专利名称：治疗乙型肝炎的药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及到一种由天然植物药材中提取的单体成份，尤其是对乙型肝炎有治疗作用的由该单体成份制成的药物。
背景技术：
乙型肝炎是一种常见疾病，其对人类的危害是众所周知的，许多研究者对治疗乙型肝炎的药物做了大量的研究，也有许多药物及药物组合物进行了公开报道。但是用三七总皂甙提取单体作为有效活性成份用于治疗乙型肝炎的药物尚未见报道。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种用人参皂甙Rg1为唯一活性药用成份辅以药用辅料制成的治疗乙型肝炎的药物。
本发明所述的治疗乙型肝炎的药物由以下成分组成重量百分比为50-99％的人参皂甙Rg1和余量的药用辅料。
上述人参皂甙Rg1的含量范围还可为60-99％，Rg1的纯度为90％以上。
本发明的药物含有治疗有效量的人参皂甙Rg1为活性成分，以及含有一种或多种药学上可接受的载体。
上述的药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体。
本发明的药物可按已知方法制成的口服片剂、软胶囊、硬胶囊、颗粒剂或口服液体制剂、水针剂、缓释、控释剂等制剂。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。
本发明药物的施用量可根据用药途径、患者的年龄、体重、所治疗的疾病的类型和严重程度等变化，其日剂量可以是50-500mg。
本发明药物主要用于乙型肝炎的治疗。
本发明所述药物的动物急性试验小鼠在24小时内灌胃给药3次，每次0.8ml/20g(120ml/，7200mg/kg)，，按体重计算，相当于人用剂量(每日90mg/60kg)的4800倍，无毒性反应。小鼠在24小时内腹腔注射给药3次，每次0.4ml/20g(60ml/kg，3600mg/kg，按体重计算，相当于人用剂量(每日90mg/60kg)r的2400倍，无毒性反应。
本发明所述药物的鸭乙型肝炎动物模型的药物抑制试验一、实验动物实验动物为江浙地区特有的鸭禽种系麻鸭，经筛选确认为垂直传播感染、DHBV DNA检测阳性的麻鸭，本实验动物模型经国家“六五”肝炎攻关课题确立、实验动物为上海市医学实验动物委员会认可。本实验选用十月龄雌性麻鸭，体重范围为900-1100克。
二、受试药物本发明所述药物，每片含60mg，由云南特安呐制药股份有限公司提供。
三、阳性对照药物贺普丁片，每片含拉米夫定100mg，由英国葛兰素威康药业有限公司研制和生产。该品是目前国内外公认并得到美国FDA和我国卫生部认可的唯一抗乙肝病毒有效药物，所以可以作为本发明所述药物的阳性对照药物。
四、受试药的剂量选择和给药方法口服途径给药，用于观察本发明所述药物抗乙肝病毒作用及改善鸭肝病理炎症的作用。
参考人和动物间体重和体表面积等效剂量比率折算，确定试验中本发明所述药物的给药剂量为20mg/kg、40mg/kg和80mg/kg，因给药周期较长，故采用隔日给药一次以减少喂饲操作的刺激。实际每次给药量是60mg/kg、120mg/kg和240mg/kg。
五、试验分组本发明所述药物分为低、中、高三个剂量组，剂量分别为60mg/kg、120mg/kg和240mg/kg。均为口服途径给药，每周三次给药，连续给药12周。
贺普丁阳性对照组，剂量100mg/kg，亦为口服途径给药，每周三次给药，连续给药12周。
此外，实验又设DHBV DNA(+)和(-)两个对照组。
六、观察指标实验组和对照组的麻鸭分别在给药前、给药后第四周、第八周、第十二周和停药后第二周时静脉采血，作血清的DHBV DNA水平的定量PCR检测。在停药后两周，各组麻鸭同时放血处死取肝脏，福尔马林固定液固定和2.5％戊二醛固定液保存，分别作鸭肝常规病理和电镜检查。
七、结果1、各组麻鸭血清DHBV DNA含量变化从表1中半定量数据可见，本发明所述药物不同剂量组麻鸭血清DHBVDNA含量在用药后均有5-9只麻鸭出现DHBV DNA水平下降，各组DHBV DNA平均含量分别下降32.65％(高剂量240mg/kg组)、20.71％(中剂量120mg/kg组)和51.56％(低剂量60mg/kg组)，实验观察中本发明所述药物低、中剂量组各有1只动物血清出现DHBV DNA转阴，并且各有一只持续转阴至停药观察结束。
以上实验结果提示本发明所述药物有较好的抗病毒作用，可抑制鸭乙肝病毒DNA的复制，降低血清DHBV DNA含量。
