转录活性试验的制作方法

专利名称：转录活性试验的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于测定可以调节基因转录的化合物的生物活性的新方法，和基于此的一种用于测定化合物的相对生物活性的方法，以及一种鉴定可调节基因转录的化合物的方法。本发明的方法对于鉴定那些可以用于疾病治疗的化合物尤为有用，其中所述疾病取决于患病的细胞和组织中的基因转录调节。
背景技术：
可调节细胞增殖或病毒防御等细胞功能的化合物的生物活性的通常测定方法为在体外或在基于细胞的结合试验中测定这些因子和/或化合物与其天然或重组受体的结合活性的增减。这些用于评价化合物生物活性的方法的缺点在于结合亲和力并不必然地与化合物的生物活性相关。
对于化合物生物活性更为直接且由此更为可靠的测定可以通过一些广为人知的试验例如细胞增殖、细胞存活、或细胞迁移试验来实现。然而，这些试验比较繁琐，尤其对于较大规模的筛选而言。在很多情况下，调节这些细胞活性的化合物也调节基因的转录。因而，这样的化合物的生物活性可以通过测定基因转录的调节来确定，这通常通过报告基因试验来进行，此试验需要制备可表达适宜报告基因构建体的重组细胞。或者，这样的化合物的生物活性可以由测定(例如通过Northern杂交分析或定量PCR)适当的靶基因的表达来确定，但此法的效率不高。
本发明的问题是要提供一种可靠、易行的方法来测定转录活性调节剂的生物活性，该法没有结合试验的缺点，而又比通常采用的活性试验更高效。

发明内容
出人意料的，发现化合物的生物活性能够通过一种基于测定在这种化合物诱导下的总体转录基因应答(general transcriptional gene response)的新方法而更为可靠地确定，此法包括对转录活性受所述化合物调节的基因的信号强度进行定量。
本发明提供一种用于测定可调节基因转录的化合物的生物活性的新方法，包括以下步骤a)使化合物与宿主接触；b)测定宿主的总体转录基因应答；c)对所述化合物诱导的总体转录基因应答进行定量。优选的，上述化合物的生物活性由步骤c)中定量的信号强度的归一化平均差(normalized average difference)之和给出。本发明的一个更为优选的实施方案中，总体转录基因应答通过DNA阵列技术测定。在一个更加优选的实施方案中，阵列技术是寡核苷酸阵列技术。优选地，DNA或寡核苷酸阵列是高密度的DNA或寡核苷酸阵列。这些阵列以及用这些阵列分析DNA或RNA的方法在已有的文献例如EP0834575，EP0834576，WO96/31622，US5837832或WO98/30883中有所描述。WO97/10365提供了用高密度寡核苷酸阵列对大量基因的表达水平进行监测的方法。在一个最优选的实施方案中寡核苷酸阵列是基因芯片(GeneChip)阵列。
这里用到的“总体转录基因应答”一词是指化合物的生物活性，由该化合物在有反应的宿主中所调节的基因的信号强度的归一化平均差之和来表示。总体转录基因应答的确定是通过将来自处理过的宿主的标记cDNA与DNA或更优选地寡核苷酸阵列杂交而进行的。然后测量阵列的原始数据，例如，用共聚焦激光扫描仪(Hewlett Packard，美国)进行(此例子并不是为了对本发明加以限制)，并用通常已知的方法对象素水平加以分析。各个基因的表达水平都相对于与错配的寡核苷酸的杂交计算为归一化平均差强度，用任意单位(AD)表示。用四个标准筛选差异表达的基因(1)处理过的细胞的强度值至少比未处理细胞的强度值高两倍。(2)处理过的细胞的强度值应大于或等于至少50个任意单元(AD)。(3)未经处理的细胞的强度值应小于50AD。(4)标准差必须显著低于平均差的绝对变化，且基因的计算的置信水平设定在大于97％(p值＜0.03)。然后，受化合物诱导的宿主的总体转录基因应答通过信号强度的归一化平均差之和(任意单位之和，∑AD)来定量。
下文中描述的非限制性实施证明用这种新方法获得的结果与生物活性之间的相关性比结合试验更为可靠，此外此方法还具有高效的优点。这些例子还表明，用本发明的方法测定总体转录基因应答比测定单个基因或选定的少数基因的转录表达水平更为可靠。
本发明方法中所用的宿主可以是所有非人类生物体，包括但并不仅限于转基因或基因敲除动物；来自任何物种的特定种类的组织，其中包括但并不仅限于肝脏、心脏、肾脏或原代细胞分离物，例如血细胞或从组织分离到的原代细胞或细胞系。本发明中用于测定化合物的生物活性的宿主必须对目的化合物有反应。此处所用“有反应”一词指宿主在响应化合物时能够表现出增强或降低的基因转录水平。作为一个非限制的例子，黑色素瘤细胞系ME15(WO02/18633中的CNCM I-2546)可被用于通过本发明的方法检测PEG-IFN或PEG-IFN同种型的生物活性。
相对于通常所用的活性分析试验或测定基因转录的方法例如报告基因试验或Northern杂交，本发明的主要优势在于本方法无需制备任何经报告基因构建物转染的细胞系，它还可以对大量受到转录水平调节的基因进行方便且有效的分析，因此使得活性分析更高效和可信。另外，如图4所示，结合活性并不总是与生物活性相关联，基于测定总体转录基因应答而确定的化合物的转录活性却总是与生物活性相关。因此，本发明的方法对于化合物生物活性的测定比结合试验更准确。
在一个实施方案中，前面所述方法中的化合物是修饰的化合物，更优选为修饰的蛋白，甚至更优选是聚乙二醇化蛋白(pegylated protein)，或最优选是聚乙二醇化蛋白的特定的分离的同种型。优选地，该聚乙二醇化蛋白是促红细胞生成素(EPO)或干扰素(IFN)。
这里所用到的“PEG-IFN”一词包括从任何天然物质(例如白细胞、成纤维细胞和淋巴细胞)或其衍生物(如细胞系)来源的IFN-α，或通过DNA重组技术得到的IFN-α。对IFN-α特别是在大肠杆菌(E.coli)中的克隆以及直接表达的细节在许多文献中已有描述。重组IFN-α的制备是公知的，例如，可参见Goeddel等人(1980)Nature284，316-320和(1981)，Nature290，20-26，以及欧洲专利号32134，43980和211148。IFNα有许多种类，例如IFNαI，IFNα2；还有它们的亚类，包括但并不仅限于IFNα2A，IFNα2B，IFNα2C和IFNαII(又名IFNαII或ω-IFN)。“IFNα”一词还包括从Amgen可购得的共有IFNα(consensus IFNα)或天然的和/或重组的IFNα的混合物。优选地使用IFNα2A。IFNα2A的制备在欧洲专利号43980和211148中有记载。
IFN-α可以与取代或未取代的聚(亚烷基)二醇例如聚乙二醇等聚合物缀合，形成PEG-IFN-α缀合物。缀合可以通过多种本领域公知的连接体来实现，特别是例如在欧洲专利申请公开号0510356，0593868和0809996中公开的连接体。
聚合物，优选聚乙二醇的分子量可以在300至70,000道尔顿的范围；并且可以是一个或多个，优选一到三个聚合物与IFN-α相缀合。优选的PEG-IFN-α缀合物具有下式 其中R和R’是甲基，X是NH，n和n’分别为或同时为420或520。
在上文中描述的方法的另一个优选实施方案中，被转录调节的基因是从Seq ID No.1至29的一组基因中选出的一个或多个基因，这些基因也在表3中列出。
本发明的方法适用于分析在任何类型宿主中调节基因转录的任何化合物。对基因转录的调节包括上调或下调基因转录。
上述的方法可以作为测定修饰后化合物的相对生物活性的方法的基础，相对生物活性测定包括用上述方法对修饰后的化合物以及对应的未修饰化合物的生物活性进行测定，其中，修饰化合物的相对转录活性通过计算修饰化合物与未修饰的化合物的生物活性之比得出。优选的，修饰化合物是经化学或酶学方法修饰的化合物。更优选的，修饰化合物是聚乙二醇化蛋白。因此，本方法提供了一种可以用于比较修饰化合物与其对应的未修饰化合物的生物活性的简单试验。在一个优选的实施方案中，本发明可以从化合物的同种型的混合物中，最优选从聚乙二醇化蛋白质中分离出生物活性最高的同种型。
生物活性可以通过本发明的方法测定的化合物包括所有能够调节基因转录的化合物。它们可以是蛋白质、多肽、核酸、聚合物或小分子。许多蛋白质、多肽、核酸、聚合物或小分子可以直接地作为转录因子来调节基因转录，或者间接地通过诱导最终能上调或下调基因转录的信号级联或者通过干扰别的能够调节基因转录的化合物来调节基因转录。下列能够用本发明的方法测定其生物活性的化合物只是能用上本发明方法的各类化合物，包括蛋白质和多肽的非限定性例子。
在这些非限制的例子中，有可以诱导作为转录因子的核激素受体的激素例如视黄酸(A.Rowe视黄酸X受体，Int.J.Biochem.Cell Biol.，29(1997)，275-278；CK.Glass通过甲状腺激素和视黄酸受体调节基因表达的一些新手段，J.Endorinol，150(1996)，349-357)。本发明的方法可以用于测定这些激素和它们的核激素受体的生物活性，此方法还可以用于鉴定能够干扰这些核激素受体的转录活性的化合物。因此，本发明可以用于例如鉴定和分析核激素受体如RXR或LXR的抑制物。
除了能够激活核激素受体的激素之外，本发明的方法还可以用于测定其它能激活信号级联从而引起基因转录调节的激素的生物活性。这些激素包括，但不限于，已知可以调节基因转录的激素如促红细胞生成素(Epo)(Z.Z.Chong等人造血因子促红细胞生成素通过新的信号转导级联促进神经保护，J.Cereb.Blood Flow Metab.，22(2002)，503-514；D.M.Wojchowski和T.C.He促红细胞生成素受体系统中的信号转导，Stem.Cells，11(1993)，381-392；J.L.Spivak促红细胞生成素的作用机制，Int.J.Cell Cloning，4(1986)，139-166；以及L.Mulcahy促红细胞生成素的受体Semin.Oncol.28(2001)，19-23)。
已知细胞因子和生长因子可以诱导能导致基因转录调节的信号级联。因此，作为一个非限制的例子，本发明的方法也可以用于鉴定细胞因子和生长因子的激动剂或拮抗剂，并测定其生物活性。这些细胞因子和生长因子包括，但不仅限于干扰素、肿瘤坏死因子、血管内皮细胞生长因子(T.Hanada和A.Yoshimura细胞因子信号通路的调节及炎症，CytokineGrowth Factor Rev.，13(2002)，413-421；和Y. Sato等人两类血管内皮细胞生长因子(VEGF)受体Flt-1和KDR在信号转导中的性质，Ann.N Y.Acad.Sci.，902(2000)，201-207)。
除此以外，本发明的方法可以用于测定修饰或突变的蛋白或多肽的生物活性。修饰可以通过化学方法或酶促反应实现。此应用的一个非限制的例子是测定不同同种型的聚乙二醇化干扰素的生物活性，结果示于本申请的附图中。因此本发明可用于测定修饰化合物的相对生物活性，包括用上述方法测定修饰的化合物和相应的未修饰化合物的生物活性，其中修饰蛋白的相对转录活性通过计算修饰化合物与未修饰化合物的生物活性之比来得到。优选的修饰化合物是经化学方法或酶促反应修饰的化合物。最为优选的修饰化合物是聚乙二醇化蛋白质。
本发明的方法还可以用于鉴定和表征酶的调节剂，其中，作为下游事件，此酶能够引起基因转录的调节。这种酶有，例如(但不限于此)磷酸二酯酶(PDE)，优选PDE4，最优选为PDE4D同工酶。优选PDE4D同工酶从PDE4D1，PDE4D2，PDE4D3，PDE4D4，PDE4D5，PDE4D6，PDE4D7和PDE4D8组成的组中挑出。PDE可以降解能够调节基因转录的第二信使——环AMP(G.S.McKnight环AMP第二信使系统，Curr.Opin.CellBiol.，3(1991)213-7)，并且，已发现PDE的强抑制剂可以调节基因转录(B.Wagner等人7-苄基氨基-6-氯-2-哌嗪并-4-吡咯烷蝶啶，cAMP-特异性磷酸二酯酶的强抑制剂，增强人的肿瘤细胞中核蛋白与CRE共有序列的结合，Biochemcial Pharmacology，63(2002)659-668；Y.Nishio等人Cilostazol，一种cAMP磷酸二酯酶抑制剂，在血管内皮细胞中减弱肿瘤坏死因子α引起的单核细胞趋化蛋白-1的产生，Hormone & MetabolicResearch，29(1997)491-495)。因此，本发明的方法可以用于筛选此类酶的调节剂。
在可被鉴定和分析的化合物中还包括功能抗体。功能抗体是指能够抑制或刺激其所结合的蛋白质的功能的一类抗体。已开发出抗多种靶蛋白的此类抗体，有一些抗体还具有治疗价值。这其中，例如(但不限于)有抗-Her2/ErbB2抗体，又名赫赛汀(herceptin)抗体。此抗体正被成功的用于治疗乳腺癌。它们通过抑制人表皮生长因子受体Her2/ErbB2(该受体在包括乳腺癌的多种癌症中起关键作用)的活化来发挥作用。如同其它许多生长因子受体一样，当配体与Her2结合时，Her2能介导包括基因转录调节在内的信号转导。已证明赫赛汀(herceptin)可以在表达Her2/ErbB2的细胞中调节基因的转录(A.H.Talukder等人抗人表皮生长因子受体2抗体赫赛汀(herceptin)抑制自分泌活动因子(AMF)表达，并增强AMF抑制剂的抗肿瘤效果，Clin.Cancer Res.8(2002)，3285-3289；以及R.Mandler等人合成策略中的修饰提高格尔德霉素-赫赛汀(herceptin)免疫缀合物的产率和效力，Bioconjugate Chemistry，13(2002)，786-791)。目前，存在8种不同的赫赛汀(herceptin)抗体，并且还可能生产出更多的种类。通常地，就功能性抗体而言，本发明的方法可以用于确定哪种抗体具有最高的生物活性且最适合于治疗用途。因此，本发明的方法同样适用于测定抗体的生物活性，例如用于鉴定抑制性或激活性抗体。在优选的实施方案中，抗体是有治疗用途的抗体。更为优选的实施方案中，抗体是赫赛汀(herceptin)抗体。
