专利名称：以左手香萃取物治疗发炎及发炎相关疾病之组合物及方法
以左手香萃取物治疗发炎及发炎相关疾病之组合物及方法相关申请案本揭示内容纳入参考美国暂时申请案第60/973，164号(2007年9月17日申请) 并主张其巴黎公约优先权。
背景技术：
左手香(Plectranthus amboinicus (PA))是一种用于咳嗽、喉咙痛、及鼻塞之传统 中药，但其亦可用于诸多其它病症，诸如，感染、风湿、及胃胀气。尽管PA之化学组成已有广 泛之研究，其用于抑制AP-1结合之活性成分却尚未获得报告。转录因子活化蛋白-l(AP-l)借着结合位于目标基因启动子区域中之共有的DNA 辨识序列TGA(C/G)TCA(亦称为TPA反应组件(TRE))而调控各种不同基因之表现。在哺乳 动物细胞中，AP-1复合物主要是由Fos及Jim相关蛋白之成员而形成。AP-1蛋白含有称为 bZIP域之特征性胺基酸序列。此蛋白域有两个部份；其含有螺旋构形并可作为二聚化之界 面。与两个bZIP域之N-端基础区域并列之两个白胺酸重复序列间的作用可形成能够结合 DNA之二聚体。试管内之试验指出，Fos家族之一成员与Jim类别之一成员可形成稳定之异 源二聚体。Jun同源二聚体可在试管中形成；但其在生理条件下并不稳定。Fos同源二聚体 尚未见于正常之实验条件下。试管内之结合及转录实验指出，Fos-Jim异源二聚体是AP-1 蛋白之主要活性种类。AP-1之活化后会有某些基因之表现增加，这是诸多细胞反应后段步骤的调控机 制，诸如，发炎、应激反应、细胞分化、以及肿瘤新生。因此，抑制AP-1-DNA复合物之形成为 降低发炎及癌症进程的方法之一。AP-1之活性已被认为涉及数种自体免疫疾病，诸如，大肠 炎、红斑性狼疮、以及类风湿性关节炎。一般而言，发炎信号传导途径会造成数种转录因子之活化，包括AP-1，其接着会活 化免疫细胞并诱发特定细胞之分化。在类风湿性关节炎之滑膜中发现AP-1之显著增加表 现及高DNA结合活性。此外，c-fos之过表现会造成滑膜细胞之过度生长以及关节炎性关 节破坏。此等观察结果引出调控AP-1之DNA结合活性可能可降低疾病中之发炎进展的假 设。事实上，投与诱捕性AP-1寡核苷酸已证实可降低胶原诱发性关节炎，并可减少小鼠实 验性大肠炎中之肠发炎情形。基于此等观察结果，此领域已针对炎性疾病以及癌症致力研发AP-1抑制剂。AP-1 结合活性之强力抑制剂姜黄素已被证实具有抗癌活性，且可抑制蚀骨细胞新生作用并激发 蚀骨细胞之凋亡。Jun/Fos 二聚体形成及AP-1-DNA结合之强抑制剂地肤子皂苷I (Momordin I)可借着诱发细胞凋亡而抑制癌细胞之增殖。发炎作用广泛涉及诸多人类之急性及慢性疾病，包括过敏、关节炎、牙龈炎、及大 部分名称以「-itis (炎)」结尾之疾病。发炎通常由组织之损伤起始，并接着将免疫细胞吸 引至损伤区域以促进复原。发炎可保护身体，但是，如该发炎反应不平衡并超出其所处理之 威胁，其亦会损伤身体。抗炎药物可潜在用于自体免疫疾病、类风湿性关节炎(RA)、过敏、 癌症、心脏病、及关节硬化。RA是一种由增高之T细胞活性中介的炎性疾病，且其特征为滑膜炎以及因为过量之软骨下蚀骨细胞性骨吸收而造成之关节周围骨的侵蚀及关节破坏。RA 之治疗性管理已将焦点放在研发出可阻断细胞因子信号传导之抗炎药物。目前之治疗为 NSAIDs (非类固醇抗炎药物)、皮质类固醇、及DMARDs (疾病修饰抗风湿病药物)(诸如，胺 甲蝶呤)、TNF抑制剂、以及Actemraaocilizumab)( 一种人源化抗人间白素_6 (IL-6)受体 单株抗体)。发炎是一种组织对于损伤之反应。其可经由诸多不同细胞因子的调控而吸引免疫 细胞进行修复，该等细胞因子主要是由NF- k B、AP-1、及NFAT、以及STAT家族的转录因子活 化。活化蛋白-l(AP-l)是一种转录因子，其在细胞循环中受到活化以促进细胞之存活、分 化、及适应性反应。近来证实，AP-1之活性涉及发炎之信号传导，因此建议AP-1可作为干 扰发炎相关性疾病之新颖标的。
发明内容
左手香(Plectranthus amboinicus (PA))之粗萃取物具有抗发炎之效应，且可在 试管内抑制AP-1之结合。与PA粗萃取物之共置可在HUVEC细胞中显著抑制IL-6、IL-12、 MCP-1、及RANTES之LPS-诱发性表现。在使用制备性HPLC对该粗萃取物进一步进行分级分 离后，辨识出级份8、9、10、及11可抑制AP-1结合活性。级份8之活性组成份为Mena 987； 级份9为Mena 998 ；级份10为Mena 9102 ；而级份11为迷迭香酸及合成之迷迭香酸类似 物。其它化合物亦显示具有抑制活性。此等化合物对于AP-1活性具有抑制效应，且可作为 预防剂或疗剂而用于其中涉及AP-1之过量表现或活性的疾病。根据本发明之特点，其揭示一种组合物，该组合物包含左手香萃取物以及医药可 接受之载体。根据本发明之特点，其揭示一种方法，该方法包含提供至少含有左手香萃取物以 及医药可接受之载体的组合物，以治疗有效量投与至有需要的病患。根据本发明之特点，其揭示一种方法，该方法包含制备重组Fos-Jim复合物，其中 该Fos-Jim复合物是由具有Fos基因及Jim基因以及与该Fos基因相关之第一标记基因及 与该His基因相关之第二标记基因的载体制备，其中该第一标记基因与该第二标记基因不 同；以一标记对该载体之基因产物进行第一筛选而筛选Fos-Jim复合物，以产生经部份筛 选之基因产物组；再以另一标记筛选该经部份筛选之基因产物组，以分离该Fos-Jim复合 物。本发明揭示一种用于治疗发炎或发炎相关性病症之方法。该方法包含下列步骤 提供至少含有左手香萃取物的组合物，并将治疗有效量之该组合物投与至有需要的病患。在本发明之另一态样中，其揭示一种用于治疗发炎或发炎相关性病症之方法。该 方法包含下列步骤提供包含具有下列通式结构之化合物的组合物 并将治疗有效量之该组合物投与至有需要的病患。
本发明揭示一种用于治疗发炎或发炎相关性病症之组合物。该组合物包含左手香 萃取物。在本发明之另一态样中，其揭示一种用于治疗发炎或发炎相关性病症之组合物。 该组合物包含具有下列通式结构之化合物 本发明系关于左手香(PA)萃取物，其活性成分(迷迭香酸、Mena 987,Mena 998、 Mena 9102)，诸等合成之迷迭香酸类似物，以及其于AP_1之抑制及治疗发炎相关性疾病之 用途。在一态样中，该左手香(PA)萃取物显示具有AP-1复合物之抑制活性。此等AP-1 复合物可由0几11、几1^、几110、(；寸08、？08-8、？仪-1、或？仪-2形成，但不限于此。在一态样中，本发明提供左手香萃取物。该萃取物含有(或基本上由其构成)以 重量计0.5-1. 2%之迷迭香酸、以重量计0.05-0. 之Mena 987、以重量计0. 05-0. 之 Mena 998、以及以重量计0. 05_0. 之Mena 9102。特定言之，该萃取物可包括(或基本上 由其构成)以重量计0.89%之迷迭香酸、以重量计0.06%之Mena 987、以重量计0. 09%之 Mena 998、以及以重量计0. 08%之Mena 9102。该萃取物可含有(或基本上由其构成)以 重量计至少30%之多酚。本发明之左手香萃取物可由，如，干燥之左手香叶汁粉的RPC18-HPLC纯化，并使 用G13658UV/VIS侦测器在214nm监测所有样本而制备。该制备PA萃取物之方法系在本发 明之范围中。本发明亦提供一种用于进行AP-1抑制检定之方法，以评估左手香萃取物成分之 活性。
上述本发明之特点以及标的将可在参照下列之叙述并结合附呈之图式时更为明 了，在该等图式中，类似之参照编号代表类似之组件，且其中图1是显示左手香(PA)萃取物抑制效应的具体实施例之实验数据的柱状图；图2是左手香萃取物分级分离的具体实施例之HPLC图；图3是CHM9102之NMR光谱图；图4显示CHM9102及迷迭香酸之化学结构以及显示抑制效应之柱状图；图5是显示左手香萃取物AP-1抑制活性的具体实施例之实验数据图；图6是显示左手香萃取物可抑制由各种不同组成份蛋白所形成之AP-1复合物的 具体实施例之实验数据图；图7是显示基因X及Y在双顺反子表现系统中之共表现的具体实施例之实验数据 的示意图；图8是显示重组Fos-Jim复合物由细菌细 进行单一步骤纯化的具体实施例之实验数据的实验结果；图9是显示针对AP-1DNA结合活性之分析发展的具体实施例的实验数据图；图10是本发明化合物合成的具体实施的流程图；图11是本发明化合物合成的具体实施的流程图；图12是本发明化合物合成的具体实施的流程图；图13是本发明化合物合成的具体实施的流程图；图14是本发明化合物合成的具体实施的流程图；图15是本发明化合物合成的具体实施的流程图；图16是本发明化合物合成的具体实施的流程图。
