专利名称：文冠果的提取物和从提取物分离出的化合物的组成,功能和应用,以及它们的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种叫文冠果(Xanthoceras sorbifolia)的植物的提取物，其特征在于从所述提取物中分离和提纯的生物活性化合物的组成，功能和应用，及其制备方法。
背景技术：
详见专利申请书(PCT/US04/33359，2004年10月8日递交)有关章节。
摘要本发明专利的扼要摘要，为了使本发明的某些条款更加突出或引入新条款，另一些条款的内容可能在本摘要中被简化甚至略去，但是，这不表明本发明专利仅限于这些在摘要中提到的内容。
本发明涉及从文冠果的提取物中分离提纯的化合物的用途，其特征在于所述的提取物可治疗夜尿，遗尿，失禁，尿频。文冠果的提取物治疗夜尿，遗尿，失禁，尿频的功能不仅和它可以改善膀胱功能相关，而且它可以改善大脑中枢系统的功能和泌尿系统信息的传递过程，使传递到大脑的信号不断增强，改善了睡眠警觉系统，防止深度睡眠的发生，使大脑发出信号叫醒睡觉的人去撒尿，避免遗尿的发生。有助于松弛膀胱，提高储尿量，从而避免遗尿的发生。
本发明专利公开的文冠果的这些化合物还有助于消除由于精神紧张，压力，衰老活动过度，反射亢进和不稳定而引起的避免逼尿肌不稳定和膀胱的紧张，从而防止尿急和尿频。文冠果提取物可松弛由乙酰胆碱(Ach)引起的膀胱的紧张。
本发明专利公开的文冠果的这些化合物还能抑制乙酰胆碱酶(AchE)的合成，调解制尿贺尔蒙(ADH)的释放，从而控制膀胱产生过多的尿量，抗炎，从而避免遗尿的发生。
本发明公了从开文冠果提取皂甙化合物的方法，其特征在于所述文冠果的皂甙化合物是从文冠果的果壳和/或果柄，叶，种仁，种壳，枝干，树皮和根中提取的。本发明还公开了一种组合物，其特征在于所述组合物含有文冠果的果壳和/或果柄，叶，种仁，种壳，枝干，树皮和根的皂甙提取物。
本发明公了开文冠果皂甙化合物的用途，其特征在于所述文冠果的皂甙化合物可用于促进膀胱生长，改善膀胱功能；改善睡眠警觉系统；调节制尿荷尔蒙(ADH)的释放，分解和摄取及其受体的功能；调节促肾上腺皮质的荷尔蒙(ACTH)的释放，分解和摄取及其受体的功能；调节5-羟色胺(5-HT)的释放，分解和摄取及其受体的功能；调解乙酰胆碱(Ach)的释放，分解和摄取及其受体的功能；调节肾上腺素(AD)的释放，分解和摄取及其受体的功能；调解去甲肾上腺素(NE)的释放，分解和摄取及其受体的功能；调节神经肽的合成，释放，分解和活性及其受体的功能；防止进入睡眠麻痹的状态；治疗遗尿。治疗癌症，如卵巢癌，膀胱癌，骨癌，乳腺癌，白血病，肝癌，前列腺癌和脑癌，但又不限于上癌症。以及改善肺的功能。
本发明专利还公开了一种化合物，其特征在于所述化合物含有三萜皂甙原或其它皂甙原，在碳3位上联有糖链，在碳21和22位上联有酰基和/或糖链，在糖链上联有当归酰基。这些基团有机(operatively)组成了具生物活性的化合物。
本发明专利公开了一种化合物，其特征在于所述化化合物中具有如下的化学结构化合物Y-1 3-O-[(D-半乳糖吡喃酰基(1(2)]-(-L-阿拉伯糖呋喃酰基(1(3)-(-D-葡萄糖醛吡喃酰基-21-O-(3，4-二党归酰基)-(L-鼠李糖吡喃酰基-22-O-乙酰基-3(，16(，21(，22，28-五羟基-12-烯五环三萜皂甙。
化合物R-1 3-O-[二党归酰基-(1(3)-(-D-葡萄糖吡喃酰基-(1(6)]-(-D-葡萄糖吡喃酰基-28-O-[(-L-鼠李糖吡喃酰基-(1(2)-(-D-葡萄糖吡喃酰基-(1(6)-(-D-葡萄糖吡喃酰基1-3(，21(，22(，28-四羟基-12-烯五环三萜皂甙。
本发明专利还公开了一类盐类，其特征在于所述盐类是由上述化合物形成的。本发明专利还公开了一类组合物(composition)，其特征在于所述组合物是由上述化合物或其盐类和适当载体形成的。
本发明专利还公开了一类药物组合物，其特征在于所述药物组合物是由一定数量的上述化合物或其盐类和适当药物载体所组成。
本发明专利还公开了从文冠果提取物中分离和提纯化合物的方法，其特征在于所述方法如下采收文冠果样品，清选，干燥；粉碎文冠果样品，得文冠果样品粉；用适量的一种或几种有机溶剂浸提文冠果样品粉(适当的次数和时间)，得机溶剂浸提液；收集浸提液，再回流热提(适当的次数)，得第二次提取物；回收有机溶剂得流浸膏；干燥和灭菌流浸膏，得粉状文冠果提取物；把上述从从文冠果提出的粉状取物分离成一至多个成分；用速效液相色谱(FPLC)分离和提纯上述具有生物活性的成分；再用高效液相色谱(HPLC)分离出具有生物活性的化合物。
本发明专利公开了化合物Y-1的化学结构的验证方法，其特征在于所述验证的方法是一维和二维的核磁共振法，其图谱见图7，8，9和10。
本发明专利公开了化合物R-1的化学结构的验证的方法，其特征在于所述验证的方法是一维(氢的核磁共振和C-13核磁共振)和二维核磁共振法(HMBC和HMQC)，及质谱法，其图谱和数据见图21，22，23，24和25。
本发明专利还公开了具有抗癌作用的上述从文冠果的提取物分离出的化合物Y-1及其衍生物，其特征在于所述Y-1的化学名称为3-O-[(β-D-半乳糖吡喃酰基(1→2)]-α-L-阿拉伯糖呋喃酰基(1→3)-(β-D-葡萄糖醛吡喃酰基-21-O-(3，4-二党归酰基)-α-(L-鼠李糖吡喃酰基-22-O-乙酰基-3β，16α，21β，22α，28-五羟基-12-烯五环三萜皂甙。其分子式为C65H100O27。
本发明专利还公开了具有抗癌作用的这些化合物或组合物，可癌通路(pathways)，其特征在于所述化合物或组合物可调节像G蛋白细胞和其受体，Fas蛋白细胞和其受体，赖氨酸激酶和其受体，分裂素和其受体等的代谢活动。这些化合物可从文冠果中提出，或人工合成，或从其它生物资源中提出。
本发明专利公开了具有抗癌作用的从文冠果的提取物分离出的化合物Y-1，其特征在于所述Y-1抗卵巢癌，膀胱癌，骨癌，乳腺癌，白血病，肝癌，前列腺癌和脑癌，但又不限于上癌症。
本发明专利的扼要摘要，为了使本发明的某些条款更加突出或引入新条款，另一些条款的内容可能在本摘要中被简化甚至略去，但是，这不表明本发明专利仅限于这些在摘要中提到的内容。
图的详细说明
图1.用高效液相色谱(HPLC)在μbondapak C18柱上分离文冠果提取物成几个组分的图谱。
图2.用膀胱细胞检测被快速液相色谱(FPLC)从文冠果提取物中分离出的组分对细胞的生长的影响(MTT法)。2A.被快速液相色谱(FPLC)从文冠果提取物中分离出的组分。2B.不同组分对膀胱细胞的生长的影响不同。仅组分5962(Y)抑制细胞生长。横坐标浓度(μl/ml)，纵坐标细胞生长(％)。
图3.文冠果提取物组分5962的64％乙晴等梯度洗脱图谱。在FPLC上两个主要组分X和Y被分离出来。横坐标光强度(254nm)；纵坐标组分编号(1ml/组分).