对于鉴定和分析通过抑制或激活另一化合物(例如激素、细胞因子、生长因子、酶等)的生物活性而间接起作用的化合物，本发明提供了一种可以鉴定间接调节基因转录的化合物的方法，该法包括用上文所述方法测定已知可以调节基因转录的第一化合物在有或没有第二化合物存在的情况下的生物活性，若第一化合物在存在所述第二化合物时测得的生物活性明显不同于第一化合物在不存在第二化合物时测得的活性，则鉴定出可间接调节基因转录的化合物。
本发明提供经上述方法鉴定到的可调节基因转录的化合物。同时也提供上述方法在鉴定可调节基因转录的化合物中的用途。本发明还提供包含用于实施上述方法的成分的试剂盒。优选的，所述成分包括DNA阵列，更为优选的是寡核苷酸阵列。
进一步的，提供药物组合物，其包含经上述方法鉴定的化合物和可药用载体(carrier)。任何常规的载体材料均可以使用。载体材料可以是适于肠的、经皮的或胃肠外施用的有机物或无机物。适宜的载体包括水、明胶、阿拉伯胶、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、滑石、植物油、聚(亚烷基)二醇、凡士林等等。此外，药物制剂可以包含其它药学活性剂。额外的添加剂例如调味剂、稳定剂、乳化剂、缓冲液等可以按照药物化合物的公认惯例被添加进去。
另外，本发明提供一种用于制备药物组合物的方法，此法包括如下步骤用本发明的方法鉴定化合物，对鉴定到的化合物进行修饰，然后与可药用载体或稀释剂一起配制所得化合物。
本发明还提供将按照上述方法鉴定到的化合物或该化合物的可药用盐用于制备治疗疾病，特别是病毒性疾病或癌症的药物。
这里所用“可药用”一词是指在合理的医学判定范围内，化合物、材料、组合物和/或剂型适用于与人和动物的组织接触而不会引起过度的毒性、刺激性、过敏反应或别的问题或并发症，并相称地具有合理的药效/风险比。
这里所提到的“可药用盐”指鉴定到的活性剂的衍生物，其中将亲本活性剂修饰成为其酸或碱式盐。可药用盐包括但不仅限于如碱性残基如胺的无机酸或有机酸盐；酸性残基如羧酸的碱金属盐或有机盐；等等。可药用盐包括亲本化合物的常规无毒性盐或季铵盐，例如由无毒性的无机酸或有机酸形成的盐。例如，这样的常规无毒性盐包括从无机酸衍生的盐，无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等；以及由有机酸制备的盐，有机酸有例如醋酸、丙酸、琥珀酸、甘醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、棕榈酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、安息香酸、水杨酸、磺胺酸、2-乙酰氧基安息香酸、反丁烯二酸、苯磺酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸、羟乙磺酸等。
本申请还要求保护上面提到的，尤其是参照上面例子所提到的方法、化合物、试剂盒及用途。
上面已经对本发明做了一般性的描述，而通过特定的实施例，结合下面的附图可以更好地理解本发明，这里包括的实施例除非特别地指明仅是用于举例说明目的而并非为了加以限制。
附图简述

图1180μg PEG-IFN的分析性IEC-HPLC。用分析性强阳离子交换柱(TOSOH-BIOSEP，SP-5PW，粒径10μm，柱直径7.5mm，柱高7.5cm)分离位置异构体。
图2(A)9种位置异构体和PEG-IFN的抗病毒比活性图中所示为位置异构体的抗病毒比活性[U/μg]。该抗病毒活性在受到水泡性口炎病毒感染的MDBK细胞中测定。
(B)位置异构体和PEG-IFN的抗增殖比活性图中显示100U/ml各种位置异构体和PEG-IFN对ME15细胞增殖的单位抑制作用[OD490nm/μg]。
结果是三次独立试验的平均值。给出PEG-IFN的抗病毒比活性和抗增殖比活性(虚线所示)用于比较。
图3
对黑色素瘤细胞系(ME15)增殖的时间依赖性抑制。ME15细胞系在不同浓度(500，125，和15U/ml)的IFN，PEG-IFN和异构体的存在下培养5天。每24小时对细胞增殖进行一次测量。五天后对照细胞的密度设为100％作为参照。数据来自三次独立的重复培养试验。
图4动力学解离常数与PEG-IFN和具有高(K134)、中(K131，K164)、低(K121)抗病毒比活性的各异构体的抗病毒活性的相关性。
图5(A)各个异构体的抗病毒比活性、抗增殖比活性和单位转录应答的相关性。PEG-IFN的值设为100％作为参照。虚线所示为PEG-IFN的生物学活性和转录活性。对于每个异构体，相对mRNA丰度(AD)之和由所有可诱导基因的总和表示。
(B)对100U/ml IFN，PEG-IFN和各异构体引起的不同总体转录基因应答的AD的分级群聚(hierarchical clustering)。IFN和各聚乙二醇化异构体的孵育时间是48小时；所用细胞系是IFN敏感的黑色素瘤细胞系(ME15)。数据分析的条件在文中描述。基因差异表达谱的数据记录于表3中。
图6PEG-IFN介导的干扰素应答的3D结构模型。按照抗病毒比活性和抗增殖比活性将PEG-IFN位置异构体分为4组。人干扰素α-2a的高分辨率结构由NMR光谱测得(Klaus等人由杂核NMR光谱测得的溶液中的人干扰素α-2a的高分辨率三维结构，J.Mol.Biol.274(1997)；661-675)。干扰素α-2a的聚乙醇化位点以红色显示。
实施例
IFN的抗病毒和抗增殖作用干扰素α-2a(IFN)在介导抗病毒和抗增殖应答以及调节免疫应答中起着重要的作用(G.R.Stark细胞如何应答干扰素，Annu.Rev.Biochem.67(1998)，227-264)。IFN的这些生物活性使其作为病原抑制剂而具有重要作用，并可被用于治疗病毒感染和某些癌症(S.Zeuzem等人慢性丙型肝炎患者中聚乙二醇化干扰素α-2a，New England Journal of Medicine 343(2000)，1666-1172)。自1986年以来，重组的人IFN(ROFERON-A)已经成为治疗患病毒性疾病和肿瘤的病人的一种重要治疗剂(S.Zeuzem等人聚乙二醇化干扰素α-2a(40kDa)单一用药一种治疗慢性丙型肝炎的新药剂，Expert Opinion on Investigational Drugs 10(2001)，2201-2213)。
IFN在临床治疗中的成功应用部份地受到其在血清中的短半衰期(4-6小时)的限制。IFN在静脉或皮下给药后的3-8小时达到峰浓度，每次给药后血清中的浓度会发生大幅度的波动。24小时后，体内留有的外源IFN的量微乎其微，因而一周三次的治疗方案不可能保持抗病毒活性所需的浓度(J.M.Harris等人聚乙二醇化一种用于改变药物动力学的新方法，Clin.Pharmacokinet.40(2001)，539-551；P.Bailon等人强效持久形式的干扰素的合理设计一种用于治疗丙型肝炎的40kDa支链聚乙二醇缀合的干扰素2a，Bioconjugate Chem.12(2001)，195-202)。
IFN的施用频率视疾病而定。例如，标准IFN治疗性使用由3百万国际单位的IFN每周皮下给药三次并最多施用48周组成(J.M.Harris等人聚乙二醇化一种用于改变药物动力学的新方法，Clin.Pharmacokinet.40(2001)，539-551)，而有的肿瘤适应症则需要每日给药(P.Bailon等人强效持久形式的干扰素的合理设计一种用于治疗丙型肝炎的40kDa支链聚乙二醇缀合的干扰素2a，Bioconjugate Chem.12(2001)，195-202)。为了提高IFN的药物动力学和药效学特性，将之与聚乙二醇(PEG)缀合。
几年以来，就PEG的大小和PEG的种类对体内和体外的生物活性的影响进行了研究。研究的结果证明PEG的特性与生物活性有着重要的关联。例如，对于掩盖和保护IFN免于蛋白水解而言，支链的PEG部分比直链PEG结合更为有效，且支链的PEG部分还可以增强蛋白质的吸收和改善蛋白质的分布特性。另一效果是增加PEG部分的分子量可以降低治疗分子的清除率，由此造成与病毒的持久接触(J.M.Harris等人聚乙二醇化一种用于改变药物动力学的新方法，Clin.Pharmacokinet.40(2001)，539-551)。基于这些认识以及聚乙二醇化手段的最新进展，已开发出一种持久的支链单聚乙二醇化IFN(P.Bailon等人强效持久形式的干扰素的合理设计一种用于治疗丙型肝炎的40kDa支链聚乙二醇缀合的干扰素2a，Bioconjugate Chem.12(2001)，195-202)。
一种通过酰氨键连接上40kDa支链PEG的干扰素α-2a(PEG-IFN)表现出持久的吸收和减低的肾清除率，其在整个每周一次给药的方案中导致强的抗病毒压力(M.C.Perry和B.Jarvis综述聚乙二醇化干扰素α-2a(40kD)用于治疗慢性丙型肝炎，Drugs 15(2001)，2263-2288；以及M.W.Lamb和E.N.Martin聚乙二醇化干扰素(40kDa)α-2a的基于体重给药相对固定给药，The Annals of Pharmacotherapy 36(2002)，933-938)。对此PEG-IFN混合物的表征显示出有9种在赖氨酸上单聚乙二醇化的位置异构体K31，K49，K70，K80，K112，K121，K131，K134和K164。在抗病毒试验中，所有的位置异构体均能引起MDBK细胞对病毒的抵抗。
实施例1PEG-IFN的制备PEG-IFN由Hoffmann-La Roche公司生产。聚乙二醇化的干扰素α-2a如下制备用活化的支链聚乙二醇衍生物(分子量40000Da)与干扰素分子表面的赖氨酸ε-氨基基团缀合(Bailon，P.等人强效持久形式的干扰素的合理设计一种用于治疗丙型肝炎的40kDa支链聚乙二醇缀合的干扰素2a，Bioconjugate Chem.12(2001)，195-202；EP809996)。按照下文所述分离和分析PEG-IFN的异构体。其它所有试剂和化学品均为能获得的最高纯度。
PEG-IFN的组成是单聚乙二醇化的IFN分子的混合物。每一个分子中仅一个赖氨酸通过结合PEG部分而被化学修饰，从而形成几种物质的混合物。因为存在11个赖氨酸和一个游离的N末端氨基基团，预期有12种单聚乙二醇化的分子，但仅能发现9种赖氨酸修饰的分子(K31，K49，K70，K83，K112，K121，K131，K134和K164)。
实施例2纯化和表征PEG-IFN位置异构体我们开发了一种制备性两步层析方法用于有效的分离这些种类的异构体。制备的位置异构体的纯度可以用分析性离子交换方法检验，例子参见图1中的洗脱曲线。分离是基于这些异构体的局部电荷差异进行的，而这种差异是由于蛋白质部份上聚乙二醇化位置的不同而造成的。
层析图中基线吸收朝向末尾的下降意味着没有别的种类的单聚乙二醇化IFN在更高的滞留时间被洗脱下来。通过两步分离纯化得到9种位置异构体，之后的性质分析显示聚乙二醇化位点均在赖氨酸上K31，K49，K70，K83，K112，K121，K131，K134和K164。
实施例3位置异构体的分离使用两步分离纯化的方案制备PEG-干扰素α2a单聚乙二醇化同种型。
a)第一步是在一个制备性低压液相色谱柱上进行位置异构体的分离，柱基质是弱阳离子交换基质(TOSOH-BIOSEP，Toyopearl CM-650S，树脂批号82A，其离子交换容量为123mEq/ml，柱直径为16mm，柱长120cm)。以0.7mL/min流速使用具有递增醋酸钠浓度的线性pH梯度(25mM，pH4.0至75mM，pH7.8)。检测波长为280nm。通过这个层析步骤，能够得到1、2、5、6类型的异构体以及3，4，4a，7和8类型异构体的混合物，参见表1。
b)这些级分进一步地用第二个制备步骤加以分离和纯化。使用的制备性柱子的基质和上文提及的分析性强阳离子交换柱的基质相同，只是增加了柱的大小(30mm内径，70mm长)，另外，使用更高的流速和延长的运行时间。就此分析方法，该柱先用3.4mM的醋酸钠，10％乙醇和1％二甘醇，pH值调节为4.4的溶液(缓冲液A)预平衡。将PEG-IFN样品上样后，柱子用缓冲液A洗，之后用递增线性梯度至10mM磷酸氢二钾、10％乙醇和1％二甘醇，pH值6.6(缓冲液B)的溶液洗。流速为1.0mL/min，检测波长为218nm。
基于PEG-IFNα2a的蛋白质部分在280nm处的光吸收，用光谱法测定PEG-IFNα2a异构体的蛋白浓度。
180μg的PEG-IFNα2a的分析性洗脱曲线示于图1。此法的结果是分出8个洗脱峰，其中2个为基线分离，6个是部分的分离。基线吸收朝向层析图末端方向的下降意味着没有别的单聚乙二醇化IFN种类在更高的滞留时间被洗脱下来。
此外，仔细观测IEC的层析图可以发现在峰2和峰3之间有另外一个接近检测界限的峰，这说明还有另外的位置异构体存在，这些异构体对于PEG-IFNα2a混合物的比活性应该也有贡献。由于干扰素α-2a分子显示出12个可聚乙二醇化的位点(11个赖氨酸以及N-末端)，故预期还有其它种类的异构体。然而，鉴于这些种类的低丰度，它们没有被分离出来，性质未能得到检测。
由优化的IEC操作下得到的异构体样品在分离后直接分析(t＝0)和储存于5℃下2周后进行分析。就光谱测定法得到的蛋白含量而言，没有发现来自IEC各峰的蛋白有明显的差别；也没在单聚乙二醇化位点、低-PEG-IFNα2a的含量、团聚体的量和生物测定活性方面发现变化。考虑到各个异构体的相对丰度(由IEC法测得)以及比活性(由抗病毒试验测定)，用于异构体分离的PEG-IFNα2a混合物的生物学比活力几乎全部得以回收(回收率近93％)。考虑到IEC级分中有其它位置异构体的污染，故用分析性IE-HPLC检测各个异构体的纯度。峰2，3，4，4a，5和7的纯度大于98％，峰1和8纯度为93％，峰6的纯度为88％。
表1通过比较异构体与标准参照的Lys-C消化谱鉴定的PEG-肽。
在分离出的各种PEG-IFN中鉴定到的PEG位点峰 肽图谱中缺少的峰PEG-IFNPEG位点 Mr(DA) 序列峰1K31A，E 24-49峰2K134I，I’ 134-164峰3K131C122-131a峰4K121B，C 113-131峰4a K164b134-164a，b峰5K70D，F 50-83峰6K83D，H 71-112峰7K49E，F 32-70峰8K112B，H 84-121a132-133太小而未检测a bRP-HPLC.
