专利名称：诱导细胞凋亡的药物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药领域，特别涉及黄芪以及黄芪抽提物的一种新用途。黄芪抽提物能诱导HEL细胞编程性死亡，表明黄芪抽提物能制备成治疗肿瘤，尤其是血液系统肿瘤的药物。
背景技术：
中草药是祖国传统医学宝库中一颗璀璨的明珠。近年来，已引起西方国家的高度重视。但是有关它们的分子作用机制尚知之甚少，有待运用近代的知识与技术加以阐明。一般认为黄芪具有增强机体免疫功能的作用，近来在临床上，通常运用它减轻化疗与放疗所引起的毒副作用。但是有关它的确切功能与作用机制还不清楚。
黄芪是一种常用的补气升阳的中药，现已证实其具有增强机体非特异性、改善心功能、扩张冠状动脉、利尿消肿、抗菌、抗病毒、促进造血功能、抗疲劳、抗衰老等作用。为了更好的发挥它的作用和方便临床应用，已将其有效成分提取出来制成了注射液，从而提高了疗效，减少了不良反应，为临床应用开辟了广阔前景。从目前的临床应用看，黄芪注射液在心血管疾病、免疫力降低引起的呼吸系统疾病及肾病综合症等方面表现出较好的辅助治疗效果。
发明人于1999年10月29日申请的专利“诱导分化治疗的药物及其应用”中，申请号99119912.X公开了黄芪等诱导造血系统肿瘤细胞趋向终末分化的药物，具有无毒性，抗肿瘤的优点。
细胞编程性死亡是一个高度调节进程，它与动植物的生长发育密切相关。机体通过细胞凋亡，去除有害的细胞，假如因为种种原因而使细胞凋亡过程失控，就会导致一些疾病的产生(例如，肿瘤，老年痴呆症等)。所以对诱导肿瘤细胞凋亡的药物筛选及其作用分子机理的研究就显得十分重要，而且对新型药物的设计与开发开阔了一条新的途径。具有重要的理论意义与实际运用价值，也会带来较大的经济效益。
发明内容
本发明的目的，就是提供黄芪及黄芪抽提物在制备治疗肿瘤的药物中的新用途。
本发明的另一目的，就是提供一种新的治疗肿瘤的药物组合物。
本发明的第一方面，提供了黄芪在制备治疗肿瘤的药物中的应用。较佳的，所述肿瘤为血液系统肿瘤。
本发明的第二方面，提供了黄芪抽提物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。较佳的，所述肿瘤为血液系统肿瘤。
本发明的第三方面，提供了一种组合物，其特征在于，所述组合物包括安全有效量的黄芪抽提物以及药学上可接受的载体和/或赋型剂。
优选的，所述组合物的剂型为片剂、胶囊、口服液或注射液。
如本文所用，“黄芪抽提物”是指将黄芪用蒸馏水煮沸30-180分钟，除去块状物，过滤得到黄芪溶液，将黄芪溶液在低温下高速离心后的上清。然后将所得上清液冻干，以便于保存。通常保存于-20C左右。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明黄芪抽提物，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约6.0毫克/千克体重。此外，本发明的黄芪抽提物还可与其他治疗剂一起使用。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。此外，载体和配制方法的例子可以参见《Remington药物科学》(Remington’sPhamaceutical Science)。
本发明还提供了一种筛选治疗肿瘤，尤其是血液系统肿瘤的药物或化合物等的方法，包括步骤(a)在适合生长的条件下，培养肿瘤细胞，其中在第一组肿瘤细胞的培养基中添加候选物质，在第二组肿瘤细胞的培养基中不添加候选物质；(b)测定第一组和第二组肿瘤细胞的凋亡蛋白酶激活因子1(Apaf-1)的活性，其中第一组肿瘤细胞或裂解物的该酶活性高于第二组就表示该候选物质能诱导肿瘤细胞凋亡。
较佳的，所述肿瘤细胞为HEL细胞。更佳的，所述方法还包括测定第一组和第二组肿瘤(HEL)细胞的蛋白酶-3(Caspase-3)的活性，其中第一组肿瘤(HEL)细胞的该酶活性高于第二组就表示该候选物质是能诱导肿瘤(血液系统肿瘤)细胞凋亡。