同时发现，血清DNA含量在本发明所述药物停药后第2周时仍能基本维持于停药时水平，未见某些药物(如膦甲酸钠和阿昔洛韦)所常见的停药后“反跳”或回升现象，表明本发明所述药物有较好的持续抗病毒复制作用。
本实验中，DHBV DNA(+)组麻鸭的血清DHBV DNA含量虽略有变化，但与药物组的变化相比有明显差别，实验前后的变化经统计学检验无显著性意义。在阳性药物对照组可见贺普丁有明显的抗病毒作用。
2、各组麻鸭病理检查结果a、各组光镜病理检查结果见表2和表3。
光镜下DHBV(+)实验对照组，麻鸭肝组织炎性变化介于“±～+++”之间，平均加权为1.1818，出现较明显炎症改变，类似慢性迁延性肝炎的变化，主要表现为肝组织汇管区炎症和小叶实质炎症明显，肝细胞肿胀显著，窦细胞活跃，汇管区胆管增生，并有明显脂肪性变。贺普丁阳性对照组与病毒阳性对照组有一定差异，其观察数据比病毒阴性的对照组的还低，说明该有效药物同时能改善一般炎症，从表3结果对比中可见，药物对病理炎症改善的有效度由高到低依次为本药物高剂量组、中剂量组、低剂量组。
相对而言，病理观察发现，本药物有较好的药物疗效，其中高剂量组比有效药物贺普要对照组的稍好。
b、各组电镜观察结果DHBV DNA(-)对照组肝细胞排列整齐，核圆，有核仁。胞质中有线粒体，个别有轻度肿胀。粗面内质网丰富，糖元聚集大片，有较多脂滴。胆小管可见，结构好，附近有髓样小体。血窦结构完整，窦壁有枯氏细胞，腔中有红细胞、淋巴细胞等。
DHBV DNA(+)对照组肝细胞结构尚好，排列整齐，核卵圆或有轻度变形，核仁明显。胞质中有线粒体，少数内质网轻度肿胀，糖元聚集，但有的切片也见糖元丢失，并见大量脂滴。胆小管结构好，微绒毛丰富，附近有脂褐素颗粒，血窦壁完整，有枯氏细胞，其中含吞噬体，腔内有红细胞和淋巴细胞，也可见淋巴细胞向肝细胞浸润，并侵入肝细胞的现象，储脂细胞可见，但不多。
阳性药物贺布丁对照组肝细胞排列整齐，核圆，有核仁，胞质中有线粒体和粗面内质网，糖元聚集成片但有挂失现象，脂滴多，有些很大，胆小管结构好，其中一例有扩张。血窦壁完整，有一例有储脂细胞，窦上枯氏细胞较多，有吞噬体，腔内有淋巴等细胞，并见淋巴细胞向肝细胞浸润。
本药物低剂量组肝细胞核园有核仁，线粒体、内质网丰富，糖元聚集，有的有丢失现象。脂滴特大、核呈新月形。肝细胞间胆小管有不同程度扩张，有的结构尚好。血窦壁完整，枯氏细胞可见成不同程度的活跃状态。血窦中可见淋巴细胞，有向肝细胞浸润。
本药物中剂量组肝细胞园核有核仁，部分结构好，线粒体有不同程度的肿胀，内质网和糖元丰富，糖元可见有丢失，脂滴较少。肝细胞间胆小管结构好，血窦壁完整，少量枯氏细胞，不活跃，未见有淋巴细胞及淋巴细胞浸润现象。
本药物高剂量组肝细胞排列尚好，核园有核仁，胞质中有线粒体，内质网有不同程度肿胀和扩张，糖元也有丢失，脂滴量少至中等。胆小管一般尚可。血窦壁完整，有少量枯氏细胞，其中有吞噬体，但不活跃，细胞间有淋巴浸润，但数量不多。
本发明所述药物对四氯化碳、脂多糖/D-半乳糖胺所致小鼠肝炎的影响一、试验药物本发明所述药物，含量为15mg/片。
阳性对照药乙肝宁冲剂，长沙九芝堂生产。
二、试验动物，ICR小鼠22±4g，7-8周龄，雌雄兼用，购于云南省天然药物重点实验室。
三、试验方法将小鼠随机分为常水组，乙肝宁冲剂组及本发明所述药物30mg/kg、90mg/kg、180mg/kg共五组。一天一次连续灌胃给药7天，于灌胃第6天时ip0.1％CCl4(10ml/kg)和LPS(lug/kg)D-GalN(700mg/kg)，24小时后摘眼球取血，分离血清，分别用ALT和AST测定试剂盒测定血清中的ALT和AST活性；并处死小鼠取其肝脏进行病理组织学观察。计量资料采用成组t检验进行统计学处理。
四、结果1、本发明所述药物对四氯化碳肝炎模型小鼠肝功能的影响由表4可见，与常水组相比，本发明所述药物各剂量组和乙肝宁冲剂组小鼠血清ALT水平均明显下降，本发明所述药物90mg/kg，180mg/kg还明显降低小鼠血清AST水平，其中以中剂量(90mg/kg)组的降酶作用最为显著。病理组织切片发现，常水对照组的小鼠肝细胞出现出血性片状、灶状坏死，肝间质充血明显，而给药组小鼠出血性坏死数目减少，出血性坏死程度明显减轻，但仍可见到间质充血。
2、本发明所述药物对脂多糖D-半乳糖胺所致小鼠肝功能及小鼠死亡率的影响表5表明，本发明所述药物各剂量组和乙肝宁冲剂组小鼠血清ALT水平明显低于常水对照组，本发明所述药物90mg/kg，180mg/kg还明显降低小鼠血清AST活性。由表6可见，常水对照组小鼠的死亡率为54％，而乙肝宁冲剂组和本发明所述药物低、中、高剂量组小鼠死亡率分别为28％，32％，25％和18％均较常水对照组死亡率低。病理组织学观察发现，给药组肝细胞片状及灶状坏死的数目，肝间质充血、出血的程度较常水对照组轻。
