近10年文献检索中未见报道。
一种制备上述的马鞭草提取物的方法，它由下列步骤组成步骤一、将马鞭草全草Wkg，用3W～8Wkg95％乙醇加热至沸，回流提取3小时，冷却，过滤，滤渣再用3W～8Wkg95％乙醇加热至沸，回流提取3小时，冷却，过滤除去沉淀，合并乙醇提取液，减压蒸馏回收乙醇(压力范围为0.08～0.09MPa，温度范围为60℃～70℃)，至无醇味，加水至0.15～0.25W升，使每毫升相当3.3～6.5生药，步骤二、将步骤一制得的乙醇提取物水溶液每次加0.1～0.3W升石油醚萃取3～4次，弃去石油醚萃取液，保留水溶液，步骤三、将步骤二所得的水溶液每次用0.1～0.3W升氯仿提取3～4次，合并氯仿提取液，减压蒸馏(压力范围为0.08～0.09MPa，温度范围为55℃～65℃)回收氯仿至无氯仿蒸出，得浸膏，即为本发明的马鞭草提取物。
上述的制备方法中，所述的石油醚是60～90℃的石油醚。
本发明的马鞭草提取物可以应用于制备抗早孕的药物。
本发明的马鞭草提取物可以应用于制备抗滋养层细胞肿瘤的药物。
本发明人以下列方法观察本发明的马鞭草提取物的药用价值以体外培养人早孕绒毛分离纯化的滋养层细胞及人绒毛膜癌JAR细胞为实验手段，应用细胞增殖抑制试验(MTT比色法)、3H-TdR及荧光显色法来观察本发明的马鞭草提取物对细胞的抑制作用；将本发明的马鞭草提取物给早孕小鼠灌服，观察其对孕鼠子宫、胎盘及胎鼠的影响；建立裸鼠人绒毛膜癌实体瘤的动物模型，观察本发明的马鞭草提取物的抗肿瘤的体内效果。
通过以上实验方法表明本发明的马鞭草提取物，对人早孕绒毛分离纯化的滋养层细胞有明显的抑制细胞增殖作用，HCG的分泌与对照组相比明显减少，并呈时间及剂量依赖；能使孕鼠胎盘滋养层细胞及蜕膜细胞染色质边聚，核空泡化，细胞固缩等退行性改变，明显抑制胚胎生长；对人绒毛膜癌JAR细胞有抑制增殖、促细胞凋亡的作用；裸鼠人绒毛膜癌实体瘤的动物模型，观察到了有抑制瘤体的发生、发展及延长荷瘤模型的生存时间，具有较为理想的体内作用。
四
图1为培养对照组绒毛组织HCG免疫组化(合体滋养细胞内有反应强棕黄色阳性颗粒)×400的显微照片；图2为加马鞭草提取物培养48小时后绒毛组织HCG免疫组化(阳性部位反应明显减弱)×400的光镜照片；图3为培养对照组绒毛组织SDH酶组化(合体滋养细胞表面见兰色阳性颗粒)×400的光镜照片；图4为加马鞭草提取物培养48小时后绒毛组织SDH酶组化(阳性部位反应减弱)×400的光镜照片；图5为培养48小时后人肝癌SMMC-7721细胞株×400的比相倒置显微镜照片；图6为加马鞭草提取物后48小时人肝癌SMMC-7721细胞株×400的比相倒置显微镜照片；
图7为培养48小时后人胚肺二倍体成纤维细胞株(2BS)×400的比相倒置显微镜照片；图8为加马鞭草提取物后48小时2BS×400的比相倒置显微镜照片；图9为马鞭草提取物组的孕鼠子宫与对照组相比明显改变；图10为马鞭草提取物组与对照组胎鼠的比较，其中a为米非司酮组，b为马鞭草提取物组，c为对照组；图11为加马鞭草提取物后24小时，JAR细胞(可见中央部分细胞死亡)×400的比相倒置显微镜照片；图12为加马鞭草提取物后48小时，JAR细胞(可见大片细胞死亡)×400的比相倒置显微镜照片；图13为3H-TdR掺入法显示加马鞭草提取物后对JAR细胞的抑制作用，其中，1为对照组；2为低剂量加药组；3为中剂量加药组；4为高剂量加药组；图14为对照组JAR细胞EGFR表达免疫组化染色(胞质、核膜见棕色反应物)×400的光镜照片；图15为20mg/mL马鞭草提取物作用48小时JAR细胞EGFR表达免疫组化染色(阳性反应物减少)×400