一种上调Runx2转录活性的化合物在防治骨质疏松中的应用
【技术领域】
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[0001]本发明属于医药领域，涉及一种化合物在防治骨质疏松中的应用。具体来说，本发明涉及所述化合物在制备Runx2表达活性上调剂、细胞内碱性磷酸酶活性上调剂以及抑制多核成熟破骨细胞形成药物中的应用。
【背景技术】
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[0002]骨质疏松是一种以骨量减少，骨微结构破坏，导致骨脆性增加，容易发生骨折为特征的全身代谢性骨病。骨质疏松可发生于任何人群和任何年龄，多见于中老年人。骨代谢平衡是由成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收两个动态过程精妙地调控的。当骨吸收超过骨形成时，会出现骨量减少，可出现骨丢失，发生骨质疏松。
[0003]治疗骨质疏松的药物通常分为两类:抗骨吸收药物和促进骨形成药物。抗骨吸收药物通过抑制破骨细胞的活性从而减少骨吸收。目前可用的抗骨吸收药物有双膦酸盐、选择性雌激素受体调节剂、降钙素和雌激素等。对于已经患有骨质疏松症或骨量严重丢失的人群，单纯抑制骨吸收显然不够，促进成骨形成已成为治疗骨质疏松的新型重要策略，此类药物还能够直接促进骨折并发症后的骨再生。目前人源重组甲状旁腺激素(rhPTH)，是美国FDA唯一批准上市的促进骨形成药物。其具体作用机制仍在研宄中，可能是影响多条信号通路，改变成骨细胞、骨系细胞、破骨细胞和骨细胞的活性[JilkaRL.Bone, 2007, 40 (6): 1434-1446.]。rhPTH作为当前最为有效的促进骨形成药物，也存在着一定的局限性。因此，开发新型多效的小分子促进骨形成药物，有望在未来的骨质疏松治疗领域具有广阔前景。
[0004]成骨细胞作为主要的骨形成细胞，来源于具有成骨分化潜能的间充质干细胞，通过产生碱性磷酸酶(ALP)和骨基质蛋白，包括骨钙素(OCN)和骨桥蛋白(OPN)，诱导矿化的发生。基于成骨细胞在骨形成中的重要作用，因而认为能增加成骨系细胞增殖或促进成骨分化的化合物具有促进骨形成的效应。
[0005]近几年，在小鼠和人身上进行的分子遗传学研宄进展，揭示了参与调控成骨细胞发生的多种转录因子及其作用。这些转录因子在成骨细胞的定向、分化和功能行使等过程中都发挥了调控作用，使得相关细胞表达特定的表型基因并获得成骨细胞表型。在这些转录因子中，Runx2 (Runt-related transcript1n factor 2)被证实为调节成骨细胞定向和分化的主要转录因子。Runx2属于Runt结构域基因家族成员，在间质细胞发育为骨时开始表达，之后在成骨细胞的整个分化过程中都存在。Runx2能调节多种成骨细胞标记基因，包括Alp、type I collagen、Ocn、Opn的表达及最终矿化的发生。Runx2能调控胚胎时期骨发育和出生后骨形成。Runx2基因敲除的小鼠由于成骨细胞分化受阻，不能通过任何膜内骨化或软骨内骨化的途径形成新骨[Ghosh S, Cell, 2002, 109Suppl (0092-8674(Print)):S81-96.]。这也证实Runx2是成骨分化所必需的。在人体中单个Runx2等位基因的失活将引起一种骨形成缺陷性疾病一锁骨颅发育不全症[Chen LF, et al EMBOJ, 2002, 21(23):6539-6548.] ο
[0006]此外，多种小分子化合物的促成骨分化效应与Runx2激活有关。白藜芦醇是一种在红酒和大量植物中天然存在的植物多酚，能逆转卵巢去势大鼠的骨量丢失。体外实验发现，白藜芦醇活化的SIRT1-F0X03A复合物能结合至Runx2启动子远端的FRE位点，从而上调Runx2的表达，该机制介导了白藜芦醇诱导人间充质干细胞向成骨方向分化的效应。另夕卜，也有报道指出，小檗碱通过P38MAPK通路活化的Runx2机制诱导成骨细胞分化。在传统中药学中，淫羊藿因其强筋骨的功效而常常应用于治疗骨质疏松。从该草本中提取出的一种异戊烯基多黄酮醇甙-淫羊藿苷，是其主要的药理活性物质。研宄发现，淫羊藿苷诱导成骨分化也依赖于Runx2。
[0007]Runx2参与了包括BMP通路、Wnt通路、Notch通路和Hedgehog等通路在内的多条成骨分化和骨形成相关信号通路，并且可能是信号整合的汇集点[Lin GL, et al J Cell Biochem, 2011, 112(12):3491-3501.]。因而推测能有效上调Runx2转录活性的化合物，可能囊括了靶向以上各通路的各种活性化合物，其具有潜在的促进成骨分化和骨形成效应。