各级分通过本文中所述方法来鉴定其性质。
实施例4通过质谱肽作图法分析各级分质谱用MALDI-TOF MS仪(PerSeptive Biosystems Voyager-DE STR，使用“延迟引出”(delayed extraction))记录。各个IEC(离子交换层析)级分通过透析脱盐，用0.02M 1，4-二硫代-DL-苏糖醇(DTT)还原，并用0.2M 4-乙烯基吡啶烷基化。然后用内切蛋白酶Lys-C(Wako Biochemicals)消化蛋白质，反应溶液是0.25M Tris(三(羟甲基)-氨基乙烷)，pH8.5，酶与蛋白的比例约为1∶30。在37℃下反应过夜。
20mg/mlα-氰基-4-羟基桂皮酸和12mg/ml硝酸纤维素在40/60(v/v)的丙酮/异丙醇中的溶液作为基质(薄层施用)。首先，将0.5μL基质铺于靶上并让其干燥。然后，加入1.0μL样品。光谱在线性阳离子化模式下获得，其中加速电压为20,000V，栅极电压为95％。每一个光谱至少收集可覆盖整个点的190次激光发射。Des-Arg1-缓激肽和牛胰岛素用来作为内部校准。
实施例5高效液相色谱(RP-HPLC)肽作图肽通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)肽作图法来表征。IEC的级分用上面MALDI-TOF MS肽作图中的方法还原、烷基化、以及用内切蛋白酶Lys-C消化。消化的异构体在Waters Alliance HPLC系统中进行分析，所用为Vydac RP-C18分析柱(5μm，2.1×250mm)和填充同样材料的前置柱。用水中的1％至95％的乙腈梯度进行洗脱，时间为105分钟，流速0.2mL/min。两种溶剂均含有0.1％(v/v)TFA。每个消化样品注射100μL，监测波长为215nm。
实施例6未消化蛋白的MALDI-TOF谱18mg/ml的反式-3-吲哚基丙烯酸在70/30(v/v)的乙腈/0.1％三氟乙酸中的溶液与等体积的样品溶液预混合。然后将1.0μL混合物施于靶表面。通常在线性阳离子化模式下平均进行150-200次激光发射。加速电压设为25,000V，栅极电压至90％。牛血清M+和M2+用作外部校准。
实施例7SE-HPLC(大小排阻HPLC)SE-HPLC在配有TosoHaas TSK gel G 4000 SWXL柱(7.8×300mm)的Waters Alliance 2690 HPLC系统下进行。蛋白质用含有0.02MNaH2PO4，0.15M NaCl，1％(v/v)二甘醇以及10％(v/v)乙醇(pH6.8)的流动相洗脱，洗脱流速为0.4mL/min，用210nm的波长监测。注射量为每种异构体20μg。
大小排阻HPLC以及SDS-PAGE用于测定不同的IEC级分中的低-PEG-IFNα2a和团聚体的量。参照物含有2.3％团聚体和2.2％低聚物。
峰1，4，4a，5，6和8含有小于0.7％的低聚乙二醇化IFNα2a，而峰2，3，和7中低聚乙二醇化IFNα2a的百分比低于测量的底限(＜0.2％)。对于团聚体，观察到不同趋势。所有峰中团聚体的量均低于0.9％。
实施例8SDS-PAGESDS-PAGE使用16％的Tris-甘氨酸凝胶(1.5mm，10孔)在非还原和还原条件下进行。分子量分布在2.5到200kDa的Novex Mark 12分子量标准被用作参照，用牛血清白蛋白(BSA)(2ng)作为灵敏度标准。大约所有样品各约1μg和0.5μg标准物加到胶上。电泳条件是在125V，6W下120分钟。用Novex的SilverXpress银染试剂盒对蛋白进行固定和染色。
对于IEC级分1-8，在非还原条件下记录的胶显示出与参照标准PEG-IFNα2a相类似的模式。在还原条件下，与标准相比而言，凝胶显示出在大约90kDa的次要条带的强度有所增强。对于峰6，7和8，在6到10kDa之间有蛋白质片断。两条带一起相当于被剪切物质的约1％。在异构体1，5，6，7，8的泳道中，可见大于100kDa的额外的条带，这些条带在标准物中也有出现。这些条带可以推定为低聚体。因而，SDS-PAGE证实了SE-HPLC分析的结果。
总之，RP-HPLC和SDS-PAGE试验显示IEC组分的纯度可以被认为与PEG-IFNα2a参照标准相当。
由9个IEC-级分得来的各种PEG-IFNα2a的结构基于上述方法的结果使用上述策略得以鉴定。
实施例9体外抗病毒保护活性分离到的异构体的抗病毒活性通过水泡性口炎病毒(VSV)在Madin-Darby牛肾细胞(MDBK)上的致细胞病变效应的减弱来测定。细胞系在含有10％胎牛血清的MEM培养基中培养。为了测定有效浓度，异构体和PEG-IFN稀释至终浓度为10ng/ml(试验起始浓度)。这里有效浓度(EC50)定义为使得50％细胞抵抗VSV所需的浓度。在所有测定中，细胞培养物在加入PEG-IFN异构体后4小时经VSV攻击。在37℃下生长18小时后，细胞用结晶紫crystal violet_染色，以确定完好的细胞的数量。
测定EC50值以确定9个位置异构体的抗病毒活性。在本试验中测定PEG-IFN作为参照。
图2A显示的是异构体的比活性(U/μg，灰色柱)。在这个试验中，各个位置异构体均有活性，只是水平不同。异构体K31和K134有比PEG-IFN高的活性，分别相当于PEG-IFN活性的170％和125％。K164的活性等于混合物的活性，而K49，K70，K83，K112，K121和K131的活性则较低。
实施例10抗增殖活性试验在此试验中，使用人的转移性黑色素瘤细胞系(ME15)的原代细胞培养物。此细胞系于2000年8月17日依据布达佩斯条约保藏在巴黎的国立微生物保藏中心(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes，Institut Pasteur)，保藏号为CNCM I-2546。细胞系在添加有10％FCS，2mM谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，10mM非必需氨基酸和HEPES缓冲液(均购自英国Gibco Life Sciences)的RPMI培养基中培养。当细胞汇合时。用胰蛋白酶消化以进行细胞传代。以平底96孔板中每孔约5000-6000个细胞为细胞增殖试验的起点，试验分别在有或没有各个浓度的IFN，PEG-IFN和异构体的情况下进行5天。之后用细胞着色试剂盒(Promega，Madison，USA)进行活细胞计数，计数是基于四氮唑盐MTS裂解为甲月替(formazan)后的比色测定进行的。按照厂商推荐加入MTS反应溶液，37℃反应4小时之后在分光光度计上测定490nm处的光吸收值。
用IFN-敏感的黑色素瘤细胞系(ME15)和商业试验来测定异构体的抗增殖比活性。位置异构体和作为参照的PEG-IFN的使用浓度为100U/ml(图2B)。试验所用的异构体的生物学单位(U)由本文中前述的抗病毒试验来定义和确定，以PEG-IFN为标准参照。
在本试验中，所有的异构体均有活性，其中异构体K31和K134相对于PEG-IFN的活性分别为159％和115％。异构体K164显示与PEG-IFN相同的活性；其余所有异构体的活性均低于参照物。
此结果中的活性排序与抗病毒试验中的活性排序基本上相同，这表明上述活性来源于一个共同的引发机制或信号事件。
对于在以上二试验中9种位置异构体具有不同比活性的一种解释是它们的蛋白稳定性有所不同。为了证实此点，我们在ME15细胞系中进行了一个时间过程试验来测试不同的浓度下的一些异构体。我们选择了活力最高的异构体K31和K134，以及活力最低的异构体K121，用IFN以及PEG-IFN作为参照(参见图3)。不同浓度(500，125和15U/ml)的IFN，PEG-IFN和位置异构体被用来处理ME15细胞，作用时间为5天。每24小时计算细胞的数量。
我们又发现了与上述抗增殖活性惊人的相关性K134活性最高，K31和PEG-IFN次之。和我们预想的一样，活性最低的是K121和IFN。
可以观察到，对增殖的抑制随着浓度的降低而降低。有趣的是，5天之后，PEG-IFN在500U/ml使用浓度时的抗增殖活性与使用浓度为125U/ml的异构体K134的抗增殖活性一致，而5天后，IFN和K121在使用浓度至少125U/ml时表现出较低或没有抗增殖活性。
通过三个独立的生物试验，我们在PEG部分的分子内结合位点和生物活性之间建立了联系。总体而言，异构体K31和K134比商购混合物表现出一贯的较高的比活性，而其余7个异构体相对于商购混合物(等于K164)有相近似的比活性。活性范围在170％到20％之间，说明不同的位置异构体之间蛋白的比活性的差异是显著的。
实施例11从大肠杆菌表达和纯化重组干扰素受体2的胞外结构域。
干扰素受体2的胞外结构域(IFNR2-EC)被克隆进pET15b-载体(美国Invitrogen)，N末端带有His-Tag_。用此载体构建体在E.coli中表达IFNR2-EC。目的蛋白在细胞中以包函体的形式沉淀。在完全培养基中发酵后将E.coli沉淀并重悬于含50mM Tris，10％蔗糖，0.02％叠氮化钠，10mM氯化镁以及无EDTA的蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中。在FrenchPress中匀浆并于13000rpm离心后，将包函体溶解于8M的尿素。第一个层析步骤是镍螯和层析，用大于10个柱体积的0-500mM咪唑进行线性梯度洗脱。合并的IFNR2峰在8M尿素中透析以去除咪唑。透析之后用含有150mM pH8.0 Tris/HCl的8M尿素稀释样品至A280吸收值为0.1，然后将之储存在室温下直到Ellman试验结果显阴性。氧化的IFNR2-EC对50mM Tris pH8.4透析以使之重新折叠。pH8.4的50mM Tris溶液也是第二步层析的起始缓冲液。第二步层析用阴离子交换树脂(HiTrap Q HP，5×5ml，Amersham Biosciences)，用0-500mM NaCl梯度进行。
所有的纯化步骤都用还原和非还原SDS-PAGE加以分析。蛋白质的纯度由使用Superdex_75和200 HR(PC 3.2/30，Amersham Biosciences)的分析性大小排阻层析进行监测。此层析方法同样用于测定结合活性和能力(数据未显示)。
实施例12用光学生物传感器系统表征IFN以及PEG-IFN异构体与IFNR2-EC的相互作用。
IFNR2-EC的固定用生物素标记来实现。生物素化蛋白质被锚定在链亲和素传感器表面(SA Sensor，BIAcore)。
生物素化是通过将蛋白质的储存溶液(10mM醋酸，pH7.5)用Hepes(10mM，pH＝8.4)稀释至最终蛋白浓度为0.23mg/ml(8.65μM)进行的。8.65mM溶在DMSO中的生物素氨基己酸-正-羟基琥珀酰亚胺酯(Fluka)被加入溶液中使得生物素化试剂的终浓度为86.5μM。混合物反应1小时后对10mM Hepes缓冲液(pH8.4，含150mM NaCl)透析过夜以去除低分子量的反应产物。此溶液用于固定步骤中。固定是通过将生物素化蛋白质溶液与SA传感器表面相接触来进行的。固定化的蛋白质的量通过接触时间来控制。对于结合试验，固定4000RU，相当于固定大约4ng/mm2蛋白质。
结合试验以Hepes缓冲液(10mM Hepes，150mM NaCl，3mM EDTA，0.005％聚山梨醇酯20，pH7.4)为运作缓冲液。干扰素溶液通过用运作缓冲液稀释干扰素贮液来制备。所有结合试验的流速设定为5μl/min。干扰素溶液与固定的IFNR2-EC接触5分钟的时段。
结合数据的计算基于形成1/1复合物的简单动力学模型，将时间依赖的反应曲线进行数学拟合来确定解离常数值(KD)。Kon和koff值通过此拟合而得到。KD为koff/Kon之比。
当用无标记的固相探测例如表面等离子体共振(surface plasmonresonance，SPR)来研究蛋白质的相互作用时，需要固定相互作用的化合物中的一个。
我们使用两个不同的偶联策略来将IFN或IFNR2-EC固定于传感器表面。IFN经由自由氨基基团被固定到羧化葡聚糖传感器表面，IFNR2-EC被生物素标记并锚定在链亲和素传感器表面。分别用此两种传感器和对应的IFN来进行IFNR2-EC结合试验。获得速率常数和结合亲合力的一致值。结果显示结合亲合力与使用的固定手段和所固定的蛋白无关(数据未显示)。这些预试验对于增加异构体测定的准确性以及验证1/1复合体形成的简单动力学模型是必要的。
为了测定亲合力和动力学常数，我们选择了可以涵盖整个生物学比活性范围的五种异构体(K31，K121，K131，K134和K164)，参见图2A，B。为了增加动力学和平衡参数的意义，我们用了不同的异构体浓度在固定的IFNR2-EC上进行结合研究。用IFN和PEG-IFN作为参照。基于1/1复合物形成的动力学模型的结合曲线拟合结果示于表2。
表2野生型IFN；PEG-IFN以及几种位置异构体的相互作用的动力学常数
konkoffKDkin[105M-1×s-1] [10-2s-1][nM]IFN 12.5 1.14 9.12PEG-IFN 0.27 2.3851K31n.d. n.d. n.d.(＞1mM)K1340.87 3.96 455K1310.96 2.8289K1210.83 2.33 279K1640.652 2.19 335表中显示了测得的亲和力和动力学数据。对于动力学常数的计算是基于形成1/1的复合物的动力学模型进行的。IFNR2-EC由生物素标记。生物素化的蛋白质被锚定在链亲和素传感器的表面(SA Sensor，Biacor)。结合试验在作为运作缓冲液的Hepes缓冲液(10mM Hepes，150mM NaCl，3mM EDTA，0.005％聚山梨醇酯20，pH7.4)中进行。
所获得的KD-值显示IFN的聚乙二醇化导致其与INFR2-EC的亲和力降低。亲和力的降低值由聚乙二醇化的位点而定。亲和力的变化通常由结合常数(Kon)的变化引起。例如，异构体K134使亲和力改变了大约15倍。其kon减少了10倍以上，而其Koff仅增加大约4倍。
对于异构体K31，因为其蛋白质浓度太低，故只可能得出KD的估算值。
将抗病毒比活性或抗增殖比活性数据与IFNR2-EC亲和力研究相结合，发现一种有趣的联系，参见图4。它显示，对于一个给定的异构体，IFNR2-EC亲和力越高(KD越低)，其生物学比活性越低。此关系与主要用于寻找具有低KD和高生物活性的配体的通常药物筛选原则正相反。
实施例13异构体相对于IFN的转录应答可用于同时测量数千个基因的表达水平的DNA微阵列提供了一个全面的架构以确定位置异构体如何在基因组水平上影响细胞的新陈代谢和调节。
为了评价聚乙二醇化位点对于IFN转录活性的影响，我们用寡核苷酸阵列技术测量了IFN诱导的黑色素瘤细胞系ME15的基因表达模式。
ME15细胞在100U/ml的IFN，PEG-IFN或PEG-IFN异构体存在的条件下孵育48小时。经过48小时后培养的细胞用刮除的方法收获，并用RNA-BeeTM提取细胞的总RNA。从每个样品中10μg的细胞总RNA被逆转录(Invitrogen，U.S.)，标记(Ambion，U.S.)，并利用商购的试剂盒按生产厂商的说明进行加工。碱性条件下加热片断化以及之后U95Av2 GeneChip阵列与cDNA的杂交依照microchip(Affymetrix，U.S.).的生产商提供的标准程序进行。进行寡核苷酸阵列分析的另外一个方法实例在文献中有记载——Fambrough等人生长因子受体活化的多样信号通路可以诱导在很大范围上重叠而非独立的多组基因，Cell 97(1999)，727-741。
阵列的原始数据用共聚焦激光扫描仪(Hewlett Packard，U.S.)测定，并用GeneChip v3.1软件(Affymetrix，U.S.)分析像素水平。各个基因的表达水平相对于与错配寡核苷酸的杂交计算为荧光强度的归一化平均差，用任意单位(AD)表示。样品的每个分析均用来自三个不同的细胞板的标记cDNA重复进行三次。
判定一个基因在用IFN，PEG-IFN或PEG-IFN异构体处理后相对于未处理细胞是否有差异表达的四项标准为(1)处理后的细胞的强度值至少比未处理的细胞高两倍。(2)处理后的细胞的强度值应至少大于或等于50AD。(3)未处理的细胞的强度值应低于50 AD。(4)标准差必须显著低于平均差的绝对变化值，计算的基因的置信水平设为大于97％(p值＜0.03)。
在这些试验中，我们所用的细胞系(ME15)和抗增殖试验中用到的相同。我们用100U/ml的各个异构体或IFN和PEG-IFN处理细胞48小时。IFN用来作为参照。经过这样的处理之后从ME-15细胞中提取总RNA。用于制备cDNA以及随后进行杂交和U95Av2 GeneChip阵列扫描的方法见上文所述。加工前经琼脂糖凝胶电泳对总RNA样品进行肉眼观察，没有在样品中发现任何降解迹象。对于每个异构体、IFN和PEG-IFN的生物重复次数(n＝3)使得可以为数据分析应用统计学算法，以解决实验差异问题。数据分析集中于那些在未处理细胞中低于50 AD而在处理细胞中上调至少两倍以致AD值至少为50AD的基因。
标准差必须显著低于平均差的绝对变化值，基因的计算置信水平设为大于97％(p值＜0.03)。
运用这些标准，观察到29个上调的基因的表达谱。在这个表达模式下，相对于IFN，13种已知参与抗增殖和抗病毒通路的IFN所诱导的基因受到很大程度的上调(表3)。分级群聚(图5B)显示所有的异构体都有转录活性，但强度有所不同。
针对每个异构体和IFN，测定所诱导基因的AD值之和(∑AD)，转录、抗病毒、抗增殖活性均以IFN为参照进行比较。图5A显示，当异构体具有增加的生物活性(与PEG-IFN相比较根据异构体的抗病毒和抗增殖活性来确定)，其也具有增加的转录活性；而生物活性较低的异构体显示较低的转录活性，因此，与生物活性相对于结合试验的关系有所不同，生物活性与转录活性之间有着正相关性。
除了异构体对于总体转录基因应答的影响，还发现单个基因的不同的上调。例如，干扰素诱导的核磷蛋白基因在K49和K31接触下的表达高于在K134或K131接触下的表达。K49和K31异构体比K134或K131具有较低的总体转录基因应答。此发现突出了为了确定目的化合物的转录活性，有必要用本发明的方法分析总体转录基因应答而不是测量某个或一小部分选定的基因的转录表达水平。
另外，针对转录特异的副作用也分析了微阵列芯片的数据，这些副作用可以指示出任何异构体对于细胞的生存或代谢的不良影响。这些分析的标准与上述的相同，唯一的区别在于各个异构体的数据是交叉比较的。本分析的结果显示所有异构体均无特异副作用。
表3取决于聚乙二醇化位点由IFN调节的基因


