专利名称：大肠杆菌热不稳定毒素作为鸟类和家禽的佐剂的用途的制作方法
技术领域：
本发明总体上涉及免疫学领域，提供用于接种鸟类和家禽来抵抗粘膜病原体的佐剂组合物和方法。本发明特别涉及生产免疫原性肽、蛋白和佐剂的遗传改良植物的用途。
长期以来，一直认为口服接种是一种简便和非创伤性的施用疫苗的方法。可食用疫苗完美地结合了药物治疗的便捷和已经建立的动物饲养实践，因此对于动物健康业特别有吸引力。尽管在20世纪60年代以后已经成功地试验了口服的脊髓灰质炎疫苗，但商品化的口服疫苗，特别是利用非活性的抗原来激活免疫反应的疫苗非常少。转基因植物提供了一种经济地生产用于可食用疫苗的抗原的途经。首次在该领域报道的研究可以见于美国专利5,654,184；5,679,880和5,686,079。这种转基因植物提供了结合利用可接受的动物饲养实践的特点和将口服抗原呈递到粘膜组织来接种的便捷的方法。
为成功地获得可食用疫苗，必须穿越复杂的消化道环境。存在于脊椎动物的消化道、呼吸道和生殖道中的粘膜相关淋巴组织(MALT)实际上是最丰富、最全面的免疫系统之一。任何通过肠粘膜相关淋巴组织(GALT)能够在消化道中激活免疫反应的抗原在进入消化道时面临混合的环境。口腔和其他消化器官含有参与食物消化的宽范围的pH值、酶、去垢剂和共生的微生物。
共生的微生物常常比构成消化道本身的细胞的数量多。Savage，D.1999.Mucosal Microbiota，Mucosal Immunity，eds(P.Orga，J.Mestecky，M.Lamm，W.Strober，J.Biennenstock，J.McGhee)Academic Press，Inc.pp19-30。尽管如此，这些共生的微生物产生有用的功能，并且处于被GALT的免疫系统所能“耐受”的稳定状态下。抗原面临着与摄取的并且处于不同消化阶段的食物成分和其他环境组分的竞争。免疫系统必需持续地检测消化道、呼吸道和生殖道中的相对于自体抗原的包括食物抗原的外来抗原，这些抗原具有“自身”特征，在免疫学上是耐受的。最后，具有被动和主动转运机制、由绒毛状和具有成行的粘液的滤泡上皮构成的先天性免疫屏障，以稳定的流量给粘膜表面提供营养成分和必要的分泌物。
尽管消化道的环境很复杂，极少量的生物活性(肠道活性)物质能够诱导免疫反应。粘膜系统的两种最可能的免疫激活物，大肠杆菌(E.coli)的热不稳定毒素(LT)和霍乱弧菌(V.cholera)的霍乱毒素(CT)，当用口服管饲时即使是几微克也能够激活血清学反应。Isaka，M.等，1998，Vaccine 161620-1626；Rappuoli，R.等，1999；Immunol.Today.20493-499；和Isaka，M.等，2000，Vaccine 18743-751。因此，粘膜表面能够被少量生物活性蛋白如LT和CT成功地突破。但是，由于LT和CT的肠道致病产毒活性，不建议将天然形式的LT和CT作为安全地用于人或动物的口服佐剂。
与非活性的抗原相反，粘膜活性蛋白如CT和LT的主要特征之一是CT和LT是肠道受体(GM1-神经节苷脂)的配体，该受体允许低浓度的这些毒素进入(侵入)。这与非活性的抗原相反，非活性抗原不具有侵入能力，被稀释并经受肠道的消化环境。Dogma提出，非侵入的抗原需要大剂量(毫克用量)和多次施用来通过肠道粘膜表面激活免疫反应。然而，可能需要大剂量的抗原和多次施用来饱和消化环境。由于大部分的抗原被降解或吸收，可能需要极少量抗原来筛选和激活后天的免疫反应。
由于LT和CT是致病性的，它们成为致力于降低或消除其致病性而保存其佐剂活性的重要的生物化学和遗传研究的对象。LT和CT具有相似的四级蛋白结构，其中这两种蛋白都由寡聚“B”亚基(分别为LT-B和CT-B)和单一的“A”亚基(分别为LT-A和CT-A)组成，“B”亚基具有G1神经节苷脂受体特异性，“A”亚基具有ADP核糖基转移酶活性。涉及LT的研究已经制备了大量的类似物，并在哺乳动物中测试了它们的免疫原性的和佐剂的特性。通过在“A”亚基中进行氨基酸取代和缺失来降低肠道致病活性而不减少该毒素的佐剂特性，已经制备了LT毒素的一些类似物(Ghiara等，1997，Infect.Immun.，654996-5002)。但是，极少关于这种毒素在鸟类中作为佐剂或免疫原的用途的信息。
Hoshi等，1995，Vaccine，13245-252和Meinersmann等，1993，AvianDis.，37427-432，报道在鸟类中口服施用CT未能增强抵抗口服施用的破伤风毒素或灭活的传染性法氏囊(bursal disease)病毒的系统的和粘膜体液的反应。Takeda等，1996，Vet.Microbiol.，5017-25证明，鼻内和皮下施用CT-B能够增强对新城疫病毒的体液反应。此外，Vervelde等，1998，Vet.Imunol.Immunopath.，62261-272报道，在小鸡中肠道内手术施用CT提高对肠道内和手术施用Eimeria抗原的体液反应。因此，可以得知，即使将CT通过手术施用到肠道来表明已经结合到肠道上皮上，在鸟类中通过口服施用CT不能产生佐剂效应。
基于大量与LT和CT在广泛的各种哺乳动物中的肠道致病性和佐剂效果相关的文献实例，可以预期在鸟类中也能产生类似效果。令人意外地发现，在口服施用从纯化的毒素到原地植物生产的毒素的各种形式的天然LT和CT毒素时，家鸡不出现腹泻和其他肠道致病性效果的症状，但是仍然产生免疫反应。
还没有描述在家禽中表达热不稳定毒素的肠道致病性大肠杆菌，也没有报道LT作为粘膜免疫原或佐剂的用途。家禽可以在幼龄时部分地通过B细胞分化器官(腔上囊)进行免疫接种，该分化器官在孵化前具有活性。Dibner，J.J.等，1998，Applied Poultry Research 7427-436。因此，鸟类在出生之日进行免疫接种能够降低肠道中竞争或降解非活性抗原的食物、微生物和消化酶的负荷。
在本说明书中描述的研究证明，天然LT和LT-B诱导血清学反应，在通过鼻内(IN)、皮下、卵或口服路径免疫接种毒素后的仅仅21天后在血清IgG中可以检测到该反应。类似地，通过口服或IN路径，表达天然序列LT-B和灭活的LT-A类似物的转基因烟草NT-1细胞能够诱导血清学反应，而该毒素或植物材料不会产生任何的副作用。此外，当通过口服或皮下路径施用时，意外地发现，以高于报道的在小鼠中致死的和在人中引起肠道疾病的剂量施用天然LT，对于肉用仔鸡(broiler)不是致病性的。
可以将本发明概括为一种含有佐剂量的选自大肠杆菌热不稳定毒素(LT)或大肠杆菌热不稳定毒素类似物(LT类似物)的蛋白的组合物对鸟类接种时作为佐剂的用途。本发明还包括对鸟类接种的方法，包括给鸟类施用佐剂量的任一要求保护的组合物，特别是当这种组合物用转基因植物制备和/或以加工的或未加工的转基因植物材料的形式施用。
附
