专利名称：罗汉松属萃取物及其制造方法
技术领域：
本发明涉及一种罗汉松属(Podocarpus spp.)萃取物及其制造方法，特别涉及含有双黄酮类(Biflavonoid)化合物的罗汉松属萃取物及其制造方法。
背景技术：
皮肤是人体最大的器官，同时更是人体和外界接触的第一道防线。皮肤具有多种功能，其中最主要就是保护人体，可以防止病菌的侵入，并防止体内水分的过度散失。而且皮肤中含有黑色素，黑色素呈褐色至黑色。当皮肤曝于日光中，会使黑色素的颜色加深且量亦增加，可以防止紫外线透入体内。此外，皮肤也有排泄、调节体温、感觉等的功能。
皮肤老化是必经的过程，老化的皮肤会产生各种组织形态与生理功能的变化，例如皮肤萎缩、松弛、失去弹性和光泽、产生皱纹、色素变化、皮肤伤口愈合能力及免疫力降低等。除了因增龄而造成的内因性老化之外，皮肤尚受到环境诸多不利的影响，而加速或提前老化。这些外因性老化的原因例如，长期暴露于阳光或高能量放射线下、饮食不干净、组织受损、微生物感染、生活压力过大、疲劳过度、或过多的油脂摄取等，也会增加自由基及黑色素的产生或是代谢因子丧失。过量的自由基累积于皮肤中，会造成表皮、真皮结缔组织中的DNA受到破坏、脂质过氧化(Lipid Peroxidation)以及各种胶原蛋白质变性，使得结缔组织失去原有功能，而产生皮肤老化的现象，例如皱纹(Wrinkle)、失去弹性(Loss of Tone)以及干燥等。近年来，很多研究报告指出反应性氧族(ROS)不但能直接破坏组织间隙的胶原蛋白，还能让基质蛋白酶组织抑制物(Tissue Inhibitors of Metalloproteinases；TIMPs)去活性化，诱使另一类与皮肤老化相关的酵素，即基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinases；MMPs)活化与表现。
基质金属蛋白酶涵盖了一整个大家族，大部分功用都是切除细胞外基质(Extracellular Matrix)的蛋白质，至今已被发现的基质金属蛋白酶至少有26种，它们都具有很多结构上的共同点，例如具有锌离子的结构及某些相同序列的胜肽链。基质金属蛋白酶可细分为几个次家族，包括胶原蛋白酶(Collagenases；MMP-1、MMP-8与MMP-13)、明胶水解酶(Gelatinases；MMP-2与MMP-9)、基质溶酶(Stromelysins；MMP-3、MMP-7、MMP-10、MMP-11与MMP-12)、以及膜形基质金属活化蛋白酶(Membrane-Type MMP；MMP-14、MMP-15、MMP-16与MMP-17)等。一般而言，基质金属蛋白酶在正常、健康或休止的组织中几乎都不被表现出来，或是维持在非常微量的状态。但当细胞或组织处于修复(Repair)或重组(Remodeling)的状态时，例如遭逢组织受伤、发炎反应、皮肤日晒、或各类疾病及癌细胞等，各类型的基质金属蛋白酶就会被大量的分泌出来。举例而言，在伤口愈合过程中，基质金属蛋白酶-1的表现相当重要，正常的角皮细胞(Keratinocytes)在与第一类胶原蛋白(CollagenType I)接触的时候，会诱导MMP-1(Collagenase)表现，同时在细胞激素的参与下，基质金属蛋白酶-1表现量会更加显著。另外，在紫外线照射的照射下，人类皮肤纤维母细胞(Fibroblasts)的基质金属蛋白酶-9(Gelatinase)活性会明显的增加；而在慢性暴露紫外线照射下，则可刺激胶原蛋白的合成，并增加MMP的表现。
在正常情况下，基质金属蛋白酶切除结缔组织，有利于伤口的修复以及组织的重组，且基质金属蛋白酶活性之平衡系由存在于组织中之基质金属蛋白酶组织抑制分子(TIMPs)所调节。然而，当皮肤基质金属蛋白酶分泌不正常时，反而会造成结缔组织的损害。举例而言，在光老化(Photoageing)现象中，皮肤受到阳光中能量最高且波长介于320nm至400nm之间的UVA(Ultraviolet A)、以及能量次之且波长介于280nm至320nm之间的UVB(Ultraviolet B)曝晒后，一方面皮肤结缔组织中的DNA吸收光子后引起结构上的改变而失去作用，另一方面表皮上一些光敏感性物质(Photosensitizer)，诸如反式尿刊酸(Trans-Urocanic Acid)吸收光子后会进一步和氧分子反应，而形成例如单旋氧(Singlet Oxygen)、超氧阴离子自由基(Superoxide AnionRadical)等反应性氧族。反应性氧族会进一步破坏组织结构，也会去活化基质金属蛋白酶组织抑制分子(Tissue Inhibitors of MMP；TIMPs)，使得皮肤基质金属蛋白酶分泌不正常，而引起结缔组织异常的损害。
许多报告显示皱纹形成之重要原因是由于皮肤弹性降低，并伴随弹性纤维(Elastic Fiber)之降解或弯曲所造成。除了上述照射UV会引起皱纹之外，皮肤弹性降低是因弹性纤维水解酶(Elastase)降解(Degeneration)弹性纤维，而皮肤之纤维母细胞中之弹性纤维水解酶在降解或弯曲弹性纤维中最为重要。
此外，紫外线亦能诱导皮肤组织中的黑色素(Melanin)的产生。黑色素为一种含氮的化合物，依其结构的不同，可分为褐色、黑色的真黑色素(Eumelanin)和黄色、红色的嗜铬黑色素(Pheomelanin)。黑色素大多集中位于皮肤基底层(Basal Layer)的黑色素细胞(Melanocyte)内，此两种黑色素的比例、分布位置的差异、黑色素细胞活性大小以及各种外界环境的刺激，造就了个体乃至于人种肤色上的差异。黑色素在对抗紫外光扮演了很重要的角色，能吸收、散射紫外光，保护人体不受其能量的伤害。然而黑色素的不正常制造，如长期曝晒阳光、黑皮病(Melasma)、雀斑和老人斑等黑色素沉积的病症，亦带来不少困扰。
近年来的研究朝向于从植物中取得天然成分，以有效解决皮肤老化各种问题。举例而言，芦荟(Aloe vera Webb.)中的Aloesine及Gvae grsi中的熊果素(Arbutin)具有很好的抑制酪氨酸酶活性并且两者合用具有协同效果。番红花(Crocus sativus L.)的山奈酚(Kaempferol)、苦参(Sophoraflavescens Ait.)中的苦参素(Kurarinone)、人参(Panax ginseng C.A.Meyer)中的p-香豆酸(p-Coumaric Acid)以及Pulsatilla cernua植物中分离的3，4-二羟基肉桂酸(3，4-Dihydroxycinnamic Acid)及4-羟基-3-甲氧基肉桂酸(4-Hydroxy-3-Methoxycinnamic Acid)都具有不错的酪氨酸酶抑制活性。仙草(Mesona procumdens Hemsl)对于清除α，α-二苯基-β-苦基肼基(α，α-Disphenyl-β-Picryl-Hydrazyl；DPPH)自由基以及超氧自由基有很好的活性。番石榴(Psidium guajava L.)果实具有不错的DPPH清除活性。朝鲜蓟(Cynaa scolymus L.)也有不错的清除DPPH自由基活性。烘培过后的各种咖啡豆(Coffea spp.)有不错的抗氧化活性。马尾藻(Sargassumsiliquastrum)萃取物对酯质过氧化的保护及清除超氧自由基也有很好的效果。在相思树(Acacia confuse Merr.)的心材中，也发现有保护脂质过氧化、清除氢氧自由基及超氧自由基的化合物。