为了鉴定出受诱导的基因，ME15细胞系在没有(未处理细胞)或有100U/ml IFN或PEG-IFN样品存在的条件下被培养48小时。各个基因的表达水平相对于与错配寡核苷酸的杂交计算为荧光强度的归一化平均差，以任意单位来表示。样品的每个研究用来自三个不同的细胞板的标记cDNA重复进行三次测量。对于基因在IFN或PEG-IFN样品处理后相对于未处理细胞是否差异表达的判断准则是处理细胞的平均值比未处理细胞的平均值至少高出两倍，而处理细胞的平均值应至少大于或等于50单位。且未处理的细胞的平均值应小于50单位。另外，标准差必须显著低于平均差的绝对变化值，基因的计算置信水平设为大于97％(p值＜0.03)。运用这些标准，发现了29个受到调节的基因。
序列表<110>弗·哈夫曼-拉罗切有限公司(F.Hoffmann-La Roche AG)<120>转录活性试验<130>21574<160>29<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>597<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>干扰素α诱导的基因；ISG12基因<222>(1)..(597)<223>GenBank accession No.X67325<400>1agctgaagtt gaggatctct tactctctaa gccacggaat taacccgagc aggcatggag 60gcctctgctc tcacctcatc agcagtgacc agtgtggcca aagtggtcag ggtggcctct120ggctctgccg tagttttgcc cctggccagg attgctacag ttgtgattgg aggagttgtg180gccatggcgg ctgtgcccat ggtgctcagt gccatgggct tcactgcggc gggaatcgcc240tcgtcctcca tagcagccaa gatgatgtcc gcggcggcca ttgccaatgg gggtggagtt300gcctcgggca gccttgtggg tactctgcag tcactgggag caactggact ctccggattg360accaagttca tcctgggctc cattgggtct gccattgcgg ctgtcattgc gaggttctac420tagctccctg cccctcgccc tgcagagaag agaaccatgc caggggagaa ggcacccagc480catcctgacc cagcgaggag ccaactatcc caaatatacc tgggtgaaat ataccaaatt540ctgcatctcc agaggaaaat aagaaataaa gatgaattgt tgcaactctt aaaaaaa 597<210>2<211>996<212>DNA<213>人<220>
<221>BST-2<222>(1)..(996)<223>GenBank accession No.D28137<400>2gtggaattca tggcatctac ttcgtatgac tattgcagag tgcccatgga agacggggat 60aagcgctgta agcttctgct ggggatagga attctggtgc tcctgatcat cgtgattctg120ggggtgccct tgattatctt caccatcaag gccaacagcg aggcctgccg ggacggcctt180
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<221>干扰素诱导的肽(6-16)基因<222>(1)..(6803)<223>GenBank accession No.U22970<400>3agatctatca tgatggccac atgaacacag gcttcactgg tcttaccata tgcccatgac 60ccagaagcag ccagcctgag agaacaatgg aacaaagtga cttaatttcc aaagttctgg120gggtttataa acagcatatg gtatgtcaca tgactactgt gggattggaa aaagatcatg180taaatagagc actttgcaca gaccctggca tgcagcaagt gctcaataaa tgataggtgt240tgtttactaa ttggactgaa tggtgaaagg cctgtgtgcc ccagggggag ctggtgatca300ggcttcacta agcccagtat ggccgtggct ctcatctcag tgtgacatgc tttgaatacc360cttagcggct ccaaaagtcc tcagcttgaa gtgcattttt ctgccagcag gcagcacaca420aatgttccgc tgggcggagc tgggagagag gggaaaatga aactctgcag agtgcaggag480ctgggagaga ggggaaaatg aaactgcaga gtgcagaaat agaaactccg acagggattg540gctgcctagg gtgagacgtg ggaggatcca caagtgatga taaaaagcca gccttcagcc600
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<221>干扰素诱导的17-kDa/15-kDa蛋白质<222>(1)..(634)<223>GenBank accession No.M13755<400>4cggctgagag gcagcgaact catctttgcc agtacaggag cttgtgccgt ggcccacagc 60ccacagccca cagccatggg ctgggacctg acggtgaaga tgctggcggg caacgaattc120caggtgtccc tgagcagctc catgtcggtg tcagagctga aggcgcagat cacccagaag180attggcgtgc acgccttcca gcagcgtctg gctgtccacc cgagcggtgt ggcgctgcag240gacagggtcc cccttgccag ccagggcctg ggccctggca gcacggtcct gctggtggtg300gacaaatgcg acgaacctct gagcatcctg gtgaggaata acaagggccg cagcagcacc360tacgaggtcc ggctgacgca gaccgtggcc cacctgaagc agcaagtgag cgggctggag420ggtgtgcagg acgacctgtt ctggctgacc ttcgagggga agcccctgga ggaccagctc480ccgctggggg agtacggcct caagcccctg agcaccgtgt tcatgaatct gcgcctgcgg540ggaggcggca cagagcctgg cgggcggagc taagggcctc caccagcatc cgagcaggat600caagggccgg aaataaaggc tgttgtaaga gaat634<210>5<211>2058
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<221>ISGF3-γ<222>(1)..(1584)<223>GenBank accession No.M87503<400>7gatcagaggg cgatcagctg gacagcaact caggatggca tcaggcaggg cacgctgcac 60ccgaaaactc cggaactggg tggtggagca agtggagagt gggcagtttc ccggagtgtg 120ctgggatgat acagctaaga ccatgttccg gattccctgg aaacatgcag gcaagcagga 180cttccgggag gaccaggatg ctgccttctt caaggcctgg gcaatattta agggaaagta 240taaggagggg gacacaggag gtccagctgt ctggaagact cgcctgcgct gtgcactcaa 300caagagttct gaatttaagg aggttcctga gaggggccgc atggatgttg ctgagcccta 360caaggtgtat cagttgctgc caccaggaat cgtctctggc cagccaggga ctcagaaagt 420accatcaaag cgacagcaca gttctgtgtc ctctgagagg aaggaggaag aggatgccat 480gcagaactgc acactcagtc cctctgtgct ccaggactcc ctcaataatg aggaggaggg 540ggccagtggg ggagcagtcc attcagacat tgggagcagc agcagcagca gcagccctga 600gccacaggaa gttacagaca caactgaggc cccctttcaa ggggatcaga ggtccctgga 660gtttctgctt cctccagagc cagactactc actgctgctc accttcatct acaacgggcg 720cgtggtgggc gaggcccagg tgcaaagcct ggattgccgc cttgtggctg agccctcagg 780ctctgagagc agcatggagc aggtgctgtt ccccaagcct ggcccactgg agcccacgca 840gcgcctgctg agccagcttg agaggggcat cctagtggcc agcaaccccc gaggcctctt 900cgtgcagcgc ctttgcccca tccccatctc ctggaatgca ccccaggctc cacctgggcc 960aggcccgcat ctgctgccca gcaacgagtg cgtggagctc ttcagaaccg cctacttctg1020cagagacttg gtcaggtact ttcagggcct gggcccccca ccgaagttcc aggtaacact1080gaatttctgg gaagagagcc atggctccag ccatactcca cagaatctta tcacagtgaa1140gatggagcag gcctttgccc gatacttgct ggagcagact ccagagcagc aggcagccat1200tctgtccctg gtgtagagcc tgggggaccc atcttccacc tcacctcttt gttcttcctg1260tctcctttga agtagactca ttcttcacac gattgacctg tcctctttgt gataattctc1320agtagttgtc cgtgataatc gtgtcctgaa aatcctcgca cacactggct ggtggagaac1380tcaaggctaa ttttttatcc tttttttttt tttatttttg agatatacgc cctctttcat1440ctgtaaggga ctaggaaatt ccaaatggtg tgaacccagg gggcctttcc ctcttccctg1500acctcccaac tctaaagcca agcactttat atttttctct tagatattca ctaaggactt1560aaaataaaat ttttttgaaa gagg 1584
<210>8<211>483<212>DNA<213>人<220>
<221>丙型肝炎相关的微管聚集体<222>(1)..(483)<223>GenBank accession No.D28915<400>8cctctggttg cctttcctga gataatccac taagaatatt ttgtgtttct tttctcaggg 60aatctaaggg aggaaattat caactgtgca caaggaaaaa aatagatatg tgaaaggttc120acgtaaattt cctcacatca cagaagatta aaattcagaa aggagaaaac acagaccaaa180gagaagtatc taagaccaaa gggatgtgtt ttattaatgt ctaggatgaa gaaatgcata240gaacattgta gtacttgtaa ataactagaa ataacatgat ttagtcataa ttgtgaaaaa300taataataat ttttcttgga tttatgttct gtatctgtga aaaaataaat ttcttataaa360actcgggtct aacttgagag tgtgtgtgat tttggaaaaa ttatgatttg tcagcatctt420ctgatattca ctgctttcat cttaattttg ccttctgatt ttatttctaa agtatgtgat480ttt 483<210>9<211>1642<212>DNA<213>人<220>
<221>干扰素诱导的56Kd蛋白质_(IFIT-1)<222>(1)..(1642)<223>GenBank accession No.M24594<400>9ccagatctca gaggagcctg gctaagcaaa accctgcaga acggctgcct aatttacagc 60aaccatgagt acaaatggtg atgatcatca ggtcaaggat agtctggagc aattgagatg120tcactttaca tgggagttat ccattgatga cgatgaaatg cctgatttag aaaacagagt180cttggatcag attgaattcc tagacaccaa atacagtgtg ggaatacaca acctactagc240ctatgtgaaa cacctgaaag gccagaatga ggaagccctg aagagcttaa aagaagctga300aaacttaatg caggaagaac atgacaacca agcaaatgtg aggagtctgg tgacctgggg360caactttgcc tggatgtatt accacatggg cagactggca gaagcccaga cttacctgga420caaggtggag aacatttgca agaagctttc aaatcccttc cgctatagaa tggagtgtcc480
agaaatagac tgtgaggaag gatgggcctt gctgaagtgt ggaggaaaga attatgaacg 540ggccaaggcc tgctttgaaa aggtgcttga agtggaccct gaaaaccctg aatccagcgc 600tgggtatgcg atctctgcct atcgcctgga tggctttaaa ttagccacaa aaaatcacaa 660gccattttct ttgcttcccc taaggcaggc tgtccgctta aatccagaca atggatatat 720taaggttctc cttgccctga agcttcagga tgaaggacag gaagctgaag gagaaaagta 780cattgaagaa gctctagcca acatgtcctc acagacctat gtctttcgat atgcagccaa 840gttttaccga agaaaaggct ctgtggataa agctcttgag ttattaaaaa aggccttgca 900ggaaacaccc acttctgtct tactgcatca ccagataggg ctttgctaca aggcacaaat 960gatccaaatc aaggaggcta caaaagggca gcctagaggg cagaacagag aaaagctaga1020caaaatgata agatcagcca tatttcattt tgaatctgca gtggaaaaaa agcccacatt1080tgaggtggct catctagacc tggcaagaat gtatatagaa gcaggcaatc acagaaaagc1140tgaagagaat tttcaaaaat tgttatgcat gaaaccagtg gtagaagaaa caatgcaaga1200catacatttc tactatggtc ggtttcagga atttcaaaag aaatctgacg tcaatgcaat1260tatccattat ttaaaagcta taaaaataga acaggcatca ttaacaaggg ataaaagtat1320caattctttg aagaaattgg ttttaaggaa acttcggaga aaggcattag atctggaaag1380cttgagcctc cttgggttcg tctataaatt ggaaggaaat atgaatgaag ccctggagta1440ctatgagcgg gccctgagac tggctgctga ctttgagaac tctgtgagac aaggtcctta1500ggcacccaga tatcagccac tttcacattt catttcattt tatgctaaca tttactaatc1560atcttttctg cttactgttt tcagaaacat tataattcac tgtaatgatg taattcttga1620ataataaatc tgacaaaata tt 1642<210>10<211>853<212>DNA<213>人<220>
<221>干扰素诱导的蛋白质9-27<222>(1)..(853)<223>GenBank accession No.J04164<400>10ctagtcctga cttcacttct gatgaggaag cctctctcct tagccttcag cctttcctcc 60caccctgcca taagtaattt gatcctcaag aagttaaacc acacctcatt ggtccctggc120taattcacca atttacaaac agcaggaaat agaaacttaa gagaaataca cacttctgag180aaactgaaac gacaggggaa aggaggtctc actgagcacc gtcccagcat ccggacacca240