图4.文冠果提取物的组分X(2021)和Y(2728)对膀胱细胞生长的影响仅Y抑制膀胱细胞生长。
图5.文冠果提取物组分Y的高效液相色谱(HPLC)35％乙晴等梯度洗脱图谱，显示Y(2728)含有4-5个组分Y0，Y1，Y2，Y3和Y4。
图6.文冠果提取物组分Ys的高效液相色谱(HPLC)45％乙晴在C18柱(Delta PakC18)上的等梯度洗脱图谱。Y1和Y2清晰地分离开来。
图7.化合物Y的质子核磁共振(NMR)的图谱。
图8.化合物Y1二维核磁共振(HMQC)图谱。
图9.化合物Y1二维核磁共振(HMBC)图谱。
图10.化合物Y1质子COSY-NMR图谱图11.化合物Y2质子核磁共振图谱。
图12.化合物Y2二维核磁共振(HMQC)图谱。
图13.化合物Y5质子核磁共振图谱。
图14.化合物Y5二维核磁共振(HMQC)图谱。
图15.化合物Y1的四个可能的化学结构A化学结构Y1-1；B化学结构Y1-2；C化学结构Y1-3；D化学结构Y1-4。
图16.化合物Y1的化学结构。
图17.化合物Y1和Y1-2对卵巢癌细胞生长的影响。
图18.用快速液相色谱(FPLC)纯化化合物R。
图19.用高效液相色谱(HPLC)分析从快速液相色谱(FPLC)获得的组分#9，#10和#11。
图20.用高效液相色谱(Delta-Pak C18柱)纯化组分R。A被快速液相色谱(FPLC)分出的组分#10进一步被高效液相色谱分离(1)Delta-Pak C18柱；(2)30％乙晴等梯度洗脱和(3)流速1ml/分，在207nm检测，光密度-0.128。B在同等条件下，R的主要组分再次色谱分析。
图21.化合物R1的质子核磁共振(NMR)的图谱。
图22.化合物R1二维核磁共振(HMQC)图谱。
图23.化合物R1二维核磁共振(HMBC)图谱。
图24.化合物R1质子COSY-NMR图谱图25.化合物R1的C13核磁共振图谱。
图26.化合物R1的化学结构。
图27.化合物Y-a的化学结构。
R5＝B or C or S1(见注释1)；R1＝A or B or C；R2＝A or B or C；R4＝B orC。注释1A＝当归酰基；B＝乙酰基；C＝H；S1＝侧链含有一至多个糖D-葡萄糖，D-半乳糖，L-鼠李糖，L-阿拉伯糖，D-木糖和糖醛酸D-葡萄糖醛酸，D-半乳糖醛酸，以及它们的衍生物。
图28.化合物Y-b的化学结构。
R5＝B or C or S1(见注释1)；R1＝A or B or C；R2＝A or B or C；R4＝B orC。注释1A＝当归酰基；B＝乙酰基；C＝H；S1＝侧链含有一至多个糖D-葡萄糖，D-半乳糖，L-鼠李糖，L-阿拉伯糖，D-木糖和糖醛酸D-葡萄糖醛酸，D-半乳糖醛酸，以及它们的衍生物。
图29.化合物Y-c的化学结构。
图30.化合物Y1-a的化学结构。
R5＝B or C or S1(见注释1)；R1＝A or B or C；R2＝A or B or C；R4＝B orC。注释1A＝当归酰基；B＝乙酰基；C＝H；S1＝侧链含有一至多个糖D-葡萄糖，D-半乳糖，L-鼠李糖，L-阿拉伯糖，D-木糖和糖醛酸D-葡萄糖醛酸，D-半乳糖醛酸，以及它们的衍生物。
图31.化合物Y1-b的化学结构。
R5＝B or C or S1(见注释1)；R1＝A or B or C；R2＝A or B or C；R4＝B orC。注释1A＝当归酰基；B＝乙酰基；C＝H；S1＝侧链含有一至多个糖D-葡萄糖，D-半乳糖，L-鼠李糖，L-阿拉伯糖，D-木糖和糖醛酸D-葡萄糖醛酸，D-半乳糖醛酸，以及它们的衍生物。
图32.化合物Y1-c的化学结构。
R5＝B or C or S1(见注释1)；R1＝A or B or C；R2＝A or B or C；R4＝B orC。注释1A＝当归酰基；B＝乙酰基；C＝H；S1＝侧链含有一至多个糖D-葡萄糖，D-半乳糖，L-鼠李糖，L-阿拉伯糖，D-木糖和糖醛酸D-葡萄糖醛酸，D-半乳糖醛酸，以及它们的衍生物。
图33.用高效液相色谱(HPLC 20％乙晴等梯度洗脱)分离从快速液相色谱(FPLC)获得的组分O。
图34.组分#28再次色谱分析。
图35.组分#34再次色谱分析。
图36.组分#54再次色谱分析。
专利申请的详细说明本发明提供文冠果粗皂甙提取物，其特征在于所述文冠果粗皂甙提取物从文冠果的果壳和/或果柄，种仁，种壳，枝干，树皮和根中取得的。其从文冠果制备粗皂甙的工艺过程如下采收文冠果，清选果壳，干燥；粉碎文冠果果壳，得文冠果果壳粉；用有机溶剂(乙醇，甲醇等)浸提文冠果果壳粉，有机溶剂∶果壳粉2∶1的比例，在室温下，浸提4-5次，每次20-35小时，得有机溶剂提取物；收集浸提液，再回流热提(80C)2-3次，得二次提取物；把二次提取物溶于水，得水提取液；用正丁醇萃取水提取液，得正丁醇提取物；正丁醇萃取物经色谱分离得粗皂甙。该粗皂甙提取物主要含有皂甙。
根据传统中医理论，遗尿，尿频和尿急是由肾亏引起的。因此，治疗遗尿，尿频和尿急要用草药，如人参，巴戟天，肉苁蓉，杜仲和虫草固肾。这些固肾的草药可增强肾功能，通过“肾经”调节人体的水分代谢作用，从而达到治疗遗尿，尿频和尿急的目的。
本发明提供的文冠果提取物也可用于治疗遗尿，尿频和尿急，但是，是通过“膀胱经”调节人体的水分代谢作用从而达到治疗遗尿，尿频和尿急的目的。本发明提供的文冠果提取物可刺激膀胱的生长(见图9和23B)，增强膀胱控制排尿的能力和尿容量，详见国际PCT专利申请No.PCT/US04/33359的实验5(101-106页)。因而，把入“肾经”的草药和本发明提供的入“膀胱经”的文冠果提取物结合起来用于治疗遗尿，尿频和尿急，会受到更佳的效果。
本发明还提供了由文冠果提取物制成的药物或保健品，其特征在于所述这些文冠果提取物制成的药物或保健品分别可和维生素B，D，K，葡萄籽提取物或其它抗氧化剂，冬虫夏草及其提取物，银杏及其提取物，人参和西洋参及其提取物，聚果菊及其提取物，小金丝桃及其提取物，葛根及其提取物，天麻及其提取物，蜜环菌及其提取物，丹参及其提取物，三七及其提取物，红曲，黄芪及其提取物，地黄及其提取物，当归及其提取物，远志及其提取物，灵芝及其提取物，茯苓及其提取物，甘草及其提取物，石松碱A，敌百虫，拉西汀(Lacithin)，脑洗泰来(Nocetile)，叶酸，氨基酸，肌酸激酶和纤维添加剂等配伍一起制成各种造新药物和保健食品。
本发明提供的文冠果提取物，其特征在于所述提取物可抑制5-羟色胺(5-HT)的吸收，5-羟色氨的存在可维持和加强人的深度睡眠。文冠果提取物抑制5羟色氨的吸收’从而打破深度睡眠，使人在膀胱尿满时可以惊醒，避免尿床。(详见国际PCT专利申请No.PCT/US04/33359的38页)。
本发明提供的文冠果提取物，其特征在于所述提取物可增强多巴胺的活力，从而提高中枢神经系统的警觉能力。
本发明提供的文冠果提取物，其特征在于所述提取物可调节制尿贺尔蒙(ADH)的合成，以减少肾脏产尿量，防止遗尿发生。
本发明提供的文冠果提取物，其特征在于所述提取物可抑制乙酰胆碱酶(AchE)的合成，调解乙酰胆碱(Ach)的释放，吸收和分解，从而改善大脑中枢系统和泌尿系统信息的传递过程，避免由5-羟色氨(5HT)造成的深度睡眠发生，而增加轻度睡眠。
本发明提供的文冠果提取物，其特征在于所述提取物可防止睡眠麻痹(sleepparalysis)的发生。
本发明提供的文冠果提取物，其特征在于所述提取物可为睡眠提供警觉系统。
本发明提供的文冠果提取物，其特征在于所述提取物有助于膀胱和括约肌的生长发育，防止遗尿发生。发育不良的膀胱和括约肌不能控制排尿过程。
本发明提供从文冠果提取物提出的化合物，其特征在于所述化合物可治疗癌症，如卵巢癌，膀胱癌，骨癌，乳腺癌，白血病，肝癌，前列腺癌和脑癌，但又不限于上癌症。
本发明专利还公开了一种化合物，其特征在于所述化合物含有三萜皂甙原或其它皂甙原，在碳3位上联有糖链，在碳21和22位上联有酰基和/或糖链，在糖链上联有当归酰基。这些基团有机(operatively)组成了具生物活性的化合物。
本发明专利公开了一种化合物，其特征在于所述化化合物中具有如下的化学结构化合物Y1 3-O-[β-D-半乳糖吡喃酰基(1→2)]-α-L-阿拉伯糖呋喃酰基(1→3)-β-D-葡萄糖醛吡喃酰基-21-O-(3，4-二党归酰基)-α-L-鼠李糖吡喃酰基-22-O-乙酰基-3β，16α，21β，22α，28-五羟基-12-烯五环三萜皂甙。