[0008]综上所述，基于Runx2在调节成骨分化中的重要作用，本发明构建了 Runx2转录活性上调剂细胞筛选模型，并通过筛选，发现化合物N-(环丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)-1，2-唑-3-甲酰胺具有上调Runx2的转录活性，体外活性实验表明，其具上调细胞内Runx2蛋白水平、上调成骨细胞碱性磷酸酶ALP活性、上调成骨特异性分化基因的表达和增加钙化结节的产生，同时也发现该化合物可以抑制破骨细胞的形成，是一种潜在抗骨质疏松候选化合物。本发明所述筛选模型以及基于该模型所发现的化合物N-(环丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)-1，2-唑-3-甲酰胺的抗骨质疏松作用，迄今尚未见有相关报道，系本发明首次发现。所述化合物与临床上使用的药物相比，结构没有相似性，且该化合物具有促进骨形成和抑制骨吸收的双重抗骨质疏松活性，可能具有新的抗骨质疏松机制，存在广阔的开发前景。
【发明内容】
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[0009]本发明的目的是提供一种通过细胞筛选模型获得的N-(环丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)-1, 2-唑-3-甲酰胺化合物在防治骨质疏松中的应用。
[0010]为了达到上述目的，本发明采取以下技术方案:
[0011]1，构建Runx2转录活性上调剂细胞筛选模型，并基于该模型发现N_(环丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)-1，2-唑-3-甲酰胺在制备Runx2转录活性上调剂中的应用；
[0012]2，N-(环丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)-1,2-唑-3-甲酰胺在制备Runx2蛋白水平上调剂中的应用；
[0013]3，N-(环丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)-1，2_唑-3-甲酰胺在制备MC3T3-E1细胞诱导成骨分化的ALP活性上调剂中的应用；
[0014]4，N-(环丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)_1，2_唑-3-甲酰胺在制备MC3T3-E1细胞诱导成骨特异性分化基因Alp，Ορη, Runx2上调剂中的应用；
[0015]5，N-(环丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)-1,2-唑-3-甲酰胺在增加C3H10T1/2细胞诱导钙化结节数目中的应用；
[0016]6，N-(环丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)_1，2_唑_3_甲酰胺在减少破骨细胞形成中的应用。
[0017]本发明所述Runx2转录活性上调剂细胞筛选模型，可以应用于高通量防治骨质疏松疾病化合物筛选，基于该模型筛选出的化合物N-(环丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)_1，2-唑-3-甲酰胺是一种Runx2转录活性上调剂，上调细胞内Runx2的蛋白、细胞内碱性磷酸酶的活性、钙化结节的数目、成骨分化特异基因mRNA水平以及抑制破骨细胞形成，有望开发成为防治骨质疏松疾病的药物。
[0018]本发明还提供了以所述化合物为活性成分与药学上可接受的载体组成的组合物在抗抗骨质疏松中的应用。
[0019]本发明的优点和积极效果是，基于Runx2转录活性上调的抗骨质疏松化合物的发现具有新颖性，本发明首次阐述了所述化合物N-(环丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)_1，2-唑-3-甲酰胺在骨质疏松防治中的作用，在国内外尚属首次，对我国开发具有自主知识产权的抗骨质疏松药物具有现实意义。
【附图说明】
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[0020]图1:N-(环丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)-1,2-唑-3-甲酰胺上调模型中Runx2表达效应
[0021]其中:纵坐标-Runx2表达效应上调率)；
[0022]横坐标-N-(环丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)_1，2-唑_3_甲酰胺的浓度