cagcggccct tcgctccacg cagaaaacca cacttctcaa accttcactc aacacttcct 300tccccaaagc cagaagatgc acaaggagga acatgaggtg gctgtgctgg gggcaccccc 360cagcaccatc cttccaaggt ccaccgtgat caacatccac agcgagacct ccgtgcccga 420ccatgtcgtc tggtccctgt tcaacaccct cttcttgaac tggtgctgtc tgggcttcat 480agcattcgcc tactccgtga agtctaggga caggaagatg gttggcgacg tgaccggggc 540ccaggcctat gcctccaccg ccaagtgcct gaacatctgg gccctgattc tgggcatcct 600catgaccatt ggattcatcc tgtcactggt attcggctct gtgacagtct accatattat 660gttacagata atacaggaaa aacggggtta ctagtagccg cccatagcct gcaacctttg 720cactccactg tgcaatgctg gccctgcacg ctggggctgt tgcccctgcc cccttggtcc 780tgcccctaga tacagcagtt tatacccaca cacctgtcta cagtgtcatt caataaagtg 840cacgtgcttg tga853<210>11<211>1377<212>DNA<213>人<220>
<221>干扰素诱导的2-5A合成酶<222>(1)..(1377)<223>X04371<400>11aacgaaacca acagcagtcc aagctcagtc agcagaagag ataaaagcaa acaggtctgg 60gaggcagttc tgttgccact ctctctcctg tcaatgatgg atctcagaaa taccccagcc120aaatctctgg acaagttcat tgaagactat ctcttgccag acacgtgttt ccgcatgcaa180atcaaccatg ccattgacat catctgtggg ttcctgaagg aaaggtgctt ccgaggtagc240tcctaccctg tgtgtgtgtc caaggtggta aagggtggct cctcaggcaa gggcaccacc300ctcagaggcc gatctgacgc tgacctggtt gtcttcctca gtcctctcac cacttttcag360gatcagttaa atcgccgggg agagttcatc caggaaatta ggagacagct ggaagcctgt420caaagagaga gagcattttc cgtgaagttt gaggtccagg ctccacgctg gggcaacccc480cgtgcgctca gcttcgtact gagttcgctc cagctcgggg agggggtgga gttcgatgtg540ctgcctgcct ttgatgccct gggtcagttg actggcagct ataaacctaa cccccaaatc600tatgtcaagc tcatcgagga gtgcaccgac ctgcagaaag agggcgagtt ctccacctgc660ttcacagaac tacagagaga cttcctgaag cagcgcccca ccaagctcaa gagcctcatc720cgcctagtca agcactggta ccaaaattgt aagaagaagc ttgggaagct gccacctcag780
tatgccctgg agctcctgac ggtctatgct tgggagcgag ggagcatgaa aacacatttc 840aacacagccc agggatttcg gacggtcttg gaattagtca taaactacca gcaactctgc 900atctactgga caaagtatta tgactttaaa aaccccatta ttgaaaagta cctgagaagg 960cagctcacga aacccacgcc tgtgatcctg gacccggcgg accctacagg aaacttgggt1020ggtggagacc caaagcgttg gaggcagctg gcacaagagg ctgaggcctg gctgaattac1080ccatgcttta agaattggga tgggtcccca gtgagctcct ggattctgct ggtgagacct1140cctgcttcct ccctgccatt catccctgcc cctctccatg aagcttgaga catatagctg1200gagaccattc tttccaaaga acttacctct tgccaaaggc catttatatt catatagtga1260caggctgtgc tccatatttt acagtcattt tggtcacaat cgagggtttc tggaattttc1320acatcccttg tccagaattc attcccctaa gagtaataat aaataatctc taacacc 1377<210>12<211>5503<212>DNA<213>人<220>
<221>Wilms肿瘤基因<222>(1)..(5503)<223>GenBank accession No.X69950<220>
<221>misc_feature<222>(2041)..(2041)<223>不明确的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(2083)..(2083)<223>不明确的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(2186)..(2186)<223>不明确的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(2187)..(2187)<223>不明确的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(2488)..(2488)<223>不明确的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(3386)..(3386)
<223>不明确的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(3718)..(3718)<223>不明确的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(3720)..(3720)<223>不明确的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(3938)..(3938)<223>不明确的核苷酸<400>12ggtgcgctca ggactggaag caactctcag ttcatcaatt tcatgggcct acgtatctgc 60tctggccacg gcctggcctc catccccact gtggcattaa tgcagaacaa attgagacat 120atcctctata taattagttc cagaatttaa aaagatttac ggtataataa tagaggcagt 180gccgcggaat cctttcactg aggactctcg gggagctcgg ggaccatctc gcggtggcat 240cagaacagac gagtaacccc agcggctcca ggcactgcga actgggggag agggggaaat 300tttgcaccgc attcggcagt acctaacggt tccgggctcc cagatagggt cagcgaggag 360agttaggaca gtaagtgggg actggttaaa aaaaatcgac ttaattttga aatgatcaga 420agaagctggg agtagttatc acaaagcccc tcccttgccc cccccttttt ttaattgaag 480gaatgacgtt gaaattttca ccgccagcgc ggggctggga accatcctaa acacttgccc 540tgcagccccg agtgggcaga ttccgaagag ttggagtcgg cggggagggg aggaacagct 600gttgggctgt cttgcgcgtg gggctcgggg cgcgggcccc ggggagaggc gctagtcgaa 660agcttgttcc tctcccgcga caggcagcag cgaggtcgag ccactcttta ttacggcctg 720cgggccccgc gcgcagtgtg gctgtccccg cccttgaccg accgcagcgc tttggggtgt 780ttattcagtt gtccgcggcc gctgggtgac tcccggaggc ggcccaggcg tgcgcactgg 840tccctggggt tgcggctgta gcagcccagc tccgcgctct gtcagatgca gtggacagcg 900ccggggtgaa agtaagggtt gagaaatcct cactgccctg ctcctaccca gcctcgattt 960tttcatattg caataattat gcaccttcga ggccgggatg cctgcgcttt gccagtgtat1020caacgccaca tggttttcca ggggctgtcc tcgcctctgc atcccattag ctctgaagag1080gtagaggggt ggtgggtaaa acctccaact ggacgttgag agacccgggt ttcagctcgg1140cgttgccact aacttgtttc ctgtccttaa acagtagtag taacaaaaac tgtaaagttg1200attgagtcaa aggcccacac tgctctccta tctaatcctc agaacaactc tatgaggtgg1260gcgctagtat cccattatcc cgtttgacca gtaaggaaac tgaggctcag agagactgcg1320
gaactcgtct agggtcacac agctgttggt tacctggcag agctgaggtt ccattctggg1380gccaccaacc ccttgctctt tacgtgcgct ccatagactg cctctccttc ggctgtctgg1440gcctcagttt ccttctctgt aaaacgagaa gtttaatctg cagctttctt tgccaatcgg1500tggttcagac caggaacctc tgctacagat ctcggcgctg acaggggtaa gaaggtgggt1560gaaagaaggg ggcgcccagt tttccacagc ctgcttttct ctgggacctc gcgaagggcg1620ggcctcgcga gctaaaggag gtacaggaga gcgcctatcg tccgcggcgg gtgaaggtgc1680tacctgcctt cgtgctaggc tgtgagtcct ggtgcttagc tcagggcgcc aaggccagtg1740tagctggcat gtcccccttg gaaaacctca ggtctcccgc agagaacgtt acccacaaca1800aagaagagga cagagaggca tggagcgccc tgcgactgca ggagtacgtc agttccccag1860cgctggctta gtgtcgcctg ggcttccggg catgtggatc cgttggggtc gtacggagac1920ttcctgtcgg gtccctgggg tcctccgact gcggctcctc agcttagcac tttcttcttg1980gccccgcagg ctgcagggaa ctcctcccac ctctttagtc ggagaagtcc aagtcgggcg2040agggggcacc ccggggttcg caccggtgct cttcccctcc ccncccccac aaggattctg2100agaaaataaa tggcagagga gagaggagtt ctacatttgc ttggctctcc tttcctccta2160tccaccccta catccctcac cccggnncaa aaacttattt ttgaaaaatg ttggcagaga2220tttacgtgtc tttgccttac ctgggtttca caaacacaac gactcacatt caagccagcc2280tcccttcaga taacctcctc tccccccgct aaaagtgcca aggatggtaa aagaagaaac2340aatctcaatc ttttcgtttg gaaatgaaag tccccggctt ttcataaagg gctcctcgcc2400cctcacagtt gagtcctagt taagaaaaac gacttccaag tagaaataat aggcggggag2460aaggaaggga gatacaggga tctggggngt tcttagggca actggcagtg aattttgtct2520cgagagtcct ttctccactc aaaaaaccaa acgcgcgagc cccgcgaaag gtttagggat2580agatcgtgtg ggagaggact gagcagagag cgtgggggca gtgtcttgta gaatctttct2640tttcttaata ataattttaa aagcttctga gtggagacga cgcaaagtca agcagcaaag2700gtggcctggg aggcaagcgg agggctcaag tgccgcatct ttaccctcag ggtctcctgc2760gcctacggga tgcgcattcc caagaagtgc gcccttcgag taagtcctgg gcccgcacac2820acttcgggtc cgcagccaga atttaatggc gacaacgttt atgcaatgca agctaaaaac2880caaagcgtaa aaaattacta tgtcatttat tgaaacgcca ttctttgtca aactgcaact2940actttgcttc acataagttt ggctggaaag cttgcagccc cagcccgggc cagccaggta3000caggaggccg gactgcaacc ggttgcttcc ctcccgtcgc gcctggccgt cccacgctgc3060gccgtcgctg ctgcctcctg gcgcccctgg gattttatac gcacctctga aacacgctcc3120gctccggccc ccggttcttc tccttgccta ggggttgttt cccaatagat actgactcct3180
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cggagccgca cgaggagcag tgcctgagcg ccttcactgt ccacttttcc ggccagttca5100ctggcacagc cggagcctgt cgctacgggc ccttcggtcc tcctccgccc agccaggcgt5160catccggcca ggccaggatg tttcctaacg cgccctacct gcccagctgc ctcgagagcc5220agcccgctat tcgcaatcag ggtaagtagg ccggggagcg ccccctacgc gcggggcagt5280ggcgccaggg actctccgct ctaggacacc cccctctcct accccttttg accgcagctc5340ttacccagct gcttcccaag ggccgtgagg atagcggaag cggcggctgg ggaggaggcc5400ggagagtggg agtgcacgca ggcactggcc cccgacatcc tccaaagcca ggcagagcta5460ggagcctgac tgttcgcaag agccgggagg gcgtctgggg ccc 5503<210>13<211>1816<212>DNA<213>人<220>