综上所述，皮肤内因性老化虽不能避免的，所幸皮肤的外因性老化倒是可以预防、避免、甚至治疗的。因此，企需提出一种能清除反应性氧族活性、抑制酪氨酸酶活性以及抑制基质金属蛋白酶活性的物质，以期能延缓甚至避免皮肤组织受到破坏，减少皮肤的皱纹、缺乏弹性、干燥、色素表现异常(Dyspigmentation)等老化以及紫外线伤害所造成的光老化现象。
发明内容
本发明的目的之一就是在提供一种罗汉松属(Podocarpus spp.)萃取物，其系至少一双黄酮类(Biflavonoid)化合物且萃取自于有机溶液。由于本发明之罗汉松属萃取物具有抗皮肤老化、皮肤美白以及皮肤抗皱之功效，因此可作为活性成分以添加至皮肤用化妆品或皮肤用医药品中。
本发明的另一目的是在提供一种罗汉松属萃取物的制造方法，其系利用有机溶液以及凝胶层析(Gel Chromatography)法萃取罗汉松属植物之叶片，藉以获得罗汉松属萃取物，其中此罗汉松属萃取物为至少一双黄酮类化合物。由于本发明之罗汉松属萃取物具有抗皮肤老化(清除氢氧自由基、清除超氧自由基)、皮肤美白(抑制酪氨酸酶活性)以及皮肤抗皱(抑制基质金属蛋白酶活性)之功效，因此可作为活性成分以添加至皮肤用化妆品或皮肤用医药品中。
根据本发明之上述目的，提出一种罗汉松属萃取物，此罗汉松属萃取物为至少一双黄酮类化合物且利用有机溶液萃取而得，其中此双黄酮类化合物之结构式如下式(I)之所示 其中R1基之结构式系如式(II)或式(III)之所示 依照本发明一较佳实施例，上述R2基可例如为甲氧基(H3CO-)或烃基(HO-)。
依照本发明一较佳实施例，上述有机溶液可例如为甲醇、水或其上述之任意组合。
依照本发明一较佳实施例，上述罗汉松属萃取物系萃取自罗汉松属植物之叶片，而罗汉松属植物可包括但不限于大叶罗汉松(Podocarpus macrophyllus var.macrophyllus)、兰屿罗汉松(Podocarpus costalis presl)、桃实百日青(Podocarpus nakaii Hayata)或丛花百日青(Podocarpus fasciculus deLaubenfels)。
依照本发明一较佳实施例，上述罗汉松属萃取物具有清除氢氧自由基、清除超氧自由基、抑制酪氨酸酶活性以及抑制基质金属蛋白酶活性之功效，因此可作为活性成分以添加至皮肤用化妆品或皮肤用医药品中。
根据本发明之上述目的，另提出一种罗汉松属萃取物的制造方法。首先，进行萃取过滤步骤，其系利用有机溶液萃取并过滤含有罗汉松属植物之叶片的有机溶液，以获得粗萃取物。接着，利用第一有机溶剂对上述粗萃取物进行部份划分(Partitioning)步骤，以获得第一有机溶剂层萃取物以及水层萃取物。然后，进行第一分离步骤，其系将上述第一有机溶剂层萃取物通过第一层析管柱并以第二有机溶剂冲提后，收集第二有机溶剂萃取物。之后，进行第二分离步骤，其系将第二有机溶剂萃取物至少通过逆相层析管柱，以获得罗汉松属萃取物，其中上述罗汉松属萃取物为上述式(I)之所示之至少一双黄酮类化合物。由于上述之双黄酮类化合物之结构式(I)以及罗汉松属植物等之较佳态样已悉如前述，故不另赘述。
应用本发明的罗汉松属萃取物的制造方法，其系利用有机溶剂以及凝胶层析法萃取罗汉松属之叶片，藉以获得罗汉松属萃取物，其中此罗汉松属萃取物为至少一双黄酮类化合物，且具有抗皮肤老化(清除氢氧自由基、清除超氧自由基)、皮肤美白(抑制酪氨酸酶活性)以及皮肤抗皱(抑制基质金属蛋白酶活性)之功效，因此可作为活性成分以添加至皮肤用化妆品或皮肤用医药品中。
具体实施例方式
本发明系揭露一种罗汉松属萃取物及其制造方法，其系利用有机溶液以及凝胶层析法萃取罗汉松属植物之叶片，藉以获得含有双黄酮类化合物之罗汉松属萃取物。以下配合第1图藉此详细说明本发明的罗汉松属萃取物及其制造方法。
罗汉松属植物系属于常绿乔木，在台湾，罗汉松属植物广布于中低海拔地区，而此属的植物常做为造林用树种。本发明所指之罗汉松属(Podocarpus sp.)植物一般可包括但不限于大叶罗汉松(Podocarpus macrophyllus var.macrophyllus)、兰屿罗汉松(Podocarpus costalis presl)、桃实百日青(Podocarpus nakaiiHayata)或丛花百日青(Podocarpus fasciculus de Laubenfels)。上述适用于制造罗汉松属萃取物之物种，均可运用于本发明中，然而本发明系以大叶罗汉松为较佳实施例，来阐明本发明所揭露的罗汉松属萃取物的制造方法。
请参阅第1图，其系绘示根据本发明一较佳实施例之罗汉松属萃取物之制程流程图。首先，如步骤101之所示，进行萃取过滤步骤101，其系利用有机溶液萃取并过滤罗汉松属植物之叶片，以获得滤液。上述之有机溶液一般可例如甲醇、水或其上述之任意组合，然以80体积百分比之甲醇溶液为较佳。进一步而言，在萃取过滤步骤101中，其系利用粉碎装置，例如粉碎机，在室温或略低于室温之温度下，打碎罗汉松属叶片后，将打碎之叶片浸于上述有机溶液中。接着，进行至少一次过滤步骤，其系利用过滤装置，例如纱布、滤纸、棉花、具有预定筛孔大小之滤网或其上述之任意组合，过滤上述含有粉碎叶片之有机溶液，以获得滤液。然后，去除滤液中之有机溶液，以获得粗萃取物102。上述适用于去除滤液中之有机溶液的方法一般可包括但不限于减压浓缩、冷冻干燥处理(Lyophilization)、低温喷雾干燥处理(Spray-Drying)或低温蒸发处理(Evaporation)，然以减压浓缩为较佳。
之后，利用第一有机溶剂，例如乙酸乙酯(Ethyl Acetate)，对上述粗萃取物102进行部份划分(Partitioning)步骤103，以获得第一有机溶剂层萃取物105以及水层萃取物106。然后，进行第一分离步骤107，其系将上述第一有机溶剂层萃取物105利用凝胶层析法，而得到罗汉松属萃取物。
进一步而言，在本发明一较佳实施例中，第一分离步骤107系将上述第一有机溶剂层萃取物105通过第一层析管柱109并以第二有机溶剂冲提后，收集第二有机溶剂萃取物111。在第一分离步骤107中适用之凝胶材质一般可包括但不限于聚葡聚醣(Polydextran；其商品名为Sephadex)、聚丙醯烯胺(Polyacrylamide；其商品名为Bio Gel P)、琼脂醣(Agarose；其商品名为Separose)或聚丙醯烯胺与琼脂醣之交联物等，然而第一层析管柱以Sephadex LH-20层析管柱为较佳，而第二有机溶剂以甲醇为较佳。
接下来，如步骤113之所示，进行第二分离步骤113，其系将上述第一分离步骤107所得之第二有机溶剂萃取物111通过高效率液向层析(High PerformanceLiquid Chromatography；HPLC)仪之逆相层析管柱117，其中逆相层析管柱117以Biosil 5 Octadecyl Silane(ODS)-W逆相层析管柱为较佳，以获得罗汉松属萃取物119。在本发明的另一个例子中，上述第一分离步骤107之第二有机溶剂萃取物111更可先通过第二层析管柱115后，再通过逆相层析管柱117，其中第二层析管柱115适用之凝胶材质一般可包括但不限于聚葡聚醣(Sephadex)、聚丙醯烯胺(Bio Gel P)、琼脂醣(Separose)或聚丙醯烯胺与琼脂醣之交联物等，然以MCI凝胶层析管柱或Sephadex LH-20层析管柱为较佳。