五、结论本发明所述药物30mg/kg，90mg/kg，180mg/kg均可明显降低CCI4和LPS/GalN引起的两种肝炎模型小鼠血清ALT活性升高；90mg/kg，180mg/kg还可明显降低两种肝炎模型小鼠AST血清含量；病理组织学观察发现，给药组小鼠肝损伤程度明显降低。此外，本发明所述药物各剂量组均使LPS/GalN所致小鼠死亡率降低。提示本药物对CCI4和LPS/GalN所致肝炎有良好的防治作用。
表1为各给药组麻鸭血清DHBV DNA含量测定结果。
表2为光镜下肝炎病理分级标准。
表3为光镜下实验组和对照组鸭肝并理炎症变化比较。
表4为本发明所述药物对四氯化碳所致小鼠肝炎血清ALT和AST的影响。
表5为本发明所述药物对脂多糖/D-半乳糖胺所致小鼠肝炎血清ALT和AST的影响。
表6为本发明所述药物对脂多糖/D-半乳糖胺所致坏死性肝炎小鼠死亡率的影响。
具体实施例方式
实施例1取重量百分比为90％、纯度为90％的人参皂甙Rg1和余量的常用口服片剂药用辅料，按照片剂常规制造工艺制得人参皂甙Rg1口服片剂。
实施例2取重量百分比为70％、纯度为90％的人参皂甙Rg1和余量的基质PEG-6000，将人参皂甙Rg1和基质混合置于容器中，加热至80-95℃，搅拌混合均匀，保温80-90℃过滤，溶液置于滴丸机中，根据丸重大小要求，装好尺寸相应的滴头，控制冷却液温度在15℃以下，滴距4-8cm滴制，得到滴丸。
本药物 采血时间片剂剂量P值**(mg/KG)给药前 给药后第4周 第8周 第12周 停药后2周A1+++ +++ +++ ++++++A2+++ ++ +++++A3+++++++ ++++ ++++ ++++A4+++++++ ++++ ++++ ++++A5++++++++++ 死亡P＜0.0560mg/kg A6+++++++ ++ +++++A7+++++-+++++A8++++++ ++ +++++++A9+++ +++ ++ +A10 + --- -A11 ++++++ +++ ++++ ++A12 +++++++ +++ ++ +B1++++++++ +++ ++++ ++++B2++ ++ +++ ++++ ++++B3+++ +++ ++ ++++++B4+++ ++++ +B5+++ ++ -- + P＜0.05120mg/kg B6+++ +++ ++++++++B7++++++++ ++++++B8+++ ++ ++ ++ ++B9+++ +++ +++ + +B10 +++ +++ +++++++B11 ++++++ ++++ ++++++B12 ++ --- -表1
本药物 采血时间片剂剂量 P值**(mg/kg)给药前 给药后第4周 第8周 第12周 停药后2周C1++++++++ +++ +++C2+++ +++ +++ +++C3+++ +++ +++ +++ +++C4+++++++ ++++++++++++C5+++++++ ++ ++ ++240mg/kg C6+++ ++ ++ ++P＜0.05C7+++ +++ ++ + +C8+ ++ ++ +C9+++ +++ +++ +++ +++C10 +++ ++ +++ +++ +++C11 ++++++ ++ + +++C12 ++ +++ ++ ++D1++++++++ ++++++++++++D2++++++++ +++++++ ++++D3++++++++ +++ +++ +++D4+++ +++ +++ +++ +++DHBV(+) D5++++++++ +++ ++++++++ P＞0.05对照组 D6++++++++ +++ +++ +++D7+++ +++ +++ +++ +++D8++++++++ ++++++++++++D9++++++++ ++++死亡D10 ++ ++ ++ ++ ++++D11 ++++++++ ++++++++++++D12 ++++++ +++ +++++++*表中++++相当于DHBV DNA含量为100pg；+++为50pg；++为25pg；+为10pg。