<221>干扰素调节因子7B_IRF-7<222>(1)..(1816)<223>GenBank accession No.U53831<400>13ggcacccagg gtccggcctg cgccttcccg ccaggcctgg acactggttc aacacctgtg 60acttcatgtg tgcgcgccgg ccacacctgc agtcacacct gtagccccct ctgccaagag120atccataccg aggcagcgtc ggtggctaca agccctcagt ccacacctgt ggacacctgt180gacacctggc cacacgacct gtggccgcgg cctggcgtct gctgcgacag gagcccttac240ctcccctgtt ataacacctg accgccacct aactgcccct gcagaaggag caatggcctt300ggctcctgag agggcagccc cacgcgtgct gttcggagag tggctccttg gagagatcag360cagcggctgc tatgaggggc tgcagtggct ggacgaggcc cgcacctgtt tccgcgtgcc420ctggaagcac ttcgcgcgca aggacctgag cgaggccgac gcgcgcatct tcaaggcctg480ggctgtggcc cgcggcaggt ggccgcctag cagcagggga ggtggcccgc cccccgaggc540tgagactgcg gagcgcgccg gctggaaaac caacttccgc tgcgcactgc gcagcacgcg600tcgcttcgtg atgctgcggg ataactcggg ggacccggcc gacccgcaca aggtgtacgc660gctcagccgg gagctgtgct ggcgagaagg cccaggcacg gaccagactg aggcagaggc720ccccgcagct gtcccaccac cacagggtgg gcccccaggg ccattcttgg cacacacaca780tgctggactc caagccccag gccccctccc tgccccagct ggtgacaagg gggacctcct840gctccaggca gtgcaacaga gctgcctggc agaccatctg ctgacagcgt catggggggc900agatccagtc ccaaccaagg ctcctggaga gggacaagaa gggcttcccc tgactggggc960
ctgtgctgga ggcgaggccg cggccccaga gtccccgcac caggcagagc cgtacctgtc1020accctcccca agcgcctgca ccgcggtgca agagcccagc ccaggggcgc tggacgtgac1080catcatgtac aagggccgca cggtgctgca gaaggtggtg ggacacccga gctgcacgtt1140cctatacggc cccccagacc cagctgtccg ggccacagac ccccagcagg tagcattccc1200cagccctgcc gagctcccgg accagaagca gctgcgctac acggaggaac tgctgcggca1260cgtggcccct gggttgcacc tggagcttcg ggggccacag ctgtgggccc ggcgcatggg1320caagtgcaag gtgtactggg aggtgggcgg acccccaggc tccgccagcc cctccacccc1380agcctgcctg ctgcctcgga actgtgacac ccccatcttc gacttcagag tcttcttcca1440agagctggtg gaattccggg cacggcagcg ccgtggctcc ccacgctata ccatctacct1500gggcttcggg caggacctgt cagctgggag gcccaaggag aagagcctgg tcctggtgaa1560gctggaaccc tggctgtgcc gagtgcacct agagggcacg cagcgtgagg gtgtgtcttc1620cctggatagc agcagcctca gcctctgcct gtccagcgcc aacagcctct atgacgacat1680cgagtgcttc cttatggagc tggagcagcc cgcctagaac ccagtctaat gagaactcca1740gaaagctgga gcagcccacc tagagctggc cgcggccgcc cagtctaata aaaagaactc1800cagaacaaaa aaaaaa1816<210>14<211>2056<212>DNA<213>人<220>
<221>干扰素诱导的60kDa蛋白质(CIG49)<222>(1)..(2056)<223>GenBank accession No.AF026939<400>14gtggaaacct cttcagcatt tgcttggaat cagtaagcta aaaacaaaat caaccgggac 60cccagctttt cagaactgca gggaaacagc catcatgagt gaggtcacca agaattccct120ggagaaaatc ctcccacagc tgaaatgcca tttcacctgg aacttattca aggaagacag180tgtctcaagg gatctagaag atagagtgtg taaccagatt gaatttttaa acactgagtt240caaagctaca atgtacaact tgttggccta cataaaacac ctagatggta acaacgaggc300agccctggaa tgcttacggc aagctgaaga gttaatccag caagaacatg ctgaccaagc360agaaatcaga agtctagtca cttggggaaa ctacgcctgg gtctactatc acttgggcag420actctcagat gctcagattt atgtagataa ggtgaaacaa acctgcaaga aattttcaaa480tccatacagt attgagtatt ctgaacttga ctgtgaggaa gggtggacac aactgaagtg540
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<221>核自身抗原(SP-100)<222>(1)..(1879)<223>GenBank accession No.M60618<400>15ctgaggccca cgcagggcct agggtgggaa gatggcaggt gggggcggcg acctgagcac 60caggaggctg aatgaatgta tttcaccagt agcaaatgag atgaaccatc ttcctgcaca 120cagccacgat ttgcaaagga tgttcacgga agaccagggt gtagatgaca ggctgctcta 180tgacattgta ttcaagcact tcaaaagaaa taaggtggag atttcaaatg caataaaaaa 240gacatttcca ttcctcgagg gcctccgtga tcgtgatctc atcacaaata aaatgtttga 300agattctcaa gattcttgta gaaacctggt ccctgtacag agagtggtgt acaatgttct 360tagtgaactg gagaagacat ttaacctgcc agttctggaa gcactgttca gcgatgtcaa 420catgcaggaa taccccgatt taattcacat ttataaaggc tttgaaaatg taatccatga 480caaattgcct ctccaagaaa gtgaagaaga agagagggag gagaggtctg gcctccaact 540aagtcttgaa caaggaactg gtgaaaactc ttttcgaagc ctgacttggc caccttcggg 600ttccccatct catgctggta caaccccacc tgaaaatgga ctctcagagc acccctgtga 660aacagaacag ataaatgcaa agagaaaaga tacaaccagt gacaaagatg attcgctagg 720aagccaacaa acaaatgaac aatgtgctca aaaggctgag ccaacagagt cctgcgaaca 780aattgctgtc caagtgaata atggggatgc tggaagggag atgccctgcc cgttgccctg 840tgatgaagaa agcccagagg cagagctaca caaccatgga atccaaatta attcctgttc 900tgtgcgactg gtggatataa aaaaggaaaa gccattttct aattcaaaag ttgagtgcca 960agcccaagca agaactcatc ataaccaggc atctgacata atagtcatca gcagtgagga1020ctctgaagga tccactgacg ttgatgagcc cttagaagtc ttcatctcag caccgagaag1080tgagcctgtg atcaataatg acaacccttt agaatcaaat gatgaaaagg agggccaaga1140agccacttgc tcacgacccc agattgtacc agagcccatg gatttcagaa aattatctac1200attcagagaa agttttaaga aaagagtgat aggacaagac cacgactttt cagaatccag1260tgaggaggag gcgcccgcag aagcctcaag cggggcactg agaagcaagc atggtgagaa1320ggctcctatg acttctagaa gtacatctac ttggagaata cccagcagga agagacgttt1380cagcagtagt gacttttcag acctgagtaa tggagaagag cttcaggaaa cctgcagctc1440atccctaaga agagggtcag gtaaagaaga ttaggatgcc aagacttggc ctgcagaatg1500tcaggaatgt gaattaaaag ctgctgtttc cagacgcttt ttattctgag caccttcact1560accttgtatc cagttcatct gggaactcct ttttgcattt tagaaaatgg aaagaggcag1620gaaattatga taaactcatg tttaacagaa agagtttcac tgactaaatg tatgtaatta1680tattttgttg ttgtagaaga aataaatagc aaatttgtgg tattcttttt tttaaacctg1740
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<221>KIAA0793<222>(1)..(3997)<223>GenBank accession No.AB018336<400>16ggcgacgccg acgcgagtct ggcggctgct gcttgcgact gcggaggccg ggcgaggccg 60gtgaggacgc ggcgggcgag cgagaggccg aggtgttttc ttcactcatg gtgaagaatg 120ggggagatag aaggaacata cagagtcctg cagactgcag ggatgcgctt gggtgcccag 180acccctgtgg gagttagcac ccttgagcct gggcagactc tcttgcccag aatgcaagag 240aagcacctgc acctcagagt aaagctgctg gacaacacca tggaaatatt tgacattgag 300cctaaatgcg atggccaggt attactgaca caagtgtgga agcgtttaaa cctggtagaa 360tgtgactact tcgggatgga gtttcaaaat actcagtcct actggatttg gcttgaacct 420atgaaaccca tcattaggca aatacgaagg ccaaagaatg tggtgcttcg cctagctgta 480aaattttttc cacctgatcc tggtcagcta caagaagaat atacaagata cttgtttgcc 540ttgcaactta agagagacct gctggaagag cgtttgacct gtgctgacac cacagcggcc 600cttctcacgt cccatctcct gcagtcggaa ataggagatt acgatgaaac gctggaccga 660gagcacctca aagtgaacga gtatttgcct ggccagcagc actgccttga gaagatacta 720gaattccatc agaagcacgt gggccagaca cctgctgagt cggatttcca ggtgctcgaa 780attgctcgaa agttggaaat gtacggcatc agatttcaca tggcttctga cagggaagga 840accaagattc aactggcagt ttcccacatg ggtgtactcg tgttccaggg caccaccaaa 900atcaacactt tcaactggtc caaggtccgt aaactaagct tcaagaggaa aagatttctt 960atcaaacttc atccagaggt tcatggacct taccaggaca cattagaatt tttgttgggt1020agtagagatg aatgtaagaa cttctggaag atttgtgtgg agtatcacac cttttttaga1080cttttggacc aacctaagcc aaaagcaaaa gccgtcttct tcagccgggg ctcctccttc1140agatacagtg gaagaactca gaaacaacta gtagattatt tcaaagacag tggaatgaag1200agaattccat atgaaagaag gcacagcaag acccacacgt ccgttcgagc tctgactgca1260
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<221>2′5′寡腺苷酸合成酶(p69 2-5A合成酶)<222>(1)..(2905)<223>GenBank accession No.M87434<400>17cggcagccag ctgagagcaa tgggaaatgg ggagtcccag ctgtcctcgg tgcctgctca 60gaagctgggt tggtttatcc aggaatacct gaagccctac gaagaatgtc agacactgat120cgacgagatg gtgaacacca tctgtgacgt ctgcaggaac cccgaacagt tccccctggt180gcagggagtg gccataggtg gctcctatgg acggaaaaca gtcttaagag gcaactccga240tggtaccctt gtccttttct tcagtgactt aaaacaattc caggatcaga agagaagcca300acgtgacatc ctcgataaaa ctggggataa gctgaagttc tgtctgttca cgaagtggtt360gaaaaacaat ttcgagatcc agaagtccct tgatgggtcc accatccagg tgttcacaaa420aaatcagaga atctctttcg aggtgctggc cgccttcaac gctctgagct taaatgataa480tcccagcccc tggatctatc gagagctcaa aagatccttg gataagacaa atgccagtcc540
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<221>GPR12 G蛋白偶联受体<222>(1)..(1230)<223>GenBank accession No.U18548<400>19aagcttgtgg catttggtac tggtatctga gcaggggctg gctttctgtt tgtctgtgtg 60ttttttgcat gatcttggat tgtcaccctg ctgtatttaa acattaaaaa gcctgtcttt 120tcgttgaaga ggacaggggt taaaatgaat gaagacctga aggtcaattt aagcgggctg 180cctcgggatt atttagatgc cgctgctgcg gagaacatct cggctgctgt ctcctcccgg 240gttcctgccg tagagccaga gcctgagctc gtagtcaacc cctgggacat tgtcttgtgt 300acctcgggaa ccctcatctc ctgtgaaaat gccattgtgg tccttatcat cttccacaac 360cccagcctgc gagcacccat gttcctgcta ataggcagcc tggctcttgc agacctgctg 420gccggcattg gactcatcac caattttgtt tttgcctacc tgcttcagtc agaagccacc 480aagctggtca cgatcggcct cattgtcgcc tctttctctg cctctgtctg cagcttgctg 540gctatcactg ttgaccgcta cctctcactg tactacgctc tgacgtacca ttcggagagg 600acggtcacgt ttacctatgt catgctcgtc atgctctggg ggacctccat ctgcctgggg 660ctgctgcccg tcatgggctg gaactgcctc cgagacgagt ccacctgcag cgtggtcaga 720ccgctcacca agaacaacgc ggccatcctc tcggtgtcct tcctcttcat gtttgcgctc 780atgcttcagc tctacatcca gatctgtaag attgtgatga ggcacgccca tcagatagcc 840ctgcagcacc acttcctggc cacgtcgcac tatgtgacca cccggaaagg ggtctccacc 900ctggctatca tcctggggac gtttgctgct tgctggatgc ctttcaccct ctattccttg 960atagcggatt acacctaccc ctccatctat acctacgcca ccctcctgcc cgccacctac1020aattccatca tcaaccctgt catatatgct ttcagaaacc aagagatcca gaaagcgctc1080tgtctcattt gctgcggctg catcccgtcc agtctcgccc agagagcgcg ctcgcccagt1140gatgtgtagc acccttgcac ccaggaggac tctgcattta ccaagcactt ccactgcctg1200gccaaggttt gagatgcttc ccttgaattc 1230<210>20<211>5141<212>DNA<213>人<220>