具体实施例方式在下列本发明具体实例之详述中，其参照附呈之图式，其中类似之参照数目代表 类似之组件，且其中系以说明方式显示可实施本发明之特定具体实例。此等具体实例系以 足够之细节进行叙述，以使一般技艺人士可据以实施本发明，且需明了者，可使用其它具体 实例，且可在不偏离本发明范围之情形下进行逻辑、机械、生物、电学、功能、及其它之改变。 下文之详述因此不应被视为任何限制，而本发明之范围仅由附呈之权利要求定义。在本文 中，「或」乙辞应被视为一种论理上之选言，且不应被视为一种排他性选言，除非其明示为 此，或被标示为「或不」(xor)乙辞。本发明系关于抗炎组合物。该等方法及组合物是用于治疗发炎以及治疗及预防发 炎相关性疾病、病症、及症状。发炎相关性病症包括，但不限于，自体免疫疾病、关节炎、过敏、癌症、心脏病、中 风、关节硬化、及阿兹海默症。自体免疫疾病包括急性急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、僵直性 脊椎炎(AS)、乳糜泻、克隆氏症、吉兰-巴雷氏症候群(Guillain-Barre syndrome (GBS))、 桥本氏症、视神经炎、Ord氏甲状腺炎、类风湿性关节炎、及颞动脉炎。根据本发明，其提供一种用于治疗发炎及发炎相关性病症之方法。该方法包含下 列步骤提供至少含有左手香萃取物的组合物，并将治疗有效量之该组合物投与至需要病 患。根据具体实施，本发明之一种特定左手香品种为台湾岛屿之特有种。在本发明之另一态样中，其提供一种用于治疗发炎及发炎相关性病症之组合物。 该组合物包含左手香萃取物。名辞「左手香」或「PA」系指左手香植物，其亦包括来自其之任何组织、部分、或级 份，或是其任何制备物，包括勻质物、悬浮液、滤液、过滤残余物、及溶液。左手香之其它名称 包括古巴奥勒网、西班牙百里香、印度琉璃苣、墨西哥百里香、及墨西哥薄荷。名辞「萃取物」系指借着由指定物质萃取而取得任何固体、黏稠体、及液体物质。在 本发明中，左手香萃取物包括由左手香之植物组织萃取之任何固体、黏稠体、及液体物质。熟习技艺者已知并使用各种不同的萃取方法及流程。此等方法及流程包括物理及 化学流程两者，包括使用溶剂、蒸馏、渗滤、及超临界流体萃取。萃取物可如所需进一步进行 过滤或浓缩。在一实例中，左手香萃取物系藉由研磨勻质化之左手香植物组织并以离心澄 清该粗萃取物而取得。在例示性的具体实施中，该左手香萃取物可抑制下列至少一者IL_6、IL-12、MCP-1、及RANTES的表现。对于IL-6、IL-12、MCP-1、及RANTES之抑制至少扮演着抗发炎的 角色。在部分例示性的具体实施中，该左手香萃取物可抑制AP-1结合活性。AP-1结合活性之抑制涉及预防及治疗与AP-1之过量表现或活性相关的疾病，例如，炎性疾病及免疫疾病。在本发明一态样中，其提供一种用于治疗发炎及发炎相关性病症之方法。该方法 包含下列步骤将左手香萃取物过滤成为至少一个级份，提供具有至少一个该等左手香萃 取物级份之组合物，并将治疗有效量之该组合物投与至有需要的病患。在本发明一态样中，其提供一种用于治疗发炎及发炎相关性病症之组合物。该组 合物包含至少一个左手香萃取物之级份。在例示性的具体实施中，该左手香萃取物级份可抑制下列至少一者IL-6、IL-12、 MCP-1、及RANTES的表现。在部分例示性的具体实施中，该左手香萃取物级份可抑制AP-1 结合活性。名辞「级份」系指一物质的可分离性组成份之一。级份是根据个别组成份之特定 特性的差异而收集。在例示性的具体实施中，级份是由其在特定波长下之光学吸收值而辨 识。名辞「过滤」是指用于将物质的某一组成份与该物质之其它组成份分离的任何流 程。熟习技艺者已知并使用各种不同的过滤方法及流程。此等方法及流程包括透析、凝胶 过滤层析、及高效液相层析(HPLC)。在一实例中，左手香萃取物系使用C-18管柱过滤。过滤之流程可重复进行多次，其中所收集到之一或多个级份可进一步进行过滤以 产生额外之级份。在例示性的具体实施中，其将左手香萃取物之一个经过滤之级份再次过 滤成为更多个级份，以进一步分离该左手香萃取物之组成份。在一实例中，该经过滤之级份 系以C-18管柱，使用具有0. 三氟乙酸之由2%乙腈至90%乙腈的溶剂梯度进行过滤。在本发明之例示性具体实施中，一个左手香萃取物级份，其在本文中称为「F10」或 「级份10」，含有一种C18H17N08化合物，其在本文中称为「CHM9102」，具有下列通式结构 根据具体实例，其提供一种用于治疗发炎或发炎相关性病症之方法。该方法包含 下列步骤提供包含具有下列通式结构之化合物的组合物 并将治疗有效量之该组合物投与至有需要的病患。根据具体实例，其提供一种用于治疗发炎或发炎相关性病症之组合物。该组合物 包含具有下列通式结构之化合物 在例示性的具体实施中，该CHM9102化合物可抑制下列至少一者IL_6、IL-12、 MCP-1、及RANTES的表现。在部分例示性的具体实施中，CHM9102可抑制AP-1结合活性。根据例示性的具体实施，组合物可为各种不同的形式，包括粉末、乳霜、凝胶、油 膏、软膏、溶液、锭剂、胶囊、喷雾、及贴布。可使用载剂及载体而将该组合物投与至病患。此 等载体包括助溶剂、稀释剂、及分散基质。此等载体为生物可兼容、医药可接受者，且其不会 改变该左手香萃取物或CHM9102化合物之治疗特征。亦可在该组合物中包括赋形剂、佐剂、 及其它成分。该组合物应在制造及贮存过程中为安定。该左手香萃取物或CHM9102化合物可以 诸如单硬脂酸铝、明胶、以及生物可降解性及生物可兼容性之聚合物的试剂进行包囊，以防 止在体内或是由该组合物之其它成分产生不想要的降解。亦可在该组合物中包括抗菌及抗 真菌剂，诸如，苯甲醇、对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、及硫柳汞。该组合物之投与可经由各种不同的方法达成而到达体内之不同部分，包括静脉、 皮内、皮下、口服(如，吸入)、穿皮(亦即，局部)、穿黏膜、以及直肠投与。在例示性的具体实施中，该组合物系一种经由肠外、皮内、或皮下注射之溶液或悬 浮液。载体包括水、盐水溶液、及其它合成溶剂。可使用诸如醋酸盐、柠檬酸盐、及磷酸盐之 缓冲剂，以及用以调整渗透度之试剂，诸如，氯化钠及葡萄糖，以及用以调整PH之试剂，诸 如，盐酸及氢氧化钠。在其它例示性的具体实施中，该组合物系一种营养补充品。营养补充品可制备为 各种不同的形式，包括固体、液体、及粉末形式。该组合物可以丸剂、锭剂、或包囊之凝胶形 式独立服用，或者可以食品添加物、饮料、或可混合性粉末的形式使用。名辞「治疗有效量」系指可以能够应用于任何医药治疗之合理效益/风险比而产 生某些所欲效应的量。该有效量可根据诸等因子而各异，诸如，待治疗之疾病或病况、待投 与之特定靶向建构物、该对象之尺寸、或该疾病或病况之严重性。熟习技艺者可在不须过度 实验之情形下以经验判定特定化合物之有效量。根据本发明之另一态样，可使用CHM9102类似物取代CHM9102而用于治疗发炎及 发炎相关性病症。在例示性的具体实施中，可使用CHM9102类似物(其在本文中称为「迷迭 香酸」)取代CHM9102。该迷迭香酸具有下述之通式结构 根据具体实施，其提供一种用于治疗发炎或发炎相关性病症之方法。该方法包含 下列步骤提供包含具有下列通式结构之化合物的组合物
并将治疗有效量之该组合物投与至有需要的病患。根据具体实施，其提供一种用于治疗发炎或发炎相关性病症之组合物。该组合物 包含具有下列通式结构之化合物 在例示性的具体实施中，该迷迭香酸化合物可抑制下列至少一者IL_6、IL-12、 MCP-1、及RANTES的表现。在部分例示性的具体实施中，该迷迭香酸可抑制AP-1结合活性。如上所论，左手香具有AP-1抑制活性，如图5所示。因此，该左手香萃取物及其活 性成分(单独或组合)可用于治疗发炎相关性疾病，诸如类风湿性关节炎及其它。根据图5所示实验数据的具体实施，其将含有AP-1结合位点之寡核苷酸与取自经 TPA刺激之K562 (K562)或HeLaOfeLa)细胞的核萃取物进行共置。加入AP-1复合物之抗 体，接着加入经辣根过氧化物酶标记之二级抗体，以进行基于ELISA分析。将该取自经TPA 刺激之细胞的核萃取物之AP-1结合活性定义为100%并将仅为缓冲液之AP-1结合活性定 义为0%。数据显示PA萃取物可抑制AP-1结合活性。根据一具体实施，AP-1复合物可由 C-Jun、JunB、JunD、c_Fos、Fos_B、Fra_l、或 Fra-2形成，但不限于此。如图6所示，该等所形成之AP_1复合物的结合活性指出，蛋白在 左手香萃取物的存在下会减少。根据图6所示实验数据的具体实施，AP-1复合物可由不同蛋白形成，诸如，C-Jim、 JunB、JunD、c_Fos、Fos_B、Fra_l、或Fra_2。在基于ELISA之分析中使用各种不同抗体，显 示PA萃取物之目标蛋白。