发明人采用HEL细胞(人体红白血病细胞株)为实验模型。当培养的HEL细胞，加入黄芪(4.5mg/ml)诱导3-5天后，能促使HEL细胞产生编程性死亡。其细胞凋亡的程度与药物的剂量和诱导时间有关联。
黄芪诱导HEL细胞凋亡的分子机理的研究方面，发明人得到如下实验结果a)黄芪诱导HEL细胞后，促进了该细胞内凋亡蛋白酶激活因子1(Apoptotic protease-acting factor 1，APAF1)的表达，及凋亡小体的形成。
运用免疫荧光分析方法，观察到在用黄芪诱导的HEL细胞中，呈APAF1阳性染色，而未被黄芪诱导的HEL细胞则呈阴性染色。表明用黄芪诱导HEL细胞后，使APAF1的表达上调，从而促进了凋亡小体的形成。
b)黄芪诱导HEL细胞后，激活了蛋白酶-3(Caspase-3)的活力。免疫荧光分析方法的结果表明，用黄芪诱导HEL细胞后，在凋亡细胞内，蛋白酶-3(Caspase-3)被激活，呈阳性染色，而在非凋亡的HEL细胞内，蛋白酶-3无活性，呈阴性染色。
上述结果表明黄芪诱导HEL细胞后，使细胞内APAF1的表达增加。APAF1能与线粒体释放的细胞色素C相结合，形成凋亡小体，依次激活凋亡途径中下游蛋白酶，最终使肿瘤细胞凋亡。
本实验首次证明了黄芪诱导HEL细胞凋亡过程中，涉及到一条APAF1依赖蛋白酶激活的线粒体凋亡途径。
c)黄芪促进HEL细胞内乙酰胆碱脂酶(AChE)的活性。
运用乙酰胆碱脂酶细胞化学染色方法证明在用黄芪诱导的凋亡的HEL细胞内，AChE的活力被激活，呈现阳性染色，而在未被黄芪诱导的HEL细胞则呈阴性染色反应。
用免疫荧光染色方法，进一步揭示了在用黄芪诱导的凋亡细胞中呈现阳性染色，而未被黄芪诱导的HEL细胞则呈阴性反应。
上述实验结果暗示了AChE酶也积极参与了黄芪诱导的HEL细胞的凋亡过程。
然后，发明人采用K562细胞形成的裸鼠实体肿瘤，在注射黄芪后观察到肿瘤显著缩小，而对照组的肿瘤则无显著变化。
1.本发明首次证明了用黄芪诱导HEL细胞后，引起该细胞产生编程性死亡。
2.黄芪诱导HEL细胞凋亡，至少涉及了一条APAF1依赖的蛋白酶激活的线粒体凋亡的途径。
3.通过动物实验证明黄芪具有抑制肿瘤生长的功能，以达到治疗肿瘤，特别是血液肿瘤的目的，比发明人原申请的药物疗效更为显著、明确。黄芪还具有提高机体免疫力以及减轻化疗与放疗所引起的毒副作用等功能，更显示了黄芪在肿瘤治疗中的优越性。
图1.黄芪诱导HEL细胞凋亡(A)流式细胞仪分析a和c为未诱导的HEL细胞，b和d为黄芪抽提物分别诱导HEL细胞3天和5天的凋亡结果。
(B)透射电镜分析a为未诱导的HEL细胞，放大7040倍；b为黄芪诱导三天的凋亡细胞，放大7200倍。
(C)TUNEL分析a为未诱导的HEL细胞；b为黄芪诱导三天的凋亡细胞。TUNEL阳性的细胞呈绿色。(附图中呈灰色)图2.黄芪诱导HEL细胞中Apaf-1的表达上调(细胞放大400倍)(a)Hoechst 33258染色未诱导的HEL细胞；(b)未诱导的HEL细胞，Apaf-1免疫染色为阴性；(c)Hoechst 33258染色黄芪抽提物诱导三天的HEL细胞；(d)黄芪抽提物诱导三天的HEL细胞，Apaf-1免疫染色为阳性(箭头，呈红色(附图中呈灰色))。
图3.黄芪诱导HEL细胞中caspase-3的活性上调(细胞放大1000倍)(a)黄芪抽提物诱导凋亡的HEL细胞，caspase-3染色呈阳性(长箭头所指，呈绿色(附图中呈灰色))；未凋亡细胞为阴性；(b)Hoechst 33258染色黄芪抽提物诱导凋亡的HEL细胞(长箭头所指)用Hoechst 33258染色，基因组碎裂；未凋亡HEL细胞(箭头所指)细胞核是完整的；(c)光学显微镜下观察黄芪抽提物诱导的HEL细胞。凋亡的HEL细胞(长箭头所指)和未凋亡的HEL细胞(箭头所指)。