本发明专利公开了一种化合物，其特征在于所述化化合物中具有如下的化学结构 化合物R13-O-[二党归酰基-(1→3)-β-D-葡萄糖吡喃酰基-(1→6)]-(-D-葡萄糖吡喃酰基-28-O-[(-L-鼠李糖吡喃酰基-(1(2)-(-D-葡萄糖吡喃酰基-(1(6)-(-D-葡萄糖吡喃酰基1-3(，21(，22(，28-四羟基-12-烯五环三萜皂甙。
本发明专利还公开了一种化合物，其特征在于所述化化合物的化学结构见于图15A，15B，15C，15D，27，28，29，30，31和32。
本发明专利还公开了一类盐类，其特征在于所述盐类是由上述化合物形成的。
本发明专利还公开了一类组合物(composition)，其特征在于所述组合物是由上述化合物或其盐类和适当载体形成的。
本发明专利还公开了一类药物组合物，其特征在于所述组药物合物是由一定数量的上述化合物或其盐类和适当药物载体所组成。
本发明专利公开了一种抗卵巢癌的物组合物，其特征在于所述组合物是由上述组和物所组成。
本发明还提供了检测文冠果提取物的细胞特异性毒性反应的方法，其特征在于所述方法是MTT检测法。
材料和方法细胞下列人体癌细胞是从美国模式菌种保藏中心(Americarn TypeCulture Collection)获得HTB-9(膀胱)，HeLa-S3(宫颈)，DU145(前列腺)，H460(肺)，MCF-7(乳腺)，k562(白细胞)，HCT116(结肠)，HepG2(肝)，U20S(骨)，T98G(脑)，和OVCAR-3(卵巢)。
培养HeLa-S3(宫颈)，DU145(前列腺)，MCF-7(乳腺)，HepG2(肝)和T98G(脑)细胞培养在MEN(Earle盐)培养基上。HTB-9(膀胱)，H460(肺)，562(白细胞)和OVCAR-3(卵巢)培养在RPMI-1640培养基上，其它细胞在McCoy-5A培养基上。
这些培养基都要添加10％的牛胎儿血清，谷氨酰胺和抗菌素。在CO2浓度为5％的培养箱内培养。
MTT检测检测方法基本按照Carmicheal et al.1987的方法，仅个别地方小有改动。这些细胞培养在有96个小穴的培养皿的小穴中24小时；每穴1万HTB-9(膀胱)，HeLa-S3(宫颈)，H460(肺)，HCT116(结肠)，T98G(脑)，和OVCAR-3(卵巢)的细胞；每穴1.5万DU145(前列腺)，MCF-7(乳腺)，HepG2(肝)和U20S(骨)的细胞；每穴4万k562(白细胞)。然后，将文冠果提取物的试样放入穴中，再培养48小时(肝和骨癌细胞72小时，乳腺癌细胞96小时。然后，MTT(0.5mg/ml)加入每个穴中，培养1小时。产生的formazan溶于DMSO，然后用ELISA读数器(Dynatech，Model R700)测它的O.D.值(TD)。加入试样前的MTTO.D.值(TO)也要测出。每种细胞生长的百分数(％G)可按下面公式求出％G＝(TD-TO/TC-TO)×100 (1)(TC是对照细胞组的O.D.值)当TO＜TD时，则细胞特异性毒性反应(LC)值为％LC＝(TD-TO/TO)×100 (2)本发明提供的抗癌化合物，其特征在于所述化合物的分子式是C65H100O27，化学名称3-O-[β-D-半乳糖吡喃酰基(1→2)]-α-L-阿拉伯糖呋喃酰基(1→3)-β-D-葡萄糖醛吡喃酰基-21-O-(3，4-二党归酰基)-α-L-鼠李糖吡喃酰基-22-O-乙酰基-3β，16α，21β，22α，28-五羟基-12-烯五环三萜皂甙，即化合物Y1。它的衍生物也具抗癌作用。另外，本发明还提供了化合物的化学结构Y，化学结构R1，化学结构1-4，化学结构Y-a，化学结构Y-b，化学结构Y-c，化学结构Y1-a，化学结构Y1-b，化学结构Y1-c，化学结构Y1-3，化学结构Y1-4和它们的衍生物，详见图案5，27，28，29，30，31和32。这些化合物可从文冠果中提出或人工合成。
本发明提供的文冠果提取物的皂甙化合物及其衍生物可调节Wnt信号途径中的生化环节或其受体，Wnt信号系统(Wht signaling pathway)调控胚胎发育和细胞的增殖，死亡和形态发育，同时在癌细胞的发生方面也起着重要作用。发现一些癌症发生是和Wnt信号系统被不适当地活化有关。本发明提供的文冠果提取物和新皂甙化合物或其组合物，可调控Wnt信号途径中的生化环节或其受体，避免Wnt信号系统的不适当地活化，从而防止制癌细胞的生成和增殖。
细胞有丝分裂和Ras-MAP激酶链信号途径有关，如果Ras-MAP激酶链的活动过分活跃，会导致基因调控蛋白Myc的生成，Myc会加快一些基因的复制，如果这一活动过分活跃，会导致癌细胞的生成和增殖。本发明提供的文冠果提取物和新皂甙化合物或其组合物，可调控Ras-MAP激酶链的活动，使Ras-MAP激酶途径的活动不能过分活跃，从而不会引起癌细胞的生成和增殖。
有时Ras信号途径中的氨基酸发生突变，引起含有这一氨基酸的蛋白永久性的过分活跃，导致从属的Ras信号途径在没有有丝分裂的刺激的情况下也过分活跃。同样，氨基酸发生突变也会引起Myc信号途径活动过分活跃。这都会导致细胞异常生长，而引起癌细胞的生成。本发明提供的文冠果提取物和新皂甙化合物或其组合物，可调控氨基酸发生突变从属的Ras信号途径和Myc信号途径，使它们不能过分活跃，从而不会引起细胞异常生长而导致癌变。
本发明提供的文冠果提取物的皂甙化合物及其衍生物可启动不正常细胞内的监控点(checkpoint)机制，细胞内有一种监控点(checkpoint)机制，监控畸形有丝分裂和引起不正常过分活跃的细胞的死亡。癌细胞的监控点机制由于编译监控点机制的基因突变而不能活动，造成癌细胞无限制的生长和增殖。本发明提供的文冠果提取物和新皂甙化合物或其组合物，可启动细胞内的监控点机制，及时制止不正常的有分裂活动发生和制止癌细胞的生长和增殖。
本发明提供的文冠果提取物的皂甙化合物及其衍生物可调控胞外生长信号途径。刺激细胞生长的胞外生长因子可通过细胞表面的受体启动胞内信号途径，激活PI3激酶促进蛋白质的合成，至少通过激活激酶eif4e和s6增加mRNA的扩增，从而刺激细胞的生长。本发明提供的文冠果提取物和新皂甙化合物或其组合物，可调控胞外生长信号途径的环节或其受体，从而影响胞内生长信号途径，抑制细胞过分增殖，防止癌细胞的产生。
细胞分裂也要受到细胞核内的Myc蛋白的控制。Myc蛋白过多会引起细胞的过分增殖，癌细胞形成。本发明提供的文冠果提取物和新皂甙化合物或其组合物，控制细胞内Myc蛋白的过量产生，从而防止细胞过分增殖，导致肿瘤形成。
转化生长因子α(TGF-alpha)可诱导鼠和鸡的不成熟的先期造血细胞(例如BFU-E)的长期增值，还可诱导BFU-EDE细胞转化成红血球。转化生长因子α还可刺激培养的内皮细胞的增殖。它在肿瘤组织的血管化方面起重要作用。转化生长因子α是由keratimcyte，巨噬细胞，肝细胞和血小板等产生的，病毒感染可刺激转化生长因子α的合成。本发明提供的文冠果提取物和新皂甙化合物或其组合物，可调控转化生长因子α信号途径的环节或其受体，从而抑制卵巢和膀胱癌细胞的生长。
转化生长因子β(TGF-beta)可调控细胞的增长，阻止许多细胞的生长。它有两种受体受体1受体2。它们是丝氨酸-苏氨酸激酶，通过SMAD编译调节基因家族传递信号。转化生长因子β信号途径和SMAD编译调节基因的突变和癌变有关。本发明提供的文冠果提取物和新皂甙化合物或其组合物，可调控转化生长因子β信号途径的环节或其受体，从而抑制卵巢和膀胱癌细胞的生长。
DNA肿瘤病毒可通过干扰细胞循环控制蛋白E6和蛋白p53引起癌变。蛋白p53基因的突变使癌细胞在DAN损伤的情况下继续生存和增长。乳头瘤病毒利用蛋白E6和E7去分别使蛋白p53和Rb排序，这一过程会启动突变的细胞，使他们生存，分裂和增长。损伤细胞的增长会导致癌变。本发明提供的文冠果提取物和新皂甙化合物或其组合物，可调控蛋白E6和E7和释放蛋白p53和Rb，而抑制畸形细胞的分裂生长。同时，还可以控制或者与这些蛋白质发生反应，引起癌细胞死亡。
蛋白p53可以帮助多细胞有机体在DAN损伤和其它不利的情况下安全的自我复制，并在危险的情况下停止细胞分裂和增长。癌细胞往往含有大量突变的蛋白p53，表明在不利的情况下遗传上的突变或者生长受到压抑会启动蛋白p53。因而，失去蛋白p53的活性是很危险的，因为它会使突变的细胞继续完成它的生长周期，避免死亡。所以，如果DAN受到损伤，一些细胞会死亡，那些没有修复损伤而生存下来并能继续增长的细胞，可能携带一组败坏的基因组，在基因扩增的过程中，导致失去抑制癌的基因，而启动致癌基因。同时，基因扩增也可能使细胞发展抗药性。本发明提供的文冠果提取物和新皂甙化合物或其组合物，可调蛋白质53信号途径的环节或其受体，从而抑制癌细胞增殖。