<221>类固醇21-羟化酶(CYP21)<222>(1)..(5141)<223>GenBank accession No.M12792<400>20agatctttct cccagtagct gctcagcatg gtggtggcat aagcccattt tccggagcca 60gggattcagt tgcagcaaga catggcccgg tctgggaggt caaccatgaa gaaggcagta 120gctgtcattg cccaacccca gaaatcccaa tcctgttttc tccctctcag tcctgatcat 180ggattcagca gcagcgaact cgccaatgta gtgggtggca cagccagggt cttgactctg 240gctctgcagt agcacagtct ggaaaagctc tgaggggaga gagaccccca ctggtccgag 300ggtctggcac agagccagaa atggggggga aggtatgagg ctgggtcgcc tctgacctct 360caggtaccat ccaggaggcc ctggcctctc actgaacccg gccactcctc tttggcatgg 420cctcttccca aatccccaaa ctgcctcctt acccacaaaa gtggtctctg agtgtcagtc 480cagtgggacc cccacccctt atggcttcag ttccccaaat agggctggac ccttgatcct 540gatccagctg tggctatcca gccccttcct ggggactttg gactttgagg ggggcatgcc 600acttgtgctg ggaatccata ctttccctgg ctggagtaga acctgtggac tgtagtcctg 660agggcagtca tgttctgcct gtgcctggaa agacaagaaa cttgactgca gagagaagaa 720agaggagaga ggaacagagc gaggaaaccg cccgtctccg gggctttttc tgttccctat 780ccttgacttt ctaagaccag tggggtcccc tcctctgctt ctttttcctg agttctgtga 840aattccccaa ttcttatttt ttatctcaaa ccagctcaag gtgggctgtt ttcctttcaa 900ccaaagaaag gtgctcctgg tggctaaagg tacatattcg acagctagat ttccaggctg 960gaatcctgcc ctccacaaca tgcgaacaat acccgtgttg catatagagc atggctgtga1020agagttgagt gagtgcccac aaagcactta gagcagtgtc tggtacatgc tattactccg1080cagcgggaaa ccacttcctc ctttgtcttc tgggcacttt tgtgagtgaa aggaggcact1140aataacaatc acactgggat acctgtatat actggaatgc cccaggcaaa ccaggcttaa1200actgtattac tctatctgta gcttaaacta acaaacaacc cacacaaatc acattttgtt1260cttcaggcga ttcaggaagg cctattaggc agggactgcc attttctctc tgagacaaac1320atcattccat aaactggccc acggtgggtg gcagagggag agggcccagg tgggggcgga1380cactattgcc tgcacagtga tgtggaacca gaaagctgac tctggatgca ggaaaaaggt1440cagggttgca tttcccttcc ttgcttcttg atgggtgatc aatttttttg aaatacggac1500gtcccaaggc caatgagact ggtgtcattc cagaaaaggg ccactctgtg ggcgggtcgg1560tgggagggta cctgaaggtg gggtcaaggg aggccccaaa acagtctaca cagcaggagg1620gatggctggg gctcttgagc tataagtggc acctcagggc cctgacgggc gtctcgccat1680gctgctcctg ggcctgctgc tgctgcccct gctggctggc gcccgcctgc tgtggaactg1740
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<221>推测的肿瘤抑制蛋白(101F6)<222>(1)..(1117)<223>GenBank accession No.AF040704<400>21tccggaagta aagcggctcc gtgacggagc ggcggtgcgc gcggcagggc ccggagtatc 60ccgctttctt tggaggaaac caccgcatca gatctgcgct gcggcagagg caggctacaa 120ccactagcac ggctgacgat ggccctttct gcggagaccg agtcacacat ctaccgagct 180ctgcgtactg cttctggcgc tgccgcccac cttgtggccc tgggctttac catctttgtg 240gctgtgcttg ccaggcctgg ctccagcctg ttctcctggc acccggtgct tatgtctttg 300gctttctcct tcctgatgac cgaggcacta ctggtgtttt ctcctgagag ttcgctgctg 360cactccctct cacggaaagg ccgagcacgc tgccactggg tgctgcagct gctggccctg 420ctgtgtgcac tgctgggcct cggccttgtc atcctccaca aagagcagct tggcaaagcc 480cacctggtta cgcggcatgg gcaggcaggg ctgctggctg tgctgtgggc agggctgcag 540tgctcaggtg gggtggggct gctctacccc aagctgctgc cccgatggcc cctggcgaag 600ctcaagctat accatgctac ttctgggctg gtgggctacc tgctgggtag tgccagcctc 660ttgctgggca tgtgctcact ctggttcact gcctctgtca ctggtgcagc ctggtacctg 720gctgtattat gccctgtcct caccagcttg gtcattatga accaggtgag caatgcctac 780ctataccgca agaggatcca accatgagct cttcccagcc taggggaagc ctggatttgc 840ccctccatgt aggagctggg cctagggacc tgttgaactc tctcagctga gtcaggggac 900acctcaggca ctgggacagt tgggcatttg gaggcccgtg tgtgaattcc tgctcctcat 960gctggagtgc ctcccatttc cttccccttt ctctgtcatc ccagaggaac ataggcatca1020tgtgtctgga tgaagctggg gctgcaagac tgcctctcct gcaaggcagc tcatacttgt1080actgtatgtt cagaaatttt aggagagaaa aaagtaa 1117<210>22<211>4396<212>DNA<213>人<220>
<221>转录因子E2A<222>(1)..(4396)<223>GenBank accession No.M31523<400>22gcctgaggtg cccgccctgg ccccaggaga atgaaccagc cgcagaggat ggcgcctgtg 60ggcacagaca aggagctcag tgacctcctg gacttcagca tgatgttccc gctgcctgtc120accaacggga agggccggcc cgcctccctg gccggggcgc agttcggagg ttcaggtctt180
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<221>KIAA0691<222>(1)..(4133)<223>GenBank accession No.AB014591<400>23aaattctccc tgggggtaag gtaccagccc tgtcctttat gggcttcttg ttctaaagca 60tatccgtccc atatggttgc tgctagtcac atgtggtgat tagtaactag ttaaaaatga120aaaattcagt tcctccatta cacttgccac atttcagatg ttcagtggcc aacagatatg180cgcaaataga gtgtttccag cattgcaaag ttctgttgga tagcactgtt tgccagatgt240tcccttcttt gtgggtgagg actcttttgg tgtgacttcc ctctgtattg aggctcttgt300tcctcagtat ggggctgttt ctgtctttac agtaagtgac tactccaggg ttccctgccc360tgcacacgta gagtgggagc ggcccgtgga tcccagggaa ctgtgctttt cattgtaggc420cccctccctg gaggggaaga gggcaatctc cgctggtatc tcagaagtct tcttctgagg480cataagcctc tcttcccagg gctcccctgg tctcgctgtc aggccctaag gtatgtcttc540ccttggacta aagctccttg gaactccctt ttgacctcag tcttctctgg gttccaggta600acttccttta aaataaagac gctcctctct tgaagttttg ggttcctgcc ctgatggtct660atgtctccct gactctaaat taccaatcca cttgctatgg gattcctcca tgagtgcaga720ttggctccct cacagctgcg gtacctttgc accctcttat cttagtaaga tttctgtctt780ctcccaggtc tctcttgggt actgccttct gcccccaaat ctctaagcct tcttggtatt840agcttctttg ggttaggagt gttatttcct tttggtttaa ggatcctgct ctggaataaa900
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cccggccccc cagcgtccag cctagcggag gcggaggcgg cggcagcgga ggcggaggga2820gcagcagcag tagtaacagc agtgccggtg gaggggctgg caagcagaat ggcgccacca2880gttacagctc agttgtggca gacagcccgg cagaggtggc tttgagcagc agtgggggca2940acaatgccag cagccaggcc ttgggccccc cttccggccc ccacaaccca cctcccagca3000cctcgaagga acccagtgcg gcagccccaa cgggggctgg gggcgtggcc ccaggctcag3060ggaacaactc agggggaccc agcctcctgg tgccactgcc tgtgaatcct cccagctccc3120caacgcccag cttcagtgat gccaaggcag ccggtgccct gctcaatggg cctccacagt3180tcagcaccgc cccagaaatc aaggcccctg agcctctgag ctccttgaag tccatggcgg3240aacgggcagc catcagctct ggcattgagg accctgtgcc aacgctgcac ctgaccgagc3300gagacatcat cctgagcagt acatcagcac ctccggcctc agcccagccg cccctgcagc3360tgtcagaggt gaacataccg ctgtcgctgg gtgtctgtcc actgggccct gtgcccctca3420ccaaggagca gctctatcag caggccatgg aagaggccgc ctggcaccac atgcctcacc3480cctctgactc tgagcgtatt cggcagtacc tcccccggaa cccctgtccg acgcccccct3540accaccacca gatgccaccc ccacactcgg acactgtgga attctaccag cgcctgtcga3600ccgagacact cttcttcatc ttctactatc tggagggcac taaggcacag tatctggcag3660ccaaggccct aaagaagcag tcatggcgat tccacaccaa gtacatgatg tggttccaga3720ggcacgagga gcccaagacc atcactgacg agtttgagca gggcacctac atctactttg3780actacgagaa gtggggccag cggaagaagg aaggcttcac ctttgagtac cgctacctgg3840aggaccggga cctccagtga caccggcccc tccctctacc cacccccttc ccccgcatgc3900tgatccccct gcccaggtga gggccctgcc ctggaagact ggagggaggc cccaagccac3960ggggcatccc cctctcccag gaagcaggga gggggccggg aggttttcct ctcagcccca4020ccctgggggc ccgggggcga gggctgcccc ctcctcccct ccccagtgag ggacattttt4080tggtaaacct attttcattt tggaaaatat ttatgaataa atagttttat atg 4133<210>24<211>1260<212>DNA<213>人<220>
<221>5-羟色胺1D受体5-HT1D<222>(1)..(1260)<223>Genank accession No.M81590<400>24ccctctcctt cgtccgctcc atgcccaaga gctgcgctcc ggagctgggg cgaggagagc 60
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<221>凝血因子XII(Hageman因子)<222>(1)..(1990)<223>GenBank accession No.M31315<400>25ctgctgctcc tggggttcct gctggtgagc ttggagtcaa cactttcgat tccaccttgg 60gaagccccca aggagcataa gtacaaagct gaagagcaca cagtcgttct cactgtcacc120ggggagccct gccacttccc cttccagtac caccggcagc tgtaccacaa atgtacccac180aagggccggc caggccctca gccctggtgt gctaccaccc ccaactttga tcaggaccag240
