专利名称：一种抗凝血性不溶性丝素材料的制备方法
技术领域：
本发明为制备具有良好生物相容性，血液相容性以及机械性能并在水中可以稳定存在的丝素蛋白材料的新方法，涉及生物材料。
背景技术：
丝素蛋白作为天然生物蛋白，具有优异的生物相容性，低炎症反应性和良好的机械及物理化学性能，近年来受到生物材料界广泛的研究。在人造皮肤，人造韧带，人造骨，人造血管方面有良好的应用前景，并可作为药物缓释材料，酶固定化材料等。在组织工程中，其优异的细胞生长性和缓慢降解性也使其具有广泛的应用前景。虽然由于丝素蛋白在自然界以一维丝状态存在，但在实际应用中，则需要制备成二维薄膜或三维管材形态，所以要对丝素进行溶解再生以制备符合使用要求的材料。
丝素蛋白溶解再生后，一般是溶于水的材料，在生物体内容易造成流失，很难作为生物材料使用。现有的使丝素蛋白不溶于水的处理方式是将丝素浸泡在甲醇溶液中，这种方法容易引发残留甲醇对人体的危害问题。为避免甲醇对人体的危害，我们研究了在合适条件下直接制备不溶性丝素蛋白材料的新方法，并获得了成功。
但是在另一方面，由于丝素蛋白的血液相容性较差，虽然其细胞生长性良好，从而在一定时间内可以在薄膜表面产生新的内皮细胞层，但植入体内后在细胞没有覆盖表面的情况下容易产生凝血，从而不适合作为血液接触类材料使用。为扩展丝素蛋白在生物材料领域的应用，必须对丝素蛋白进行改性以提高材料的抗凝血性能尤其是短期的抗凝血性能。现有的改善丝素抗凝血性的方法主要有接枝磷酸酯类化合物和等离子体改性等，反应条件复杂，重复性差，并且抗凝血性的改善有一定的限制，不适合大规模使用。
本发明为解决丝素蛋白抗凝血性，尤其是短期抗凝血性的简单方法，通过共混一定量的肝素，制得力学性能优良，不溶于水的具有良好抗凝血性的材料，其优异的抗凝血性可以在水中保持28天以上，考虑到丝素蛋白所具有的良好的生物相容性，此方法制备的材料在血液接触类生物材料中具有广泛的应用前景。
丝素蛋白一般有两种结晶态，其中α-螺旋为易溶于水的，而β-折叠为不溶于水的结晶态。自然状态下丝素蛋白主要以β-折叠存在，不溶于水和其它一般溶剂，可以溶解在CaCl2/水/乙醇(摩尔比1∶8∶2)三元溶液或其它浓盐溶液中，但是丝素溶解后会破坏丝素蛋白原有的β-折叠结构，并且在干燥成膜后主要以α-螺旋或不定型形态存在，易溶于水，这极大的限制了该材料在生物领域的应用。原来制备不溶性丝素薄膜的方法主要是通过甲醇处理使其晶型转变，我们的研究表明在合适的浓度、温度和蒸发速率等条件下，不溶性丝素蛋白材料可以直接制得，而不需甲醇处理。这种方法使不溶性丝素蛋白薄膜的制备更为安全和简单。另一方面，丝素蛋白的抗凝血性能很难满足血液接触类材料的使用要求。研究表明丝素蛋白材料在植入体内后会立即引发凝血，但由于丝素具有良好的细胞相容性，随着植入时间的延长，材料表面逐渐有内皮细胞层生成，从而其血液相容性也逐渐提高，当植入体内28天后，内皮细胞层就会完全覆盖丝素表面。因此，如果提高丝素蛋白的血液相容性，尤其是开始阶段的血液相容性，将使丝素蛋白在血液类生物材料领域有广泛的应用前景。
肝素是最常用的抗凝血剂，具有良好的抗凝血性，被广泛使用在聚氨酯等生物材料的抗凝血性的改善上。但是关于丝素同肝素共混的材料一直未见报道。考虑到肝素为多糖，有良好的氢键形成的能力，与丝素都可以溶解在水溶液中，所以将肝素同丝素共混，通过氢键作用降低肝素的流失速率，使共混材料在较长时间内具有优异抗凝血性是可行的。
本发明目的是为克服丝素蛋白血液相容性差的缺点，利用肝素作为抗凝血剂，制备肝素同丝素均匀共混的机械性能良好的不溶性丝素蛋白材料的新方法。
发明内容
将适量的肝素溶解在丝素溶液中后，搅拌，使之在低于90℃浓缩至100～500mg/ml的共混有肝素的高浓度透明丝素蛋白水溶液，将水溶液倾倒在聚苯乙烯板或玻璃板上，在干燥箱中20～200℃下挥发干燥成不溶于水的丝素薄膜。
将高浓度的溶液浇铸在不同直径的模具中，在20～200℃下，控制干燥速度，挥发干燥成丝素蛋白管状材料。制成具有优异机械性能的不同直径的不溶于水的具有血液相容性的丝素蛋白管材。