图1为用于转化NT-1细胞的pSLT107的图谱。T-DNA的左、右边界(left and right borders)界定将要转化到植物细胞中的DNA，LT-A-R72的侧翼表达盒的转录由双增强的CaMV35S启动子(promotor)驱动并由马铃薯pin2 3’区域终止；LT-B的转录由双增强的CaMV35S启动基因驱动并由大豆vspB 3’区域终止；npt2用于选择抗卡那霉素的植物。还应当指出的是在实施例中所描述的用于转化NT-1细胞的pSLT101，pSLT102和pSLT105与pSLT107在除了LT-A编码区的所有方面是相同的。如Rappuoli等1999，Immunol.Today.20，493-500中所描述，pSLT102载体(vector)编码K63 LT-A突变体，pSLT105载体编码G192 LT-A突变体，pSLT107载体编码R72 LT-A突变体。pSLT101载体编码与大肠杆菌LT生物学等价的完全天然LT。
鸟类在此定义为前肢进化为翅膀、脚上有鳞、有喙和在硬壳蛋中孵化幼仔的鸟纲中的任何温血脊椎动物。用于说明的目的，优选的一组鸟类为家鸡、火鸡、鸵鸟、鸭子、鹅和考尼什母鸡(cornish game hen)。更加优选的组是家鸡和火鸡。用于本发明目的的最优选的鸟类是家鸡，包括肉用仔鸡和产蛋鸡。
免疫原是一种非自身的物质，在健康动物中引起体液的和/或细胞的免疫反应，使得动物在将来暴露于该免疫原时受到保护。免疫原通常是病原体如病毒、细菌和真菌，可以表现为某种非致病性的形式。免疫原还可以是病原体的抗原部分，例如细胞壁成分、病毒外壳蛋白，和分泌蛋白如毒素和酶，仅列举少数。免疫原还包括重组细胞如植物细胞和细胞提取物，这种细胞已经被遗传工程学改变以表达和呈递免疫保护性抗原。
接种定义为一种通过用病原体的免疫原性制备物或其非毒性形式或其部分免疫接种宿主来提供抵抗病原体的保护的方法，使得宿主免疫系统激活来防止或减少随后的宿主对后来暴露于病原体的反应。
施用定义为将物质导入动物机体，包括口腔、鼻腔、眼睛、直肠、卵和胃肠外(静脉内、肌肉内或皮下)路径。与本发明相符的更加优选的施用路径是口腔和/或鼻腔施用，这两种方法都可以到达肠道粘膜，以及通过蛋施用。更加高度优选口腔施用。
有效量或免疫保护量定义为产生期望的抵抗疾病攻击的保护结果的物质的数量或质量。对于技术人员来说，根据本说明书提供的数据和信息，有效量是显而易见的。
用于该说明书的目的，佐剂是一种增强、提高或加强对免疫原或抗原的免疫反应的物质。佐剂通常同时增强体液和细胞的免疫反应，但是在缺乏其他限定来定义佐剂时，用反应升高的来定义。而且，佐剂及其用途是免疫学家熟知的，并且佐剂通常用于增强下列情况的免疫反应免疫原的剂量受限时或者免疫原的免疫原性极低时或者施用的路径为次优时。因此，术语“佐剂量”是能够增强对特定的免疫原或抗原的免疫反应的佐剂的量。与佐剂量等同的质量是变化的，取决于多种因素，包括但是不限于免疫原的特性、被施用的免疫原的数量、宿主种类、施用路径和用于施用免疫原的方案。在给定一组特定条件下，佐剂量可以很容易地通过常规试验来量化。这完全在普通技术人员的技术范围内，并且对于变化的免疫原和佐剂的施用量通常采用常规剂量反应确定。采用酶联免疫吸收测定、放射免疫测定、血细胞凝集分析等确定对免疫原反应时升高的血清抗体滴度来测定反应。
对于LT，在哺乳动物中进行了相当多工作已经确定，亚微克/千克的量不仅产生强烈的免疫反应，而且还导致疾病。最令人惊奇的是，在鸡中不出现这种情况，口腔施用高达10mg/kg的天然LT未出现任何病理迹象，但是仍然产生高血清IgG滴度形式的实质性的免疫反应。这与表明在缺乏病理状况的情况下，手术植入CT和抗原引起免疫反应(Vervelde等，1998，同上文)而CT-B会产生免疫反应而不是病理状况(Takeda等，1996，同上文)的试验研究相反。
大肠杆菌热不稳定毒素(LT)已经通过X射线晶体学被充分地表征，由多亚基(multimeric)蛋白质构成。全毒素包括一个分子量为27,000道尔顿的“A”亚基(LT-A)，“A”亚基在小肠内被蛋白酶裂解为LT-A1和LT-A2。全毒素还含有5个分子量为11,600道尔顿的“B”亚基(LT-B)，各个亚基非共价地连接成非常稳定的环形样(doughnut-like)五聚物结构。优选任何来源的天然LT。
大肠杆菌热不稳定毒素类似物(LT类似物)定义为任何已知的其中一个或多个氨基酸被取代的天然LT，已被文献报道。一些熟知的LT类似物是那些其中天然存在于α亚单位的位点63、72和192上的残基分别被替换为赖氨酸、精氨酸和甘氨酸(K63、R72和G192)。Rappuoli等，1999，Immunol.Today.20，493-500。生物活性的LT和LT类似物在ELISA平板中结合到GM1神经节苷脂上，在体外细胞毒性测试中对Y1肾上腺细胞是有毒的。
鸟类易感各种大量疾病，本发明提供了这些疾病的保护性免疫接种。如下是列举一些具有较高经济影响的鸟类疾病，这些疾病的病原体为与本发明兼容的免疫原。该列表无论如何不表示可应用于本发明的鸟类疾病的穷举。新城疫、禽流感、传染性法氏囊病、球虫病、坏死性肠炎、气囊炎(airsacculitis)、蜂窝织炎、鸡贫血、喉鼻气管炎(larygnorhinotracheitis)、传染性支气管炎、和马立克氏(Marek’s)病。优选的一组提供抵抗鸟类疾病的保护作用并且与本发明一致的免疫原是新城疫病毒的抗原决定簇、新城疫病毒的血凝素神经氨酸酶蛋白、禽流感病毒的抗原决定簇、禽流感病毒的血凝素蛋白。
用于制备大量相对纯的多肽和蛋白质，包括LT-A、LT-B、LT和LT类似物的许多方法在本领域是熟知的。用于制备重组多肽和蛋白质的细菌和酵母菌系统已经应用了数十年。最近，已经开发出了转基因蛋白制备系统，该系统采用昆虫、脊椎动物、哺乳动物或植物细胞作为制备载体。在转基因植物中制备佐剂如LT，并且任选地与选择的免疫原共同表达，特别适合本发明，这是因为转基因的植物材料可以进行直接加工并作为疫苗饲喂或者鼻内施用给鸟类。
转基因植物在此定义为植物细胞培养物、植物细胞系、植物或来自转化的植物细胞、组织或原生质体的后代，其中转化的植物的基因组含有外源DNA，该DNA是通过实验室操作导入的，不是原始存在于天然的、非转基因的相同株系的植物中。术语“转基因植物”和“转化的植物”在本领域中有时作为相同意义的术语来定义其DNA中含有外源DNA分子的植物。在该定义中还包括通过不产生整合转基因事件的病毒载体系统用异源DNA瞬时转化的植物。这种技术在本领域是熟知的，美国专利5,846,795和5,500,360提供了该技术的部分。
用于实施本发明的优选的一组植物是植物细胞培养物、马铃薯、西红柿、紫花苜蓿和浮萍。更加优选的组是植物细胞培养物和西红柿，最优选植物细胞培养物。优选的植物细胞培养物包括单子叶和双子叶来源的培养物。特别优选的植物细胞培养物是由Toshiyuki等1992，Int’lRev.of Cytolgy，132，1-30所描述的命名为NT-1和BY-2的烟草细胞培养物。
在本领域有许多熟知的将转化DNA片段导入到细胞中的方法，但是并不是所有这些方法都适合于将DNA呈递到植物细胞中。一般认为，合适的方法实质上包括任何可以将DNA导入细胞的方法，例如通过农杆菌转染，直接呈递DNA，例如通过PEG介导的原生质体转化(Omirulleh等，Plant Molecular Biology，21415-428，1993)，通过干燥/抑制介导的DNA摄取，通过电穿孔，通过碳化硅纤维搅动，加速DNA外壳的粒子等。在某些实施方案中，优选加速的方法，包括，例如微粒轰击等的方法。