**表列数据经自然对数转换后作自身前后比较的方差分析，用药前后有显著性差异表1
采血时间组别 P值**给药前 给药后第4周 第8周 第12周 停药后2周E1 - -- - -E2 - -- - -E3 - -- - -E4 - -- - -DHBV(-) E5 - -- - - P＞0.05对照组 E6 - -- - -E7 - -- - -E8 - -- - -E9 - -- - -E10 - -- - -E11 - -- - -E12 - -- - -F1 +++ ++ + + ++F2 +++ +++ + +++F3 +++ ++ + + +++F4 +++++++ +++ +++贺普丁 F5 ++ +++ ++ +++P＜0.01阳 性 F6 ++ +++ + +++对照组 F7 +++ ++ + +++ ++++100mg/kg F8 ++++-+| + +F9 ++ -- + ++F10 +++++++ ++ ++F11 ++++-+ ++ ++++F12 ++++++ ++ +++*表中++++相当于DHBV DNA含量为100pg；+++为50pg；++为25pg；+为10pg。
**表列数据经自然对数转换后作自身前后比较的方差分析，用药前后有显著性差异表1
分汇 管 区肝细胞小叶实质 界板破坏 纤维及小 肝细胞 肝细胞级炎细胞浸润胞 浆炎症碎屑样坏死胆管增生 脂肪变性 空泡变0+/- 少量 略疏松少量个别小灶+中等 疏松 偶有点状坏死 轻微 25％以下少量嗜酸性小体++多量，扩展疏松 巨灶性坏死 局限性 增生，向小叶 50％以下中等空泡 伴炎性浸润内伸展+++ 大量，扩大疏松 散在多量灶 多处 向小叶放射伸 75％以下大量延伸 大量空泡 性坏死 展，微胆总管显增多表2各组病理炎症变化分级 总 加权脂肪变组 别 0.25 0.5 0.75 1.0 1.50 2.0 2.50例 平均 (例)0～+ +- +-～+ + +～++ ++ ++～+++病毒(-)对照组 5 4 3 12 0.70838病毒(+)对照组 2 4 1 1 21 12 1.18187阳性药物对照组7 4 1 12 0.62508七生力片剂(低)5 2 211 12 0.95457七生力片剂(中) 2 7 2 2 1 12 0.79178七生力片剂(高)8 412 0.58336表3
(X±SD，n＝10)组 别ALT AST(U/L) (U/L)低剂量组(30mg/kg) 576.55±130.03*542.21±76.36中剂量组(90mg/kg) 367.08±152.77***377.91±126.40**高剂量组(180mg/kg) 397.52±156.01**360.78±129.92**常水对照组 729.23±173.12 677.07±246.68乙肝宁冲剂组(17g/kg) 380.82±159.87***398.74±145.24***P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，vs常水对照组表4(X±SD，n＝10)组别 ALT AST(U/L) (U/L)低剂量组(30mg/kg) 535.85±368.11*671.62±279.69中剂量组(90mg/kg) 441.22±183.97***495.28±125.50***高剂量组(180mg/kg)488.68±297.64**538.28±346.39*常水对照组862.99±248.04 903.14±298.78乙肝宁冲剂组(17g/kg) 511.55±286.35**597.50±231.43**P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，vs常水对照组表5组 别 死亡只数 死亡率％低剂量组(30mg/kg) 9 32％中剂量组(90mg/kg) 7 25％高剂量组(180mg/kg) 5 18％常水对照组 15 54％乙肝宁冲剂组(17g/kg)18 28％表权利要求
1.一种治疗乙型肝炎的药物，其特征在于由以下成分组成重量百分比为50-99％的人参皂甙Rg1和余量的药用辅料。
2.根据权利要求1所述的治疗乙型肝炎的药物，其特征在于所述的人参皂甙Rg1的含量范围为60-99％。
3.根据权利要求1所述的治疗乙型肝炎的药物，其特征在于所述的人参皂甙Rg1的纯度为90％以上。
全文摘要
本发明涉及到一种由天然植物药材中提取的单体成分，尤其是对乙型肝炎有治疗作用的由该单体成分制成的药物。一种治疗乙型肝炎的药物，由以下成分组成重量百分比为50－99％的人参皂甙Rg
文档编号A61K31/704GK1565463SQ0314880
公开日2005年1月19日 申请日期2003年6月12日 优先权日2003年6月12日
发明者唐修文 申请人:唐修文