[0023]图2:N-(环丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)-1，2_唑-3-甲酰胺上调MC3T3-E1细胞中Runx2的蛋白水平
[0024]图3:N-(环丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)-1，2_唑-3-甲酰胺上调细胞内碱性磷酸酶ALP的活性
[0025]图4:N-(环丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)_1，2_唑_3_甲酰胺增加钙化结节的数巨
[0026]图5:N-(环丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)-1,2-唑-3-甲酰胺上调细胞内Alp，Opn，Runx2 的 mRNA 水平
[0027]图6:N-(环丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)_1，2_唑_3_甲酰胺抑制破骨细胞形成图7:N-(环丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)-1，2-唑-3-甲酰胺增加钙化结节的数目图8:N-(环丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)-1，2-唑-3-甲酰胺上调细胞内Alp，Ορη，
Runx2的mRNA水平
图9:N-(环丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)-1，2-唑-3-甲酰胺抑制破骨细胞形成【具体实施方式】:
[0028]以下实施例可以使专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0029]《实施例1》上调Runx2转录活性细胞筛选模型的构建及上调剂的发现
[0030]用于筛选的化合物源自但不限于国家新药(微生物)筛选实验室，将其溶于DMSO配置成20mM保存。通过Runx2转录活性上调剂细胞筛选模型构建、化合物筛选和荧光检测等步骤，观察化合物对模型中Runx2转录活性的影响。具体操作如下i
[0031]模型构建:
[0032](I)质粒的构建
[0033]根据p60SE2 质粒[Geoffroy V, et al J B1l Chem, 1995, 270 (52): 30973 - 9.](如图1)的信息，设计了引物以扩增P60SE2质粒6个重复的Runx2结合元件(60SE2)和下游的最小骨钙素启动子片段，并在引物上添加酶切序列。引物序列如下:0SE:正向引物(5’含 Xho I 酶切序列):5，-ccgctcgaggctgcaatcaccaaccac_3，(SEQ ID N0.1);反向引物(5，含 Hind III酶切序列):5，-cccaagcttttgtctgtctgcaccctc-3’ (SEQ ID N0.2)。PCR 结果显示，利用该引物能扩增获得靶片段，并且特异性很好，条带单一。因而直接将PCR产物用PCR纯化试剂盒进行提纯，最后用20 μ I去离子水将产物从柱子上洗脱下来。将所有产物用Xho I和Hind III双酶切过夜。载体pGL4.17(购自promega)同样用Xho I和Hind III双酶切过夜。次日，将酶切产物跑胶回收。将获得的插入片断与线性PGL4.17载体按照摩尔数比3:1在T4DNA Ligase作用下进行连接，16°C连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH_5a感受态，于含有氨苄青霉素LB培养板上培养过夜。次日，挑选单克隆，扩增培养并提取质粒，所得重组质粒PGL4.17-0SE用Xho I和Hind III双酶切的方法鉴定。结果如图2，获得3个重组质粒#4，#7，#14。
[0034](2)瞬时转染重组质粒及荧光测定
[0035]分别将pGL4.17、p60SE2、重组质粒#4、#7和#14在96孔板进行转染，转染时，用10 4 1/孔0?^-1^11(购自英潍捷基(上海)贸易有限公司)培养基稀释200ng DNA, 10 μ I/孔opt1-MEM培养基稀释0.5μ1 origene转染试剂(购自美国Origene公司)，室温孵育5min后与稀释的DNA合并混匀，并继续孵育20min。取处于生长对数期的MC3T3-E1细胞(购自中国医学科学院基础医学研宄所细胞培养中心)用胰酶消化后，加入含10% FBS的培养基适量，轻轻吹打制成单细胞悬液，并调整细胞浓度为2X 1