将DNA导入细胞的技术是本领域技术人员所熟知的。已经描述了四种基本的将外源DNA导入植物细胞的方法。化学方法(Graham和van der Eb，Virology，54(02)536-539，1973；Zatloukal，Wagner，Cotten，Phillips，Plank，Steinlein，Curiel，Birnstiel，Ann，N.Y.Acad.Sci.，660136-153，1992)；包括微注射的物理方法(Capecchi，Cell，22(2)479-488，1980)，电穿孔(Wong和Neumann，Biochim.Biophys.Res.Conmmun，107(2)584-587，1982；Fromm，Taylor，Walbot，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82(17)5824-5828，1985；美国专利5,384,253)和基因枪(Johnston和Tang，Methods Cell.Biol.，43(A)353-365，1994；Fynan，Webster，Fuller，Haynes，Santoro，Robinson，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(24)11478-11482，1993)；病毒方法(Clapp，Clin.Perinatol.，20(1)155-168，1993；Lu，Xiao，Clapp，Li，Broxmeyer，J.Exp.Med.178(6)2089-2096，1993；Eglitis和Anderson，Biotechniques，6(7)608-614，1988；Eglitis，Kantoff，Kohn，Karson，Moen，Lothrop，Blaese，Anderson，Avd.Exp.Med.Biol.，24119-27，1988)；和受体介导方法(Curiel，Agarwal，wagner，Cotton，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88(19)8850-8854，1991；Curiel，Wagner，Cotton，Birnstiel，Agarwal，Li，Loechel，Hu，Hum，Gen.Ther.，3(2)147-154，1992；Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89(13)6099-6103，1992)。
通过电穿孔方法将DNA导入植物细胞是本领域技术人员熟知的。植物细胞壁降解酶，例如果胶降解酶，用于赋予受体细胞，与未处理的细胞相比，对电穿孔转化更加易感。为了通过电穿孔进行转化，可以采用脆性组织如细胞的悬浮培养物、或者胚性愈伤组织、或者未成熟的胚芽、或者直接采用其他具有机体构造的组织。通常需要以可以控制的方式用果胶降解酶或机械创伤来部分地降解目标植物材料的细胞壁。这种处理的植物材料很容易通过电穿孔来接受外源DNA。
另一种将外源转化DNA呈递给植物细胞的方法是通过微粒轰击。在这种方法中，微粒用外源DNA包被并通过推进力传递到细胞中。这种微粒通常由钨、金、铂以及类似金属制备。微粒轰击的一个优点在于不需要分离原生质体(Cristou等，1988，Plant Physiol.，87671-674)，也不要求对农杆菌感染的易感性。通过加速将DNA呈递到玉米细胞中的方法的一个示例性实施方案是Biolistics基因枪(Particle DeliverySystem)，该系统可以用于加速DNA包被的粒子或者细胞，使它们通过网筛到达覆盖了在悬浮液中培养的玉米细胞的滤膜的表面上。网筛将粒子分散使得这些粒子不会以大的集合体形式呈递到受体细胞中。对于轰击，悬浮液中的细胞优选集中在滤膜上或固体培养基上。可选择地，未成熟的胚芽或者其他靶细胞可以排列在固体培养基上。将被轰击的细胞置于微粒挡板(microprojectile stopping plate)下面的适当位置。在轰击转化中，可以优化预轰击的培养条件和轰击参数来获得最大量的稳定转化体。用于轰击的物理和生物的参数在该技术中是重要的。物理因素是那些涉及处理DNA/微粒沉淀物的因素，或者那些影响微粒的飞行和速度的因素。生物学因素包括涉及在轰击之前和之后的细胞处理、调节靶细胞的渗透压以减少与轰击相关的损伤的所有步骤，以及转化DNA的性质，例如线性化DNA或者完整的超螺旋质粒。
农杆菌介导的转化是广泛应用于将外源DNA导入植物细胞中的系统，因为DNA可以被导入到完整的植物组织中，而不需要从原生质体再生完整的植物。使用农杆菌介导的植物整合载体来将DNA导入植物细胞中的应用在本领域是熟知的。参见，例如，在Fraley等，1985，Biotechnology，3629；Rogers等，1987，Meth.in Enzymol.，153253-277中所描述的方法。此外，Ti-DNA的整合是一种相对精确的方法，几乎不产生重排。被转化的DNA的区域被边界序列所限定，介入(intervening)DNA常常插入到植物基因组中，如Spielmann等，1986，Mol.Gen.Genet.，20534；Jorgensen等，1987，Mol.Gen.Genet.，207471中所描述。
现在的农杆菌转化载体能够如在农杆菌中一样在大肠杆菌中复制，如(Klee等，1985)所述以便于加工。而且，在用于农杆菌介导的基因转化的载体方面的最近技术进展已经改进了基因和限制性位点在载体中的排列，以便于构建能够表达各种蛋白质或多肽的载体。所述的载体(Rogers等，1987)具有与启动子和聚腺苷酸位点侧面连接的便捷的多接头区域，用于直接表达插入的多肽编码基因，这些载体适合用于本发明目的。此外，含有具刺的和不具刺的(armed and disarmed)Ti基因的农杆菌可以用于转化。
植物原生质体的转化可以采用基于磷酸钙沉淀、聚乙二醇处理、电穿孔和该处理方法的组合方法来实现(参见，例如Potrykus等，1985，Mol.Gen.Genet.，199183和Marcotte等，1988，Nature，335454)。这些系统在不同植物种类中的应用取决于从原生质体中再生特定种类的能力。
实施例1材料编码大肠杆菌菌株H10407的LT-B基因的植物优化序列在本领域是已知的(Mason等，1998，Vaccine 161336-1343)。编码大肠杆菌菌株H10407的LT-A基因的植物优化序列在WO/2000/37609中描述，该专利最先为美国临时申请60/113,507。WO/2000/37609描述了三个双元T-DNA载体的结构(pSLT102，pSLT105，pSLT107)，它们用于实施例2的烟草NT-1细胞的根癌农杆菌介导的植物细胞转化。得到的转化的NT-1细胞系(SLT102，SLT105，SLT107)表达和沉积完整组装的LT和由LT-B和LT-A亚基的改进形式组成的LT类似物。附图1说明了pSLT107，其含有改进的用Arg72置换Ala72的LT-A基因。除了在LT-A基因中含有不同的改变(在pSLT102中由Ser63变为Lys63，在pSLT105中由Arg192变为Gly192)，SLT102和SLT105的表达产物是相同的。这些细胞系中含有未确定数量的稳定地整合到核染色体DNA中的质粒的T-DNA区域拷贝。转基因NT1细胞沉积LT-B亚基，该亚基被组装成键合了神经节苷脂的五聚体，神经节苷脂依赖的ELISA确定五聚体的水平达到总体可溶性蛋白质的0.4％。转基因NT1细胞还沉积改进的LT-A亚基，部分LT-A亚基与LT-B五聚体组装，这采用LT-A特异性抗体通过神经节苷脂依赖的ELISA确定。