结果显示，PA萃取物可抑制该等由C-Jun、JunB、JunD、c_Fos、 Fos-B、Fra-1、或Fra_2所形成之复合物的DNA结合活性。因此，迷迭香酸、Mena 987、Mena 998、Mena 9102存在于左手香萃取物中，其具有 AP-1抑制活性。根据具体实施，该左手香萃取物在用于医药或营养医学(nutraceutical) 组合物中时可用于治疗类风湿性关节炎或其它发炎相关性疾病。根据实施。左手香萃取物含有以重量计0.5-1. 2% (如，0.89% )之迷迭香酸、以 重量计 0. 05-0. 1% (如，0. 06% )之 Mena 987、以重量计 0. 05-0. 1% (如，0. 09% )之 Mena 998、以及以重量计0.05-0. (如，0. 08% )之Mena9102。多酚在该萃取物中之百分比可 为以重量计至少30% (亦即，在30%及100% (含)间之任何整数百分比)，如使用皮粉 法(hide powder method)所测定，该方法已为多酚分析之官方方法(美国皮革化学家协会(AmericanLeather Chemist Association))。多酚之含量系借着制备多酚溶液、使该多酚 吸收至铬皮粉上、再接着以重量分析测定残余物质而进行测定。根据具体实施，该萃取物是根据下文实例所述之方法或是相当方法而制备。举例 而言，其以lOOOOx g离心该粗制叶汁30分钟，再过滤该上清液。冻干该滤液以产生干燥 粉末。接着以RPC18_HPLC纯化该粉末。根据溶析特征及具体实施，由型号CHF 122SB之 Advantec级份收集器收集到四个级份。Frac#8(含有Mena 987)系自19. 5至21. 5min收集， Frac#9 (含有 Mena 998)系自 21. 5 至 23. 5min 收集，Frac#10 (含有迷迭香酸及 Mena9102) 系自23. 5至25. 5min收集。根据具体实施，lg之左手香干燥粉末可产生4. 8mg Frac#8, 14mg Frac#9、及 12. 7mg Frac#10o根据具体实施，其揭示一种医药组合物Mena 987，包含治疗有效量之 根据具体实施，其揭示一种组合物Mena 998，包含治疗有效量的下列至少之一 根据具体实施，其揭示一种组合物Mena 9102，包含治疗有效量之 根据具体实施，其揭示一种组合物迷迭香酸，包含治疗有效量之 因迷迭香酸、Mena 987、Mena 998、及Mena 9102之生物功能各异，各组成份在该 PA萃取物中之比例可如所需调整。为取得改良之生物活性，可以人工合成部分类似物。
根据具体实施，其揭示一种组合物，包含以有效量之式I化合物抑制AP-1
(i)其中Ar1及Ar2是独立选自苯基、单、双及多取代之苯基，例如，(H0)n、(H3C0)n(其 中 n = 1-3)、亚甲二氧基(0CH20)、CH3、F、CI、Br、I、NHR(R = H、0C0CH3)、N02、及 C00R(其 中R是H或烷基)、以及RCO (其中R是H或烷基)；A是独立选自H、C00R、C0NRR'、S03H、 S02NRR'、或P0(0R)(0R')，其中R及R'是独立选自H、C1-C6烷基、或芳基；且其中X是 012、0、或朋。根据具体实施，其揭示一种组合物，包含治疗有效量的表1化合物之一 表1根据具体实施，其揭示一种组合物，包含治疗有效量之式II化合物 其中Ar1及Ar2是独立选自苯基、单、双及多取代之苯基，例如，(H0)n、(H3C0)n(其 中 n = 1-3)、亚甲二氧基(0CH20)、CH3、F、Cl、Br、I、NHR(R = H、0C0CH3)、N02、C00R(其中 R 是H或烷基)、以及RCO(其中R是H或烷基)，X是CH2、0、NH，R1是独立选自H、C1_C6烷基、 芳基，R2是独立选自C00H、C00Et、芳基、羟基-芳基。根据具体实施，其揭示一种组合物，包含治疗有效量的表2化合物之一 表2为试验本发明化合物对于AP-1与AP-1辨识序列之结合活性的效应，进行ELISA 实验。该等AP-1抑制分析之结果示于表3。
表3根据具体实施，其发展出结合分析以辨识可阻断AP-1DNA结合活性之抑制剂。传 统的方法需要由经TPA刺激之细胞中制备核萃取物，或者需要分别纯化Fos及Jim再接续 进行试管内之二聚化作用以形成功能性之AP-1复合物。因此如图7所示设计可在一个质 体中驱动两种基因表现之双顺反子表现载体。在此系统中，启动子可直接驱动该第一基因 之表现，该第一基因经由核糖体结合位点而连结该第二基因，以造成该第二基因之表现。在 该等细胞中就其生理功能而形成异源二聚体之任何基因对潜在皆可使用此系统而在该等 细胞中以复合物的形式表现。根据具体实施，其使用图7之表现系统以共表现AP-1复合物。因此，其以(组胺 酸)6标记Fos (为基因1)，并以Str印-标记标记Jim (为基因2)，如图8A所述。该等结果 说明，其以Ni2+层析，使用单一步骤，纯化出含有经his标记之蛋白及经str印标记之蛋白 两者的复合物(图8B)。交叉连结实验进一步确认该等Fos-Jim复合物为二聚体(图8C)。根据图8所示具体实施的实验数据，其如图8A所示创造可在单一载体(诸如质 体)中进行Fos及Jim之双顺反子表现的建构物。在图8B中，其完成重组Fos-Jim复合物 之纯化。其诱发具有pFos-Jim之细菌细胞以进行重组蛋白表现。在进行细胞裂解后，使该 细胞粗萃取物通过Ni2+管柱，接着再进行咪唑溶析，以释出含有(组胺酸)6之复合物。如 图8B所示，M道为蛋白标记物；第1道为细胞粗萃取物；第2道为Ni2+管柱之流出液；第3 道为使用10mM咪唑之洗液；而第4道为使用500mM咪唑之溶析液。使用含有蛋白之粗萃取物或经纯化之蛋白进行基于ELISA及基于荧光各向异性 之结合分析。将含有一或多个拷贝之AP-1共有结合位点的经标记寡核苷酸用于该等结合 分析中。在ELISA结合分析中，使用经生物素标记之寡核苷酸涂覆链霉亲和素盘。经罗丹 明(Rhodamine)或荧光黄或是其它荧光团标记之寡核苷酸则用于荧光各向异性分析。如图9所示，该等结果确认该等重组AP-1复合物之DNA结合活性具有如强竞争物 般之特异性，因在使用基于ELISA及基于荧光各向异性之结合分析两者时，含有AP-1共有 结合位点之自由未经标记的寡核苷酸皆可阻断经标记DNA及该等AP-1复合物间之结合。 根据图9所示之具体实例，其针对AP-1之DNA结合活性发展出基于ELISA (图9A及9B)及 基于荧光各向异性(图9C及9D)之分析。图9A及9C显示AP-1结合活性之浓度相关性增 加。图9B及9D显示自由之含AP-1结合位点之寡核苷酸的剂量相关性抑制作用。根据具体实施，本发明之化合物可结合熟习技艺者在阅读本发明时可辨识之其它 活性剂、载体、载剂、赋形剂、或辅助剂而包括在医药或营养医学(nutraceutical)组合物 中，并至少对一动物(诸如人类)之眼进行投与。该等医药或营养医学组合物较佳至少包含一种医药可接受之载体。在此等医药组 合物中，本发明之试剂为其「活性化合物」，亦称为「活性剂」。在本文中，词语「医药可接受 之载体」包括语该医药投与相容之溶剂、分散基质、涂层、抗菌剂及抗真菌剂、等渗透及吸收延迟剂、及其类似者。亦可在该等组合物中纳入补充性之活性化合物。医药组合物系调配 为与其所欲投与途径兼容。投与途径之例包括肠外(如，静脉)、皮内、皮下、口服(如，吸 入)、穿皮(局部)、穿黏膜、及直肠之投与。用于肠外、皮内、或皮下施用之溶液或悬浮液可 包括下列组成份无菌稀释剂，诸如，注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇、 或其它合成溶剂；抗菌剂，诸如，苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如，抗坏血酸或 亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如，乙二胺四乙酸；缓冲剂，诸如，醋酸盐、柠檬酸盐、或磷酸盐；以 及用以调整渗透度之试剂，诸如，氯化钠及葡萄糖。PH可以酸或碱调整，诸如，盐酸或氢氧化 钠。可将肠外制备物包装于玻璃或塑料制之安瓿、抛弃式针筒、或多次剂量小瓶中。本文所用之对象系指人类，以及非人类灵长类(如，猩猩、猕猴、狨)、家畜(如，羊、 牛、马、驴、及猪)、宠物(如，狗、猫)、实验室试验动物(如，小鼠、兔、大鼠、天竺鼠、仓鼠)、 圈养之野生动物(如，狐狸、鹿)、以及任何可由本发明之试剂获益之生物。可由本发明所 揭示之试剂获益的动物类型并无限制。不论其为人类或非人类生物，对象可被称为病患、个 体、动物、宿主、或接受者。适合用于注射使用之医药组合物包括无菌之水性溶液(在其为水可溶性之情形 下)或分散液，以及用于实时制备无菌注射容抑或分散液之无菌粉末。