上述所得之罗汉松属萃取物119为至少一双黄酮类化合物，且此双黄酮类化合物之结构式如下式(I)之所示 其中R1基之结构式可例如式(II)或式(III)之所示
，其中式(II)以及式(III)之R2基以甲氧基(H3CO-)或烃基(HO-)为较佳。
本发明之罗汉松属萃取物经过一系列测试后，发现更具有清除氢氧自由基、清除超氧自由基、抑制酪氨酸酶活性以及抑制基质金属蛋白酶活性之功效，因此可作为活性成分与皮肤外用剂合并使用。本发明之皮肤外用剂通常系指化妆品或医药品中之外用成分。当本发明之罗汉松属萃取物与皮肤外用剂合并使用时，适用之皮肤外用剂一般可包括但不限于其它美白剂、保湿剂、抗氧化剂、紫外线吸收剂、接口活性剂、增稠剂、色料、皮肤营养剂等。
本发明之罗汉松属萃取物应用于皮肤用化妆品或皮肤用医药品时，亦可搭配其它已知美白作用剂及/或其它活性成分，诸如维生素C、熊果素、曲酸、懈皮酮(Quercetin)与儿茶素(Catechin)等酪胺酸酵素抑制剂、抗痘剂、抗菌剂、镇痛剂、麻醉剂、抗皮肤发炎剂、止痒剂、抗发炎剂、抗过角化剂(Antihyperkeratolytic Agents)、抗干皮肤剂(Anti-Dry Skin Agents)、抗汗剂(Antipsoriatic Agents)、抗老化剂、抗皱剂(Antiwrinkle Agents)、抗皮脂溢出剂(Antiseborrheic Agents)、美黑剂(Self-TanningAgents)、伤口治疗剂(Wound-Healing Agents)、皮质类固醇(Corticosteroids)或激素(Hormones)等等。
此外，当本发明之罗汉松属萃取物应用于皮肤用化妆品或皮肤用医药品时，此化妆品或医药品之配方更至少包含佐剂及其它成分。佐剂一般可包括但不限于亲水性或疏水性之胶凝剂(Gelling Agent)、亲水性或疏水性之活性剂(Active Agent)、保存剂(Preserving Agent)、抗氧化剂(Antioxidant)、溶剂、香料(Fragrance)、填料(filler)、遮蔽剂(Screening Agent)、螯合剂(Chelating Agents)、气味吸收剂(Odor Absorbers)以及染料。其它成分一般可包括但不限于乳糖与葡萄糖之醣类，诸如葡聚糖、纤维素、硅酸盐与碳酸钙之赋形剂，则诸如纤维素、淀粉、明胶、醣类之黏结剂，以及诸如琼脂粉末、明胶粉末、藻酸钠、纤维素衍生物以及碳酸钙之崩解剂来一起形成于所需的化妆品或医药品之配方中。至于上述佐剂及其它成分之用量为此技术领域中具有通常知识者所熟知，在此不另赘述。
再者，当本发明之罗汉松属萃取物应用于皮肤用化妆品或皮肤用医药品时，其形式一般可包括但不限于水性溶液、水-醇溶液或油性溶液、呈水包油型(Oil-In-Water)或油包水型(Water-In-Oil)或复合型之乳剂(Emulsions)、水性或油性凝胶、乳霜(Cream)、油膏(Ointment)、乳(Milk)、乳液(Lotion)、乳浆(Sserum)、软膏(Paste)、泡沫(Foam)或分散液(Dispersion)等。
除了上述形式之外，本发明之罗汉松属萃取物应用于皮肤用化妆品时，其形式更可例如化妆水(Tonic Water)、唇彩(Lip Colors)、粉底(Foundations)、肤乳(Milk)、面霜(Cream)、面膜(Masks)、凝胶(Gel)、气雾(Aerosol)、乳状的乳液(Milky Lotions)、慕斯(Mousse)、分散液(Dispersions)、乳霜(Cream)、卫浴用水液(Toilet Waters)、贴布(Packs)与清洁剂(Cleansings)，以及卸妆用的清洁乳、洗面皂(Wash Soap)等。
以下利用数个实施例并配合第2图至第14图，藉此更详尽阐述本发明之罗汉松属萃取物及其制造方法，然其并非用以限定本发明，因此本发明之保护范围当视后附之申请专利范围所界定者为准。
实施例一请参阅第2图，其系绘示根据本发明实施例一至实施例三之罗汉松属萃取物之制程流程图。首先，进行萃取步骤201，其系利用粉碎机，在室温或略低于室温之温度下，打碎约8公斤之大叶罗汉松叶片后，将打碎之叶片浸于80体积百分比之甲醇溶液中。接着，进行过滤步骤203，其系利用纱布以及滤纸，过滤上述含有粉碎叶片之80％甲醇溶液，重复三次后，以获得滤液。然后，利用减压浓缩法去除甲醇溶液后，获得大叶罗汉松之粗萃取物204。
之后，利用乙酸乙酯对上述粗萃取物204进行部份划分步骤205，以获得乙酸乙酯层萃取物207以及水层萃取物209。然后，进行第一分离步骤211，其系将上述乙酸乙酯层萃取物205利用凝胶层析法，而得到大叶罗汉松之萃取物。
进一步而言，第一分离步骤211系将上述乙酸乙酯层萃取物207通过第一层析管柱213，例如Sephadex LH-20层析管柱，并以100体积百分比之甲醇冲提后，收集甲醇萃取物214。此甲醇萃取物214经薄层层析片分析后，分成第一部分215、第二部分217以及第三部份219。其中第一部分215可进行第二分离步骤225，即先通过第二层析管柱231，例如MCI凝胶层析管柱，再通过逆相层析管柱233后，可得到大叶罗汉松之第一萃取物241。
实施例二实施例二系参照实施例一之方式进行萃取过滤步骤201、过滤步骤203、部份划分步骤205后，即进行第一分离步骤211，如第2图之所示。进一步而言，实施例二之第一分离步骤211系将上述乙酸乙酯层萃取物207通过第一层析管柱213，例如Sephadex LH-20层析管柱，并以100体积百分比之甲醇冲提后，收集甲醇萃取物214。如实施例一之所述，其中甲醇萃取物214之第二部分217可进行第二分离步骤225，即通过上述之逆相层析管柱233后，可得到大叶罗汉松之第二萃取物243。
实施例三实施例三亦参照实施例一之方式进行萃取过滤步骤201、过滤步骤203、部份划分步骤205后，即进行第一分离步骤211，如第2图之所示。进一步而言，实施例三之第一分离步骤211系将上述乙酸乙酯层萃取物207通过第一层析管柱213，例如Sephadex LH-20层析管柱，并以100体积百分比之甲醇冲提后，收集甲醇萃取物214。如实施例一之所述，其中甲醇萃取物214之第三部份219可进行第二分离步骤225，即通过第二层析管柱231，例如Sephadex LH-20层析管柱，先分成第四部分221及第五部分223后，再分别将第四部分221及第五部分223通过逆相层析管柱233，可分别得到大叶罗汉松之第三萃取物245以及第四萃取物247。
实施例四将实施例一所得之大叶罗汉松之第一萃取物，利用1H-NMR光谱以及13C-NMR光谱等，进行萃取物之结构分析。