此外，还获得质粒pQETHK，pJC217和pCS96。pQETHK是克隆到Quiagens pQE60载体上的LTB的植物优化序列；pJC217(Cardenas等，1993，Inf.and Imm.614629-4636)含有大肠杆菌来源的LTB序列和克隆到pUC8中的LTA非编码区。pCS96表达大肠杆菌的LTB和LTA亚基基因。在大肠杆菌的DH5α和JM83宿主菌株中的各种质粒，在LB培养液中生长(Gibco/BRL)，采用50ug/ml氨卡青霉素进行选择。
通过将1-2L的DH5α中的pCS96在含有50ug/ml氨卡青霉素的LB培养液中培养过夜来分离天然LT。采用Heraeus Megafuge(以4000rpm离心20min)来粉碎细胞，再悬浮在200ml的TE缓冲液中(50mM TrispH7.2，1mM EDTA)，以4000rpm离心20min并悬浮在100ml的TE缓冲液中，在-80℃下存储。再悬浮的颗粒采用具有扁平的可替换的尖端的Branson 450超声波仪，以输出控制8、负载循环60在冰上破碎10min。然后在2-7℃下以10,000rpm用J2-21 Beckman离心机和JA-20Beckman转子离心制备物30min。将上清液转移到新的试管中，以20,000RPM离心1h。将20,000RPM离心后的上清液转移到透析管中(6000-8000MWCO)，并且用2L TEN透析4天(每天更换TEN)。透析后，该样品以约10ml/h的流速通过TEN平衡固定化的半乳糖亲合柱。用数个柱体积的TEN缓冲液洗涤该柱，并用1M D(+)半乳糖洗提结合的LT。含有LT的馏分用聚丙烯酰胺凝胶电泳验证，收集并存储在-80℃下。
实施例2制备表达LT的转基因烟草在转化前的3-4天，将2ml的NT-1培养物加入到40ml的NT-1培养液中来在新鲜培养液中分培1周龄的NT-1培养物。黑暗中在25±1℃下在摇床中以100rpm维持分培。
NT-1培养液试剂 /L
B1肌醇母液(100x)(1L)盐酸硫胺素(维生素B1)-0.1gMES(20x)(1L)MES(2-N-吗啉代丙烷磺酸)-10g肌醇-10gMiller’s I(1L)KH2PO4-60g含有目标表达载体的根癌农杆菌从甘油母液中划线到含有50mg/l奇霉素的LB培养液的平板上。细菌培养物在黑暗中30℃下培养24-48h。选择形成良好的菌落，并转移到3ml含有50mg/L的奇霉素的YM培养液中。液体培养物在黑暗中30℃下在培养箱的摇床中以250rpm培养，直到OD600为0.5-0.6。这约需要24h。
LB培养液YM培养液试剂 /L 试剂 /L胰酶解胨 10g 酵母提取物400mg酵母提取物 5g 甘露醇10gNaCl 10g NaCl 100mgDifco Bacto琼脂15g MgSO4·7H2O 200mgKH2PO4500mg
(此外，可以购买粉末状的YM(Gibco BRL；产品目录号#10090-011)。将11.1g加入1L水中来制备液体培养液。)在转化的当天，在每ml的NT-1培养液中加入1μl 20mM乙酸丁香酮。在转化的当天，在乙醇中制备乙酸丁香酮母液。创伤NT-1细胞来提高转化效率。进行创伤时，用孔径为5ml宽的无菌移液管反复(20次)抽吸悬浮培养液。将4ml悬浮液转移到每个10,60×15mm的Petri平板中。留出一块平板用作未被转化的对照。类似地，将50-100μl的农杆菌悬浮液加到剩下的9个平板的每一个中。用封口膜包裹，然后在黑暗中在25±1℃下在摇床中以100rpm培养3天。
将细胞转移到无菌的、50ml的圆锥形离心管中，添加NTC培养液(含有500mg/L羧苄青霉素的NT-1培养液，在高压灭菌后加入)到最终体积为45ml。混合，然后在装备了甩平(swinging bucket)转子的离心机中以1000rpm离心10min。去除上清液，生成的沉淀再悬浮在45ml的NTC中。重复洗涤。离心悬浮液，弃去上清液，将沉淀再悬浮在40ml的NTC中。将5ml的等分试样加到每个含有NTCB10培养液(用8g/l琼脂/琼脂固化NTC培养液，在高压灭菌后添加10mg/l bialaphos)的Petri平板中(150×15mm)。用封口膜包裹平板，然后维持在黑暗中25±1℃下。在转移到培养室之前，平板在层流净化罩上敞开，使多余的液体蒸发。在6-8周后，出现推定的转化体。选择推定的转化体并转移到新鲜的NTCB5(用8g/l琼脂/琼脂固化NTC培养液，在高压灭菌后添加5mg/l bialaphos)中。用封口膜包裹平板，然后在黑暗中在25±1℃下培养。
在死亡的未被转化的细胞的背景上，推定的转化体表现为小簇的愈伤组织。将这些愈伤组织转移到NTCB5培养液中，并生长数周。选择部分的各种推定的转化体用于ELISA分析。在至少进行两次ELISA后，选择具有最高抗原水平的品系。然后在平板培养液和有时在液体培养液中增殖各种优良品系的愈伤组织材料的数量。
得到的转化的NT-1细胞系SLT102，SLT105和SLT107表达和沉积大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚基(LT-B)和LT-A亚基的改进形式。得自SLT102，105和107的表达产物除了在LT-A基因中含有不同变化之外，是相同的。另一个NT-1品系SLT101表达天然LT-A和LT-B基因，在各个方面与大肠杆菌来源的LT是等价的。这些品系含有未确定数量的稳定地整合到核染色体DNA中的质粒的T-DNA区域拷贝。所有转基因NT-1细胞沉积LT-B亚基，该亚基组装成结合了神经节苷脂的五聚体，神经节苷脂依赖的ELISA确定五聚体的水平达到总体可溶性蛋白质的0.4％。所有转基因NT1细胞还沉积天然的(SLT101)或改进的LT-A(SLT102，SLT105和SLT107)亚基，LT-A亚基与LT-B五聚体组装，这采用LT-A特异性抗体通过神经节苷脂依赖的ELISA确定。
实施例3制备接种物缓冲液和试剂氨卡青霉素得自Sigma(产品目录号14H0041)，并且在无菌水中制备100mg/ml母液。胰蛋白胨得自Fisher Biotech(产品目录号109756JE)。酵母提取物得自Difco(产品目录号132384JD)。氯化钠(产品目录号49H0265)，半乳糖(产品目录号46HO3561)，MES(2-[吗啉代]丙烷磺酸)(产品目录号29H54281)，和氢氧化钠(产品目录号30K0229)购自Sigma。考马斯亮兰G-250购自Bio-Rad。甲醇从VWR获得(产品目录号38274842)，冰醋酸得自EM Sciences产品目录号K27260700，乙醇产品目录号DUO9723BU购自AldrichChemical。磷酸缓冲生理盐水(PBS)用0.14M氯化钠，1.5mM磷酸二氢钾，2.5mM氯化钾和6mM磷酸氢二钠制备，pH7.2(BRL/Gibco)。