就静脉投与而言，适 当之载体包括生理盐水、制菌水、CremophorEL. TM. (BASF, Parsippany, N. J.)、或磷酸缓冲 盐水(PBS)。在所有情形下，该组合物皆应为无菌，且应为具有可轻易注射性程度之液体。 其应在制造及贮存条件下为安定，且应对抗诸如细菌及真菌之微生物的污染作用进行防 腐。该载体可为溶剂或分散基质，含有，例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、及液态 聚乙二醇、及其类似者)、及其适当之混合物。适当之流动性可，例如，借着使用涂覆物(诸 如，卵磷脂)、借着保持所需之颗粒大小(就分散液之情形而言)、以及借着使用界面活性剂 而维持。微生物作用之预防可以各种不同的抗菌剂及抗真菌剂而达成，例如，对羟基苯甲酸 酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞、及其类似者。在诸多情形下，其将较佳在该组合物中包 括等渗透剂，例如，糖类、多元醇(诸如，甘露糖醇、山梨糖醇)、或氯化钠。该等可注射组合 物之延长吸收可借着在该组合物中包括可延迟吸收之试剂而达成，例如，单硬脂酸铝及明 胶。无菌可注射性溶液可借着将所需量之该活性化合物与如所需的上述成分之一或 组合纳入适当之溶剂中，接着再进行过滤灭菌而制备。一般而言，分散液系借着将该活性化 合物纳入含有基础分散基质及取自上述者之所需其它组成份的无菌载剂中。就用以制备无 菌可注射性溶液之无菌粉末而言，其制备方法包括真空干燥及冷冻干燥，由其先前经无菌 过滤之溶液产生该活性成分加上任何其它所需成分之粉末。口服组合物一般而言包括钝性之稀释剂或食用性之载体。就口服治疗性投与之目 的而言，可将该活性化合物与赋形剂共同纳入，并以锭剂、片剂、或胶囊(如，明胶胶囊)的 形式使用。口服组合物亦可使用液态载体制备而作为漱口水。亦可包括医药可兼容性结合 剂或佐剂材料为该组合物之部分。该锭剂、丸剂、胶囊、片剂、及其类似者可含有下列成分中 之任一者，或是具有类似性质之化合物结合剂，诸如，微晶纤维素、黄蓍胶、或明胶；赋形 剂，诸如，淀粉或乳糖；崩解剂，诸如，藻酸、Primogel、或玉米淀粉；润滑剂，诸如，硬脂酸镁 或Sterotes ；助流剂，诸如，胶态二氧化硅；甜味剂，诸如，蔗糖或糖精；或是调味剂，诸如， 薄荷、水杨酸甲酯、或柳橙调味剂。
就以吸入进行之投与而言，该等化合物系以气溶胶喷雾的形式，由含有适当推进 剂(如，气体，诸如，二氧化碳)之加压容器或分配器，或是由喷雾器传递。全身性之投与亦可为穿黏膜或是穿皮者。就穿黏膜或穿皮投与而言，可在该调配 物中使用适用于该待穿透屏障之穿透剂。此等穿透剂系技艺中一般已知者，且其包括，例 如，就穿黏膜之投与而言，清洁剂、胆盐、及夫西地酸(fusidic acid)衍生物。穿黏膜之投与 可经由使用鼻喷雾或栓剂达成。就穿皮投与而言，其系将该等活性化合物调配成为油膏、软 膏、凝胶、或乳霜，如技艺中一般所知。该等化合物亦可以栓剂(如，使用习知之栓剂基质， 诸如，可可脂及其它甘油酯)或保留灌肠的形式制备以进行直肠投与。根据具体实施，该等活性化合物系与可保护该化合物对抗体内之快速排除的载 体共同制备，诸如，控释调配物，包括植入物及微囊化传递系统。可使用生物可降解性、 生物可兼容性之聚合物，诸如，乙烯醋酸乙烯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯、及聚乳 酸。此等调配物之制备方法将为熟习技艺者明显可知者。该等材料亦可以商业而由Alza Corporation及Nova Pharmaceuticals, Inc.取得。亦可使用脂质体悬浮液(包括以针对 细胞专一性抗原之单株抗体靶向经感染细胞之脂质体)作为医药可接受之载体。此等悬浮 液可根据技艺中已知之方法制备，例如，如美国专利第4，522，811号中所述者，其纳入本文 作为参考。较佳系将口服或肠外组合物调配为剂量单元形式，以便利投与及统一剂量。本文 所用之剂量单元形式系指适于作为该待治疗对象之单位剂量的物理不连续性单元；各个单 元含有经计算可产生所欲治疗效应之预定量活性化合物，结合所需之医药载体。此等化合物之毒性及治疗功效可由标准之医药流程而在细胞培养物或实验动物 体内测定，如，以测定LD50 (使50%之族群致命的剂量)及ED50 (对于50%之族群具治疗 有效性的剂量)。毒性与治疗效应之剂量比例为治疗指数，且此可以比例LD50/ED50表示。 具有高治疗指数之化合物为较佳者。尽管可使用具有毒性副作用之化合物，应小心设计可 使此等化合物靶向受影响位置之位点的传递系统，以使对于未经感染细胞之潜在伤害减至 最小并因此降低副作用。可使用取自该等细胞培养分析及动物实验之数据，调配用于人类之剂量范围。此 等化合物之剂量较佳系在可以极少或无之毒性诱发ED50的循环浓度范围中。剂量可根据 所用之剂形及所用之投与途径而在此范围内变化。就用于本发明方法中之任何化合物而 言，最初可在细胞培养分析中估计该治疗有效剂量。可在动物模式中调配一剂量，以达成可 诱发如在细胞培养中所判定之IC50 (亦即，可达成症状之半最大抑制的试验化合物浓度) 的循环血浆浓度范围。可使用此等信息而更精确测定可用于人体之剂量。可以，例如，高效 液相层析测量血浆中之含量。如本文所定义，该活性化合物之治疗有效量(亦即，有效剂量)可介于自约0.001 至100g/kg体重，或是可由熟习技艺者在无过度实验之情形下明显可知并明了之其它范 围。熟习技艺者将可明了，部分因子可影响有效治疗对象之所需剂量及时机，其包括，但不 限于，该疾病或病症之严重性、先前之治疗、该对象之一般健康情形或年龄、以及存在之其 它疾病。根据另一态样，熟习技艺者可预期一或多种部件套组，该等部件套组可实施至少 一种本文所揭示之方法，该部件套组包含二或多种组合物，该等组合物包含单独或组合之有效量的根据至少一种上述方法之本发明试剂。该等套组可能亦包括包含非本发明化合物之活性剂、生物事件辨识剂、或是可由 熟习技艺者在阅读本发明时可辨识之其它化合物的组合物。名辞「辨识剂」系指一分子、 代谢物、或其它化合物，诸如，抗体、DNA、或RNA寡核苷酸，其可在熟习技艺者可辨知之流程 下，发现或判定一生物事件之存在、或事实、或是以其它方式侦测；例示性之辨识剂为抗体， 例示性之流程为西方点渍、亚硝酸盐分析、及RT-PCR，或是如实施例中所述之其它流程。例 示性之生物事件为细胞因子表现或是其它免疫调控事件。该套组亦可包含至少一种包含有效量之本发明化合物的组合物或是一种细胞系。 该等部件套组之该等组合物或该细胞系可根据熟习技艺者可辨识之流程而用于进行至少 一种本文所揭示之方法。实施例对于本发明之更完整理解可借着参照下列之特定实施例及图式而取得。该等实施 例及图式仅系为说明目的而叙述，且并不欲限制本发明之范围。形式之变化以及相当物之 取代如情况所可建议或是认为合宜而可为预期。尽管在本文中使用特定之名辞，此等名辞 系欲用以进行叙述而非限制。可在不偏离其精神及范围之情形下，对前文所述之揭示内容 进行修饰及变化，而因此其仅应具有附呈之权利要求所指出之限制。实施例1 :PA萃取物之抗炎活性PA对于17种细胞因子以及5种趋化因子之LPS (脂多醣)-诱发性表现的效应示 于表1。在有或无lmg/ml PA粗萃取物之情形下，使人类脐静脉内皮(HUVEC)细胞与LPS共 同培育。使用Luminex测定细胞因子表现特征。结果显示，PA粗萃取物显著降低细胞因子 IL-6、IL-8、IL-12、MCP-1、及 RANTES 之表现。表1. PA萃取物对于LPS-诱发性表现之效应
控制组LPS茚甲新 (Indomethacin) LPSPA LPSIL-la13. 213. 831. 813. 6IL-lb11. 611. 711. 711. 7IL-21010. 110. 110. 1IL-38. 858. 868. 828. 8IL-411. 711. 911. 811. 6IL-51. 191. 231. 241. 19IL-6280698006230036600