的光镜照片；图16为对照组JAR细胞荧光染色(兰色为活细胞，红色为死细胞)×200的荧光显微镜照片；图17为加马鞭草提取物后24小时JAR细胞荧光染色(死细胞数量增多)×200的荧光显微镜照片；图18为加马鞭草提取物后48小时JAR细胞荧光染色(死细胞数量更多)×200的荧光显微镜照片；图19为加马鞭草提取物后72小时JAR细胞荧光染色(细胞大多死亡)×200的荧光显微镜照片；图20为JAR细胞荧光染色的荧光显微镜照片，其中a为活细胞×200，b1为早期凋亡细胞×200，b2为早期凋亡细胞×400，c为晚期凋亡细胞×400，d为凋亡细胞核呈碎片状；图21为早期凋亡细胞电镜像×14000，染色质边聚，核呈空泡状，线粒体髓样改变；
图22为凋亡细胞电镜像×6000，见凋亡小体(↑)；图23为培养48小时后对照组JAR细胞流式分析图；图24为加马鞭草提取物后48小时JAR细胞流式分析图，见明显的凋亡峰；图25为裸鼠人绒毛膜癌实体瘤模型，下图为放大图，△为实体瘤。
实施例2.马鞭草提取物的制备步骤一、马鞭草全草10kg，用30kg的95％的乙醇加热提取两次，每次3小时，冷却过夜，滤去沉淀，减压蒸馏回收乙醇(0.09MPa，70℃)，至无醇味，加水定容至1500毫升(相当6.5g生药/mL)，步骤二、将步骤一得到的水溶液用石油醚(60～90℃)萃取3次，每次用1500mL，保留水层，步骤三、将步骤二保留的水层加入氯仿提取4次，每次用1500mL，减压蒸馏(0.09MPa，65℃)，回收氯仿至无溶剂蒸出，得浸膏，即为本发明的马鞭草提取物，此马鞭草提取物每毫升相当马鞭草生药100克。
实施例3.马鞭草提取物的制备步骤一、马鞭草全草10kg，用50kg的95％的乙醇加热提取两次，每次3小时，冷却过夜，滤去沉淀，减压蒸馏(0.09MPa，70℃)，回收乙醇，至无醇味，加水定容至3000毫升(相当3.3g生药/mL)，步骤二、将步骤一得到的水溶液用石油醚(60～90℃)萃取3次，每次用3000mL，保留水层，
步骤三、将步骤二保留的水层加入氯仿提取4次，每次用3000mL，减压蒸馏(0.09MPa，65℃)，回收氯仿至无溶剂蒸出，得浸膏，即为本发明的马鞭草提取物，此马鞭草提取物每毫升相当马鞭草生药100克。
实施例4.马鞭草提取物的抗早孕药效研究a)体外实验以人早孕绒毛分离纯化的滋养层细胞作为实验手段，于体外培养72小时后加入不同浓度的马鞭草提取物，结果表明相当20mg/mL马鞭草生药的马鞭草提取物能明显抑制细胞增殖，HCG的分泌与对照组相比明显减少，并呈时间及剂量依赖(见表1)。
b)体内实验将马鞭草提取物于早孕小鼠灌服，观察其对孕鼠子宫、胎盘及胎鼠的影响。
结果表明一定剂量的马鞭草提取物，能使孕鼠胎盘滋养层细胞及蜕膜细胞染色质边聚，核空泡化，细胞固缩等退行性改变，明显抑制胚胎生长，胚重0.100±0.08g、胚长0.23±0.12cm，与生理盐水对照组胚重0.23±0.17g、胚长0.84±0.24cm，相比有显著差异(见图9、10，表2)。应用NYD-1000显微图象分析系统对胎盘微血管分布的绝对面积与相对面积进行定量分析，结果发现明显小于对照组。动物实验结果提示一定浓度的马鞭草提取物能致滋养细胞及蜕膜退行性改变，使胎盘组织萎缩，血流量减少，从而影响胚胎正常的生长发育。体内实验结果与体外滋养层细胞培养结果互为佐证，进一步说明抗早孕的作用机制。
实施例5.马鞭草提取物对早孕绒毛滋养层细胞形态及功能的影响应用本室建立的滋养层细胞形态学研究的方法，于加药后对细胞进行光镜、电镜观察结构的变化；SDH酶组织化学、HCG免疫组织化学定量分析、表皮生长因子受体表达等细胞生物学及分子生物学方法，研究其影响。