所有细胞的细胞核内都有各种休眠的procaspase，等待命去杀死细胞。procaspase是一种休眠的酶原，由自杀蛋白酶形成。它可通过蛋白酶的裂被另外caspase酶组动。两个裂的碎片结合在一起组成了caspase的有活性的部分。一个有活性的酶都被认为是这两个部分之一的四分体。每一动了的caspase分子可裂成多个procaspase分子，它们反过来又动更多的caspase分子。通过这一链式反应，导致大量procaspase分子的爆炸式的活动。一些动了的procaspase裂成多个关键的蛋白质，包括细胞液蛋白和nuclear-lamins，控制细胞的死亡。动细胞外的死亡受体也能动procaspase。但是，由于基因突变癌细胞的杀死细胞的信号被阻断了。因而，癌细胞就不断的分裂，导致了癌变。本发明提供的文冠果提取物和新皂甙化合物或其组合物，可疏通阻滞癌细胞“自杀”信号传递的通路，使癌细胞“自杀”。
本发明专利还公开了一种化合物，其特征在于所述化合物含有三萜皂甙原或其它皂甙原，在碳3位上联有糖链，在碳21和22位上联有酰基和/或糖链，在糖链上联有当归酰基。这些基团有机(operatively)组成了具生物活性的化合物。
本专利还公开了一种抑制癌细胞生长的方法，其特征是所述方法是使一定量的上述化合物和适当的药物载体所组成的药物去接触所述癌细胞。
本专利还公开了一种抑制癌细胞生长的方法，其特征是调整上述药物的用量。
下面通过实施例进一步说明本专利公开的文冠果提取物，它的组成，功能和应用，以及他们的制备方法。
实施例之一 文冠果提取物的制备制备工艺过程如下(a)采收文冠果果壳，枝干，叶，种仁，根和树皮，清选，干燥，粉碎，得文冠果原料粉；(b)用有机溶剂浸提文冠果原料粉，有机溶剂∶原料粉2∶1的比例，浸提4-5次，每次20-35小时，得有机溶剂提取物；(c)收集浸提液，再回流热提(80C)2-3次，得二次提取物；(d)回收有机溶剂，得文冠果提取物浸膏；(e)干燥和灭菌，得粉状文冠果提出物。
实施例之二 用高压液相色谱(HPLC)分离提纯文冠果提取物方法和材料色谱柱采用C18逆相μbondapak柱(Water P/N 27324)，乙睛(10％)，三氟乙酰酸(TFA，0.005％)为平衡液。
进样样品溶入10％的乙睛-TFA(0.005％)中，浓度为1mg/ml；进样20μg。
洗脱用乙睛逐梯度洗脱，在70分钟内，浓度由10％升到80％；流速0.5ml/分。然后，在浓度80％时再保持10分钟(70-80分)。然后，乙睛浓度降到10％(80-85分)，并保持25分钟(85-110分)。
检测吸收波长207nm。
记录纸速度0.25cm/分。
光密度(OD)满程，0.128。
所用仪器Waters Model 510溶剂传送系统；Waters 484吸收率可调探测器；Waters 745/745B数据模型。
结果HPLC图谱显示，有60-70个峰。其中有4个为主要的峰，10个中等的峰，余者为小峰(见图5)。其中27个主要的峰按乙睛洗脱液的浓度递增的顺序编号为a-z(见图1)。
实施例之三 MTT检测文冠果提取物的细胞特异性毒性反应的方法方法和材料细胞下列人体癌细胞是从美国模式菌种保藏中心(American TypeCulture Collection)获得HTB-9(膀胱)，HeLa-S3(宫颈)，DU145(前列腺)，H460(肺)，MCF-7(乳腺)，k562(白细胞)，HCT116(结肠)，HepG2(肝)，U20S(骨)，T98G(脑)，和OVCAR-3(卵巢)。
培养HeLa-S3(宫颈)，DU145(前列腺)，MCF-7(乳腺)，HepG2(肝)和T98G(脑)细胞培养在MEN(Earle盐)培养基上。HTB-9(膀胱)，H460(肺)，562(白细胞)和OVCAR-3(卵巢)培养在RPMI-1640培养基上，其它细胞在McCoy-5A培养基上。
这些培养基都要添加10％的牛胎儿血清，谷氨酰胺和抗菌素。在CO2浓度为5％的培养箱内培养。
MTT检测检测方法基本按照Carmicheal et al.1987的方法，仅个别地方小有改动。这些细胞培养在有96个小穴的培养皿的小穴中24小时；每穴1万HTB-9(膀胱)，HeLa-S3(宫颈)，H460(肺)，HCT116(结肠)，T98G(脑)，和OVCAR-3(卵巢)的细胞；每穴1.5万DU145(前列腺)，MCF-7(乳腺)，HepG2(肝)和U20S(骨)的细胞；每穴4万k562(白细胞)。然后，将文冠果提取物的试样放入穴中，再培养48小时(肝和骨癌细胞72小时，乳腺癌细胞96小时。然后，MTT(0.5mg/ml)加入每个穴中，培养1小时。产生的formazan溶于DMSO，然后用ELISA读数器(Dynatech，Model R700)测它的O.D.值(TD)。加入试样前的MTTO.D.值(TO)也要测出。每种细胞生长的百分数(％G)可按下面公式求出％G＝(TD-TO/TC-TO)×100(1)(TC是对照细胞组的O.D.值)当TO＜TD时，则细胞特异性毒性反应(LC)值为％LC＝(TD-TO/TO)×100 (2)结果在这10种癌细胞中，可根据对文冠果提取物的敏感程度分为4组最敏感的是卵巢癌细胞；第二敏感的是膀胱，骨，前列腺和白血病癌细胞；有点敏感的是肝，乳房和脑癌细胞；不太敏感的是结肠，宫颈和肺癌细胞(图23和国际专利申请书No.PCT/US04/33359的表8.1)。
表A文冠果提取物的MTT检测结果
同时发现，低浓度的文冠果提取物可刺激膀胱，骨，和肺细胞的生长(详见国际专利申请书No.PCT/US04/33359的109-110页)。
实施例之四 文冠果的化合物Y1的提纯分离和化学结构确定的方法(A)用快速液相色谱(FPLC)分离文冠果的提取物的组分的方法方法色谱柱采用octadecyl活化的硅胶柱，2cm×28cm，用乙睛(10％)-TFA(0.005％)为平衡液。
进样样品溶入10％的乙睛-TFA(0.005％)，浓度为100mg/ml；进样体积1-2ml。
梯度洗脱用10-80％的乙睛(总共500ml)梯度洗脱。
检测吸收波长254nm。
收集分离组分从10％-72％的乙睛洗脱液中共得到90个组分，每组分5ml。
所用仪器AKTA-FPLC；泵P920；检测器UPC-900；Frac-900。
结果FPLC洗脱图谱显示，有4-5大的组分(见图4)。这些组分进一步用高效液相色谱(HPLC)分析，其中一些在图21L按a-z编号的特别的小峰(成分)再在FPLC的组分图谱上定位。
经FPLC分离的组分被分为7组，并用于膀胱细胞生长的MTT检测。结果表明，至少有一组(5962)对膀胱细胞生长有抑制作用(图2B)。
纯的文冠果提取物Y(5962)组分失去了刺激膀胱，骨，和肺细胞的生长的能力，但是，仍然保持抑制癌细胞的能力。
(B)用快速液相色谱(FPLC)进一步分离文冠果生物活性物质组分#5962。
方法色谱柱采用octadecyl活化的硅胶，50ml，2cm×28cm，用乙睛(64％)-TFA(0.005％)为平衡液。
进样样品溶入65％的乙睛-TFA，浓度为1-2mg/ml；
进样体积1-2ml。
洗脱用64％乙睛等梯度洗脱。
检测吸收波长254nm。
收集分离组分从洗脱液中收集前90个组分，每组分1ml。
所用仪器AKTA-FPLC；泵；P920；检测器UPC-900；Frac-900。
结果组分#5692用开式ODS-C18分流柱和64％的isocratic乙睛洗脱进一步分离和纯化，得到两个主要组分X和Y(图3)。但是，MTT检测结果显示，仅组分Y癌细胞有抑制反应(图4)。
(C)高压液相色谱(HPLC)分离文冠果生物活性物质组分Y方法色谱柱采用Waters μbondapak C18(3.9mm×300cm)。
洗脱35％或45％的等梯度洗脱。
流动速率0.5ml/分，检测吸收波长207nm。
检测光密度(O.D.)标度0.128；记录纸速度0.25cm/分。
结果用35％等梯度洗脱，组分Y分离出4-5成份(Y0，Y1，Y2，Y3，Y4和Y5)(图5)。
(D)用HPLC把组分Y中的生物活性成分分离提纯出来方法色谱柱采用Waters Delta Pak C18-300A。
洗脱45％的等梯度洗脱。
流动速率1.0ml/分。
检测吸收波长207nm。
结果Y1和Y2被很好地分离出来，并分别予以收集。但是，Y3/Y4和Y5没有很好地分离开(图6)。Y1峰的部分收集起来，并真空冷冻干燥(化合物Y1)。
最终提纯的Y1组分外观呈不定型的白色粉末状。可溶于水醇中(甲醇和乙醇)，50％的乙睛和100％的吡啶中。