被转化的NT-1细胞作为愈伤组织在琼脂平板上维持，该平板用含有0.8％琼脂的NT-1培养液制备。该培养液的成分包括2.5mM MES，1.2mM磷酸氢二钾(产品目录号47HO811)，0.1％(w/v)肌醇(产品目录号49H039025)，0.001％(w/v)盐酸硫胺素(产品目录号107H02785)，0.4％(w/v)MS盐(产品目录号470803)，3％(w/v)蔗糖(产品目录号47H0803)，和0.8％(w/v)琼脂-琼脂(产品目录号390906)，都来自Sigma，以及0.22％(v/v)得自Gibco的2，4-D(产品目录号107091)。悬浮细胞以及琼脂平板还含有用于评价筛选NT-1转化的重组DNA的50ug/ml卡那霉素(产品目录号129HO8941，Sigma)。通过用无菌的移液管破碎愈伤组织来转移愈伤组织，将少量愈伤组织(0.5cm3)转移到新的平板上。为制备NT-1细胞的悬浮培养液，用移液管破碎愈伤组织，将数片愈伤组织转移到爱伦美氏瓶的NT-1培养液中，不含琼脂，放置在28-30℃的旋转式培养箱中。在转移后6-12天通过几种方法来收获细胞。通过静置摇瓶使细胞滞留，接着移出培养液来获得完全湿润的细胞。如上所述，通过将湿润的细胞再悬浮在提取缓冲液中来获得超声处理的完全湿润细胞，该缓冲液含有50mM抗坏血酸钠，1mM EDTA，1mM PMSF和0.1％Triton X-100(均来自Sigma)，在pH7.2的磷酸缓冲生理盐水中制备。然后采用具有扁平的可替换的尖端的Branson 450超声波仪，以输出控制8、负载循环60在冰上破碎细胞10min。采用Beckman GPR离心机以3400rpm离心被超声处理过的制备物20-30min来制备超声处理的湿润细胞的上清液和颗粒。采用衬有Spectramesh的布氏漏斗过滤完全湿润的细胞来制备完全干燥的细胞；在一个浅的塑料盘中，将压缩的细胞分散到Spectramesh片上，然后在食品脱水机中放置过夜。
对于饲喂试验，将预先量化了靶抗原含量的全部细胞、干燥细胞或超声处理的湿润细胞直接倒入饲碗中。然而，如果首先将完全湿润的细胞、干燥细胞或超声处理的细胞与饲料混合(1日龄的肉用仔鸡6g)并倒入每个“X”鸡的笼的单独饲碗中，那么肉用仔鸡所采食的靶抗原将更加有效。对于鼻内接种，将湿润细胞、干燥细胞或超声处理的细胞悬浮在PBS中达到一定浓度，以便将25ul转移到鸡的鼻腔中。用于IN接种的细胞质量与体积的比一般为1份细胞比2份提取缓冲液。
实施例4疫苗施用和处理肉用仔鸡购自Stover Hatchery，Stover MO。这些鸡是副产的雄性或双性鸡，孵化来用于选育少量的肉用仔鸡。通过连夜快邮子鸡，并立即放入产蛋鸡的Petersime笼中(每笼7只)。每个处理的鸡的数量取决于采用重复测定的完全随机设计。任何多余的鸡随机地放入各个笼中，用于替代由于运输或放置压力而死亡的鸡。给笼中的鸡饲喂后立即随意加入水。对于禁食的鸡，禁止采食过夜并且在次日早上进行接种，或者自由采食过夜，然后在早上禁食5h并在下午进行接种。对于饲喂接种，将植物来源的抗原用最少量的水调成浆，然后与饲料混合来制成块状的糊状物。将饲料放入碗中，并将碗放入笼中，使得所有鸡都能获取。对于填饲处理，采用固定在注射器上的1英寸的填饲针头来直接接种到食道或嗉囊中。直接将25ul接种到鼻腔中来进行鼻内路径的施用。接种时，小鸡大小一般在18和30h之间，因此，在试验的第0天，临床试验采用1日龄的小鸡。
实施例5测量ELISANunc Maxisorp的96孔微量滴定ELISA平板用5ug/孔的在0.01M的硼酸缓冲液中的混合GM1神经节苷脂包被，每孔100ul；平板在室温下温育过夜。用PBS-Tween(含有0.05％Tween 20的1X，Sigma产品目录号120K0248)洗涤平板三次。然后每个孔在37℃下用200ul的封闭缓冲液培养，该缓冲液含有在PBS-0.05％Tween 20中的5％(w/v)脱脂奶粉。采用PBS-Tween20以250μl/孔洗涤各孔1X。参照抗原和样本抗原在加入平板之前与封闭缓冲液混合。LT参照抗原和LT-B参照抗原在第一孔中稀释至50ng/ml，而样本预先稀释为多个不同的起始稀释液。在第A行加入200ul样本并在剩下的行中加入100ul封闭缓冲液来将样本加入平板中。在每孔中混合并移去100ul来制备一系列的2倍的稀释液。然后平板在37℃下温育1h，用PBS-Tween中洗涤3次，在每孔中加入100ul稀释在封闭缓冲液中的抗血清，并在37℃下温育1h。用PBS-Tween洗涤平板3次，然后加入100ul的抗体结合物并在37℃下温育1h。然后用PBS-Tween中洗涤平板3次，往每个平板中加入50ul TMB底物，在加入底物20min后加入TMB阻断液。用Tecan Sunrise平板读出器确定450nm波长下的光密度。用TecanMagellan软件转化和显示数据。采用9.0.3821SR-1版本的MicrosoftExcel 2000来进行线性回归和定量分析。
实施例6血清ELISA通过断头(0-7日龄的小鸡)或者通过静脉穿刺翅静脉或颈静脉来采集血液。在进行断头前，通过脱颈或暴露在CO2中1-5min来无痛处死小鸡。将血液从动物房转移到实验室，在2-7℃下放置45min来促进和凝集血液凝块。将血液样本在37℃的水浴中处理10min，然后在2-7℃下用Beckman GPR离心机以2500rpm离心20min。从各个管中无菌移取血清，以0.5-1.5ml的等分试样装入冷冻管(Nunc)中，在-18℃下存储至使用。对于血清ELISA，神经节苷脂吸附步骤采用1.5ug/ml在2-7℃下温育过夜。
用PBS-Tween洗涤平板三次，并用200ul/孔的溶解在PBS-Tween的3％脱脂奶粉封闭。为滴定每个血清样本的抗体，在神经节苷脂被吸附后，在每孔中加入100ul以2.5ug/ml溶解在封闭缓冲液中的LT-B或LT，在37℃下温育1h。用PBS-Tween洗涤平板三次，然后往A行中加入200ul稀释在封闭缓冲液中的血清样本，并且往剩下的行中加入100ul封闭缓冲液。除非特别说明，血清的起始稀释液是以1∶10稀释在封闭缓冲液中。在两倍系列稀释血清样本后，在37℃下温育平板1h，然后用PBS-Tween洗涤三次。加入被预先滴定为最佳结合的山羊抗鸡抗体和产色剂(chromagen)，并在37℃下温育1h。洗涤平板并加入100ulABTS，温育直到用Tecan SunriseTM平板读出器测定在405/492双波长下阳性对照的起始稀释液产生0.7-1.0的吸光度。