19 实施例2 以PA萃取物抑制AP-1结合活性由于AP-1活性涉及发炎信号传导，兹检验PA粗萃取物对于AP-1/DNA结合活性之 效应。如图1所示，其使用基于ELISA之分析测定PA粗萃取物对于AP-1转录因子之DNA 结合活性的效应。使用由经TPA活化之HeLa或K562细胞所制备的核萃取物作为AP-1蛋 白来源。在与含有AP-1结合位点之寡核苷酸进行共置后，以复合HRP之抗-c-Fos抗体侦 测AP-1/DNA复合物。兹发现，AP-1在试管内之DNA结合活性会由PA粗萃取物抑制，且该 等效应具有剂量相关性。实施例3 以级份10、CHM9102、及迷迭香酸抑制AP_1结合活性使用C18管柱，以制备性HPLC，对该PA粗萃取物进行进一步之分级分离。如图2所示，其将左手香之粗萃取物分离成为16个级份。级份10显示具有对抗AP-1结合之抑制 效应。以另一 C18管柱，使用含有0. 三氟乙酸之由2%乙腈至90%乙腈的溶剂梯度，进 一步纯化此一级份。收集主峰，接着再以MASS及NMR分析对其进行结构测定，如图3所示。 此等研究产生对于该活性组成份CHM9102之结构推论。亦对迷迭香酸(CHM9102之类似物) 进行AP-1抑制活性之试验。尽管方法以及试剂已以目前视为最为实际且较佳的具体实施进行叙述，但应明了 的是，该揭示内容并不须限于所揭示的具体实施。其系欲涵括权利要求之精神及范围内所 包括之各种不同修饰及类似安排，该权利要求之范围应符合其最广释义，以使其涵括所有 此等修饰及类似结构。本揭示内容包括上述权利要求之任何及所有具体实施。实施例4 :Mena 987之纯化根据具体实施，以含有0. 三氟乙酸之50%乙腈重构Frac#8之干燥粉末。该既 已建立之HPLC系统如上所述。在RPC18-HPLC实验中，在214nm监测Frac#8。使用60min 内之由90%溶剂A(98%水，2%乙腈，及0. 三氟乙酸)至30%溶剂B(90%乙腈，10%水， 及0.1%三氟乙酸)的线性梯度纯化Mena 987。在各次注入之前，以90%溶剂A对该管柱 进行再次平衡20分钟。在我们的实验中，峰系以型号CHF122SB之Advantec级份收集器收 集。在具有TR= 13min之峰中发现Mena 987，其以质谱分析辨识为单一化合物。以MASS、 NMR辨识Mena 987之结构。lg之左手香干燥粉末可产生0. 6mg之Mena 987。
NMR (600MHz, D20) 8 7. 69 (d, J = 1. 6Hz，1H)，6. 95-6. 97 (m，2H)，6. 89 (d，J = 2. 0Hz，1H)，6. 82-6. 86(m，2H)，6. 77(dd，J = 8. 2，2. 1Hz，1H)，4. 91 (d，J = 2. 5Hz, 1H)； 4. 66 (dd, J = 2. 5,2. 5Hz, 1H) ； 13C 匪R(150MHz，D20) S 175. 1，175. 1，147. 0，1444，143. 8， 143. 4，140. 1，132. 2，125. 8，125. 3，122. 3，119. 5，118. 2，116. 5，115. 9，115. 0,83. 7,48. 1。实施例5 :Mena 998之纯化根据具体实施，以含有0. 三氟乙酸之50%乙腈重构Frac#9之干燥粉末。该既 已建立之HPLC系统如上所述。在RPC18-HPLC实验中，在214nm监测Frac#9。使用60min 内之由90%溶剂A(98%水，2%乙腈，及0. 三氟乙酸)至25%溶剂B(90%乙腈，10%水， 及0.1%三氟乙酸)的线性梯度纯化Mena 998。在各次注入之前，以90%溶剂A对该管柱 进行再次平衡20分钟。以型号CHF 122SB之Advantec级份收集器进一步收集峰。在具有 TR = 34. 5min之峰中发现Mena 998，其以质谱分析辨识为单一化合物。以NMR及高分辨质 谱(HRMS)辨识Mena 998之结构。lg之左手香干燥粉末可产生0. 9mg之Mena 998。 NMR (600MHz, D20) 8 6. 70-6. 88 (m, 9H), 6. 56 (m, 2H), 6. 12 (d, J = 8.2Hz，lH)， 4. 55(m，2H)，4. 23 (m，2H)，3. 88 (dd, J = 8. 6,8. 6Hz, 1H)，3. 78 (dd, J = 10. 5,6. 4Hz, 1H)， 3. 01 (dd, J = 14. 2,3. 5Hz, 1H)，2. 85 (dd, J = 14. 0,9. 8Hz, 1H)，2. 78 (dd, J = 14. 3,7. 5Hz, 1H),2. 71 (dd, J = 14. 4,4. 6Hz, 1H) ； 13C 匪R(150MHz，D20) S 175. 3，173. 7，173. 1，144. 0， 143. 8，143. 7，143. 6，143. 0，142. 8，142. 7，131. 1, 130. 8，129. 6，129. 1, 122. 0，121. 8， 120. 1,118. 4，117. 1,116. 9,116. 2，116. 0,115. 7,115. 0,76. 2,75. 6,47. 5,46. 1,41. 0， 40. 4,36. 5,36. 0。C36H32016[M+H] + 之 HRMS 计算值721. 1769，实验值721. 1841。实施例6 :Mena 9102之纯化根据具体实施，以含有0. 三氟乙酸之50%乙腈重构FraC#10之干燥粉末。该既 已建立之HPLC系统如上所述。在RPC18-HPLC实验中，在214nm监测Frac#10。使用60min 内之由80%溶剂A(98%水，2%乙腈，及0. 三氟乙酸)至25%溶剂B(90%乙腈，10%水， 及0. 三氟乙酸)的线性梯度纯化Mena 9102。在各次注入之前，以80%溶剂A对该管柱 进行再次平衡20分钟。以型号CHF122SB之Advantec级份收集器进一步收集峰。在具有 TR = 24. 5min之峰中发现Mena 9102，其以质谱分析辨识为单一化合物。以NMR及高分辨 质谱(HRMS)辨识Mena 9102之结构。lg之左手香干燥粉末可产生0. 8mg之Mena 9102。 NMR(600MHz5D20) 8 7. 50 (s, 1H), 6. 83-6. 90 (m, 4H), 6. 71 (dd, J = 8. 1,1. 9Hz, 1H), 6. 63-6. 68 (m, 3H), 6. 46 (d, J = 1. 9Hz，1H)，6. 29 (ddd，J = 9. 1，9. 1，2. 1Hz，2H)， 5. 06 (dd, J = 9. 5,3. 7Hz, 1H)，4. 99 (dd, J = 10. 3,3. 4Hz, 1H)，4. 39 (d, J = 1. 0Hz, 1H)， 4. 29 (d, J = 1. 0Hz, 1H)，3. 14 (dd, J = 14. 3,3. 8Hz, 1H)，2. 95-3. 00 (m, 2H)，2. 69 (dd, J = 14. 7，10. 6Hz, 1H) ；13C NMR (150MHz, D20) 8 176. 3，173. 2，167. 8，162. 9，H7-9，143-9，143-7， 1434，142. 8，142. 5，142. 5，142. 2，139. 1，132. 2，129. 9，129. 3，125. 1，124. 6，122. 8，121. 7， 120. 6，119. 2，119. 1，117. 3，117. 0，116. 1，116. 0，116. 0，115. 4，115. 0，114,6,76. 1,75. 7， 45. 8,39. 2,36. 7,36. 1。C36H34N016[M+NHj + 之 HRMS 计算值736. 1878，实验值736. 1933。实施例7 诛迭香酸之纯化根据具体实施，以含有0. 三氟乙酸之50%乙腈重构FraC#10之干燥粉末。该既 已建立之HPLC系统如上所述。在RPC18-HPLC实验中，在214nm监测Frac#10。使用60min 内之由90%溶剂A(98%水，2%乙腈，及0. 三氟乙酸)至20%溶剂B(90%乙腈，10%水，及0.1%三氟乙酸)的线性梯度纯化迷迭香酸。在各次注入之前，以90%溶剂A对该管柱 进行再次平衡20分钟。以型号CHF122SB之Advantec级份收集器进一步收集峰。在具有 TR = 17. 5min之峰中发现迷迭香酸，其以质谱分析辨识为单一化合物。以MASS、NMR辨识
迷迭香酸之结构lg之左手香干燥粉末可产生8. 9mg之迷迭香酸。 实施例8 化合物7之合成根据具体实施且如图10中之流程所示，制备化合物7。在咖啡酸(0.25g， 1. 39mmole)及左旋多巴(levodopa) _C00CH3. HC1 (0. 55g，2. 22mmole)溶于 8. 0ml 无水 DMF 中之溶液中，加入HBTU(0. 63g, 1. 67mmole)及二异丙基乙胺(2. 4ml, 13. 9mmole)，接着再在 室温下隔夜搅拌该所得之反应混合物。在真空下除去DMF，以IN HC1酸化该残余物，接着以 乙酸乙酯萃取4次。收集有机层，以MgS04(s)去水，再进行浓缩，以产生粗产物。使用乙酸乙 酯及己烷之梯度溶析，以管柱层析取得化合物5(0. 43g，82%产率)。