cgatggggat actgtttgga gcccaagaaa gtgaaagacc actgcagcaa acacagcccc 300tgccagaaag gagggacctg tgtgaacatg ccaagcggcc cccactgtct ctgtccacaa 360cacctcactg gaaaccactg ccagaaagag aagtgctttg agcctcagct tctccggttt 420ttccacaaga atgagatatg gtatagaact gagcaagcag ctgtggccag atgccagtgc 480aagggtcctg atgcccactg ccagcggctg gccagccagg cctgccgcac caacccgtgc 540ctccatgggg gtcgctgcct agaggtggag ggccaccgcc tgtgccactg cccggtgggc 600tacaccggac ccttctgcga cgtggacacc aaggcaagct gctatgatgg ccgcgggctc 660agctaccgcg gcctggccag gaccacgctc tcgggtgcgc cctgtcagcc gtgggcctcg 720gaggccacct accggaacgt gactgccgag caagcgcgga actggggact gggcggccac 780gccttctgcc ggaacccgga caacgacatc cgcccgtggt gcttcgtgct gaaccgcgac 840cggctgagct gggagtactg cgacctggca cagtgccaga ccccaaccca ggcggcgcct 900ccgaccccgg tgtcccctag gcttcatgtc ccactcatgc ccgcgcagcc ggcaccgccg 960aagcctcagc ccacgacccg gaccccgcct cagtcccaga ccccgggagc cttgccggcg1020aagcgggagc agccgccttc cctgaccagg aacggcccac tgagctgcgg gcagcggctc1080cgcaagagtc tgtcttcgat gacccgcgtc gttggcgggc tggtggcgct acgcggggcg1140cacccctaca tcgccgcgct gtactggggc cacagtttct gcgccggcag cctcatcgcc1200ccctgctggg tgctgacggc cgctcactgc ctgcaggacc ggcccgcacc cgaggatctg1260acggtggtgc tcggccagga acgccgtaac cacagctgtg agccgtgcca gacgttggcc1320gtgcgctcct accgcttgca cgaggccttc tcgcccgtca gctaccagca cgacctggct1380ctgttgcgcc ttcaggagga tgcggacggc agctgcgcgc tcctgtcgcc ttacgttcag1440ccggtgtgcc tgccaagcgg cgccgcgcga ccctccgaga ccacgctctg ccaggtggcc1500ggctggggcc accagttcga gggggcggag gaatatgcca gcttcctgca ggaggcgcag1560gtaccgttcc tctccctgga gcgctgctca gccccggacg tgcacggatc ctccatcctc1620cccggcatgc tctgcgcagg gttcctcgag ggcggcaccg atgcgtgcca gggtgattcc1680ggaggcccgc tggtgtgtga ggaccaagct gcagagcgcc ggctcaccct gcaaggcatc1740atcagctggg gatcgggctg tggtgaccgc aacaagccag gcgtctacac cgatgtggcc1800tactacctgg cctggatccg ggagcacacc gtttcctgat tgctcaggga ctcatctttc1860cctccttggt gattccgcag tgagagagtg gctggggcat ggaaggcaag attgtgtccc1920attcccccag tgcggccagc tccgcgccag gatggcgagg aactcaataa agtgctttga1980aaatgctgag 1990
<210>26<211>3840<212>DNA<213>人<220>
<221>原癌基因酪氨酸蛋白激酶c-abl<222>(1)..(3840)<223>GenBank accession No.M14752<400>26ggccttcccc ctgcgaggat cgccgttggc ccgggttggc tttggaaagc ggcggtggct 60ttgggccggg ctcggcctcg ggaacgccag gggcccctgg gtgcggacgg gcgcggccag 120gagggggtta aggcgcaggc ggcggcgggg cgggggcggg cctggcgggc gccctctccg 180ggccctttgt taacaggcgc gtcccggcca gcggagacgc ggccgccctg ggcgggcgcg 240ggcggcgggc ggcggtgagg gcggcctgcg gggcggcgcc cgggggccgg gccgagccgg 300gcctgagccg ggcccggacc gagctgggag aggggctccg gcccgatcgt tcgcttggcg 360caaaatgttg gagatctgcc tgaagctggt gggctgcaaa tccaagaagg ggctgtcctc 420gtcctccagc tgttatctgg aagaagccct tcagcggcca gtagcatctg actttgagcc 480tcagggtctg agtgaagccg ctcgttggaa ctccaaggaa aaccttctcg ctggacccag 540tgaaaatgac cccaaccttt tcgttgcact gtatgatttt gtggccagtg gagataacac 600tctaagcata actaaaggtg aaaagctccg ggtcttaggc tataatcaca atggggaatg 660gtgtgaagcc caaaccaaaa atggccaagg ctgggtccca agcaactaca tcacgccagt 720caacagtctg gagaaacact cctggtacca tgggcctgtg tcccgcaatg ccgctgagta 780tccgctgagc agcgggatca atggcagctt cttggtgcgt gagagtgaga gcagtcctag 840ccagaggtcc atctcgctga gatacgaagg gagggtgtac cattacagga tcaacactgc 900ttctgatggc aagctctacg tctcctccga gagccgcttc aacaccctgg ccgagttggt 960tcatcatcat tcaacggtgg ccgacgggct catcaccacg ctccattatc cagccccaaa1020gcgcaacaag cccactgtct atggtgtgtc ccccaactac gacaagtggg agatggaacg1080cacggacatc accatgaagc acaagctggg cgggggccag tacggggagg tgtacgaggg1140cgtgtggaag aaatacagcc tgacggtggc cgtgaagacc ttgaaggagg acaccatgga1200ggtggaagag ttcttgaaag aagctgcagt catgaaagag atcaaacacc ctaacctagt1260gcagctcctt ggggtctgca cccgggagcc cccgttctat atcatcactg agttcatgac1320ctacgggaac ctcctggact acctgaggga gtgcaaccgg caggaggtga acgccgtggt1380gctgctgtac atggccactc agatctcgtc agccatggag tacctagaga agaaaaactt1440catccacaga gatcttgctg cccgaaactg cctggtaggg gagaaccact tggtgaaggt1500
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ttccactgcc ttcatccctc tcatatcaac ccgagtgtct cttcggaaaa cccgccagcc3420tccagagcgg gccagcggcg ccatcaccaa gggcgtggtc ttggacagca ccgaggcgct3480gtgcctcgcc atctctggga actccgagca gatggccagc cacagcgcag tgctggaggc3540cggcaaaaac ctctacacgt tctgcgtgag ctatgtggat tccatccagc aaatgaggaa3600caagtttgcc ttccgagagg ccatcaacaa actggagaat aatctccggg agcttcagat3660ctgcccggcg tcagcaggca gtggtccggc ggccactcag gacttcagca agctcctcag3720ttcggtgaag gaaatcagtg acatagtgca gaggtagcag cagtcagggg tcaggtgtca3780ggcccgtcgg agctgcctgc agcacatgcg ggctcgccca tacccatgac agtggctgag3840<210>27<211>1628<212>DNA<213>人<220>
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<221>misc_feature<222>(114)..(114)<223>不明确的核苷酸<400>27agtcagcacg ggggtgctgg aagagatcgg gaataatagc gcagaccaat gagcctaggg 60agatgctttc atcgtctctc cttccctcaa gtgttctgga acctatcatt tganttagcc120gagtcaggca ggagggggcg gggaatcctt ccgcccttct taggaggggc tgcattgcag180ggggagagtg aactgacaga ctcagtcact gaagagggaa aaggagtgag aagacaaagc240cgtcaaagcc ccaacagctt tgtatttctc cagcccggcc ggcagacccc ggagctcccg300aggcactccc tccatctttg gaacgcgcca gtaattgaat tgataacagg aagctatgag360ggaccctgtg agtagccagt acagttcctt tcttttctgg aggatgccca tcccagaact420ggatctgtcg gagctggaag gcctgggtct gtcagataca gccacctaca aggtcaaaga480cagcagcgtt ggcaaaatga tcgggcaagc aactgcagca gaccaggaga aaaaccctga540aggtgatggc ctccttgagt acagcacctt caacttctgg agagctccca ttgccagcat600ccactccttc gaactggact tgctctaagg ccaagacttc tctctcccat caccttgccc660tcattgtctt ccctctcaag ccccttcctt tccactcctt tcccatttta atcttgttct720ctccctactg tgttggtggt gctgatgaat ctgccagagt tgagttctat gtatttattt780atctatctgt ctactccatt tctctcaaaa gccctcaagt cacaaagtaa atggttcaag840
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<221>胍乙酸N-甲基转移酶<222>(1)..(993)<223>GenBank accession No.Z49878<400>28cggcggcgcg cgatcgaggt cgggtcgccg tccagcctgc agcatgagcg cccccagcgc 60gacccccatc ttcgcgcccg gcgagaactg cagccccgcg tggggggcgg cgcccgcggc120ctacgacgca gcggacacgc acctgcgcat cctgggcaag ccggtgatgg agcgctggga180gaccccctat atgcacgcgc tggccgccgc cgcctcctcc aaagggggcc gggtcctgga240ggtgggcttt ggcatggcca tcgcagcgtc aaaggtgcag gaggcgccca ttgatgagca300ttggatcatc gagtgcaatg acggcgtctt ccagcggctc cgggactggg ccccacggca360gacacacaag gtcatcccct tgaaaggcct gtgggaggat gtggcaccca ccctgcctga420cggtcacttt gatgggatcc tgtacgacac gtacccactc tcggaggaga cctggcacac480acaccagttc aacttcatca agaaccacgc ctttcgcctg ctgaagccgg ggggcgtcct540cacctactgc aacctcacct cctgggggga gctgatgaag tccaagtact cagacatcac600
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<221>干扰素诱导的核磷蛋白<222>(1)..(835)<223>Genbank accession No.as of 09 Dec 2002L22342<400>29atggcgagca gcggagtcaa gaacacacca cgatggcgga gaaaagcccc tcatgggagg 60gaaaggaaag agaaaggaaa gaaaagaaaa agatgtatct ggtcaactcc aaaaaggaga 120cataagaaaa aaagcctccc aagagagatc attgatggca cttcagaaat gaatgaagga 180aagaggtccc agaagatgcc tagtacacca cgaagggtca cacaaggggc agcctcacct 240gggcatggca tccaagagaa gctccaagtg gtggataagg tgactcaaag gaaagacgac 300tcaacctgga actcagaggt catgatgagg gtccaaaagg caagaactaa atgtgcccga 360aagtccagat cgaaagaaaa gaaaaaggag aaagatatct gttcaagctc aaaaaggaga 420tttcagaaaa atattcaccg aagaggaaaa cccaaaagtg acactgtgga ttttcactgt 480tctaagtccc ccgtgacctg tggtgaggcg aaagggattt tatataagaa gaaaatgaaa 540cacggatcct cagtgaagtg cattcggaat gaggatggaa cttggttaac accaaatgaa 600tttgaagtcg aaggaaaagg aaggaacgca aagaactgga aacggaatat acgttgtgaa 660ggaatgaccc taggagagct gctgaagagt ggacttttgc tctgtcctcc aagaataaat 720ctcaagagag agttaaatag caagtgaatt tctactaccc tctcagtcac catgttgcag 780actttccctg tctggaggct caccttagag cttctgagtt tccaagcccg gaatt 83权利要求
1.一种测定能够调节基因转录的化合物的生物活性的方法，包括以下步骤a)使宿主和化合物接触；b)测定宿主的总体转录基因应答；并且c)对所述化合物诱导的总体转录基因应答进行定量。
2.权利要求1的方法，其中总体转录基因应答通过DNA阵列技术来测定。
3.权利要求2的方法，其中DNA阵列技术为寡核苷酸阵列技术。
4.权利要求1-3的任意一项的方法，其中化合物为修饰的化合物。
5.权利要求4的方法，其中修饰的化合物是修饰的蛋白质。
6.权利要求5的方法，其中修饰的蛋白质是聚乙二醇化蛋白质。
7.权利要求6的方法，其中聚乙二醇化蛋白质是聚乙二醇化蛋白质的特定的分离的同种型。
8.权利要求6或7的方法，其中聚乙二醇化蛋白质是Epo或IFN。
9.权利要求1-8的任意一项的方法，其中被转录调节的基因是选自SEQ ID No.1到29的一个或多个基因。
10.一种测定修饰的化合物的相对生物活性的方法，包括用权利要求1-7的任一项的方法测量修饰的化合物和相应的未修饰化合物的生物活性，其中修饰蛋白的相对转录活性由计算出的修饰化合物与未修饰化合物的生物活性之比确定。
11.权利要求8的方法，其中修饰化合物是化学或酶学方法修饰的化合物。
12.权利要求9的方法，其中修饰化合物是聚乙二醇化蛋白质。
13.一种鉴定能间接调节基因转录的化合物的方法，其包括用权利要求1-9的任一项的方法测定已知为基因转录调节剂的第一化合物在有或没有第二化合物存在的条件下的生物活性，若第一化合物在有所述第二化合物存在时测定到的生物活性显著不同于第一化合物在没有所述第二化合物存在时测定到的生物活性，则鉴定到能够间接调节基因转录的化合物。
14.权利要求13的方法，其中已知的基因转录调节剂是Epo或IFN。
15.通过权利要求1-14的方法所鉴定到的能够调节基因转录的化合物。
16.权利要求1-14的方法在鉴定能够调节基因转录的化合物中的用途。
17.包含用于实施权利要求1-14的方法的成分的试剂盒。
18.权利要求17的试剂盒，其中所述的成分包含DNA阵列。
19.药物组合物，其包含权利要求15的化合物以及可药用载体。
20.权利要求15的化合物或其可药用盐在制备用于治疗疾病，优选病毒性疾病或癌症的药物中的用途。
全文摘要
本发明提供了一种用于测定化合物的生物活性的新方法，包括步骤a)使宿主和化合物接触；b)测定宿主的总体转录基因应答；c)对所述化合物诱导的总体转录基因应答进行定量。
文档编号A61P35/00GK1532292SQ200410029500
公开日2004年9月29日 申请日期2004年3月19日 优先权日2003年3月21日
发明者U·塞尔塔, S·福瑟尔, K·韦耶, , U 塞尔塔 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司, 弗 哈夫曼-拉罗切有限公司