Y1和Y2 MTT检测结果显示，它们都有很强的抗癌活性(图17)。
(E)文冠果生物活性物质Y组分的化学结构的测定方法核磁共振(NMR)分析纯的文冠果提取物Y组分样品溶在含有0.05％TMS的吡啶-d5(pydine-D5)中，用带有QXI探头(1H/13C/15N/31P)的Bruker Avance 600MHz核磁共振仪，获得所有样品的298k核磁共振谱。一维1H的核磁共振谱的扫描次数(16-128)取决于样品的浓度。二维HMQC核磁共振谱，谱宽6000×24000Hz，t1和t2维的资料点分别为2024×256，扫描次数为4-128。二维HMBC核磁共振谱，谱宽6000×30000Hz，t1和t2维的资料点分别为2024×256，扫描次数为64。这些二维数据通过数学演算和运用XWIN-NMR软件进行Fourier变换，最后得到的二维HMQC和HMBC核磁共振谱的矩阵的规模分别是2048×256和2048×512(data points，F2×F1)。
质谱分析文冠果提取物样品的质量通过MALDI-TOF质谱测定法来测定。
首先将样品溶于乙睛中，然和CHCA母液混合(α-氰-4-羟基肉硅酸10mg/ml，溶于50∶50水/乙睛和0.1％TFA中)。样品完全溶于乙睛中，和母液混合后仍保持溶解状态。分子量通过高分辨率的质谱仪测定。
结果组分Y1组分Y1的质子核磁共振谱见图7。组分Y1的二维HMQC核磁共振谱的数据见图8，二维HMBC核磁共振谱的数据见图9，二维COSY核磁共振谱的数据见图10。
根据这些资料和分析(见表1)，从文冠果提取物分离出具生物活性的化合物Y1是一种三萜皂甙，含有2个糖链4个糖，联在其中含有1个糖的糖链上的2个当归酰基，化合物Y1的分子式C65H100O27，化学结构如下图所示
化学名称3-O-[β-D-半乳糖吡喃酰基(1→2)]-α-L-阿拉伯糖呋喃酰基(1→3)-β-D-葡萄糖吡喃酰基-21-O-(3，4-二党归酰基)-α-L-鼠李糖吡喃酰基-22-O-乙酰基-3β，16α，21β，22α，28-五羟基齐墩果-12-烯三萜皂甙。
表1.化合物Y1的13C和1H NMR数据(溶在吡啶-d5d中)a
a数据是根据HMQC和HMBC的相关资料确定(The data were assigned based on HMQC andHMBC correlations.)Y1的质量根据MALDI-TOF测定是is 1358.71，和Y1理论值加上两个钠(Na)和一个氢(H)是一致的(1312.64)。
组分Y2组分Y2的质子核磁共振谱见图11。组分Y2的二维HMQC核磁共振谱的数据见图12。
组分Y5组分Y5的质子核磁共振谱见图13。组分Y2的二维HMQC核磁共振谱的数据见图14。
实施例之五 文冠果的化合物Y1的酸解化合物Y是从文冠果纯化分离出来的(详见国际PCT专利申请No.PCT/US04/33359的107-108，110和136页)通过酸解，化合物Y1-c的化学结构被确定下来。
方法5mg的文冠果提取物Y溶于3ml的甲醇中，然后用3ml的3N HCl酸处理，回流4小时，进行水解。水解后用5％Na2CO3中和，然后用EtOAc萃取三次，得到水溶性部分，含糖类，和脂溶性部分，含皂甙元(aglycon)。皂甙元(aglycon)用硅胶柱色谱法(CHCl3∶MeOH，1∶9)或C18 ODS柱高压液相色谱法(HPLC)进一步提纯。得到约2mg新化合物Y-c(方法参阅Essentials of Carbohydrate Chemistry.By John F.Robyt，Springer，1998)。
低聚糖通过不完全酸水解和特殊酶水解来裂解。如，阿拉伯呋喃糖醛酸1→4键可被α-淀粉酶裂解。其它酶如β-淀粉酶，异粉酶，葡萄糖氧化酶，甘露聚糖酶(mannanse)和麦芽糖酶也可来裂解皂甙中的低聚糖。
皂甙中的当归酰胺基可用碱水解来裂解。如，把化合物Y溶于1M NaOH，室温下搅拌2-3小时，用2M HCl酸化或中和，水解了的皂甙再用乙酸乙酯萃取。然后，再在C18柱上用HPLC进一步提纯。通过酶水解，化合物Y可转化为下列化合物
和化合物 通过酸解，化合物Y1-c的化学结构被确定下来，如下 实施例之六 文冠果的化合物R1的提纯分离和化学结构确定的方法(A)用快速液相色谱(FPLC)分离文冠果的提取物的组分的方法方法色谱柱采用octadecyl活化的硅胶柱，2cm×28cm，用乙睛(10％)-TFA(0.005％)为平衡液。
进样样品溶入10％的乙睛-TFA(0.005％)，浓度为100mg/ml；
进样体积1-2ml。
梯度洗脱用10-80％的乙睛(总共500ml)梯度洗脱。
检测吸收波长254nm。
收集分离组分从10％-72％的乙睛洗脱液中共得到90个组分，每组分5ml。
所用仪器AKTA-FPLC；泵P920；检测器UPC-900；Frac-900。
结果FPLC洗脱图谱显示，有4-5大的组分(见图2A)。这些组分进一步用高效液相色谱(HPLC)分析，其中一些的特别的小峰(成分)，如a-z再在FPLC的组分图谱上定位编号(见图1)。
(B)用快速液相色谱(FPLC)进一步分离文冠果组分R方法色谱柱采用octadecyl活化的硅胶，50ml，2cm×28cm，用乙睛(30％)-TFA(0.005％)为平衡液。
进样样品溶入30％的乙睛-TFA，浓度为1-2mg/ml；进样体积0.2ml。
洗脱用30％乙睛等梯度洗脱。
检测吸收波长254nm。
收集分离组分从洗脱液中收集前90个组分，每组分1ml。
所用仪器AKTA-FPLC；泵P920；检测器UPC-900；Frac-900。
结果从快速液相色谱(FPLC)等梯度洗脱所得组分39-41(图2A)。用开式ODS-C18分流柱30％的isocratic乙睛洗脱进一步分离和纯化，得到两个主要组分中的两个成分得以确定(图18)。组分6-13的特性也得到进一步分析。
(C)高压液相色谱(HPLC)分离组分R方法色谱柱采用Waters μbondapak C18(3.9mm×300cm)。
洗脱30％的乙睛梯度洗脱(10-80％)。
流动速率0.5ml/分，检测吸收波长207nm。
检测光密度(O.D.)标度0.128；记录纸速度0.25cm/分。
结果用30％梯度洗脱，组分9-11含有一个主成分和几个次要成份(图19)。这些成分进一步用Delta Pak柱30％的乙睛等梯度洗脱，分离出4-5成分，其中主成分被确认为R1(图20A)。R1随后从柱上收集起来(图20B)。最终提纯的R1外观呈不定型的白色粉末状。可溶于水醇中(甲醇和乙醇)，50％的乙睛和100％的吡啶中。
(D)文冠果化合物R1的化学结构的测定方法核磁共振(NMR)分析请见实施例之四的核磁共振(NMR)分析。
质谱分析请见实施例之四的MALDI-TOF质谱测定法。
结果组分R1的质子核磁共振谱见图21，二维HMQC核磁共振谱的数据见图22，二维HMBC核磁共振谱的数据见图23，二维COSY核磁共振谱的数据见图24。组分R1的碳13核磁共振谱见图25，
根据上述这些资料，R1的功能集团和化学结构见表2。
表2.化合物R1的13C和1H NMR数据(溶在吡啶-d5d中)a
a功能集团的结构根据COSY，HMQC和HMBC的相关资料确定(The data were assigned based on COSY，HMQC and HMBC correlations.)b，c，d，f每纵行中数据具有相同字母的，是相互重迭的。e每纵行中数据具有相同字母的，是可能相互交换的。
根据对以上数据的分析，从文冠果提取物分离出具生物活性的化合物R1是一种三萜皂甙，含有2个糖链5糖，和联在其中含有2个糖的糖链上的一个当归酰基，化合物R1的分子式C65H105O29，化学结构如下图所示 化合物R1化学名称为3-O-[党归酰基-(1(3)-(-D-葡萄糖吡喃酰基(1(6)]-(-D-葡萄糖吡喃酰基-28-O-[(-L-鼠李吡喃酰基-(1(2)-(-D-葡萄糖吡喃酰基-(1(6)-(-D-葡萄糖吡喃酰基-3(，21(，22(，28-四羟基齐墩果-12-烯五环三萜皂甙。
实施例之七 文冠果的化合物O的提纯分离和化学结构确定的方法(A)用快速液相色谱(FPLC)分离文冠果的提取物的组分O的方法方法色谱柱采用octadecyl活化的硅胶柱，2cm×28cm，用乙睛(10％)-TFA(0.005％)为平衡液。
进样样品溶入10％的乙睛-TFA(0.005％)，浓度为100mg/ml；进样体积1-2ml。
梯度洗脱用10-80％的乙睛(总共500ml)梯度洗脱。