图4.黄芪诱导HEL细胞中AChE的检测(细胞放大400倍)(A)按照Karnovsky-Roots方法对HEL细胞进行细胞化学分析(a)未诱导的HEL细胞，用Hoechst 33258染色的；(b)未诱导的HEL细胞，AChE染色为阴性；(c)黄芪抽提物诱导三天的HEL细胞，用Hoechst 33258染色，放大600倍；(d)黄芪抽提物诱导三天的HEL细胞，AChE染色，箭头所指的凋亡细胞染色为阳性(棕褐色(附图中呈灰色))放大600倍；(e)黄芪抽提物诱导五天的HEL细胞，用Hoechst 33258染色；(f)黄芪抽提物诱导五天的HEL细胞，AChE染色，箭头所指凋亡细胞染色为阳性(棕褐色(附图中呈灰色))。
(B)AChE免疫荧光染色分析(a)未诱导的HEL细胞，用Hoechst 33258染色；(b)未诱导的HEL细胞，AChE免疫染色为阴性；(c)黄芪抽提物诱导三天的HEL细胞，用Hoechst 33258染色；
(d)黄芪抽提物诱导三天的HEL细胞，AChE免疫染色，凋亡细胞染色为阳性(绿色(附图中呈灰色))；图5、黄芪抽提物在动物模型上的抑瘤分析A对照组，未注射黄芪抽提物(实体瘤平均约为1.1厘米)；B实验组，注射黄芪抽提物两周(实体瘤平均约为0.2~0.5厘米)。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 黄芪诱导HEL细胞凋亡实验细胞培养和诱导细胞凋亡HEL和K562细胞(购自中科院上海生命科学研究院细胞库)用含有10％小牛血清的RPMI-1640培养基(GIBCO-BRL)，在37℃含5％CO2的细胞培养箱中培养。将黄芪(产地内蒙古)用蒸馏水煮沸60-90分钟，除去块状物，过滤得到黄芪溶液。将黄芪溶液在低温下高速离心，把上清冻干得到黄芪抽提物，并存放于-20℃备用。诱导时，在培养的HEL细胞中按4.5mg/ml添加黄芪抽提物，培养3-5天。
流式细胞仪分析将用黄芪抽提物诱导和未诱导的HEL细胞离心收集，重悬于柠檬酸盐溶液中。将悬浮细胞在-20℃冻20分钟后，在40℃快速融化并离心。将细胞染色，用FACS流式细胞仪分析。流式细胞仪分析结果表明HEL细胞用黄芪(4.5mg/ml)诱导5天后，有明显的细胞凋亡峰出现(~54.79％)，见图1Ad，而未诱导的HEL细胞没有检测到凋亡峰(图1Ac)。
透射电镜分析将用黄芪抽提物诱导和未诱导的HEL细胞固定，脱水，用Epon 812树脂包被。样品按常规染色并用透射电镜观察。HEL细胞用黄芪诱导3天后，在细胞形态学产生了改变如染色质凝集，凋亡小体的形成等(图1Bb)；而在非凋亡的HEL细胞内，未检测到细胞形态学上的改变(图1Ba)。
b)用TUNEL试剂盒检测凋亡TUNEL(Terminaldeoxynucleotidyl-transferase-mediated dUTP nick-end labeling)试剂盒购自Boehringer Mannheim公司，按照该公司说明书操作，检测细胞的凋亡。用荧光显微镜记录TUNEL检测的结果。TUNEL反应检测呈阳性，证明HEL细胞经黄芪诱导后，能引起HEL细胞编程性死亡。实验结果见图1C。TUNEL阳性的细胞呈绿色。(附图1Cb中呈灰色点状)实施例2 黄芪诱导HEL细胞中Apaf-1的表达上调实验细胞核染色和形态观察收集HEL细胞并固定，重悬于Hoechst 33258溶液中染色，涂片后，用荧光显微镜观察并拍照。
免疫荧光染色将用黄芪抽提物诱导和未诱导的HEL细胞离心收集，固定后封闭45分钟，先加入一抗(Apaf-1多克隆抗体购自Santa Cruz公司，sc-8339)反应30分钟，清洗后再加入Rhodamine标记的二抗(抗兔，购自Rockland公司)反应30分钟。清洗后荧光显微镜观察。黄芪诱导HEL细胞后，促进了该细胞内凋亡蛋白酶激活因子1(Apoptotic protease-acting factor 1，APAF1)的表达，及凋亡小体的形成(见图2c，细胞呈灰色点状)。
运用免疫荧光分析方法，观察到在用黄芪诱导的HEL细胞中，呈阳性染色(红色(附图2d中呈灰色))，而未被黄芪诱导的HEL细胞则呈阴性染色(图2b)。表明用黄芪诱导HEL细胞后，使APAF1的表达上调，从而促进了凋亡小体的形成。