实施例一所得之大叶罗汉松之第一萃取物外观为浅黄色粉末，与10体积百分比之稀硫酸一起加热反应后呈黄色，与氯化铁反应后呈深蓝色。另在UV光谱(图未绘示)中270nm(log∈2.5)以及370nm(log∈2.5)有最大吸收峰，又在IR光谱(图未绘示)中3339cm-1有OH基的吸收峰，1725cm-1和1649cm-1有酮基的吸收峰，又另于质谱(ESI-MS)(图未绘示)测定其伪分子离子峰在m/z 583[M+H]+，故推测其分子式为C33H26O10。请参阅第3图以及第4图，其系分别显示根据实施例一所得之大叶罗汉松之第一萃取物之1H-NMR光谱以及13C-NMR光谱。在第3图以及第4图中，可以很明显观察到两组典型黄酮类的讯号。在第3图中，第一组黄酮类的讯号包括δ5.80(1H，d，J＝2.1 Hz)和δ5.81(1H，d，J＝2.1Hz)位于黄酮类骨架的A环呈间位偶合的H6及H8位置，讯号δ7.47(1H，d，J＝2.3Hz)、δ7.20(1H，d，J＝8.6Hz)和δ7.58(1H，dd，J＝2.3，8.6Hz)这组三个氢分别是黄酮类骨架B环上呈现ABX type偶合的H2′、H5′及H6′位置，δ2.72(1H，m)和δ3.15(1H，m)则是位于C环上H3位置的两个氢，δ5.54(1H，dd，J＝2.7，12.5Hz)是位于H2位置的氢。在第4图中的δ195.5则推定是C环上C4位置接有酮基的讯号。另外，由异核多键关联(Heteronuclear Multiple BandCorrelation；HMBC)分析(图未绘示)得知，δ12.16(1H，s)是位于A环上C5位置OH基的讯号，由于和C4位置的酮基形成氢键而往低磁场处移动。
请再参阅第3图，第二组黄酮类的讯号包括δ6.63(1H，s)位于黄酮类骨架A环上H6”位置，讯号δ7.63(2H，d，J＝8.7Hz)、δ6.97(2H，d，J＝8.7Hz)分别是B环上互呈邻位偶合的H2，H6及H3，H5，讯号δ6.92(1H，s)位于C环上H3″位置。第4图中的δ182.4推定是C环上C4″接有酮基的讯号，配合HMBC(图未绘示)得知δ13.17(1H，s)则是C5″位置OH基的讯号。
综合以上数据，推定实施例一所得之大叶罗汉松之萃取物为双黄酮类的黄烷酮(Flavanone)-黄酮(Flavone)结构，如式(IV)所示。又，经由HMBC(图未绘示)得知这两组黄酮结构是由第一组黄酮C环上δ120.3(C3’)与第二组黄酮A环上的δ105.4(C8″)相连，另外δ56.4、δ55.6和δ55.5有OCH3的讯号，经由HMBC(图未绘示)确定是在C7、C4′及C4的位置有OCH3取代基。
透过以上的分析，并配合相关文献的比对，证实实施例一所得之大叶罗汉松之第一萃取物为2，3-二氢金松双黄酮(2，3-Dihydrosciadopitysin)，即如式(IV)所示 实施例五将实施例二所得之大叶罗汉松之第二萃取物，利用1H-NMR光谱以及13C-NMR光谱等，进行萃取物之结构分析。
实施例二所得之大叶罗汉松之第二萃取物外观呈浅黄色粉末，与10体积百分比之稀硫酸一起加热反应后呈黄色，和氯化铁反应呈深蓝色。另在UV光谱(图未绘示)中267nm(log∈3.0)和365nm(log∈3.2)有最大吸收峰，又在IR光谱(图未绘示)中3330cm-1有OH基的吸收峰，1648cm-1有酮基的吸收峰，又另于质谱(ESI-MS)(图未绘示)测定其伪分子离子峰在m/z 581[M+H]+，故推测其分子式为C33H24O10。请参阅第5图以及第6图，其系分别显示根据实施例二所得之大叶罗汉松之第二萃取物之1H-NMR光谱以及13C-NMR光谱。在第5图以及第6图中，可以很明显观察到有两组典型黄酮类的讯号。在第5图中，第一组黄酮类的讯号包括δ6.35(1H，d，J＝2.2Hz)和δ6.79(1H，d，J＝2.2Hz)位于黄酮类骨架的A环呈间位偶合的H6及H8位置，讯号δ8.07(1H，d，J＝2.4Hz)、δ7.36(1H，d，J＝8.9Hz)及δ8.22(1H，dd，J＝2.4，8.9Hz)这组三个氢分别是黄酮类骨架B环上呈现ABX type偶合的H2′、H5′及H6′位置，δ7.00(1H，s)则是位于C环上H3位置。在第6图中的δ182.0则推定是C环上C4位置接有酮基的讯号，由HMBC(图未绘示)得知，δ12.90(1H，s)是位于A环上C5位置OH基的讯号，由于和C4位置的酮基形成氢键而往低磁场处移动。
请再参阅第5图，第二组黄酮类的讯号包括6.40(1H，s)位于黄酮类骨架A环上H6″位置，讯号δ7.58(2H，d，J＝9.0Hz)、δ6.92(2H，d，J＝9.0Hz)分别是B环上互呈邻位偶合的H2，H6及H3，H5，讯号δ6.89(1H，s)位于C环上H3″位置。第6图中的δ182.1推定是C环上C4″接有酮基的讯号，配合HMBC(图未绘示)得知δ13.04(1H，s)则是C5″位置OH基的讯号。
综合以上数据，推定实施例二所得之大叶罗汉松之第二萃取物为双黄酮类的黄酮(Flavone)-黄酮(Flavone)结构，如式(V)所示。又，经由HMBC(图未绘示)得知这两组黄酮结构是由第一组黄酮C环上δ122.8(C3′)与第二组黄酮A环上的δ103.6(C8″)相连，另外δ55.5、δ55.9和δ56.1有OCH3的讯号，经由HMBC(图未绘示)确定是在C4、C4′和C7的位置有OCH3取代基。
透过以上的分析，并配合相关文献的比对，证实实施例二所得之大叶罗汉松之第二萃取物为金松双黄酮(Sciadopitysin)，即如式(V)所示
实施例六将实施例三所得之大叶罗汉松之第三萃取物，利用1H-NMR光谱以及13C-NMR光谱等，进行萃取物之结构分析。
实施例三所得之大叶罗汉松之第三萃取物外观呈浅黄色粉末，与10体积百分比之稀硫酸一起加热反应后呈黄色，和氯化铁反应呈深蓝色。另在UV光谱(图未绘示)中265nm(log∈2.5)和370nm(log∈2.5)有最大吸收峰，又在IR光谱(图未绘示)中1640cm-1有酮基的吸收峰，又另于质谱(FAB-MS)(图未绘示)测定其伪分子离子峰在m/z 569[M+H]+，故推测其分子式为C32H24O10。请参阅第7图以及第8图，其系分别显示根据实施例三所得之大叶罗汉松之第三萃取物之1H-NMR光谱以及13C-NMR光谱。在第7图以及第8图中，可以很明显观察到有两组典型黄酮类的讯号。在第7图中，第一组黄酮类的讯号包括δ5.94(1H，br s)和δ5.97(1H，br s)位于黄酮类骨架的A环呈间位偶合的H6及H8位置，讯号δ7.62(1H，d，J＝1.6Hz)、δ7.23(1H，d，J＝8.4Hz)和δ7.65(1H，dd，J＝1.6，8.4Hz)这组三个氢分别是黄酮类骨架B环上呈现ABX type偶合的H2′、H5′及H6′位置，δ2.81(1H，m)和δ3.27(1H，m)则是位于C环上H3位置的两个氢，δ5.57(1H，dd，J＝2.6，12.8Hz)是位于H2位置的氢。在第8图中的δ196.9则推定是C环上C4位置接有酮基的讯号，由HMBC(图未绘示)得知，δ12.16(1H，s)是位于A环上C5位置OH基的讯号，由于和C4位置的酮基形成氢键而往低磁场处移动。