检测吸收波长254nm。
收集分离组分从10％-72％的乙睛洗脱液中共得到90个组分，每组分5ml。
所用仪器AKTA-FPLC；泵P920；检测器UPC-900；Frac-900。
结果FPLC洗脱图谱显示，有4-5大的组分(见图2A)。这些组分进一步用高效液相色谱(HPLC)分析，其中一些的特别的小峰(成分)，如a-z再在FPLC的组分图谱上定位编号(见图1)。
(B)用快速液相色谱(HPLC)进一步分离文冠果组分O方法色谱柱采用Waters Delta Pak C18-300A柱。
进样收集从FPLC分离出的样品#280，进HPLC分析。
进样体积0.2ml。
洗脱用20％乙睛等梯度洗脱。进样速度1ml/min，检测吸收波长254nm。收集组分28，34和54，并冻干燥。在同等条件下，再次把组分28，34和54进行液相色谱分析。
结果
从快速液相色谱(FPLC)等梯度洗脱观察到16个组分(图33)。用HPLC进一步分离和纯化组分34，35和36，得到单一峰的组分28，34和54，说明它们是单一的成分。
最终提纯的成分0-28和0-34外观呈不定型淡黄色粉末状。可溶于水醇中(甲醇和乙醇)，50％的乙睛和100％的吡啶中。最终提纯的成分0-54外观呈不定型白色粉末状。可溶于水醇中(甲醇和乙醇)，50％的乙睛和100％的吡啶中。
(C)从文冠果化合物O中纯化组分化学结构的测定方法核磁共振(NMR)分析请见实施例之四的核磁共振(NMR)分析。
质谱分析请见实施例之四的MALDI-TOF质谱测定法。
尽管本专利发明仅对一些特别关注的方面做了详尽的说明，但这并不意味着对其它不同的方面不能加以说明，和不能对已详尽说明的部分加以改变。很明显，详尽说明这些变化和改变是受到了本专利发明规模的影响。同时，上面提供的发明，说明和图表仅用于表述目的，并不能限制本专利发明对专利权利的要求。
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1，本专利申请的一种组合物，其特征在于所述组合物含有从冠果的果壳和/或果柄，叶，枝干，种仁，根和树皮中提出的化合物。
2，如申请专利范围第1项所述组合物，其特征是该组合物含有皂甙化合物。
3，本专利申请的一种治疗遗尿的药物或保健食品，其特征在于所述药物或保健食品含有如申请专利范围第1-2项所述的组合物。
4，本专利申请的一种松弛膀胱的药物或保健食品，其特征在于所述药物或保健食品含有如申请专利范围第1-2项所述的组合物。
5，本专利申请的一种可能改善大脑皮层和小脑反应能力的药物或保健食品，其特征是所述的药物或保健食品是含有如申请专利范围第1-2所述的组合物。
6，本专利申请的一种能防止睡眠进入深度睡眠的药物或保健食品，其特征是所述的药物或保健食品是含有如申请专利范围第1-2所述的组合物。
7，本专利申请的一种能改善膀胱壁中的扩约感受接收器给中枢神经系统发出信号能力的药物或保健食品，其特征是所述的药物或保健食品是含有如申请专利范围第1-2所述的组合物。
8，本专利申请的一种能用作乙酰胆碱酯酶(AchE)的抑制剂的药物或保健食品，其特征是所述的药物或保健食品是含有如申请专利范围第1-2项所述的组合物。
9，本专利申请的一种抗炎的药物或保健食品，其特征是所述的药物或保健食品是含有如申请专利范围第1-2项所述的组合物。
10，本专利申请的一种抗病毒的药物或保健食品，其特征是所述的药物或保健食品是含有如申请专利范围第1-2项所述的组合物。
11，本专利申请的一种能治疗人体免疫缺失的药物或保健食品，其特征是所述的药物或保健食品是含有如申请专利范围第1-7项所述的组合物。
12，本专利申请的一种可用作癌细胞抑制剂的药物或保健食品，其特征是所述的药物或保健食品是含有如申请专利范围第1-2项所述的组合物。
13，本专利申请的一种可降低血液中胆固醇和甘油三酯的药物或保健食品，其特征是所述的药物或保健食品是含有如申请专利范围第1-2项所述的组合物。
14，本专利申请的一种能防止大脑衰老，增进记忆和改善脑功能；治疗夜尿，尿频，尿失禁，痴呆，弱智，老年痴呆，孤独症，脑损伤，帕金森病等和其它由于脑功能不健全或障碍所引起的病症；医治关节炎，风湿症，循环不良，动脉硬化，雷诺病，心绞痛，心脏功能紊乱，冠心病，头痛，眩晕，肾脏功能紊乱，阳萎和早泻的组合物，其特征是所述的组合物是含有申请专利范围第1或2项所述的组合物。
15，本专利申请的一种配伍的药物或保健食品，其特征是所述的配伍的药物或保健食品是由如申请专利范围第1-2项所述的组合物所制成药物或保健食品和下列植物或其提取物，或其它药物配伍葡萄籽提取物或其它抗氧化剂提取物；虫草(Cordycepsspp.)或其提取物，银杏(Gingko biloba)或其提取物，人参(Panax ginseng)或其提取物，西洋参(P.quinquefolium)或其提取物，黄皮(Clausena lansium)或其提取物，聚果菊(Echinacea)或其提取物，小金丝桃(Hypericumperforatum)或其提取物，葛根(Pueraria lobata) 或其提取物，天麻(Gastrodia elata)或其提取物，蜜环菌(Armillariella mellea)或其提取物，丹参(Salvia miltiorrhiza)或其提取物，三七(Panax notoginsen)或其提取物，红曲(Monascus)或发酵物(Red yeast rice)，黄芪(Hedysarumpolybotrys) 或其提取物，地黄(Rehmannia glutinosa)或其提取物，当归(Anqelica sinensis)或其提取物，远志(Polygala tenuifoila)或其提取物，灵芝(Ganoderma spp.)或其提取物，茯苓(Poria cocos)或其提取物，甘草(Glycyrrhiza uralensis)或其提取物，石杉碱A(Huperzine A)，Lacithin，Metrifonate，Nocetile，reatine，叶酸，氨基酸，维他命B，D，K和纤维添加物等。
16，本专利申请的由如申请专利范围第1或2项所述的文冠果的植物的组合物所制成药物或保健食品的剂型，其特征是所述的剂型为胶囊，片剂，散剂，水剂或其它剂型。
17，如申请专利范围第2项所述的从从冠果的果壳和/或果柄，叶，枝干，种仁，根和树皮中提出柄粗皂甙提取物，其特征是制备粗皂甙提取物方法依下列步骤(a)采收文冠果，清选果壳和/或果柄，叶，枝干，种壳，根和树皮，干燥，粉碎，得文冠果粉；用有机溶剂浸提文冠果粉(2∶1)4-5次，每次20-35小时，得有机溶剂浸提液；(b)收集浸提取液，再回流热提(80℃)2-3次，得二次浸提液；(c)溶解流浸膏于水中，得水浸提液；集合并提取液；(d)用正丁醇浸提水浸提液，得正丁醇浸提物；(e)用色谱法分离正丁醇浸提物，得粗皂甙提取物。
18，如申请专利范围第17项所述有机溶剂，其特征在于所述有机溶剂是乙醇或甲醇。
19，如申请专利范围第2项所述的从从冠果的种仁中提出柄粗皂甙提取物，其特征是制备粗皂甙提取物方法依下列步骤(a)采收文冠果，剥壳得到种仁，压轧种仁去油得种仁饼；(b)干燥，粉碎种仁饼得种仁粉，用正己烷提取种仁粉进一步去油；(c)回收正己烷；(d)干燥，磨粉得去油种仁霜；(e)用有机溶剂(乙醇，甲醇等)浸提种仁霜，(2∶1)4-5次，每次20-35时，得有机溶剂浸提液；(f)收集浸提液，再回流热提(80℃)2-3次，得二次浸提液；(g)溶解二次浸提液于水中，得水浸提液；(h)用正丁醇浸提水浸提液，得正丁醇浸提物；(i)用色谱法分离正丁醇浸提物，得粗皂甙提取物。
20，如申请专利范围第19项所述有机溶剂，其特征在于所述有机溶剂是乙醇或甲醇。
21，本专利申请的一种由如申请专利范围第1或2项所述的文冠果的组成物所制成的药物或保健食品，其特征是所述的药物或保健食品可促进膀胱发育，可制止深度睡眠，可提高睡眠警觉状态，可调节制尿荷尔蒙(ADH)和促肾上腺皮质的荷尔蒙(ACTH)的释放，分解和摄取及其受体，可调节5-羟色胺(5-HT)的释放，分解和摄取及其受体，可调解乙酰胆碱(Ach)的释放，分解和摄取及其受体，可调节肾上腺素(AD)的释放，分解和摄取及其受体，可调节多巴胺(DA)的释放，分解和摄取及其受体和可调解去甲肾上腺素(NE)的释放，分解和摄取及其受体。
22，本专利申请的一种由如申请专利范围第1或2项所述的文冠果的组成物所制成的药物或保健食品，其特征是所述的药物或保健食品有助防止睡眠麻痹，可调节肽的合成，释放，分解和活性及其受体。
