5个/ml。在合并后的DNA-脂质体复合物溶液中按照每孔80 μ I加入单细胞悬液，吹打均匀，使细胞与DNA-脂质体复合物充分混匀。将混合后的细胞-DNA-脂质体复合物溶液加到96孔板中，每100 μ I。将96孔板置于二氧化碳培养箱内培养过夜。次日，用培养液稀释待测化合物至2Χ浓度，在指定孔内加入100 μ 1，继续培养至指定时间，采用焚光检测试剂盒(Promega)检测焚光强度。具体方法:将荧光素酶底物溶解液放于室温，待融化且温度平衡到室温后，加到底物中并上下颠倒混匀。待测96孔酶标板中去上清，用PBS清洗3次。将5Χ细胞裂解液(CCLR)用去离子水稀释到IX，按每孔30 μ I加入待测孔中。置于37°C孵箱，裂解30min。取出酶标板，加入荧光素酶底物溶液50 μ 1，在多标记微孔板检测仪上立即检测。以阳性化合物genistein(购自南京泽朗医药科技有限公司)进行初步验证，结果，如图2D，最终选择#7质粒，序列结果如图2E。
[0036](3)稳定转染细胞株构建
[0037]将#7重组报告质粒pGL4.17-0SE转染MC3T3-E1细胞，经G418筛选得到稳定转染细胞株，命名为MC3T3-E1-0SE细胞，从而初步完成了 Runx2活性上调剂筛选模型构建工作。以阳性化合物genistein，进行初步验证，发现阳性化合物能剂量依赖地上调Runx2活性，表现为荧光素酶活性剂量依赖地升高，且在5 μΜ的浓度下达到最佳活性(图3Α)。此外，还考察了化合物处理时间、细胞接种密度、DMSO终浓度对MC3T3-E1-0SE筛选模型中荧光素酶表达活性的影响。结果如图3，确定了该细胞筛选模型的最佳条件:药物作用时间为48h ;细胞接种密度为10000个/孔；DMSO终浓度控制为0.1 %。
[0038]化合物处理:
[0039]MC3T3-E1-OSE细胞以I X 15个每孔接种于96孔板，每100 μ 1，置于二氧化碳培养箱内培养过夜。次日，用培养液稀释化合物至2X浓度，在指定孔内加入100 μ 1，继续培养至48小时。
[0040]荧光检测:
[0041]采用荧光检测试剂盒(Promega)检测荧光。方法如上所述。
[0042]结果如图4所示，发现N-(环丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)_1，2-唑-3-甲酰胺(购自百灵威科技有限公司)在0.001-25 μM范围内剂量依赖地上调模型中Runx2的转录活性。
[0043]《实施例2》N_(环丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)_1，2_唑_3_甲酰胺上调小鼠成骨前体细胞MC3T3-E1中Runx2的蛋白水平
[0044]接种30万个MC3T3-E1细胞于六孔板待细胞贴壁后，加入不同浓度的N_(环丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)-1, 2-唑-3-甲酰胺处理48h后，收集细胞，并用预冷PBS清洗细胞2次，收集细胞沉淀。按照细胞沉淀5倍体积添加细胞裂解液(提前加入PMSF使其终浓度为ImM)，冰上裂解30min后，以12000rpm转速，4°C离心15min，收集上清，测定蛋白浓度，按照40 μ g/管分装，并加入5 X蛋白上样缓冲液，用高压灭菌的超纯水补足上样体积，100°C煮7min，离心用下挂壁液体。采用LaemmLi系统，积层胶浓度为5%，分离胶浓度选用10%电泳，当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到IlOV继续电泳，根据蛋白Marker位置判断跑胶完成后，转膜。在电泳期间即制备转膜缓冲液(25mM Tris, 192mM甘氨酸，20% (v/v)甲醇)，置于4°C预冷。PVDF膜预先用甲醇活化lmin，然后浸于转膜缓冲液中，放摇床上振荡以去除膜表面气泡。滤纸在转膜前15min浸入转膜液中预冷。电泳结束后，小心取下凝胶，转移到转膜缓冲液中平衡5min，之后进行半干转膜。在半干转膜仪的阳极自下而上依次铺3张滤纸、PVDF膜、凝胶、3张滤纸，叠放整齐，注意气泡的撵除。制作三明治完毕，要用吸水纸擦干三明治结构外过量的转膜液，以防电流泄漏。最后将转膜仪的阴极盖好。转一块胶时电压设10?15V，两块胶20?25V。转膜结束后，将膜取下，室温振摇封闭lh，封闭液为 5%脱脂牛奶(PBS-T 稀释)。Runx2 (Santa Cruz B1technology) 一抗 4°C孵育过夜。次日，移除一抗溶液，PBS-T洗3次，每次7min。再用辣根过氧化物酶标记的二抗溶液(用含5%脱脂牛奶的PBS-T稀释，鼠抗以1:5000稀释)孵育lh，PBS-T洗3次，每次7min。最后用ECL免疫印迹试剂孵育，通过Chemi Imager 5500凝胶成像仪捕获图像。结果如图5，N-(环丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)_1，2-唑-3-甲酰胺可上调MC3T3-E1细胞中Runx2蛋白的表达。