'H-NMR (600MHz, MeOD) 8 2. 82-2. 87 (m, 1H) , 2. 95-2. 98 (m, 1H) ,3. 65(s，3H)， 4. 64 (dd, J = 6. 12，7. 98Hz, 1H)，6. 36 (d, J = 15. 7Hz, 1H)，6. 47 (dd, J = 1. 92，8. 1Hz, 1H)， 6. 59 (d, J = 1. 92Hz, 1H)，6. 62 (d, J = 8. 1Hz, 1H)，6. 71 (d, J = 8. 04Hz, 1H)，6. 85 (dd, J = 1. 92，8. 16Hz, 1H)，6. 95 (d, J = 1. 92Hz, 1H)，7. 32 (d, J = 15. 7Hz, 1H)。
'H-NMR (600MHz, MeOD) 8 1. 45 (t, J = 6. 5Hz, 3H) , 2. 78-2. 82 (m, 1H), 2. 89-2. 92 (m, 1H)，4. 15 (q, J = 6. 5Hz,2H)，4. 68 (dd, J = 6. 12,7. 98Hz, 1H)，6. 25 (d, J = 15. 7Hz, 1H)，6. 41 (dd, J = 1. 92，8. 1Hz, 1H)，6. 55 (d, J = 1. 92Hz, 1H)，6. 59 (d, J = 8. 1Hz, 1H)，6. 73 (d, J = 8. 04Hz, 1H)，6. 82 (dd, J = 1. 92，8. 16Hz, 1H)，6. 97 (d, J = 1. 92Hz, 1H)， 7. 34(d, J = 15. 7Hz，lH)。化合物 6 以 84%产率制备。
再次参见图10，在化合物5(0. 993g，2. 66mmole)在30ml 1，4_ 二恶烷之溶液中，加 入15ml之IN NaOH(aq)。在室温下搅拌该所得之溶液，并以TLC盘监测。加入6N HCl(aq)以 酸化该溶液(PH 2)，并在室温下搅拌lhr。在减压条件下除去1，4- 二恶烷，再以乙酸乙 酯萃取水层4次。以MgS04(s)对该结合之有基层进行去水，再进行浓缩以产生粗产物。在使 用乙酸乙酯/己烷接续乙酸乙酯/甲醇之梯度溶析以管柱层析纯化后取得化合物7(20% 产率)；1H-NMR (600MHz，MeOD) 8 2. 82-2. 85 (m, 1H)，3. 00-3. 04 (m, 1H), 4. 63(dd, J = 5. 28， 8. 16Hz, 1H)，6. 35(d, J = 15. 6Hz, 1H)，6. 50 (dd, J = 1. 98，8. 1Hz, 1H)，6. 60 (s, 1H)，6. 62 (t, J = 2. 04Hz, 1H) ,6. 69 (d, J = 8. 16Hz, 1H) ,6. 84 (dd, J = 1. 98，8. 22Hz, 1H) ,6. 93 (d, J = 1. 98Hz, 1H)，7. 30 (d, J = 15. 7Hz, 1H)。实施例9 化合物8及9之合成根据具体实施，化合物8及9之合成系与化合物5相同，除其系使用盐酸多巴胺 (针对化合物8)及1-胺基-2-(3，4-二羟基苯基)乙基膦酸二乙酯(针对化合物9)进行 酰胺键形成反应。C17H18N05[M+H] +之 HRMS 计算值316. 3285，实验值316. 3288。化合物 8 系以 86%
产率合成。 C21H27N08P[M+H] +之 HRMS 计算值452. 4147，实验值452. 4143。化合物 9 系以 65%
产率合成。实施例10 化合物11及12之合成根据图11中所示流程的具体实施，由迷迭香酸合成化合物11及12。在亚硝酸钠 (544mg, 7. 9mmole)于50ml醋酸缓冲液(0. 2M Ac0H/0. 2MAc0Na)中之溶液中，加入迷迭香酸
(360mg, 1. Ommole)。在5min(12)或lOmin(ll)后，加入饱和之氯化钠对该溶液进行淬灭， 再以乙酸乙酯萃取5次。以NaS04(s)对该结合之有基层进行去水，再在真空下浓缩。使用乙酸乙酯/己烷接续乙酸乙酯/甲醇之梯度溶析，以管柱层析纯化该 粗产物，产生化合物12(325mg，80 %产率)及化合物11 ； (12)屮-匪R(500MHz，MeOD) 8 3. 15-3. 22 (m, 1H), 3. 47-3. 53 (m, 1H), 5. 17 (dd, J = 5. 75，11. 05Hz，1H)，6. 04 (d，J = 19. 89Hz，1H)，6. 60-6. 65(m，2H)，6. 79(dd，J = 2. 36，10. 25Hz，1H)，6. 88—6. 90 (m，1H)， 7. 35 (d, J = 10. 80Hz, 1H), 7. 08 (s, 1H) ； (11) iH-WRGOOMHz，MeOD) 8 3. 31-3. 36 (m, 1H), 3. 64-3. 69 (m, 1H)，5. 37 (dd, J = 5. 94，10. 9Hz, 1H)，6. 26 (d, J = 19. 7Hz, 1H)，6. 81 (s, 1H)， 7. 05 (s, 1H)，7. 54(s，2H)，8. 12 (d, J = 19. 7Hz, 1H)。实施例11 化合物13之合成 根据图12中所示流程的具体实施，制备化合物13。在迷迭香酸(0. 5g，l. 39mmole) 及左旋多巴_C00CH3. HC1 (0. 55g，2. 22mmole)溶于8. 0ml无水DMF中之溶液中，加入 HBTU(0. 63g, 1. 67mmole)及二异丙基乙胺(2. 4ml，13. 9mmole)，接着再在室温下隔夜搅拌 该所得之反应混合物。在真空下除去DMF，以IN HC1酸化该残余物，接着以乙酸乙酯萃取4 次。收集有机层，以MgS04(s)去水，再进行浓缩，以产生粗产物。使用乙酸乙酯及己烷之梯度溶析，以管柱层析取得化合物13(0.26g，34%产率)； 'H-NMR (600MHz, MeOD) 8 2. 74-2. 90 (m, 4H), 3. 64 (s, 3H), 4. 54 (dd, J = 6. 0，7. 8Hz，1H)，
5.16 (dd, J = 4. 98，7. 8Hz，lH)，6. 21(d，J = 15. 8Hz，1H)，6. 35 (dd，J = 1.92，8.04Hz， 1H)，6. 47 (dd, J = 1. 92，8. 1Hz, 1H)，6. 52 (d, J = 1. 92Hz, 1H)，6. 56 (d, J = 7. 98Hz, 1H)，
6.61-6. 63(m，2H)，6. 73 (d, J = 8. 16Hz, 1H)，6. 91 (dd, J = 1. 92，8. 22Hz, 1H)，7. 00 (d, J = 1. 92Hz, 1H)，7. 49 (d, J = 15. 8Hz, 1H)。实施例11 化合物14之合成 根据图12中所示流程的具体实施，制备化合物13。该流程揭示于实施例11。化 合物14以38%产率制备。'H-NMR (600MHz, MeOD) 8 1. 56(t, J = 6. 6Hz，3H)，2. 76—2. 88 (m，4H)，4. 23 (q，
(13)
(14)J = 6. 6Hz，2H)，4. 46 (dd, J = 6. 0,7. 8Hz, 1H)，5. 02 (dd, J = 4. 98，7. 8Hz, 1H)，6. 33 (d, J =15. 8Hz, 1H)，6. 38 (dd, J = 1. 92，8. 04Hz, 1H)，6. 50 (dd, J = 1. 92，8. 1Hz, 1H)，6. 56 (d, J = 1.92Hz，lH)，6. 61(d，J = 7. 98Hz，1H)，6. 67-6. 69 (m，2H)，6. 74 (d，J = 8. 16Hz，lH)， 6. 87 (dd, J = 1. 92，8. 22Hz, 1H)，7. 02 (d, J = 1. 92Hz, 1H)，7. 54 (d, J = 15. 8Hz, 1H)。实施例12 化合物15及15'之合成根据图13中所示流程的具体实施合成化合物15，以和针对化合物13所述之相 同流程处理迷迭香酸，除其使用L-天冬胺酸二乙酯.HC1，以产生化合物15' (27%产 率)；1H-NMR (600MHz，MeOD) 8 1. 16-1. 21 (m, 6H), 2. 67-2. 77 (m, 2H), 2. 91-2. 99 (m, 2H),