利用丝素蛋白溶液和肝素共混后，在一定温度和高浓度下的自发晶型转变获得不溶于水的具有良好血液相容性的丝素薄膜或在进一步浓缩的条件下，直接通过挤出，吹塑的方法制成管状结构，反应条件温和，成膜均匀，肝素对丝素蛋白的结晶没有不良影响，并可以同丝素形成氢键，此方法适合材料的大规模制备，并在保持材料良好机械性能和生物相容性的基础上，使材料提高了血液相容性。
本发明的具体实现是将蚕丝在0.5％的Na2CO3溶液中100℃煮60min，以除去蚕丝外部的丝胶蛋白并将煮过的丝素蛋白用蒸馏水多次洗涤后干燥，获得纯的丝素蛋白。将一定量的丝素蛋白溶于CaCl2/水/乙醇(摩尔比1∶8∶2)三元溶液或其它浓盐溶液中，并用透析带透析三天，以除去溶液中的氯化钙和乙醇，从而得到纯净的丝素蛋白水溶液。将0.1～10％的肝素加入到此丝素溶液中溶解，将此水溶液经搅拌，在低于90℃的范围内对此溶液进行浓缩，获得浓度为100～500mg/ml的透明丝素肝素混合水溶液，搅拌的目的是防止丝素溶液在浓缩过程中凝固，并给丝素以取向力，促进丝素向β-折叠的转变。将此高浓度的透明溶液倾倒在聚苯乙烯或玻璃板上，在温度为20～200℃的干燥箱中干燥，控制干燥速度，制得透明的不溶于水的丝素蛋白薄膜，还可以将透明溶液倾倒在聚苯乙烯或玻璃板上后，通过将其部分覆盖，控制溶液的挥发速度，制备透明的丝素肝素共混薄膜。
此透明溶液经进一步浓缩可以通过浇铸，挤出及吹塑得到力学性能优异的不溶于水的丝素肝素共混材料的管材。
本发明在直接制备不溶性丝素薄膜的基础上，通过共混肝素的方法提高材料的抗凝血性，避免了以往制备方法和改性方法的复杂性，制备过程大大简化。
本发明在直接制备不溶性丝素薄膜的基础上，通过共混肝素的方法提高材料的抗凝血性，关键技术在于1.将肝素共混入丝素溶液，保持了肝素的生物活性，2.在溶液浓缩前加入肝素，避免肝素在材料中聚集，并有利于丝素同肝素之间的氢键形成.肝素作为性能良好的抗凝血剂在医疗领域得到广泛的应用。在生物材料领域，为提高材料的抗凝血性，肝素的接枝和共混也是最基本的方法。肝素接枝后，可以使材料具有长效的抗凝血性，但是接枝会破坏肝素的活性基团，从而使肝素的抗凝血性能降低。肝素共混入材料可以保持肝素的高抗凝血性，但是在一段时间后肝素会完全流失。考虑到丝素具有良好的生物相容性，在植入体内一段时间后在表面生成新的内皮细胞层，从而具有良好的血液相容性，同时肝素和丝素可能形成氢键而使肝素可以在丝素薄膜内较长时间的存在，所以从综合考虑，使用肝素共混的方法是比较有效的提高丝素抗凝血性的方法。考虑到肝素在温度过高时活性容易降低，而在浓缩后加入又会发生肝素的聚集，将肝素在浓缩之前加入，而浓缩温度控制在90℃以下，这样可以在尽可能保持肝素活性的基础上，丝素同肝素充分相互作用，使肝素和丝素有足够的氢键形成，并均匀分布。
制备出的丝素薄膜或管材用红外光谱，X射线衍射，以及丝素肝素共混薄膜37℃下在水中24小时的流失率来测定薄膜的结构和在水中的溶解性。并通过甲苯氨蓝实验测定肝素在水中24小时的流失率以及薄膜在水中浸泡28天后的抗凝血性的变化来研究肝素在材料中的流失情况。结果表明共混肝素后的丝素薄膜仍然完全不溶于水，主要结晶态为β-折叠，肝素的加入对丝素结晶没有不良影响。丝素和肝素之间有氢键生成。甲苯氨蓝实验表明肝素的流失速率随时间的增长而降低，24小时的流失率接近13％。在水中浸泡28天后，材料仍然具有良好的抗凝血性。对材料机械性能测定发现其湿态的最大拉伸强度不小于10MPa，最大拉伸率不小于40％，机械性能优良。材料的抗凝血性测量显示，表示材料抗凝血性的三个指标时间即凝血酶时间(TT)，凝血酶原时间(PT)，和部分凝血活酶时间(APTT)分别超过测量仪器的设定值，即TT＞200s，APTT＞150s，PT＞50s.而共混肝素之前，丝素抗凝血性的三个指标分别为TT＝14.4s，APTT＝25.4s，PT＝13.0s.显示共混肝素后该材料具有非常优异的抗凝血性能。经过水中浸泡28天之后仍然保持良好的抗凝血性，TT和APTT仍然大于仪器的设定值，而PT则有一定的降低(13.3s)。这使得该材料成为优良的短效和中效抗凝血材料，考虑到该具有优良抗凝血性的材料在体内28天之内可以生长出完全覆盖的内皮细胞层，因此该材料完全可以应用于血液接触材料。