23，本专利申请的一种治疗癌症的药物或保健食品，其特征是所述的药物或保健食品是由如申请专利范围第1或者说所述的文冠果的组成取物所制成。
24，如申请专利范围第23项所述治疗癌症，其特征是所述的癌症包括卵巢癌，膀胱癌，骨癌，乳腺癌，白血病，肝癌，前列腺癌，结肠癌，宫颈癌，皮肤癌和脑癌。
25，本专利申请的一种由如申请专利范围第1或2项所述的文冠果的组成物所制成的药物或保健食品，其特征是所述的药物或保健食品可改善肺和膀胱功能；促进骨胳生长发育；减少尿量和次数和推迟排尿。
26，本专利申请的一种配伍的药物或保健食品，其特征是所述的配伍的药物或保健食品是由如申请专利范围第1或2项所述的组合物所制成药物或保健食品和下列草药配伍人参，巴戟天，肉苁茸，杜仲或冬虫夏草。
27，本专利申请一化合物，其特征是所述化合物的化学结构如下化合物Y1 3-O-[β-D-半乳糖吡喃酰基(1→2)]-α-L-阿拉伯糖呋喃酰基(1→3)-β-D-葡萄糖醛吡喃酰基-21-O-(3，4-二党归酰基)-α-L-鼠李糖吡喃酰基-22-O-乙酰基-3β，16α，21β，22α，28-五羟基-12-烯五环三萜皂甙。
28，本专利申请一化合物，其特征是所述化合物含有三萜类化合物或其它皂甙元，在碳3位有一个糖链，在碳21和22位有一乙酰基和/或糖链，当归酰基集团联在糖链上，糖链和当归酰基集团有机的(operatively)和皂甙元联在一起形成了该化合物。
29，如申请专利范围第28项所述的化合物，其特征是所述化合物至少含有两个糖。
30，如申请专利范围第28项所述的化合物，其特征是所述化合物至少一个当归酰基集团
31，本专利申请一化合物，其特征是所述化合物(Y1-1)的化学结构如图15A所示。
32，本专利申请一化合物，其特征是所述化合物(Y1-2)的化学结构如图15B所示。
33，本专利申请一化合物，其特征是所述化合物(Y1-3)的化学结构如图15C所示。
34，本专利申请一化合物，其特征是所述化合物(Y1-4)的化学结构如图15D所示。
35，本专利申请一化合物，其特征是所述化合物(Y-a)的化学结构如图27所示。
36，本专利申请一化合物，其特征是所述化合物(Y-b)的化学结构如图28所示。
37，本专利申请一化合物，其特征是所述化合物(Y-c)的化学结构如图29所示。
38，本专利申请一化合物，其特征是所述化合物(Y1-a)的化学结构如图30所示。
39，本专利申请一化合物，其特征是所述化合物(Y1-b)的化学结构如图31所示。
40，本专利申请一化合物，其特征是所述化合物(Y1-c)的化学结构如图32所示。
41，本专利申请一化合物，其特征是所述化合物的化学结构(R1)具有如下化学名称3-O-[β-D-半乳糖吡喃酰基(1→2)]-α-L-阿拉伯糖呋喃酰基(1→3)-β-D-葡萄糖醛吡喃酰基-21-O-(3，4-二党归酰基)-α-L-鼠李糖吡喃酰基-22-O-乙酰基-3β，16α，21β，22α，28-五羟基-12-烯五环三萜皂甙。
42，本专利申请一化合物，其特征是所述化合物的化学结构如下图所示
43，本专利申请一化合物，其特征是所述化合物的核磁共振或质子核磁共振谱如图7所示。
44，本专利申请一化合物，其特征是所述化合物的核磁共振或HMQC图谱如图8所示。
45，本专利申请一化合物，其特征是所述化合物的核磁共振或HMBC图谱如图9所示。
46，本专利申请一化合物，其特征是所述化合物的核磁共振图谱(COSY)如图10所示。
47，本专利申请一化合物，其特征是所述化合物的质子核磁共振谱如图11所示。
48，本专利申请一化合物，其特征是所述化合物的核磁共振或HMQC图谱如图12所示。
49，本专利申请一化合物，其特征是所述化合物的核磁共振或质子核磁共振谱如图13所示。
50，本专利申请一化合物，其特征是所述化合物的核磁共振或HMQC图谱如图14所示。
51，本专利申请一化合物，其特征是所述化合物的核磁共振或质子核磁共振谱如图21所示。
52，本专利申请一化合物，其特征是所述化合物的核磁共振或HMQC图谱如图22所示。
53，本专利申请一化合物，其特征是所述化合物的核磁共振或HMBC图谱如图23所示。
54，本专利申请一化合物，其特征是所述化合物的核磁共振图谱(COSY)如图24所示。
55，本专利申请一化合物，其特征是所述化合物的C13核磁共振谱如图25所示。
56，本专利申请一化合物，其特征是所述化合物的质子核磁共振谱如图37所示。
57，本专利申请一化合物，其特征是所述化合物的核磁共振或HMQC图谱如图38所示。
58，本专利申请一化合物，其特征是所述化合物的质子核磁共振谱如图39所示。
59，本专利申请一化合物，其特征是所述化合物的核磁共振或HMQC图谱如图40所示。
60，本专利申请一化合物，其特征是所述化合物的质子核磁共振谱如图41所示。
61，本专利申请一化合物，其特征是所述化合物的核磁共振或HMQC图谱如图42所示。
62，本专利申请一化合物，其特征是所述化合物的核磁共振或HMBC图谱如图43所示。
63，本专利申请的一种盐类化合物，其特征是所述盐类化合物为如申请专利范围第27-62项所述化合物的盐类化合物。
64，本专利申请的一种可抑制癌细胞生长的组合物，其特征是所述组合物含有申请专利范围第27-62项所述的任一化合物。
65，本专利申请的一种可抑制癌细胞生长的组合物，其特征是所述组合物由如申请专利范围第27-62项中所述化合物中任一项化合物和一种适合的载体所组成。
66，本专利申请的一种可抑制癌细胞生长的组合物，其特征是所述组合物是由一定数量的如申请专利范围第27-62所述任一项化合物和一种适合的药物载体所组成。
67，本专利申请的一种抑制卵巢癌细胞生长的方法，其特征是所述抑制卵巢癌细胞生长的方法是用一定浓度的如申请专利范围第27-62项所述组合物去接触卵巢癌细胞。
68，本专利申请的一种治疗遗尿的方法，其特征是所述方法是用一定浓度的如申请专利范围第27-62项所述组合物去治疗遗尿。
69，本专利申请的一种松弛膀胱的组合物，其特征是所述组合物含有如申请专利范围第27-62项中所述任一项化合物。
70，本专利申请的一种能改善大脑皮层和小脑反应能力的组合物，其特征是所述组合物含有如申请专利范围第27-62项中所述任一项化合物。
71，本专利申请的一种能防止睡眠进入深度睡眠的组合物，其特征是所述组合物含有如申请专利范围第27-62项中所述任一项化合物。
72，本专利申请的一种能改善膀胱壁中的扩约感受接收器给中枢神经系统发出信号能力的组合物，其特征是所述组合物含有如申请专利范围第27-62项中所述任一项化合物。
73，本专利申请的一种能治疗膀胱组织紧张的组合物，其特征是所述组合物含有如申请专利范围第27-62项中所述任一项化合物。
74，本专利申请的一种能用作乙酰胆碱酯酶(AchE)的抑制剂的组合物，其特征是所述组合物含有如申请专利范围第27-62项中所述任一项化合物。
75，本专利申请的一种抗炎的组合物，其特征是所述组合物含有如申请专利范围第27-62所述任一项化合物。
76，本专利申请的一种抗病毒的的组合物，其特征是所述组合物含有如申请专利范围第27-62项中所述任一项化合物。
77，本专利申请的一种能抑制人体免疫缺失病毒蛋白酶的组合物，其特征是所述组合物含有如申请专利范围第27-62项中所述任一项化合物。
78，本专利申请的一种用作癌细胞抑制剂的组合物，其特征是所述组合物含有如申请专利范围第27-62项中所述任一项化合物。
79，如申请专利范围第78项所述治疗癌症，其特征是所述的癌症包括卵巢癌，膀胱癌，骨癌，乳腺癌，白血病，肝癌，前列腺癌，结肠癌，宫颈癌，皮肤癌和脑癌。
80，本专利申请的一种可降低血液中胆固醇和甘油三酯的组合物，其特征是所述组合物含有如申请专利范围第27-62项中所述任一项化合物。
81，本专利申请的一种能防止大脑衰老和改善脑功能，治疗夜尿，尿频，尿失禁，痴呆，弱智，老年呆，孤独症，脑损伤，帕金森病等和由于脑功能不健全或障碍所引起的病症，医治关节炎，风湿症，循环不良，动脉硬化，雷诺病，心绞痛，心脏功能紊乱，冠心病，头痛，眩晕，肾脏功能紊乱，阳萎和早泻的的组合物，其特征是所述组合物含有如申请专利范围第27-62项中所述任一项化合物。
82，本专利申请的一种能改善膀胱功能或预防膀胱癌的组合物，其特征是所述组合物含有如申请专利范围第27-62项中所述任一项化合物。
83，本专利申请的一种可提高睡眠警觉状态的组合物，其特征是所述组合物含有如申请专利范围第27-62项中所述任一项化合物。
84，本专利申请的一种可调节制尿荷尔蒙(ADH)的释放，分解和摄取的组合物，其特征是所述组合物含有如申请专利范围第27-62项中所述任一项化合物。