请再参阅第7图，第二组黄酮类的讯号包括δ6.41(1H，s)位于黄酮类骨架A环上H6″位置，讯号δ7.67(2H，d，J＝8.7Hz)、δ6.98(2H，d，J＝8.7Hz)分别是B环上互呈邻位偶合的H2，H6及H3，H5，讯号δ6.67(1H，s)位于C环上H3″位置，13C-NMR光谱中的δ183.3推定是C环上C4″接有酮基的讯号，配合HMBC(图未绘示)得知δ13.08(1H，s)则是C5″位置OH基的讯号。
综合以上数据，推定实施例三所得之大叶罗汉松之第三萃取物为双黄酮类的黄烷酮(Flavanone)-黄酮(Flavone)结构，如式(VI)所示。又经由HMBC(图未绘示)得知这两组黄酮结构是由第一组黄酮C环上δ121.8(C3’)与第二组黄酮A环上的δ105.7(C8″)相连，另外δ56.0和δ55.9有OCH3的讯号，经由HMBC(图未绘示)确定是在C4′及C4的位置有OCH3取代基。
透过以上的分析，并配合相关文献的比对，证实实施例三所得之大叶罗汉松之第三萃取物与第一萃取物的结构十分类似，差别在于第三萃取物第7位为OH基。由于实施例三所得之大叶罗汉松之第三萃取物并未见于其它文献之中，为一个新化合物，其结构命名为2，3-二氢-4′，4-二甲氧基穗花杉双黄酮(2，3-Dihydro-4′，4-Dimethoxyamentoflavone)，即如式(VI)所示 实施例七将实施例三所得之大叶罗汉松之第四萃取物，利用1H-NMR光谱以及13C-NMR光谱等，进行萃取物之结构分析。
实施例三所得之大叶罗汉松之第四萃取物外观为浅黄色粉末，与10体积百分比之稀硫酸一起加热反应后呈黄色，和氯化铁反应呈深蓝色。另在UV光谱(图未绘示)中265nm(log∈3.0)和370nm(log∈2.8)有最大吸收峰，又在IR光谱中1651cm-1有酮基的吸收峰，又另于质谱(FAB-MS)测定其伪分子离子峰在m/z 567[M+H]+，故推测其分子式为C32H22O10。请参阅第9图以及第10图，其系分别显示根据实施例三所得之大叶罗汉松之第四萃取物之1H-NMR光谱以及13C-NMR光谱。在第9图以及第10图中，可以很明显观察到有两组典型黄酮类的讯号。在第9图中，第一组黄酮类的讯号包括δ6.22(1H，br s)和δ6.52(1H，br s)位于黄酮类骨架的A环呈间位偶合的H6及H8位置，讯号δ8.12(1H，br s)、δ7.32(1H，d，J＝9.0Hz)和δ8.09(1H，d，J＝9.0Hz)这组三个氢分别是黄酮类骨架B环上的H2′、H5′及H6′位置，δ6.70(1H，s)则是位于C环上H3位置。在第10图中的δ182.9则推定是C环上C4位置接有酮基的讯号，由HMBC(图未绘示)得知，δ12.94(1H，s)是位于A环上C5位置OH基的讯号，由于和C4位置的酮基形成氢键而往低磁场处移动。
请再参阅第9图，第二组黄酮类的讯号包括δ6.43(1H，s)位于黄酮类骨架A环上H6″位置，讯号δ7.63(2H，d，J＝8.8Hz)、δ6.91(2H，d，J＝8.8Hz)分别是B环上互呈邻位偶合的H2，H6及H3，H5，讯号δ6.65(1H，s)位于C环上H3″位置。第10图中的δ183.2推定是C环上C4″接有酮基的讯号，配合HMBC(图未绘示)得知δ13.08(1H，s)则是C5″位置OH基的讯号。
综合以上数据，推定实施例三所得之大叶罗汉松之第四萃取物为双黄酮类的黄酮(Flavone)-黄酮(Flavone)结构，如式(VII)所示。又经由HMBC(图未绘示)得知这两组黄酮结构是由第一组黄酮C环上δ122.9(C3′)与第二组黄酮A环上的δ104.9(C8″)相连，另外δ55.9和δ56.3有OCH3的讯号，经由HMBC确定是在C4及C4′的位置有OCH3取代基。
透过以上的分析，并配合相关文献的比对，证实实施例三所得之大叶罗汉松之第四萃取物与第二萃取物的结构十分类似，差别在于第四萃取物少了第7位置OCH3取代基，为异银杏黄素(Isoginkgetin)，即如式(VII)所示
实施例八将实施例一至实施例三所得之大叶罗汉松之萃取物以及正对照组(水溶性维他命E；Trolox)分别配制成不同的浓度(0.3μg/ml至15.0μg/mL)，进行氢氧自由基之清除测试。
首先，样品溶液200μL加入A试剂400μL，其中A试剂含2.8mM之2-去氧-D-核醣(2-Deoxy-D-Ribose)80μl、20mM磷酸缓冲液(Phosphate Buffer，pH 7.4)120μL、100μM氯化铁(FeCl3)80μL、780μM乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic Acid；EDTA)80μL、100μM抗坏血酸(AscorbicAcid)20μL、以及1mM过氧化氢(H2O2)20μL，混合均匀后，于37℃恒温反应1小时。接着，混合液中再加入800μL之硫巴比妥酸(ThiobarbituricAcid；TBA)/三氯醋酸(Trichloroacetic Acid；TCA)溶液[即0.5％硫巴比妥酸溶于10％三氯醋酸中]，在水浴100℃下加热15分钟。待反应完成后，以分光光度计(波长532nm)测定混合液之吸光值，并依下式(VIII)计算各萃取物的氢氧自由基之清除率，而所得之结果如第1表以及第11图之所示。
第1表
由第1表以及第11图之结果得知，实施例一至实施例三所得之大叶罗汉松之萃取物对于清除氢氧自由基之浓度与抑制率皆成正相关。
人体内的反应性氧族(ROS)，如超氧自由基(·O2-)和过氧化氢(H2O2)在具有金属离子的环境下能被转变为具有高度活性的氢氧自由基(·OH)，对人体组织会造成最直接的伤害。实施例八系以Fenton反应，利用Fe2+与过氧化氢反应产生氢氧自由基。由第1表以及第11图之结果得知，四种大叶罗汉松之萃取物中，金松双黄酮以及异银杏黄素的IC50很接近，其原因可能源自于具有相似的化学结构，皆为黄酮(Flavone)-黄酮(Flavone)结构。同理可证，2，3-二氢金松双黄酮以及2，3-二氢-4′，4-二甲氧基穗花杉双黄酮的IC50也是很接近，推测也是由于化学结构之相似度，两者皆为黄烷酮(Flavanone)-黄酮(Flavone)结构。不过在第1表以及第11图之结果中，黄酮(Favone)-黄酮(Flavone)的活性系高于黄烷酮(Flavanone)-黄酮(Flavone)结构。
实施例九将实施例一至实施例三所得之大叶罗汉松之萃取物以及正对照组(水溶性维他命E；Trolox)分别配制成不同的浓度(2.5μg/ml到125.0μg/mL)，进行超氧自由基之清除测试。
首先，依序加入样品溶液200μL、630μM硝基蓝四唑(NitroblueTetrazolium；NBT)200μL、33μM吩嗪硫酸甲酯(Phenazine Methosulfate；PMS)200μL、以及156μM β-烟碱醯胺腺嘌呤还原态(β-NicotinamideAdenine Dinucleotide Reduced Form；β-NADH)200μL，混合均匀后，随即于560nm测其一分钟内吸光值之变化(ΔA560nm)，并依下式(IX)计算各萃取物的超氧自由基之清除率，而所得之结果如第2表以及第12图之所示。
第2表
由第2表以及第12图之结果得知，除了金松双黄酮在浓度100μg/mL下没有抑制活性外，其余大叶罗汉松之萃取物的抑制率皆与浓度成正相关。