用Tecan Magellan软件来转化和显示数据。采用9.0.3821SR-1版本的Microsoft Excel 2000来进行线性回归和定量分析。用9.0.3821SR-1版本的Microsoft Excel 2000来确定每个处理组的血清几何平均滴度(GMT)。对于这些计算，＜10的背景ELISA滴度被赋予值1。用最小二乘分析来确定处理的鸡与对照之间的最小二乘平均值的差异。如果处理组与未免疫接种的非攻击对照组之间存在显著差异，那么确定该处理有效。
实施例7Y1肾上腺细胞分析小鼠Y1肾上腺细胞购自ATCC(CCL-79，L#1353400)。在37℃下解冻细胞瓶，并放入装有10ml生长液的25cm2的T烧瓶中(Corning)，生长液为在F-12K培养液(Gbico L#1089716)中由含有15％供体马血清(Quad-5 L#2212)，2.5％胎牛血清(JRH L#7N2326)，1％glutamax-1(Gibco L#1080323)组成。细胞在37℃下5％CO2中培养。在每一通道中，细胞维持在这种生长液中，并用于LT和CT的细胞毒性分析。进行分析时，将细胞转移到96孔培养板上(Nunc)，达到80％汇合。LT或CT毒素在F-12K生长液中稀释为1ug/ml。通过往平板的A行中加入100ul预先稀释的样本在96孔的微量滴定板中以两倍系列稀释液进一步稀释该毒素。然后通过将A行中的50ul样本转移到下一孔的50ul的生长液中来制备两倍的系列稀释液。根据样本或细胞的可用性，将样本的各个稀释液转移到1-4孔Y1肾上腺细胞中。CT或LT毒素的终点滴度是获得50％细胞毒性(细胞死亡)时所需的ug/ml。Guidry，J.J.，Cardenas，L.，Cheng，E.和J.D.Clements.1993。Role of receptor bindingin toxicity，immunogenicity and adjuvanticity of Escherichia coliheat-labile enterotoxin(受体结合在大肠杆菌热不稳定肠毒素的毒性、免疫原性和佐剂活性中的作用)，Inf.and Imm.654943-4950。
实施例8用天然LT轰击肉用仔鸡肉用仔鸡以每笼5-6只饲养到10-21日龄。在试点试验中，将16只10日龄的小鸡分成3组(5只未接种，5只以100ug/鸡处理，5只以200ug/鸡处理)，并且皮下接种大肠杆菌天然LT。如上所述，LT毒素已预先通过滴定确定在小鼠Y1-肾上腺细胞中为活性形式。接种后的8h内，每个小时观察小鸡的临床症状。在接种后的第1、2、4、8、24和26h时，处死小鸡并进行大体尸检。记录主要器官包括肠道、肝脏、肾脏、脾脏和肾上腺的重量和损伤情况，以及体重。
进行第二次试验，将84只21日龄的小鸡分成6组，每组16只，每只鸡皮下接种0，10，50，100，200或400ug的天然LT全毒素。接种后的10、24和48h时，记录各组的5只鸡的体重、宏观病理学、粪便粘稠度和总体健康状况。在整个试验过程中，所有的鸡自由采食和饮水。
实施例9肉用仔鸡中口服CT-B的血清学反应将霍乱毒素亚基B(CT-B)添加到饲料中，或者通过各种方式直接对鸡进行接种。对于本试验，在1、14和28日龄时进行三次接种；在第1、14、28和35日龄时采集血液用于抗体分析。这些数据显示出一些先前在哺乳动物中出现的观察结果，这些结果未出现在鸡中。在28日龄或者在14日龄的第二次接种的2周后，很容易地检测到可测定的血清学反应。因此，只需要两个剂量来诱导可检测的反应。然而，28日龄的第三个剂量增强了该反应。鼻内(IN)和饲喂(OF)接种都诱导血清学反应；以等分的25ul剂量将20ug CT-B的接种物呈递到喙上的每个鼻腔时产生最高滴度(5407)。口腔呈递CT-B也产生良好的反应，无论是以20ug剂量通过填饲来呈递(滴度1790)或者通过40ug直接喷雾(表面处理)到饲料上(滴度365)。如在哺乳动物中所观察到的，采用CT-B的IN路径产生良好的血清学反应。(Verweii等，1998，Vaccine 162069-2076和Isaka等，1998，Vaccine 161620-1626)。但是，剂量的体积应当很小，使之可以进入鼻腔。在这种情况下，纯化的CT-B毒素可以以2mg/ml的母液制备，使得20ug的适当剂量的稀释液可以在25ul中进行呈递。在6克饲料中用20ug进行喷雾应用或者约0.3ppm产生很好的滴度。鉴于CT-B在饲料中的稀释及其产生的反应，通过口服路径给药显然产生较好的对GALT的刺激，无论是直接接种到食管或通过自由采食6克的接种物。作为比较，在鸡中IN给予2ug的剂量或者口服饲喂40ug与在小鼠中刺激粘膜反应的剂量十分相似。在本试验中，CT-B的有效剂量与通过肌肉内(IM)或皮下(SC)方法呈递的用作常规的动物疫苗的抗原的含量也是相当的。此外，这些鸡中没有出现由CT-B产生的不利的副作用；体重增加和饲料消耗是正常的，这说明转基因来源的植物抗原作为口服疫苗是安全的。
实施例10小鸡对烟草来源的LT的血清学反应采用已确定对CT-B有效的剂量范围，进行第二个试验来评价天然的大肠杆菌热不稳定毒素(LT)或LT-B以及遗传改进的热不稳定毒素是否能够产生类似反应。在本试验中，通过LT-B定量ELISA测定的40ug毒素在与上述CT-B试验相似的时间段以三种剂量施用。表1提供通过饲喂方法或口服免疫接种施用的烟草来源的LT(SLT)和天然毒素的结果。所有的处理组除了SLT上清液之外都有反应。在本试验中，“SLT完全”样本(滴度844)和“SLT超声处理”(滴度557)产生最高反应。
表1植物来源的Lt与细菌来源的LT、LT-B和CT-B的比较
“SLT完全”是通过简单地静置NT-1生产瓶，移去培养液而分离的完全湿润细胞，并用剩下的完全湿润细胞和残余的培养液与饲料混合。“SLT超声处理”是首先进行超声处理来破坏细胞壁、然后与饲料混合的完全湿润细胞。当直接应用于饲料时，两种烟草来源的SLT样本诱导的血清学反应都要好于天然LT或CT-B。这些结果表明，烟草细胞来源的LT(SLT)和天然LT是很好的小鸡的粘膜抗原。此外，表2表明，由体重增加测定说明烟草来源的SLT不产生有害的副作用，体重增加测定提供数据表明使用植物或天然LT通过口服路径可以安全地免疫接种小鸡。此外，在提供给第1、14和8日龄的40ug的天然LT毒素不会对任何日龄的处理鸡产生明显的肠道病理作用(腹泻、不适、脱水)。估计每kg体重的LT量为0.6mg LT/kg体重，这大大超过小鼠的致死剂量(Gill，M.D.1982.细菌毒素；致死量表.Microbiol.Reviews.4686-94.)证明了天然LT可安全地用于小鸡。
表2每种处理的每只鸡的平均总体重
实施例11血清学反应的起始和对SLT的血清学反应的持续时间前面的两个试验说明，天然的大肠杆菌或者烟草来源的热不稳定毒素在肉用仔鸡中诱导强烈的血清学反应。进行一项试验来检测在肉用仔鸡中可以测定出反应的最早日龄以及该反应的持续时间。在本试验中，采取剂量与鸡的日龄结合来检测对SLT的反应。表3显示处理组，给药时鸡的日龄以及在该试验中各个剂量中所用的抗原的含量。由于抗原产量低，第二种剂量较低，当分摊到各个组中该剂量转换为较低的抗原剂量。IN剂量约为100ng；该剂量低是由于SLT抗原被烟草细胞团块稀释以及再悬浮SLT时必须是均相的，使之可以应用于1日龄的小鸡的鼻腔。充分稀释使之可以通过移液管进行转移的NT-1细胞悬所示的，主要的药代动力学参数在第1天和第15天是可比的，这就表明在重复施药后没有血浆药物的积累。血浆暴露(plasma exposure)是剂量的线性函数。如下表所示，当剂量由50升至100mg时，药物暴露的主要的药代动力学参数(Cmax和AUC)加倍。