4.04 (dd, J = 7. 08，14. 04Hz，2H)，4. 12 (dd, J = 7. 14，14. 28Hz，2H)，4. 70 (t, J = 6. 06Hz, 1H)，5. 21(dd，J = 5. 52，7. 56Hz, 1H)，6. 23(d, J = 15. 9Hz, 1H)，6. 52(dd, J = 1. 92，8. 04Hz, 1H)，6. 62 (d, J = 8. 04Hz, 1H)，6. 65 (d, J = 1. 92Hz, 1H)，6. 73 (d, J = 8. 16Hz, 1H)，6. 91 (dd, J = 1. 98，8. 16Hz, 1H)，6. 99 (d, J = 1. 92Hz, 1H)，7. 52 (d, J = 15. 9Hz, 1H)。将化合物15' (100mg，0. 19mmole)溶于4. 0ml的乙腈与水之共溶剂(1 1)中。 在0°C下，将LiOH(46mg，1. 9mmole)加入该溶液中，接着在0°C下搅拌该全部溶液并以TLC 盘监测。以6N HCl(aq)将该溶液酸化至pH = 2，并在0°C下搅拌30min。以乙酸乙酯萃取水层 4次并收集有机层，以MgS04(s)去水，再进行浓缩，以产生粗产物。使用乙酸乙酯/己烷接续 乙酸乙酯/甲醇之梯度溶析，在硅胶上纯化该粗产物，以产生化合物15(40mg，44%产率)； iH-WR(600MHz，MeOD) 8 2. 73 (d, J = 5. 7Hz，2H)，2. 91-3. 01(m，2H)，4. 65 (t, J = 5. 58Hz, 1H)，5. 24 (dd, J = 4. 8,8. 22Hz, 1H)，6. 22 (d, J = 15. 9Hz, 1H)，6. 52 (dd, J = 1. 68，7_98Hz， 1H)，6. 61 (d, J = 8. 1Hz, 1H)，6. 65 (d, J = 1. 68Hz, 1H)，6. 72 (d, J = 8. 16Hz, 1H)，6. 90 (dd, J = 1. 8,8. 16Hz, 1H)，6. 99 (d, J = 1. 8Hz, 1H)，7. 50 (d, J = 15. 84Hz, 1H)。实施例13 化合物16之合成根据图14中所示流程的具体实施，以和针对化合物13所述之相同流程处理 左旋多巴_C00CH3.HC1，除其使用化合物12，以产生化合物16 ；1H-NMR(500MHz, MeOD) 8 2. 73-2. 83 (m, 4H)，3. 60 (s, 3H)，447-4. 49 (m, 1H)，5. 26 (dd, J = 4. 69，8. 53Hz，1H)， 6. 09 (d, J = 15. 8Hz, 1H) ,6. 32 (dd, J = 2. 06，8. 03Hz，1H)，6. 47 (d，J = 2. 02Hz，1H)， 6. 50(d, J = 8. 0Hz, 1H)，6. 63 (s, 1H)，6. 68(d, J = 8. 15Hz, 1H)，6. 86(dd, J = 2. 02，8. 23Hz, 1H) ,6. 95 (d, J = 2. 01Hz, 1H)，7. 00-7. 04 (m, 1H)，7. 13-7. 16 (m, 1H)。实施例14 化合物21之合成再次参见图14中所示本发明的具体实施，以和针对化合物15所述之相同流 程处理化合物16，以产生化合物21。根据具体实施，化合物21系以52%产率回收。 C27H23N2013 [M-H]-之 HRMS 计算值583. 4771，实验值583. 4768。实施例15 化合物17之合成根据具体实施且如图15中之流程所示合成化合物17，以和针对化合物13所述 之相同流程处理迷迭香酸，除其使用L-色胺酸甲酯.HC1，以产生化合物17(43%产率)； ^-WR (500MHz，MeOD) 8 2. 82-2. 89 (m, 2H), 3. 12-3. 24 (m，2H)，3. 61 (s，3H)，4. 73 (dd，J =
5.92，7. 18Hz, 1H)，5. 24(dd, J = 5. 39，7. 37Hz, 1H)，6. 14 (d, J = 15. 9Hz, 1H)，6. 46(dd, J = 1. 88，8. 06Hz, 1H)，6. 63(d, J = 8. 04Hz, 1H)，6. 66(d, J = 1. 86Hz, 1H)，6. 76(d, J = 8. 18Hz, 1H)，6. 88-6. 96(m，3H)，7. 01(dd，J = 6. 62，8. 15Hz，2H)，7. 25 (d, J = 8. 09Hz，lH)，7. 43 (d,J = 7. 88Hz, 1H)，7. 47 (d, J = 15. 9Hz, 1H)。实施例16 化合物18之合成根据具体实施且如图15中之流程所示，以和针对化合物15所述之相同流程 处理化合物 17，以产生化合物 18(45% 产率)；1H-NMR(600MHz，MeOD) 8 2. 75-2. 83 (m, 2H), 3. 09-3. 25 (m，2H)，4. 48 (s, 1H)，5. 14 (s，1H)，5. 96 (d, J = 15. 84Hz，1H)，6. 36 (d, J = 7. 98Hz, 1H) ,6. 50 (d, J = 8. 04Hz, 1 H)，6. 53 (s，1H)，6. 66 (d，J = 7.92Hz，lH)，
6.78-6. 88(m，5H)，7. 06(d，J = 7. 98Hz，1H)，7. 29 (d，J = 15. 96Hz，1H)，7. 40 (d，J =
7.86Hz, 1H)。实施例17 化合物19之合成根据具体实施且如图16中之流程所示，以和针对化合物13所述之相同流程处理 左旋多巴-C00CH3. HC1，除其使用化合物7，以产生化合物19 (70%产率)；1H_NMR(600MHz， MeOD) 8 2. 73-2. 94 (m, 4H), 3. 6 (s, 3H), 4. 52 (t, J = 6. 7Hz, 1H) ,4. 59 (dd, J = 6. 5Hz, 1H)，6. 33 (d, J = 15. 7Hz, 1H)，6. 35 (d, J = 2. 04Hz, 1H)，6. 39-6. 42 (m, 1H)，6. 49 (d, J = 2. 1Hz, 1H)，6. 51 (dd, J = 1. 98，13. 62Hz, 1H)，6. 56-6. 62(m，4H)，6. 70 (d, J = 8. 16Hz, 1H)， 6. 84-6. 89 (m, 1H)，6. 95 (d, J = 1. 98Hz, 1H)，7. 31 (d，J = 15. 7Hz, 1H)。实施例18 化合物20之合成根据具体实施且如图16中之流程所示，以和针对化合物7所述之相同流程 处理化合物 19，以产生化合物 20 (44% 产率)；1H-NMR(600MHz，MeOD) 8 2. 62-2. 71 (m, 1H), 2. 76-2. 91 (m, 2H), 2. 95-2. 99 (m, 1H), 4. 51 (dd, J = 5. 76，12. 6Hz，1H)，4. 61 (m，1H)， 6. 31 (d, J = 15. 7Hz, 1H) ,6. 37 (d, J = 8. 04Hz, 1H) ,6. 45 (dd, J = 1. 86，8. 04Hz，1H)， 6. 50 (dd, J = 1. 8，8. 04Hz，1H)，6. 57-6. 63(m，4H)，6. 70(J = 8. 16Hz，1H)，6. 85 (dd，J = 1. 86，8. 28Hz, 1H)，6. 94 (d, J = 1. 8Hz, 1H)，7. 29 (d, J = 15. 7Hz, 1H)。实施例19 材料及方法一由左手香分离及纯化Mena 987/998/9102及迷迭香酸材料以双去离子H20彻底清洗左手香之叶(批次#9)，再短暂风干，以在进行勻浆化前 除去水残余物。以型号Beckman之离心机，在4°C下，以10，OOOxg离心该粗制叶汁30分钟。 使该回收自粗制叶汁之澄清上清液通过No. 1滤纸(125mm, Advantec, lot no. 60821017) 进一步过滤，以除去不纯物以及叶之碎片。接着冻干该滤液，并将该干燥粉末贮存在室温之 下，直到进行RPC18-HPLC分级分离。根据我们的估计，476. 3g之左手香叶可产生440ml之 叶汁(7. 4g之干燥粉末)。左手香之粗制样本制备将左手香之干燥粉末(lg)溶于可能为含0. 三氟乙酸之25%乙腈/水混合物 中。在各次注入之前，以桌上型离心机，在室温下，以14，000x rpm对样本进行离心lmin。RPC18-HPLC 纯化HPLC纯化系在配备4-管道可编程性泵及型号G 13658之UV/VIS侦测器的 Angilent Technologies 1200系统上进行。在RPC18-HPLC实验中，所有样本皆在214nm监 测。在 Discovery BIO Wide Pore C18 反相管柱(5 ii m，25cmxl0mm，Supelco)上，以 2. 5ml/ min之流速，并以100 ill之注射量，初步分离此等样本。使用60min内之由溶剂A(98% 水，2%乙腈，及0. 三氟乙酸)至溶剂B(90%乙腈，10%水，及0. 三氟乙酸)的线性梯度进行分离。在各次注入之前，以100%溶剂A对该管柱进行再次平衡20分钟。将以 RPC18-HPLC纯化之产物冻干以除去移动相，接着在进行进一步之分离之前贮存在室温下。根 据溶析特征，由型号CHF 122SB之Advantec级份收集器收集到3个级份。Frac#8系自19. 5 至 21. 5min 收集，Frac#9 系自 21. 5 至 23. 5min 收集，而 Frac#10 系自 23. 5 至 25. 5min 收 集。一般而言，lg之左手香干燥粉末可产生4. 8mg Frac#8、14mg Frac#9、及12. 7mgFrac#10。