[0045]《实施例3》PNPP法测定碱性磷酸酶活性(ALP)
[0046]MC3T3-E1细胞接种于6孔板，3 X 15/孔，待细胞生长汇合后，换为成骨诱导液25 μ g/ml抗坏血酸，5mM0 -磷酸甘油。，并且加入不同浓度药液，每三天换液一次，在指定日收集样品。收样时，细胞用冰冷的PBS清洗2遍，再用Iml Mill1-Q H20清洗，之后吸净液体，尽量不要有残留。每孔加入Iml经高压灭菌的Mill1-Q H20，用细胞刮刀刮下细胞，转移至预冷的2ml EP管内。冰上超声30s，共2次。所得细胞裂解液于4°C，12000rpm离心15min ;转移上清液至新的预冷EP管内。取100 μ I蛋白上清液，加100 μ I新鲜配制的pNPP溶液(1.0mg/mL PNPP，IM 二乙醇胺缓冲液，0.5mM MgCl2);另外取100 μ L蛋白上清液，加100 μ I BCA反应液，于37 0C孵育30min，ALP测定孔加50 μ I浓度为3Μ的NaOH终止反应，于405nm处测定ALP反应产物对硝基苯酚的吸光度，570nm处测定蛋白与BCA液反应后的吸光度。将测定的吸光度分别代入对应线性方程，进行定量。计算公式中的0D405和0D570分别已经减去本底值。相对碱性磷酸酶活性(％ )=加药组(ALP的量/蛋白总量)/对照组(ALP的量/蛋白总量)X100%。。结果图6所示，N-(环丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)-1, 2-唑-3-甲酰胺N-(环丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)-1, 2-唑-3-甲酰胺上调细胞内碱性磷酸酶ALP的活性。
[0047]《实施例4》矿化的测定
[0048]C3H10T1/2细胞在成骨诱导液(完全培养液含25 μ g/ml抗坏血酸，5mM β -磷酸甘油，1nM地塞米松)中培养21d测定钙结节形成情况。细胞用PBS清洗2遍，吸净PBS。常温下用预冷的70%乙醇固定细胞lh，之后移除固定液，用Mill1-Q水洗2遍。加入新鲜配制的茜素红染液(PH4.2，40mM)，在常温下染色1min后，用Mill1-Q水轻柔地清洗3次，去除非特异性染色。用扫描仪扫描图像，设置输出为tif.格式。结果如图7，N-(环丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)-1，2-唑-3-甲酰胺增加钙化结节的数目。
[0049]《实施例5》成骨基因RT-PCR检测
[0050]MC3T3-E1细胞接种于6孔板，3 X 15/孔，待细胞生长汇合后，换为成骨诱导液25 μ g/ml抗坏血酸，5mM|3 -磷酸甘油。Trizol裂解细胞，提取细胞内mRNA。测定RNA浓度和纯度后，进行逆转录制备cDNA。取Iyg总RNA和4μ1 5 X PimeScriptRT Master Mix加入到PCR管中，并用无RNase的水补足到20 μ I体系。逆转录条件:37°C 30min，85°C 5s，4°C冷却。PCR 采用 20 μ I 反应体系:2XEasy Taq, 10 μM PCR 引物和 50ng cDNA 模板。