实施例3 黄芪诱导HEL细胞中caspase-3的活性上调实验a)免疫荧光染色将用黄芪抽提物诱导和未诱导的HEL细胞离心收集，固定后封闭45分钟，加入一抗(Caspase 3单克隆抗体购自Santa Cruz公司)反应30分钟，清洗后再加入FITC标记的二抗(抗鼠，购自Rockland公司)反应30分钟。清洗后荧光显微镜观察。黄芪诱导HEL细胞后，激活了蛋白酶-3(Caspase-3)的活力。免疫荧光分析方法的结果表明，用黄芪诱导HEL细胞后，在凋亡细胞内，蛋白酶-3(Caspase-3)被激活，呈阳性染色(绿色，附图中3a中呈灰色)，而在非凋亡的HEL细胞内，蛋白酶-3活性，呈阴性染色(图3)。
上述结果表明黄芪诱导HEL细胞后，使细胞内APAF1的表达增加。APAF1能与线粒体释放的细胞色素C相结合，形成了凋亡小体，依次激活凋亡途径中下游蛋白酶，最终使肿瘤细胞凋亡。
实施例4 黄芪诱导HEL细胞中AChE的检测AChE细胞化学染色根据Karnovsky-Roots的方法(J.Histochem.Cytochem.12219-222，1964)进行AChE细胞化学染色分析。棕色沉淀物(附图中呈灰色)代表AChE酶被激活的区域。实验结果证明在用黄芪诱导的凋亡的HEL细胞内，AChE的活力被激活，呈现棕色(图4Ad，图4Af中呈灰色)的阳性染色，而在未被黄芪诱导的HEL细胞则呈阴性染色反应。
免疫荧光染色将用黄芪抽提物诱导和未诱导的HEL细胞离心收集，固定后封闭45分钟，先加入一抗(AChE多克隆抗体购自Santa Cruz公司，sc-6431)反应30分钟，清洗后再加入FITC标记的二抗(抗山羊，购自Rockland公司)反应30分钟。清洗后荧光显微镜观察。用免疫荧光染色方法，进一步揭示了在用黄芪诱导的凋亡细胞中呈现绿色阳性染色(图4Bd中呈灰色)，而未被黄芪诱导的HEL细胞则呈阴性反应。
上述实验结果暗示了AChE酶也积极参与了黄芪诱导的HEL细胞的凋亡过程。
实施例5 黄芪抽提物在动物模型上的抑瘤分析用K562细胞建立裸鼠实体瘤模型将1×106~107K562细胞注射到4~5周龄裸鼠皮下，10天左右形成实体瘤。将实体瘤取出匀浆，将匀浆细胞注入到4~5周龄的裸鼠皮下，10天左右待瘤体长到一定大小时，注射中药黄芪抽提物(10mg/g体重)，一星期两次。两周后，注射黄芪抽提物的裸鼠，瘤体明显缩小(图5B)；而对照组裸鼠，瘤体继续长大(图SA)。
实施例6 制备药物组合物先将黄芪用水漂洗，于玻璃瓶中加三蒸水煎煮后，去渣、过滤、离心，灭菌，按常规方法与生理盐水配制成注射液，可用于肌肉注射或静脉滴注以治疗白血病患者。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.黄芪在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为血液系统肿瘤。
3.黄芪抽提物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为血液系统肿瘤。
5.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括安全有效量的黄芪抽提物以及药学上可接受的载体和/或赋型剂。
6.如权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述组合物的剂型为片剂、胶囊、口服液或注射液。
全文摘要
本发明提供了黄芪抽提物的新用途以及一种组合物，它包括黄芪抽提物和药学上可接受的载体和/或赋形剂，所述组合物可用于治疗肿瘤，尤其是血液系统肿瘤。
文档编号A61P35/00GK1723984SQ20041002863
公开日2006年1月25日 申请日期2004年3月9日 优先权日2004年3月9日
发明者钱若兰, 程小东, 侯春晖, 张学军, 谢恒月, 周维影, 张树冰 申请人:中国科学院上海生命科学研究院