尽管该等组合物及方法已以目前视为最为实际且较佳的具体实施进行叙述，咸须 明了，该揭示内容并不须限于所揭示的具体实施。其系欲涵括权利要求之精神及范围内所 包括之各种不同修饰及类似安排，该权利要求之范围应符合其最广释义，以使其涵括所有 此等修饰及类似结构。本揭示内容包括上述权利要求之任何及所有具体实施。
权利要求
一种组合物，其包含左手香((Plectranthus amboinicus)萃取物以及医药可接受之载体；其中该组合物系制备而供投与至具有发炎或发炎相关性病症之病患。
2.如权利要求1所述的组合物，其中该左手香萃取物包含下式化合物之组合物 其中Ar1及Ar2是独立选自苯基、单、双及多取代之苯基、0CH20、CH3、F、CI、Br、I、NHY、 N02、C00Z、以及 ZCO ；其中 A 是选自由 H、C00R、C0NRR'、S03H、S02NRR'、及 P0(0R)(0R')所组成之群; 其中R及R'是独立选自由H、C1-C6烷基、及芳基所组成之群； 其中X是选自由CH2、0、及NH所组成之群； 其中Y是选自由H及0C0CH3所组成之群；且 其中Z是选自由H或烷基所组成之群。
3.如权利要求2所述的组合物，其中该式之官能基是选自由下列者所组成之群Ar1 是 3，4-二羟基苯基，X 是 NH，A 是选自由 COOMe、COOEt、C00H、H、及 P0 (OEt) 2 所组 成之群，且Ar2是3，4- 二羟基苯基；Ar1是3，4- 二羟基苯基，X是0，A是COOEt，且Ar2是3，4- 二羟基苯基； Ar1是3，4- 二羟基苯基，X是0，A是C00H，且Ar2是3，4- 二羟基-6-硝基苯基；及 Ar1是3，4- 二羟基-6-硝基-苯基，X是0，A是C00H，且Ar2是3，4- 二羟基-6-硝基 苯基。
4.如权利要求1所述的组合物，其中该左手香萃取物包含下式化合物之组合物 其中Ar1及Ar2是独立选自苯基、单、双及多取代之苯基、0CH20、CH3、F、CI、Br、I、NHY、 N02、C00Z、以及 ZCO ；其中R1是选自H、C1-C6烷基、及芳基； 其中R2是选自C00H、COOEt、芳基、及羟基-芳基； 其中X是选自由CH2、0、及NH所组成之群； 其中Y是选自由H及0C0CH3所组成之群；且 其中Z是选自由H或烷基所组成之群。
5.如权利要求4所述的组合物，其中该式之官能基是选自由下列者所组成之群 Ar1是3，4- 二羟基苯基，X是0，Ar2是3，4- 二羟基苯基，R1是选自Me、Et，且R2是3，4- 二羟基苯基；Ar1是3，4- 二羟基苯基，X是0，Ar2是3，4- 二羟基苯基，R1是H，且R2系C00H ；Ar1是3，4- 二羟基苯基，X是0，Ar2是3，4- 二羟基-6-硝基-苯基，R1系Me，且R2是 3，4-羟基苯基;Ar1是3，4- 二羟基苯基，X是0，Ar2是3，4- 二羟基苯基，R1是选自Me及H，且R2是3-1H-吲哚；Ar1是3，4- 二羟基苯基，X是NH，Ar2是3，4- 二羟基苯基，R1是选自Me及H，且R2是3，4-二羟基苯基；及Ar1是3，4- 二羟基苯基，X是NH，Ar2是3，4- 二羟基-6-硝基-苯基，R1是H，且R2是 3，4-二羟基苯基。
6.如权利要求1所述的组合物，其中该发炎相关性病症是类风湿性关节炎。
7.一种方法，其包含提供至少含有左手香萃取物以及医药可接受之载体的组合物，用于以治疗有效量投予 至有需要的病患；其中该组合物系制备而供投予至具有发炎或发炎相关性病症之病患。
8.如权利要求7所述的方法，其中该左手香萃取物包含下式化合物之组合物 其中Ar1及Ar2是独立选自苯基、单、双及多取代之苯基、0CH20、CH3、F、CI、Br、I、NHY、 N02、C00Z、以及 ZCO ；其中 A 是选自由 H、C00R、C0NRR'、S03H、S02NRR'、及 P0(0R)(0R')所组成之群; 其中R及R'是独立选自由H、C1-C6烷基、及芳基所组成之群； 其中X是选自由CH2、0、及NH所组成之群； 其中Y是选自由H及0C0CH3所组成之群；且 其中Z是选自由H或烷基所组成之群。
9.如权利要求8所述的方法，其中该式之官能基是选自由下列者所组成之群Ar1 是 3，4-二羟基苯基，X 是 NH，A 是选自由 COOMe、COOEt、C00H、H、及 P0 (OEt) 2 所组 成之群，且Ar2是3，4- 二羟基苯基；Ar1是3，4- 二羟基苯基，X是0，A是COOEt，且Ar2是3，4- 二羟基苯基； Ar1是3，4- 二羟基苯基，X是0，A是C00H，且Ar2是3，4- 二羟基-6-硝基苯基；及 Ar1是3，4- 二羟基-6-硝基-苯基，X是0，A是C00H，且Ar2是3，4- 二羟基-6-硝基 苯基。
10.如权利要求7所述的方法，其中该左手香萃取物包含下式化合物之组合物 其中Ar1及Ar2是独立选自苯基、单、双及多取代之苯基、0CH20、CH3、F、CI、Br、I、NHY、N02、C00Z、以及 ZC0 ；其中R1是选自H、C1-C6烷基、及芳基； 其中R2是选自C00H、COOEt、芳基、及羟基-芳基； 其中X是选自由CH2、0、及NH所组成之群； 其中Y是选自由H及0C0CH3所组成之群；且 其中Z是选自由H或烷基所组成之群。
11.如权利要求10所述的方法，其中该式之官能基是选自由下列者所组成之群Ar1是3，4- 二羟基苯基，X是0，Ar2是3，4- 二羟基苯基，R1是选自Me、Et，且R2是3，4- 二羟基苯基；Ar1是3，4- 二羟基苯基，X是0，Ar2是3，4- 二羟基苯基，R1是H，且R2系C00H ； Ar1是3，4- 二羟基苯基，X是0，Ar2是3，4- 二羟基-6-硝基-苯基，R1系Me，且R2是 3，4-二羟基苯基；Ar1是3，4- 二羟基苯基，X是0，Ar2是3，4- 二羟基苯基，R1是选自Me及H，且R2是3-1H-吲哚；Ar1是3，4- 二羟基苯基，X是NH，Ar2是3，4- 二羟基苯基，R1是选自Me及H，且R2是3，4-二羟基苯基；及Ar1是3，4- 二羟基苯基，X是NH，Ar2是3，4- 二羟基-6-硝基-苯基，R1是H，且R2是 3，4-二羟基苯基。
12.如权利要求7所述的方法，其中该发炎相关性病症是类风湿性关节炎。
13.一种方法，其包含制备重组Fos-Jim复合物；其中该Fos-Jim复合物是由具有Fos基因及Jim基因以及与该Fos基因相关之第一标 记基因及与该His基因相关之第二标记基因的载体制备； 其中该第一标记基因与该第二标记基因不同；以一标记对该载体之基因产物进行第一筛选而筛选Fos-Jim复合物，以产生经部份筛 选之基因产物组；以及以另一标记筛选该经部份筛选之基因产物组，以分离该Fos-Jim复合物。
14.如权利要求13所述的方法，其中该第一基因标记及该第二基因标记是选自由组胺 酸标记及链霉亲和素标记所组成之群。
全文摘要
左手香(Plectranthus amboinicus(PA))之粗萃取物具有抗发炎之效应，且可在试管内抑制AP-1之结合。与PA粗萃取物之共置可在HUVEC细胞中显著抑制IL-6、IL-12、MCP-1、及RANTES之LPS-诱发性表现。在使用制备性HPLC对该粗萃取物进一步进行分级分离后，辨识出级份8、9、10、及11可抑制AP-1结合活性。级份8之活性组成份为Mena 987；级份9为Mena 998；级份10为Mena 9102；而级份11为迷迭香酸及合成之迷迭香酸类似物。其它化合物亦显示具有抑制活性。此等化合物对于AP-1活性具有抑制效应，且可作为预防剂或疗剂而用于其中涉及AP-1之过量表现或活性的疾病。
文档编号A61K36/18GK101854944SQ200880115580
公开日2010年10月6日 申请日期2008年9月17日 优先权日2007年9月17日
发明者余惠敏, 吴宗益, 方俊民, 翁启惠, 郑义循, 郑婷仁 申请人:梁启铭