a)对滋养层细胞增殖分化的影响分离纯化的滋养层细胞于培养24小时后，细胞逐渐向外生长，48小时生长旺盛，密度增加，细胞分裂相多，并见多数细胞聚集，有的相互融合形成多核的合体细胞。换培养液后，对照组继续增殖，72小时细胞交织在一起形成大面积单层细胞。实验组换液加马鞭草提取物后继续培养，相当20mg/mL马鞭草生药的马鞭草提取物能明显抑制其生长，48小时细胞增殖抑制率为58.7±2.0，与对照组相比P＜0.01，72小时抑制更为明显，抑制率为78.3±3.1，P＜0.001(见表1)。
b)对滋养层细胞超微结构的影响对照组细胞膜完整，微绒毛发达，细胞内线粒体丰富，滑面内质网发达，核染色质疏松。加马鞭草提取物后48小时可见细胞微绒毛明显变短、减少，溶酶体及线粒体减少，滑面内质网扩张。髓样小体增多，染色质边聚，核中央电子密度变低。
c)对滋养层细胞分泌HCG的影响应用本室建立的HCG单克隆酶免定量法，连续测定培养液中HCG的含量，对加马鞭草提取物后的滋养层细胞分泌HCG作动态变化观察。对照组48小时换液后HCG分泌量逐渐增多，48小时达换液前水平，72小时超过基数的22.6％。20mg/mL加马鞭草提取物组加药后48小时，培养液中HCG量为相应时间对照组的33.6％(P＜0.05)，72小时为14.7％(P＜0.01)。随着加药的浓度增加，HCG分泌量减少，存在剂量依赖关系(见表3)。
d)对滋养层细胞琥珀酸脱氢酶(SDH)的活性及绒毛膜促性腺激素(HCG)合成的影响SDH酶组织化学及HCG免疫组织化学反应，应用NYD-1000显微立体图象分析系统对SDH、HCG进行定量分析，相当20mg/mL生药加马鞭草提取物组SDH活性抑制率为73.4％，HCG合成抑制率为67.8％，并随着加药剂量增加而抑制越趋明显(见图1-4，表4)。
实施例6.马鞭草提取物的细胞毒性实验为了进一步确定该有效部位对滋养层细胞抑制作用是否系一般细胞毒性作用还是特异性作用，本实验以同剂量的药液作用于体外培养的人胚肺二倍体成纤维细胞株、人肝癌SMMC-7721细胞株及人绒毛膜癌JAR细胞株。结果显示，本发明的马鞭草提取物对人胚肺二倍体成纤维细胞株及人肝癌SMMC-7721细胞株的生长无明显抑制作用，对人绒毛膜癌JAR细胞有显著的抑制作用，并呈剂量及时间依赖(见图5～8)。以上结果说明该部位对滋养层细胞的作用具有特异性，包括正常及病理滋养层细胞。
实施例7.马鞭草提取物对人绒毛膜癌JAR细胞抑制作用的机制研究观察一定浓度马鞭草提取物对人绒毛膜癌JAR细胞抑制作用，并研究其作用的分子生物学机制。
实验结果显示一定浓度的马鞭草提取物致JAR细胞表皮生长因子受体(EGFR)表达减少(见图14、15)，细胞增殖抑制(见图11、12)，具有促细胞凋亡作用。
3H-TdR法显示加药后48小时细胞增殖仅为相应对照组的30.05％(见图13)；应用免疫组织化学ABC法显示EGFR的表达为对照组的27.04％；AO/EB荧光染料复合染色、荧光显微镜下可见凋亡细胞(见图16～20)；透射电镜下有明显的凋亡小体(见图21、22)；流式细胞术出现凋亡峰(见图23、24)。