表1350mg的mCyd的药代动力学参数
表14100mg的mCyd的药代动力学参数
50mg和100mg的mCyd在第1天和第15天的血浆动力学廓图描绘于图10中。
总之，在口服val-mCyd后，母体化合物mCyd在HCV感染的受治疗者的血浆中被检测到。mCyd在这些受治疗者中表现出线性的血浆药代动力学，这些受治疗者经受了已检测的两种剂量水平。在每天服用已检测的剂量15天后，没有发现在受治疗者的血浆中有明显的mCyd的积累。
HCV感染的患者以50mg/天的剂量开始口服val-mCyd，并以增加的剂量服用15天后的mCyd的抗病毒活性通过使用扩增子HCV监控TM测定2.0版(Amplicor HCV MonitorTMassay v2.0)(RocheSystems，Branchburg，NJ，USA)利用聚合酶链式反应(PCR)的方法来确定血清HCV RNA的水平。该测定中的定量下限(LLOQ)估计为约600IU/ml，定量上限(ULOQ)估计为约500,000IU/ml。
HCV RNA的血清样品在第42天前到第7天前经对是否符合研究标准进行筛选<p>表3A血清学反应的起始和反应持续时间
实施例12用大肠杆菌的天然LT处理肉用仔鸡表4和5提供用天然LT皮下处理的10和21日龄的肉用仔鸡的两个试验的结果。皮下接种自从被报道为一种有效的，如果不是更有效的致死攻击小鼠的有效方法时进行应用(Isaka等，1998)。采用16只鸡和三个处理组，在处理组和非处理组之间不存在明显的差别。虽然少数的鸡出现轻微腹泻和微量的出血，进行组织切片检测时，在被处理的鸡和未被处理的对照之间不存在差异。腹泻敏感的动物的一个指标是肠道中的水保持力/总体重。然而，在本试验中，对照的平均肠道重量/体重实际上低于100ug的处理组。基于这些结果，通过这种方法施用LT时不会在鸡中产生强烈的病理学反应。在第二个试验中，作为试点试验的84只来自同一批孵化的21日龄的肉用仔鸡用更宽范围的天然LT处理。由于在试点试验中，在样本之间不存在组织化学水平、或者宏观病理学和鸡的总体重的差异，在第二个试验中，仅进行宏观病理学和总体健康状况的观察。表5中的数据表明，在不考虑处理组时，无论是LT浓度或观察时间上鸡不存在病理学或总体健康状况上的全面变化。虽然在一些处理样本中出现了一定程度的出血性病变，这在对照中也观察的到，因此，认为这与处理无关。在试点试验中检测的每只鸡的平均体重为162g，而在攻击试验中的每只鸡的平均体重为636g。因此，两个试验中LT量与鸡体重的比在0.2mg/kg到1.2mg/kg的范围内。所报道的对于小鼠是致死性的LT量与体重的比在1mgCT/kg体重(IN给予)到0.25mg LT/kg(IV给予)。Glenn等，1998.J.Immunol.1613211-3214和Gill，1983。对于人来说，少至0.1mg/kg的量足以导致数升的体液丢失。与对照相比，在此通过可接受的和灵敏的LT攻击方法所检测的比率不会导致任何腹泻迹象。
表4对10日龄鸡皮下接种天然LT的研究
G1-组1未接种的对照；nd-未检测到；N-正常；D-脱水；s.h.-轻微出血；G2-组2 100ug/鸡；G3-组3 200ug/鸡；1死亡(mortem)后出现的部分腹泻。
表5使用天然LT通过皮下路径对肉用仔鸡的处理
14只鸡/时间点/处理组26只鸡/时间点/处理组35只鸡/时间点/处理组m.h.-适度出血s.he.-少量血肿；s.h.-轻微出血实施例15使用SLT和LT通过鼻内/眼睛接种进行佐剂反应将本试验设计为检测通过鼻内/眼睛路径辅佐另一种抗原所需的LT剂量。在本试验中，靶抗原是美国专利5,310,678中所描述的新城疫病毒血凝素神经胺酸酶(HN)蛋白。NT-1细胞基本上按照实施例2采用pCHN18作为转化载体进行转化、生成表达天然HN基因的转化的NT-1细胞系(CHN18)进行转化。
如下通过破坏转化的细胞和冻干表达SLT、HN的NT-1细胞或空白对照的提取物来分别制备免疫原。将大约1g过滤的细胞放置在2ml的缓冲液中(DPBS和1mM EDTA)，然后在冰上进行超声处理15-20秒。采用具有可替换的微尖端的Branson 450超声波仪，以输出控制8、负载循环60进行超声波处理20秒。然后以16,000xg离心超声波处理液10min来除去细胞碎片，并倒出上清液。将提取物装入玻璃的血清瓶中、冻干并在2-7℃下存储至使用。冷冻的干燥的细胞提取物用作植物来源的处理的接种物。来自大肠杆菌的LT全毒素(以5.92mg/ml悬浮在DPBS中)用作阳性对照。
在试验的第0和14天进行所包括的疫苗免疫接种。来自CHN18的提取物在第0天给予7ug，第14天给予18ug。大肠杆菌来源的LT与CHN18提取物混合，在第0天使用8ug和在第14天使用20ug，植物来源的热不稳定毒素(SLT102)在第0天给予0.5ug，在第14天给予1.5ug。用LT或SLT处理的样本与接受常规的溶解在油性佐剂中的水的处理组比较，冷冻干燥的抗原制备物通过重悬浮来制备，其最终浓度为在具有0.5％0.5％Tween 80的DPBS中2.5％含0.1.65％Span80dDrakeol油。使用两个注射器和一个三通栓来混合样本使抗原悬浮在油水混合物中。
对于鼻内/眼睛接种，给小于10日龄的小鸡的单侧鼻腔和眼睛滴加25ul，给大于10日龄的小鸡的单侧鼻腔和眼睛滴加50ul。在第21、35和42天时采集血液。在第35天，给鸡皮下接种灭活的天然病毒来模拟攻击剂量，在模拟攻击的7天后(第42天)时，采集血液用于血清学分析。表6中的结果表明，在试验中的第21天或第二次免疫接种后的第7天很容易检测到对LT和SLT的血清学反应。ELISA检测出的LT的血清学反应远远大于对植物来源的SLT的反应，然而，用于产生抗体剂量的SLT的用量比LT的用量低10倍以上。在第35和42天，对LT和SLT的血清学反应相当高，表明当给予低至0.5ug的引发剂量(priming dose)，通过鼻内和眼睛路径的粘膜反应是有效的。相反，对来自CHN18转基因的NT1细胞系的HN蛋白的反应在第21天无论通过ELISA或HAI检测都没有产生可检测到的滴度。但是，在第42天，即在用天然NDV模拟攻击后的7天，处理1和2都表现出显著的HAI血清学反应，该反应在其他处理中没有观察到。除了乳化在油和水中，其他处理包括以与处理1和2相似的剂量呈递的LT和SLT(处理7和8)。这些结果表明，在以模拟攻击剂量暴露于天然抗原后可以增强对HN的记忆反应。一般地，在暴露于抗原后的7天内难以检测到对HN的血清学反应。此外，HN抗原本身或结合其他的混合物在任何其他处理中没有诱导反应，因此，处理1和2中的HN的滴度表示为暴露于HN和LT/SLT中的结果。
表6在鸡中鼻内/眼睛施用LT和SLT蛋白的辅助作用