本发明的优点有肝素共混可以保持其良好的抗凝血性，并对丝素的结晶没有不良影响，制备简单，易于控制，重复性好，容易获得质量均匀的薄膜或管材。肝素和丝素共混后，两者之间可以形成氢键从而使肝素的扩散速率减慢，给细胞生长以充分的时间。整个过程中以水为溶剂，安全性高。因此本发明对丝素蛋白在血液接触类材料中的应用具有重大意义和实际价值。
实施例实施例1将蚕丝在0.5％的Na2CO3溶液中100℃煮60min，以除去蚕丝外部的丝胶蛋白并将煮过的丝素蛋白用蒸馏水仔细洗涤后干燥，获得纯的丝素蛋白。将1克丝素蛋白溶于10毫升的CaCl2/水/乙醇(摩尔比1∶8∶2)三元溶液中，将此丝素溶液在透析带中透析三天，除去溶液中的氯化钙和乙醇，从而得到透明的丝素溶液。称取0～30mg的肝素加入到丝素溶液中溶解。将溶液倒入烧杯，在低于90℃水浴加热情况下，用搅拌器轻微搅拌，挥发浓缩。将溶液浓缩至150～300mg/ml，为透明溶液。随后将此浓溶液在聚苯乙烯板上铺展，在干燥箱中50～200℃下干燥成膜，其厚度可以通过溶液质量控制。所成薄膜均匀透明，抗凝血性优良。
实施例2制备纯的丝素蛋白水溶液如实施例1所示。
称取20～50mg的肝素到丝素溶液中溶解。将溶液倒入烧杯，在低于90℃水浴加热情况下，用搅拌器轻微搅拌，挥发浓缩。将溶液浓缩至200～350mg/ml，为透明溶液。随后将此浓溶液在聚苯乙烯板上铺展，在干燥箱中50～200℃下干燥成膜，其厚度可以通过溶液质量控制。所成薄膜均匀透明，抗凝血性优良。
实施例3制备纯的丝素蛋白水溶液如实施例1所示。
称取0～30mg的肝素加入到丝素溶液中溶解。将溶液倒入烧杯，在低于90℃水浴加热情况下，用搅拌器轻微搅拌，挥发为150～300mg/ml的透明溶液，将此溶液在静止状态下，在干燥箱中50～200℃下干燥成半凝固状态，然后用机械挤出的方法制备出混有肝素的丝素蛋白管。
实施例4制备纯的丝素蛋白水溶液如实施例1所示。
称取0～30mg的肝素加入到丝素溶液中溶解。将溶液倒入烧杯，在低于90℃水浴加热情况下，用搅拌器轻微搅拌，挥发为150～500mg/ml的透明溶液，将溶液倒入不同直径的模具中，在50～200℃下干燥制备出管状材料。
实施例5称取0～30mg的肝素加入到丝素溶液中溶解。将溶液倒入烧杯，在低于90℃水浴加热情况下，用搅拌器轻微搅拌，挥发浓缩。将溶液浓缩至150～300mg/ml，为透明溶液。随后将此浓溶液在聚苯乙烯板上铺展，在干燥箱中50～200℃下干燥成膜，将所成薄膜用二氧化硫等离子体进行表面处理，得到细胞生长性进一步改善的薄膜。
实施例6称取0～30mg的肝素加入到丝素溶液中溶解。将溶液倒入烧杯，在低于90℃水浴加热情况下，用搅拌器轻微搅拌，挥发浓缩。将溶液浓缩至150～300mg/ml，为透明溶液。随后将此浓溶液在聚苯乙烯板上铺展，在干燥箱中50～200℃下干燥成膜，将所成薄膜用二氧化碳等离子体进行表面处理，得到细胞生长性进一步改善的薄膜。
权利要求
1.一种抗凝血性不溶性丝素材料的制备方法，其特征在于将0.1～10％肝素溶解在丝素溶液中后，搅拌，使之在低于90℃浓缩至100～500mg/ml的共混有肝素的高浓度透明丝素蛋白水溶液，将水溶液倾倒在聚苯乙烯板或玻璃板上，在干燥箱中20～200℃下挥发干燥成不溶于水的丝素薄膜。
2.如权利要求1所述的共混有肝素的高浓度透明丝素蛋白水溶液，其特征在于将高浓度的溶液浇铸在不同直径的模具中，在20～200℃下，控制干燥速度，挥发干燥成丝素蛋白管状材料。或干燥至半凝固状态经机械挤出或吹塑成管状，制成具有优异机械性能的不同直径的不溶于水的具有血液相容性的丝素蛋白管材。
全文摘要
一种具有良好抗凝血性的丝素材料的制备方法，涉及生物高分子材料。选用CaCl
文档编号A61K47/42GK1608683SQ20031010198
公开日2005年4月27日 申请日期2003年10月20日 优先权日2003年10月20日
发明者曹传宝, 吕强, 张瑛, 马西兰, 翟华嶂, 朱鹤孙 申请人:北京理工大学