在此基础上，我们已建立了裸鼠JAR细胞实体瘤的动物模型(见图25)。初步观察到了马鞭草提取物有抑制瘤体的发生、发展及延长荷瘤模型的生存时间，具有较为理想的体内作用。表1a加药后24h马鞭草提取物对滋养层细胞增殖抑制率(X±S)药物浓度(mg/mL)10 20 40马鞭草提取物13.7±1.023.4±2.638.6±3.1对照组 1.7±0.5表1b加药后48h马鞭草提取物对滋养层细胞增殖抑制率(X±S)药物浓度(mg/mL)10 20 40马鞭草提取物15.2±3.358.7±2.083.8±5.4对照组 4.3±1.2表1c加药后72h马鞭草提取物对滋养层细胞增殖抑制率(X±S)药物浓度(mg/mL)10 20 40马鞭草提取物25.8±1.778.3±3.993.3±2.7对照组 3.7±0.8表2马鞭草提取物对孕鼠胚胎的影响(X±S)组别 胚胎重量(g) 胚胎长度(cm)对照组0.23±0.170.84±0.23低剂量组 0.16±0.060.56±0.13高剂量组 0.10±0.08** 0.23±0.12***米非司酮组0.04±0.060.18±0.07**P＜0.05；***P＜0.01表3马鞭草提取物对滋养层细胞HCG分泌的影响(X±S)组别培养液中HCG量(mg/L)(g/L)24h 48h72h对照组 0.48±0.12 0.88±0.08 1.21±0.1110 0.45±0.13 0.66±0.23 0.83±0.0820 0.39±0.11 0.30±0.04 0.13±0.0640 0.32±0.05 0.08±0.02 0.06±0.01表4加药后48小时SDH酶组化及HCG免疫组化反应平均A值及抑制率(X±S)组别 SDH酶组化反应 HCG免疫组化反应(g/L)平均A值 活性抑制率(％) 平均A值 活性抑制率(％)对照组 17.6±5.2 0 53.4±9.8010 14.2±2.7 19.9 48.7±6.9 10.620 4.7±1.3 73.4 17.2±2.8 67.840 2.0±0.9 88.6 9.9±1.481.5
权利要求
1.一种马鞭草提取物，其特征是它是由中药材马鞭草全草用乙醇提取，浓缩乙醇提取液，加水，以石油醚提取，弃去石油醚提取液，水层用氯仿提取，蒸馏氯仿提取液所得的浸膏，即为本发明的马鞭草提取物。
2.一种制备权利要求1所述的马鞭草提取物的方法，其特征是它由下列步骤组成步骤一、将马鞭草全草Wkg，用3W～8Wkg95％乙醇加热至沸，回流提取3小时，冷却，过滤，滤渣再用3W～8Wkg95％乙醇加热至沸，回流提取3小时，冷却，过滤除去沉淀，合并乙醇提取液，在压力为0.08～0.09MPa，温度为60℃～70℃减压蒸馏回收乙醇，至无醇味，加水至0.15～0.25W升，使每毫升相当3.3～6.5生药，步骤二、将步骤一制得的乙醇提取物水溶液每次加0.1～0.3W升石油醚萃取3～4次，弃去石油醚萃取液，保留水溶液，步骤三、将步骤二所得的水溶液每次用0.1～0.3W升氯仿提取3～4次，合并氯仿提取液，在压力为0.08～0.09MPa，温度为55℃～65℃减压蒸馏，回收氯仿至无氯仿蒸出，得浸膏，即为本发明的马鞭草提取物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是所述的石油醚是60～90℃的石油醚。
4.根据权利要求1所述的马鞭草提取物在制备抗早孕的药物中的应用。
5.根据权利要求1所述的马鞭草提取物在制备抗滋养层细胞肿瘤的药物中的应用。
全文摘要
一种马鞭草提取物，它是由中药材马鞭草全草用乙醇提取，浓缩乙醇提取液，加水，以石油醚提取，弃去石油醚提取液，水层用氯仿提取，蒸馏氯仿提取液所得的浸膏，即为本发明的马鞭草提取物。本发明公开了其制备方法。本发明的马鞭草提取物可以应用于制备抗早孕的药物及制备抗滋养层细胞肿瘤的药物。
文档编号A61K31/7048GK1451661SQ0311347
公开日2003年10月29日 申请日期2003年5月14日 优先权日2003年5月14日
发明者徐昌芬, 曾群, 徐珊, 罗莉 申请人:南京医科大学