引物序列如下:Alp:正向引物:5’ -tgaccttctctcctccatcc-3’ (SEQID N0.1);反向引物:5’ -cttcctgggagtctcatcct-3’ (SEQ ID N0.2) ；Runx2:正向引物:5，-agagtcagattacagatcccagg-3’ (SEQ ID N0.3);反向引物:5，-tggctcttcttactgagagagg-3’ (SEQ ID N0.4) ；Opn:正向引物:5，-tccaaagccagcctggaac-3，(SEQ IDN0.5);反向引物:5，-tgacctcagaagatgaactc-3，(SEQ ID N0.6) ;GAPDH:正向引物:5，-catggccttccgtgttccta-3，(SEQ ID N0.7);反向引物:5’-cctgcttcaccaccttcttgat-3’ (SEQ ID N0.8);反应条件:94°C 5min ；94°C 30s, 60°C 30s, 72°C lmin，30 个循环；72°C 1min0结果如图8:N-(环丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)-1，2-唑-3-甲酰胺上调细胞内Alp，Opn，Runx2 的 mRNA 水平。
[0051 ]《实施例6》TRAP染色检测破骨细胞形成
[0052]将RAW264.7细胞以2.5 X 13个每孔接种于96孔板，待细胞长满后弃掉培养基，培养基成分:DMEM高糖完全培养基，然后按以下分组诱导培养:A组:control ；B组:50ng/mlRANKL ；CM:50ng/ml RANKL+1 μΜ N-(环丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)_1，2-唑-3-甲酰胺；D组:50ng/ml RANKL+5 μ M N-(环丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)-1，2-唑-3-甲酰胺；E组:50ng/ml RANKL+ΙΟμΜ N-(环丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)_1，2-唑-3-甲酰胺丨组:50ng/ml RANKL+20 μ M N-(环丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)-1，2-唑-3-甲酰胺。6天后，TRAP染色试剂盒(sigma，386A)染色。结果如图9，N_(环丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)_1，2-唑-3-甲酰胺抑制破骨细胞形成。
【主权项】
1.一种上调Rimx2转录活性的化合物在制备防治骨质疏松药物中的应用。
2.权利要求1所述的应用，其特征是，所述化合物是基于Runx2转录活性上调剂细胞筛选模型MC3T3-E1-0SE获得的。
3.权利要求1、2所述的应用，其特征是，所述细胞筛选模型MC3T3-E1-0SE，系利用P60SE2信息，设计引物以扩增P60SE2质粒上6个重复的Runx2结合元件(60SE2)和下游的最小骨钙素启动子片段及PGL4.17质粒，获得重组质粒pGL4.17-0SE，转染MC3T3-E1细胞得到的。
4.权利要求1、2、3所述的应用，其特征是，所述化合物是利用细胞筛选模型MC3T3-E1-0SE获得的具有上调Runx2转录活性的N-(环丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)-1，2-唑-3-甲酰胺化合物。
5.权利要求4所述N-(环丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)-1，2-唑-3-甲酰胺化合物在制备防治骨质疏松药物中的应用。
6.以N-(环丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)-1，2-唑-3-甲酰胺化合物为活性成分与药学上可接受的载体组成的的组合物在制备防治骨质疏松药物中的应用。
【专利摘要】本发明属于医药领域，通过构建Runx2转录活性上调剂细胞模型，筛选获得化合物N-(环丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)-1,2-唑-3-甲酰胺，实验研究表明其具有上调Runx2的转录活性、上调成骨细胞碱性磷酸酶ALP活性和成骨特异性分化基因的表达，同时增加钙化结节的产生，具有制备防治骨质疏松药物的应用前景。
【IPC分类】A61K31-4155, A61P19-10
【公开号】CN104873499
【申请号】CN201510319767
【发明人】王真, 司书毅, 赵晓丽, 陈金晶, 陈琳峰
【申请人】中国医学科学院医药生物技术研究所
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2015年6月11日