85，本专利申请的一种可调节制促肾上腺皮质荷尔蒙(ACTH)的分泌，分解和摄取及其受体的组合物，其特征是所述组合物含有如申请专利范围第27-62项中所述任一项化合物。
86，本专利申请的一种可调节多5-羟色胺(5-HT)的释放，分解和摄取及其受体的组合物，其特征是所述组合物含有如申请专利范围第27-62项中所述任一项化合物。
87，本专利申请的一种可调乙酰胆碱(Ach)的释放，分解和摄取及其受体的组合物，其特征是所述组合物含有如申请专利范围第27-62项中所述任一项化合物。
88，本专利申请的一种可调节肾上腺素(AD)的释放，分解和摄取及其受体的组合物，其特征是所述组合物含有如申请专利范围第27-62项中所述任一项化合物。
89，本专利申请的一种可调节多巴胺(DA)的释放，分解和摄取及其受体的组合物，其特征是所述组合物含有如申请专利范围第27-62项中所述任一项化合物。
90，本专利申请的一种可调去甲肾上腺素(NE)的释放，分解和摄取及其受体的组合物，其特征是所述组合物含有如申请专利范围第27-62项中所述任一项化合物。
91，本专利申请的一种可调节肽的合成，释放，分解和活性及其受体的组合物，其特征是所述组合物含有如申请专利范围第27-62项中所述任一项化合物。
92，本专利申请的一种改善肺或膀胱功能的组合物，其特征是所述组合物含有如申请专利范围第27-62项中所述任一项化合物。
93，本专利申请的一种从文冠果提取化合物的方法，其特征是所述提取化合物的方法依下列步骤a.用有机溶剂浸提文冠果样品粉，得有机溶剂浸提液；b.收集合并浸提液；c.再回流热提浸提液，得二次浸提液；d.回收有机溶剂得流浸膏；e.干燥，灭菌流浸膏得文冠果粗提取物粉。f.用高效相色谱(HPLC)和快速液相色谱(FPLC)分离文冠果粗提取物粉，得一或多种组分；g.检测吸收波长为207nm或254nm；h.从上述组分中鉴定出具生物活性的组分；i.用快速液相色谱(FPLC)分离提纯出生物活性的成分(一种或几种)；j.再用高效相色谱(HPLC)从中提纯分离出具有生物活性的化合物。
94，如申请专利范围第93项所述的制备文冠果提取物的方法，其特征是所述文冠果样品是文冠果的果壳和/或果柄，枝干，叶，种仁，种壳，根，和树皮。
95，如申请专利范围第93项所述的制备文冠果提取物的方法，其特征是所述有机溶剂是乙醇，甲醇，乙醚，氯仿和丙醇等。
96，如申请专利范围第93项所述的制备文冠果提取物的方法，其特征是所述有机溶剂和文冠果样品的比例是2比1。
97，如申请专利范围第93项所述的制备文冠果提取物的方法，其特征是所述的有机溶剂浸提文冠果样品，浸提4-5次，每次20-35小时。
98，如申请专利范围第93项所述的制备文冠果提取物的方法，其特征是所述的回流热提是回流热提2-3次。
99，如申请专利范围第93项所述的制备文冠果提取物的方法，其特征是所述的回流热提温度是80℃。
100，如申请专利范围第93项所述的制备文冠果提取物的方法，其特征是所述鉴定生物活性成分的方法是用MTT鉴定法。
101，如申请专利范围第93(i-j)项所述的从文冠果提取物中分离提纯出的一种或几种生物活性成分，其特征是所述一种或几种生物活性成分的HPLC图谱见于图5-6。
102，如申请专利范围第93项所述的从文冠果提取物中分离和提纯出的的化合物，其特征是所述化合物的HPLC图谱见于图19-20。
103，如申请专利范围第93项所述的从文冠果提取物中分离和提纯出的的化合物，其特征是所述化合物的HPLC图谱见于图20。
104，本专利申请的一种能能治疗膀胱癌的组合物，其特征是所述组合物含有如申请专利范围第27-62项中所任一种述化合物。
105，本专利申请的一种能抑制卵巢癌细胞的方法，其特征是所述抑制卵巢癌细胞的方法是用一定浓度的如申请专利范围第27-62项中所述任一种组合物去接触卵巢癌细胞。
106，本专利申请的一种能治疗或抗卵巢癌的方法，其特征是所述的方法是用适当的浓度的如申请专利范围第27-62项中所述组合物去治疗卵巢癌。
107，本专利申请的一种能调节Wnt通路中的组元或它们的受体以阻止癌细胞增殖的组合物，其特征是所述组合物是由一定浓度如申请专利范围第27-62项所述的任一化合物所组成。
108，本专利申请的一种能调节Ras-MAP激酶链中的组元或它们的受体的组合物，其特征是所述组合物是由一定浓度如申请专利范围第27-62项所述的任一化合物所组成。
109，本专利申请的一种能调节Ras-pendent或Myc通路中的组元或它的受体的组合物，其特征是所述组合物是由一定浓度如申请专利范围第27-62项所述的任一化合物所组成。
110，本专利申请的一种能启动“检查机制”(checkpoint mechanism)以阻止癌细胞增殖的组合物，其特征是所述组合物是由一定浓度如申请专利范围第27-62项所述的任一化合物所组成。
111，本专利申请的一种能调节孢外生长的组元或其受体的组合物，其特征是所述组合物是由一定浓度如申请专利范围第27-62项所述的任一化合物所组成。
112，本专利申请的一种能调节Ras和MAP激酶链中的组元或其受体以阻止卵巢癌细胞增殖的组合物，其特征是所述组合物是由一定浓度如申请专利范围第27-62项所述的任一化合物所组成。
113，本专利申请的一种能调节Myc细胞增殖以阻止癌细胞裂殖的组元或其受体的组合物，其特征是所述组合物是由一定浓度如申请专利范围第27-62项所述的任一化合物所组成。
114，本专利申请的一种能调节α-TGF的组元或其受体以抑制卵巢和膀胱癌细胞增殖的组合物，其特征是所述组合物是由一定浓度如申请专利范围第27-62项所述的任一化合物所组成。
115，本专利申请的一种能调节β-TGF的组元或其受体以抑制卵巢和膀胱癌细胞增殖的组合物，其特征是所述组合物是由一定浓度如申请专利范围第27-62项所述的任一化合物所组成。
116，本专利申请的一种能调节蛋白质E6，E7和释放蛋白质Rb，p53以抑制畸形细胞裂殖的组合物，其特征是所述组合物是由一定浓度如申请专利范围第27-62项所述的任一化合物所组成。
117，本专利申请的一种能调节或能与蛋白质起反应以引起癌细胞死亡的组合物，其特征是所述组合物是由一定浓度如申请专利范围第27-62项所述的任一化合物所组成。
118，本专利申请的一种能调节合成蛋白质p53的通路和其受体以抑制癌细胞裂殖的组合物，其特征是所述组合物是由一定浓度如申请专利范围第27-62项所述的任一化合物所组成。
119，本专利申请的一种能使细胞中被阻断的自杀信号(suicidesignal)重新释放的组合物，其特征是所述组合物是由一定浓度如申请专利范围第301-308项所述的任一化合物所组成。
120，本专利申请的一种能调节BMP，GF，Jak-jnk-STAT和Junfos的通路和其受体的组合物，其特征是所述组合物是由一定浓度如申请专利范围第27-62项所述的任一化合物所组成。
121，本专利申请的一种能调节糖肾上腺皮质激素，雌激素，酪氨酸激酶，G-蛋白，和EGF的受体的组合物，其特征是所述组合物是由一定浓度如申请专利范围第27-62项所述的任一化合物所组成。
122，本专利申请的一种抑制癌细胞生长的方法，其特征是所述方法是使一定量的具有下述化学结构的化合物去接触所述癌细胞 3-O-[β-D-半乳糖吡喃酰基(1→2)]-α-L-阿拉伯糖呋喃酰基(1→3)-β-D-葡萄糖醛吡喃酰基-21-O-(3，4-二党归酰基)-α-L-鼠李糖吡喃酰基-22-O-乙酰基-3β，16α，21β，22 α，28-五羟基-12-烯五环三萜皂甙。
全文摘要
本发明提供了从文冠果(Xanthoceras sorbifolia)分离，提纯和鉴定具生物活性的化合物的方法和工艺。本发明同时提供了含有从文冠果提纯的化合物的组合物。从文冠果提纯的化合物中有皂甙化合物。组合物可以用于抗癌，防止脑衰老，增强记忆，改善脑功能，治疗夜尿，尿频，尿急，弱智，痴呆和老年痴呆，孤独症，脑创伤，帕金森病，和其它由于脑功能不健全或障碍所引起的病症，还可用于治疗关节炎，风湿症，循环不良，动脉硬化，雷诺氏症，心绞痛，心脏功能紊乱，冠心病，头痛，头晕，肾功能紊乱，阳萎和早泻。本发明提供的化合物，含有三萜类化合物皂甙原或其它皂甙原，在碳21和22位有含乙酰基或糖链，在糖链上联有当归酰基，这些功能集团有机地连在一起形成了该化合物。
文档编号A61K131/00GK1972702SQ200480038698
公开日2007年5月30日 申请日期2004年12月23日 优先权日2003年12月23日
发明者陈沛光, 麦美送, 王云 申请人:太平洋艾瑞有限公司