超氧自由基(·O2-)亦是属于反应性氧族(ROS)之一。实施例九利用吩嗪硫酸甲酯(Phenazine Methosulfate；PMS)和β-烟碱醯胺腺嘌呤还原态(β-Nicotinamide Adenine Dinucleotide Reduced Form；β-NADH)反应形成超氧自由基，和硝基蓝四唑(Nitroblue Tetrazolium；NBT)呈色的变化来测量对氢氧自由基的清除能力。在实施例一至实施例三所得之大叶罗汉松之萃取物中，以2，3-二氢金松双黄酮以及2，3-二氢-4′，4-二甲氧基穗花杉双黄酮之活性较佳，其次为异银杏黄素，而金松双黄酮在100μg/ml不具有活性。2，3-二氢-4′，4-二甲氧基穗花杉双黄酮以及2，3-二氢金松双黄酮属于黄烷酮(Flavanone)-黄酮(Flavone)结构，异银杏黄素以及金松双黄酮属于黄酮(Flavone)-黄酮(Flavone)结构。相较于上述两组双黄酮类结构，在2、3位置为单键的黄烷酮(Favanone)-黄酮(Flavone)结构对于超氧自由基的抑制作用高于黄酮(Flavone)-黄酮(Flavone)类的结构。
实施例十将实施例一至实施例三所得之大叶罗汉松之萃取物以及正对照组(熊果素；Arbutin)分别配制成不同的浓度(2μg/ml至30μg/mL)，于96格微量盘(96-Well Microtiter Plate)中进行酪氨酸酶之抑制活性测试。
首先，在每格中加入反应液，其中反应液含0.4M HEPES缓冲溶液(pH 6.8)140μL、400u/ml酪氨酸酶20μL以及测试样品20μL，并以不含酪氨酸酶为空白对照组，混合均匀静置10分钟。接着，在450nm波长下测第一次吸光值。然后，加入2.5mM左旋酪胺酸(L-Tyrosine)20μL，混合均匀后静置20分钟。之后，在450nm波长下测第二次吸光值。以两次吸光值的差异并依下式(X)计算各萃取物之抑制率
其中式(X)中下标的A代表不含样品但含有酪氨酸酶之吸光值，下标的B代表不含样品且无酪氨酸酶之吸光值，下标的C代表含样品且有酪氨酸酶之吸光值，而下标的D代表含样品但无酪氨酸酶之吸光值，而所得之结果则如第3表以及第13图之所示。
第3表
由第3表以及第13图之结果得知，所有大叶罗汉松之萃取物对于抑制酪氨酸酶都与浓度成正相关。
人体内酪氨酸酶扮演黑色素生合成过程中重要的角色，催化酪胺酸生合成黑色素中间数个重要的步骤。实施例十系以酪氨酸酶催化酪胺酸形成黑色素，藉此比较各大叶罗汉松之萃取物抑制此反应的能力。由第1表以及第11图之结果得知，2，3-二氢金松双黄酮以及2，3-二氢-4′，4-二甲氧基穗花杉双黄酮之活性较佳，其次为金松双黄酮以及异银杏黄素。相较于实施例九之超氧自由基抑制作用的结果，本发明大叶罗汉松之萃取物对于酪氨酸酶抑制作用的结果与实施例九之结果相似。
实施例十一将实施例一至实施例三所得之大叶罗汉松之粗萃取物、水层萃取物、乙酸乙酯层萃取物以及第一萃取物至第四萃取物，连同儿茶素与槲皮酮，分别以100μg/mL之浓度添加至细胞培养液中，经细胞密度约1×105/孔之人类皮肤纤维母细胞(ATCC CRL-1502)于24孔盘中培养2天后，换成无血清之培养液再继续培养一天，然后取上清液进行酪蛋白/明胶酶谱(Casein/Gelatin Zymography)之分析。
由于酶谱系用来分析基质金属蛋白酶之活性，其中基质金属蛋白酶-1与基质金属蛋白酶-9系分别以酪蛋白与明胶为受质(Substrate)。基质金属蛋白酶-1以及基质金属蛋白酶-9会作用于前述受质上并将之切成大小不等之片段，在藉由后续凝胶电泳分析中，藉由观察上述片段之产生，而得知基质金属蛋白酶之活性。
接下来，以大叶罗汉松之萃取物经细胞培养后之上清液进行酪蛋白/明胶酶谱之分析。制作凝胶时，首先制备含最终浓度1.0mg/ml之酪蛋白或明胶的约10％硫酸十二酯钠-聚丙烯胺凝胶(Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide GelElectrophoresis；SDS-PAGE)为分离胶体(Separating Gel)，并于其上覆盖约4％SDS-PAGE之焦集胶体(Stacking Gel)后，然后将样品混合液与5倍浓缩染剂[溴酚蓝(Bromophenol Blue)与甘油混合溶液]以1∶4之体积比均匀混合，在室温下静置10分钟。之后，取20μL至30μL加入至含酪蛋白或明胶之电泳胶片中，以200V电压进行电泳分析约1.5小时。上述各凝胶的配制已为此技术领域中任何具有通常知识者所熟知，故不另赘述。待染剂移动到凝胶底部边缘后，取出胶片，依序以清洗缓冲液1(Washing Buffer 1；含2.5％Triton X-100以及3mM NaN3)、清洗缓冲液2(含2.5％TritonX-100、3mM NaN3以及50mM Tris Cl，pH 7.5)、清洗缓冲液3(含1μMZnCl2、3mM NaN3、5mM CaCl2以及50mM Tris Cl，pH 7.5)以及清洗缓冲液4(含3mM NaN3、5mM CaCl2、1μM ZnCl2以及50mM Tris Cl，pH 7.5)，在室温摇晃冲洗各20分钟后，再以新鲜的清洗缓冲液4在37℃培养1至24小时。接着，以另一染剂(Commassie Brilliant Blue)染色约30分钟后，利用去染色溶液将胶片脱色后即可分析，而所得之结果则如第14A图以及第14B图之所示。
就保护皮肤观点而言，抑制基质金属蛋白酶-1及/或基质金属蛋白酶-9会有皮肤抗皱的效果，目前已知维生素A酸(Retinoic Acid)、基质金属蛋白酶组织抑制分子-1(TIMP-1)等具有抑制基质金属蛋白酶-1的效用。请参阅第14A图，其系显示本发明实施例一至实施例三所得之大叶罗汉松之萃取物抑制基质金属蛋白酶-1活性之酪蛋白酶谱分析结果，由左至右依序分别为蛋白质标记(即第1行)、大叶罗汉松之粗萃取物(即第2行)、水层萃取物(即第3行)、乙酸乙酯层萃取物(即第4行)、加入儿茶素之基质金属蛋白酶-1(即第5行)、加入檞皮酮之基质金属蛋白酶-1(即第6行)、加入2，3-二氢金松双黄酮之基质金属蛋白酶-1(即第7行)、加入金松双黄酮之基质金属蛋白酶-1(即第8行)、加入2，3-二氢-4′，4-二甲氧基穗花杉双黄酮之基质金属蛋白酶-1(即第9行)以及加入异银杏黄素之基质金属蛋白酶-1(即第10行)之凝胶电泳分析结果。上述儿茶素以及槲皮酮可经由大叶罗汉松之水层萃取物进一步分离而得，而大叶罗汉松之第一萃取物至第四萃取物系经由大叶罗汉松之乙酸乙酯层萃取物进一步分离而得。由于基质金属蛋白酶-1会分解酪蛋白，因此被分解的酪蛋白就无法经由另一染剂(Commassie Brilliant Blue)染色，经脱色后于箭头所指约52kDa处的基质金属蛋白酶-1会呈现透明带状，而当待测物越能抑制基质金属蛋白酶-1活性时，透明带状则越不明显。因此由第14A图得知，大叶罗汉松之粗萃取物、乙酸乙酯层萃取物、2，3-二氢金松双黄酮、2，3-二氢-4′，4-二甲氧基穗花杉双黄酮以及异银杏黄素对于基质金属蛋白酶-1均有很显著的抑制效果。在本发明之四种萃取物中，2，3-二氢-4′，4-二甲氧基穗花杉双黄酮以及异银杏黄素之抑制活性又比2，3-二氢金松双黄酮以及金松双黄酮还要好，而这四种萃取物之间的差异在于2，3-二氢金松双黄酮以及金松双黄酮这组比2，3-二氢-4′，4-二甲氧基穗花杉双黄酮以及异银杏黄素少了第7位置上的甲氧基，因此推测对双黄酮类而言，第7位置的甲氧基可能会影响对于基质金属蛋白酶-1的抑制活性。