尚无参考QANDV ELISA滴度＜50为背景NDV HI滴度＜8为背景LT ELISA滴度＜10为背景表7为采用皮下(SQ)接种结合了HN的LT产生的结果。疫苗制备物与表6的描述相同。在本试验中，通过脚蹼接种来施用疫苗。
该试验中采用在第0天和第14天进行两次接种。在第35天施用具有灭活NDV的模拟攻击剂量。显示在表7中的结果证明，对LT的血清学反应还由施用SQ接种产生，而且当进行共施用时还观察到HN血清学反应的增强。
表7用LT和植物来源的HN对鸡进行皮下接种
LT还通过鸡蛋接种激活反应。在表8中，来源于大肠杆菌的LT通过气囊施用并进入羊膜腔中。受精的鸡蛋在接种的第18天进行照蛋，仅健康的胚胎确定为进行接种。鸡蛋的气室上注射的部位直接用酒精擦拭。用鸡蛋打孔器在鸡蛋上轻轻地打一个孔，通过该孔插入1.5英寸长的22号针头。将约0.3ml的接种物沉积到正好在气囊膜下的羊膜腔中。然后在第18-21天，将鸡蛋转移到孵化器中。孵化后的第14天，用LT加强小鸡，在第21天通过血清学反应分析血液。除非先前已经施用了产生抗体的剂量，否则在单一接种的7天内不出现血清学反应。
该结果表明通过鸡蛋接种LT有效地使18日龄的胚胎接触抗原。
表8鸡蛋免疫接种
根据本说明书、现有技术或简单的常规试验，普通技术人员很容易意识到和确定许多与在此描述和阐明的特定实施方案的相当的技术方案。
权利要求书(按照条约第19条的修改)1.一种用于接种鸟类的组合物，包含一种大肠杆菌热不稳定毒素(LT)的佐剂。
2.根据权利要求1所述的组合物，还包括一种在鸟类中有效的免疫保护性抗原。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中免疫保护性抗原选自病毒、细菌或真菌病原体。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中免疫保护性抗原选自已知的新城疫、禽流感、传染性法氏囊病、球虫病、坏死性肠炎、气囊炎、蜂窝织炎、鸡贫血、喉鼻气管炎、传染性支气管炎、或马立克氏病的免疫保护性抗原。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中免疫保护性抗原选自新城疫病毒的血凝素神经氨酸酶蛋白或禽流感病毒的血凝素蛋白。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中佐剂由大肠杆菌制备。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中佐剂由转基因植物制备。
8.根据权利要求2所述的组合物，其中免疫保护性抗原在转基因植物中制备。
9.根据权利要求2的组合物，其中佐剂和免疫保护性抗原在转基因植物中制备。
10.根据权利要求2所述的组合物，其中佐剂和免疫保护性抗原在单一的转基因植物中制备。
11.一种用于接种鸟类的方法，包括施用有效量的权利要求1所述的组合物。
12.一种用于接种鸟类的方法，包括施用有效量的权利要求2所述的组合物。
13.一种用于接种鸟类的方法，包括施用有效量的权利要求3所述的组合物。
14.一种用于接种鸟类的方法，包括施用有效量的权利要求4所述的组合物。
15.一种用于接种鸟类的方法，包括施用有效量的权利要求5所述的组合物。
16.一种制备用于保护鸟类抵抗鸟类疾病的疫苗的方法，其包括将有效量的天然LT与有效量的已知会在鸟类中引起免疫反应的免疫保护性抗原混合。
18.根据权利要求16所述的方法，其中免疫保护性抗原选自已知的新城疫、禽流感、传染性法氏囊病、球虫病、坏死性肠炎、气囊炎、蜂窝织炎、鸡贫血、喉鼻气管炎、传染性支气管炎、或马立克氏病的免疫保护性抗原。
19.根据权利要求16所述的方法，其中免疫保护性抗原选自新城疫病毒的血凝素神经氨酸酶蛋白或禽流感病毒的血凝素蛋白。
20.根据权利要求16所述的方法，其中免疫保护性抗原是新城疫病毒的血凝素神经氨酸酶蛋白。
权利要求
1.一种用于接种鸟类的组合物，包含一种选自大肠杆菌热不稳定毒素(LT)或大肠杆菌热不稳定毒素类似物(LT类似物)的佐剂。
2.根据权利要求1所述的组合物，还包括一种在鸟类中有效的免疫保护性抗原。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中免疫保护性抗原衍生自病毒、细菌或真菌病原体。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中免疫保护性抗原选自已知的新城疫、禽流感、传染性法氏囊病、球虫病、坏死性肠炎、气囊炎、蜂窝织炎、鸡贫血、喉鼻气管炎、传染性支气管炎、或马立克氏病的免疫保护性抗原。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中免疫保护性抗原选自新城疫病毒的血凝素神经氨酸酶蛋白或禽流感病毒的血凝素蛋白。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中佐剂由大肠杆菌制备。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中佐剂由转基因植物制备。
8.根据权利要求2所述的组合物，其中免疫保护性抗原在转基因植物中制备。
9.根据权利要求2所述的组合物，其中佐剂和免疫保护性抗原在转基因植物中制备。
10.根据权利要求2所述的组合物，其中佐剂和免疫保护性抗原在单一的转基因植物中制备。
11.一种用于接种鸟类的方法，包括施用有效量的权利要求1所述的组合物。
12.一种用于接种鸟类的方法，包括施用有效量的权利要求2所述的组合物。
13.一种用于接种鸟类的方法，包括施用有效量的权利要求3所述的组合物。
14.一种用于接种鸟类的方法，包括施用有效量的权利要求4所述的组合物。
15.一种用于接种鸟类的方法，包括施用有效量的权利要求5所述的组合物。
16.一种制备用于保护鸟类抵抗鸟类疾病的疫苗的方法，其包括将有效量的天然LT与有效量的已知会在鸟类中引起免疫反应的免疫保护性抗原混合。
17.一种制备用于保护鸟类抵抗鸟类疾病的疫苗的方法，其包括将有效量的LT类似物与有效量的已知会在鸟类中引起免疫反应的免疫保护性抗原混合。
18.根据权利要求16所述的方法，其中免疫保护性抗原选自已知的新城疫、禽流感、传染性法氏囊病、球虫病、坏死性肠炎、气囊炎、蜂窝织炎、鸡贫血、喉鼻气管炎、传染性支气管炎、或马立克氏病的免疫保护性抗原。
19.根据权利要求16所述的方法，其中免疫保护性抗原选自新城疫病毒的血凝素神经氨酸酶蛋白或禽流感病毒的血凝素蛋白。
20.根据权利要求16所述的方法，其中免疫保护性抗原是新城疫病毒的血凝素神经氨酸酶蛋白。
全文摘要
本发明涉及利用大肠杆菌热不稳定毒素(LT)和已知的类似物作为鸟类的佐剂的组合物和方法。本发明还提供利用植物制备的LT、其已知的类似物和保护性免疫原作为鸟类的疫苗的组合物和方法。
文档编号A61K39/00GK1678343SQ03820179
公开日2005年10月5日 申请日期2003年8月27日 优先权日2002年8月27日
发明者T·J·米勒, M·J·方东 申请人:美国陶氏益农公司