接下来，请参阅第14B图，其系显示本发明实施例一至实施例三所得之大叶罗汉松之萃取物抑制基质金属蛋白酶-9活性之明胶酶谱分析结果，由左至右依序分别为蛋白质标记(即第1行)、大叶罗汉松之粗萃取物(即第2行)、水层萃取物(即第3行)、乙酸乙酯层萃取物(即第4行)、加入儿茶素之基质金属蛋白酶-1(即第5行)、加入檞皮酮之基质金属蛋白酶-1(即第6行)、加入2，3-二氢金松双黄酮之基质金属蛋白酶-1(即第7行)、加入金松双黄酮之基质金属蛋白酶-1(即第8行)、加入2，3-二氢-4′，4-二甲氧基穗花杉双黄酮之基质金属蛋白酶-1(即第9行)以及加入异银杏黄素之基质金属蛋白酶-1(即第10行)之凝胶电泳分析结果。由于基质金属蛋白酶-9会分解明胶，因此被分解的明胶就无法经由另一染剂(Commassie Brilliant Blue)染色，经脱色后于箭头所指约92kDa处的基质金属蛋白酶-9会呈现透明带状，而当待测物越能抑制基质金属蛋白酶-9活性时，透明带状则越不明显。因此由第14B图得知，大叶罗汉松之粗萃取物、乙酸乙酯层萃取物、2，3-二氢金松双黄酮、2，3-二氢-4′，4-二甲氧基穗花杉双黄酮以及异银杏黄素对于基质金属蛋白酶-9均有很显著的抑制效果。在本发明之四种萃取物中，2，3-二氢-4′，4-二甲氧基穗花杉双黄酮以及异银杏黄素之抑制活性又比2，3-二氢金松双黄酮以及金松双黄酮还要好。
实施例十二将实施例一至实施例三所得之大叶罗汉松之第一萃取物至第二萃取物连同儿茶素与檞皮酮，分别以100μg/mL之浓度添加至细胞培养液中，经细胞密度约1×105/孔之人类皮肤纤维母细胞(ATCC CRL-1502)于24孔盘培养2天后，换成无血清之培养液再继续培养一天，然后取上清液进一步进行酪蛋白/明胶酶谱之分析，其步骤如实施例十一之所述。
请参阅第15A图，其系显示本发明实施例一至实施例三所得之大叶罗汉松之萃取物抑制基质金属蛋白酶-1活性之酪蛋白酶谱分析结果，箭头所指约52kDa处为基质金属蛋白酶-1，而由左至右依序分别为蛋白质标记(即第1行)、大叶罗汉松之粗萃取物(即第2行)、加入儿茶素之基质金属蛋白酶-1(即第3行)、加入檞皮酮之基质金属蛋白酶-1(即第4行)、加入2，3-二氢金松双黄酮之基质金属蛋白酶-1(即第5行)以及加入金松双黄酮之基质金属蛋白酶-1(即第6行)之凝胶电泳分析结果。由第15A图得知，儿茶素、檞皮酮以及金松双黄酮对于基质金属蛋白酶-1均有显著的抑制效果，然以金松双黄酮之抑制效果较为显著。
请参阅第15B图，其系显示本发明实施例一至实施例三所得之大叶罗汉松之萃取物抑制基质金属蛋白酶-9活性之明胶酶谱分析结果，箭头所指约92kDa处为基质金属蛋白酶-9，而由左至右依序分别为蛋白质标记(即第1行)、大叶罗汉松之粗萃取物(即第2行)、加入儿茶素之基质金属蛋白酶-1(即第3行)、加入檞皮酮之基质金属蛋白酶-1(即第4行)、加入2，3-二氢金松双黄酮之基质金属蛋白酶-1(即第5行)以及加入金松双黄酮之基质金属蛋白酶-1(即第6行)之凝胶电泳分析结果。由第15B图得知，儿茶素、檞皮酮、2，3-二氢金松双黄酮以及金松双黄酮对于基质金属蛋白酶-9均有很显著的抑制效果。
实施例十三将实施例一至实施例三所得之大叶罗汉松之第一萃取物至第四萃取物连同儿茶素与檞皮酮，分别配制成100μg/mL或50μg/mL之浓度，进一步进行弹性蛋白水解酶之抑制活性测试。
首先，在96孔盘中分别加入50μL之样品、1X反应缓冲液(Raction Buffer)作为负对照组(Negative Control)，或以0.01mM之N-甲氧基丁二醯-丙胺酸-丙胺酸-脯胺酸-缬胺酸-氯甲基酮(N-Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-Chloromethyl Ketone)作为正对照组(Positive Control)。之后加入50μL之100μg/mL DQ弹性蛋白，其最终浓度为25μg/mL。加入100μL弹性蛋白水解酶(0.5U/mL)，使其最终浓度为0.25U/mL。在室温反应2小时后，以激发波长485nm及发散波长520nm测萤光强度(FLUO StarOptima；BMG Labtechnologies)，并依下式(XI)计算各萃取物之弹性蛋白水解酶之抑制率，而所得结果如第4表以及第5表之所示抑制率(％)＝(样品之萤光强度-负对照组之萤光强度)/负对照组之萤光强度×100％(XI)
第4表
第5表
第4表以及第5表之结果显示，大叶罗汉松之粗萃取物、乙酸乙酯层萃取物、水层萃取物、儿茶素、檞皮酮、2，3-二氢金松双黄酮、金松双黄酮、2，3-二氢-4′，４-二甲氧基穗花杉双黄酮以及异银杏黄素对于弹性蛋白水解酶均有很显著的抑制效果，然以2，3-二氢-4′，4-二甲氧基穗花杉双黄酮对于弹性蛋白水解酶之抑制较果较为显著。
由上述数个实施例可知，应用本发明之罗汉松属萃取物，其优点在于本发明之罗汉松属萃取物为至少一双黄酮类化合物且利用有机溶液萃取而得。由于此双黄酮类化合物具有抗皮肤老化、皮肤美白以及皮肤抗皱之功效，因此可作为活性成分以添加至皮肤用化妆品或皮肤用医药品中。
由上述本发明较佳实施例可知，应用本发明之罗汉松属萃取物的制造方法，其优点在于利用有机溶液以及凝胶层析法萃取罗汉松属植物之叶片，藉以获得含有至少一双黄酮类化合物之罗汉松属萃取物。由于本发明之罗汉松属萃取物具有抗皮肤老化(清除氢氧自由基、清除超氧自由基)、皮肤美白(抑制酪氨酸酶活性)以及皮肤抗皱(抑制基质金属蛋白酶活性)之功效，因此可作为活性成分以添加至皮肤用化妆品或皮肤用医药品中。
虽然本发明已以数个较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，此技术领域中具有通常知识者，在不脱离本发明之精神和范围内，当可作各种之更动与润饰，因此本发明之保护范围当视后附之申请专利范围所界定者为准。
第1图系绘示根据本发明之一较佳实施例之罗汉松属萃取物之制程流程图；第2图系绘示根据本发明实施例一至实施例三之罗汉松属萃取物之制程流程图；第3图系显示根据实施例一所得之大叶罗汉松之第一萃取物之1H-NMR光谱；第4图系显示根据实施例一所得之大叶罗汉松之第一萃取物之13C-NMR光谱；第5图系显示根据实施例一所得之大叶罗汉松之第二萃取物之1H-NMR光谱；
第6图系显示根据实施例一所得之大叶罗汉松之第二萃取物之13C-NMR光谱；第7图系显示根据实施例一所得之大叶罗汉松之第三萃取物之1H-NMR光谱；第8图系显示根据实施例一所得之大叶罗汉松之第三萃取物之13C-NMR光谱；第9图系显示根据实施例一所得之大叶罗汉松之第四萃取物之1H-NMR光谱；第10图系显示根据实施例一所得之大叶罗汉松之第四萃取物之13C-NMR光谱；第11图系绘示根据本发明实施例一至实施例三之罗汉松属萃取物清除氢氧自由基之测试结果；第12图系绘示根据本发明实施例一至实施例三之罗汉松属萃取物清除超氧自由基之测试结果；第13图系绘示根据本发明实施例一至实施例三之罗汉松属萃取物抑制酪氨酸酶活性之测试结果；第14A图系显示根据本发明实施例一至实施例三之罗汉松属萃取物之抑制基质金属蛋白酶-1活性之测试结果；第14B图系显示根据本发明实施例一至实施例三之罗汉松属萃取物之抑制基质金属蛋白酶-9活性之测试结果；第15A图系显示根据本发明实施例一至实施例三之罗汉松属萃取物之抑制基质金属蛋白酶-1活性之另一测试结果；以及第15B图系显示根据本发明实施例一至实施例三之罗汉松属萃取物之抑制基质金属蛋白酶-9活性之另一测试结果。
附图标记说明101萃取过滤步骤 102粗萃取物103部份划分步骤105第一有机溶剂层萃取物106水层萃取物107第一分离步骤109第一层析管柱 111第二有机溶剂萃取物113第二分离步骤 115第二层析管柱117逆相层析管柱 119罗汉松属萃取物201萃取步骤 203过滤步骤
204粗萃取物 205部份划分步骤207乙酸乙酯层萃取物 209水层萃取物211第一分离步骤 213第一层析管柱214甲醇萃取物 215第一部分217第二部分 219第三部份221第四部分 223第五部分225第二分离步骤 231第二层析管柱233逆相层析管柱 241第一萃取物243第二萃取物 245第三萃取物247第四萃取物
权利要求
1.一种罗汉松属萃取物，这种罗汉松属萃取物为至少一种双黄酮类化合物且利用有机溶液萃取而得，其中双黄酮类化合物的结构如下式(I)所示 其中该R1基团结构式如式(II)或式(III)所示
2.如权利要求1所述的罗汉松属萃取物，其中R2基团为甲氧基(H3CO-)或烃基(HO-)。
3.如权利要求1所述的罗汉松属萃取物，其中有机溶液选自由甲醇、水及其上述物质的任意组合所组成的族群。
4.如权利要求1所述的罗汉松属萃取物，其中有机溶液为80体积百分比的甲醇溶液。
5.如权利要求1所述的罗汉松属萃取物，其中罗汉松属萃取物萃取自罗汉松属植物的叶片。
6.如权利要求5所述的罗汉松属萃取物，其中罗汉松属植物选自于由大叶罗汉松(Podocarpus macrophyllus var.macrophyllus)、兰屿罗汉松(Podocarpus costalis presl)、桃实百日青(Podocarpus nakaii Hayata)以及丛花百日青(Podocarpus fasciculus deLaubenfels)所组成的族群。
7.如权利要求1所述的罗汉松属萃取物，其中双黄酮类化合物具有清除氢氧自由基的功效。
8.如权利要求1项所述的罗汉松属萃取物，其中双黄酮类化合物具有清除超氧自由基的功效。
9.如权利要求1所述的罗汉松属萃取物，其中双黄酮类化合物具有抑制酪氨酸酶活性的功效。
10.如权利要求1所述的罗汉松属萃取物，其中双黄酮类化合物具有抑制基质金属蛋白酶-1、抑制基质金属蛋白酶-9以及弹性蛋白水解酶活性的功效。
11.如权利要求1所述的罗汉松属萃取物，其中双黄酮类化合物为一种添加至一皮肤用化妆品或一皮肤用医药品中的活性成分。
12.一种罗汉松属萃取物的制造方法，至少包含进行萃取过滤步骤，利用有机溶液萃取并过滤罗汉松属植物的叶片，以获得粗萃取物；利用第一有机溶剂对粗萃取物进行部份划分(Partitioning)步骤，以获得第一有机溶剂层萃取物以及水层萃取物；进行第一分离步骤，将第一有机溶剂层萃取物通过第一层析管柱并以第二有机溶剂冲提后，收集第二有机溶剂萃取物；以及进行第二分离步骤，将第二有机溶剂萃取物至少通过逆相层析管柱，以获得罗汉松属萃取物，其中罗汉松属萃取物为至少一种双黄酮类化合物，且此种双黄酮类化合物的结构式如下式(I)所示 其中R1基团的结构式如式(II)或式(III)所示
13.如权利要求12所述的罗汉松属萃取物的制造方法，其中罗汉松属选自于由大叶罗汉松(Podocarpus macrophyllus var.macrophyllus)、兰屿罗汉松(Podocarpuscostalis presl)、桃实百日青(Podocarpus nakaii Hayata)以及丛花百日青(Podocarpusfasciculus de Laubenfels)所组成的族群。
14.如权利要求12所述的罗汉松属萃取物的制造方法，其中有机溶液选自于由甲醇、水及其上述的任意组合所组成的族群。
15.如权利要求12所述的罗汉松属萃取物的制造方法，其中有机溶液为80体积百分比的甲醇溶液。
16.如权利要求12所述的罗汉松属萃取物的制造方法，其中萃取过滤步骤还至少包含利用粉碎装置打碎罗汉松属的叶片后，将打碎的叶片浸于有机溶液中；以及利用过滤装置过滤含有打碎的叶片的有机溶液。
17.如权利要求16所述的罗汉松属萃取物的制造方法，其中过滤装置选自由纱布、滤纸及其上述的任意组合所组成的族群。
18.如权利要求12所述的罗汉松属萃取物的制造方法，其中第一有机溶剂为乙酸乙酯。
19.如权利要求12所述的罗汉松属萃取物的制造方法，其中第一层析管柱为Sephadex LH-20层析管柱。
20.如权利要求12所述的罗汉松属萃取物的制造方法，其中第二有机溶剂为甲醇。
21.如权利要求12所述的罗汉松属萃取物的制造方法，其中逆相层析管柱为Biosil 5 ODS-W逆相层析管柱。
22.如权利要求12所述的罗汉松属萃取物的制造方法，其中第二有机溶剂萃取物至少分成第一部分、第二部分以及第三部分。
23.如权利要求22所述的罗汉松属萃取物的制造方法，其中第一部分以及第三部份在进行第二分离步骤前，至少包含将第一部分以及第三部份通过第二层析管柱。
24.如权利要求23所述的罗汉松属萃取物的制造方法，其中第一部分通过的第二层析管柱为MCI凝胶层析管柱。
25.如权利要求23所述的罗汉松属萃取物的制造方法，其中第三部分通过的第二层析管柱为Sephadex LH-20层析管柱。
26.如权利要求12所述的罗汉松属萃取物的制造方法，其中R2基团为甲氧基(H3CO-)或烃基(HO-)。
27.如权利要求12所述的罗汉松属萃取物的制造方法，其中双黄酮类化合物具有清除氢氧自由基的功效。
28.如权利要求12所述的罗汉松属萃取物的制造方法，其中双黄酮类化合物具有清除超氧自由基的功效。
29.如权利要求12所述的罗汉松属萃取物的制造方法，其中双黄酮类化合物具有抑制酪氨酸酶活性的功效。
30.如权利要求12所述的罗汉松属萃取物的制造方法，其中双黄酮类化合物具有抑制基质金属蛋白酶-1、抑制基质金属蛋白酶-9以及弹性蛋白水解酶活性的功效。
31.如权利要求12所述的罗汉松属萃取物的制造方法，其中双黄酮类化合物是一种添加至皮肤用化妆品或皮肤用医药品中的活性成分。
全文摘要
一种罗汉松属萃取物及其制造方法，利用有机溶液以及凝胶层析法萃取罗汉松属的叶片，来获得罗汉松属萃取物，其中罗汉松属萃取物为至少一种双黄酮类化合物。由于本发明的罗汉松属萃取物具有抗皮肤老化、皮肤美白以及皮肤抗皱的功效，因此可作为活性成分添加至皮肤用化妆品或皮肤用医药品中。
文档编号A61P39/06GK1800171SQ20041008187
公开日2006年7月12日 申请日期2004年12月31日 优先权日2004年12月31日
发明者李美贤, 郑可大, 陈世辉, 吕思洁 申请人:台盐实业股份有限公司