专利名称：噻萘普汀在制备治疗或预防mdma神经毒性的药中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗抑郁药物噻萘普汀的用途，尤其是在制药领域中的用途。
背景技术：
3，4亚甲二氧甲基苯丙胺(3，4-methylenedioxy-methamphetamine，MDMA，我国俗称“摇头丸”，在该说明书的后续内容中，以“MDMA”代表“3，4亚甲二氧甲基苯丙胺”)属于苯丙胺类兴奋剂，能诱导新奇感觉、增强快感、提高兴奋性，是娱乐场所易获得的非法药品(Kaplan HI，and Sadock BJ.Synopsis of Psychiatry.8th ed.BaltimoreMaryland Composition publishers，Inc.1998，pp407-412)。近年来以MDMA为代表的苯丙胺类兴奋剂在国际上迅速泛滥，我国也面临着继海洛因之后MDMA流行性滥用的威胁。MDMA能破坏实验动物及人类不同脑区的5-HT能神经末梢，引起长期的神经毒性(Hegadoren KM，Baker GB，Bourin M.3，4-methylenedioxy analogues of amphetaminedefining therisks to humans.Neurosci Biobehav Rev，1999；24539-553)。目前主要的治疗及干预方向集中在用药物诱导低热或阻止MDMA所致高热。中国专利ZL 200410022529.X公开了舒必利在制备治疗或预防3，4亚甲二氧甲基苯丙胺所致神经毒性的药中的应用，对MDMA中毒的治疗提供了一种有效的新药品，但由于MDMA等苯丙胺类兴奋剂的泛滥，开发出更多的新药是社会的需要。
噻萘普汀，化学名称为7-[(3-氯-6，11-二氢-5，5-二氧-6-甲基二苯并-[c，f][1，2]噻唑平-11-基)氨基]庚酸钠盐，分子式C21H24ClN2NaO4S，分子量458.9，化学结构式如下 噻萘普汀(Tianeptine)是新型的三环类抗抑郁剂，目前主要用于治疗抑郁症，其剂型为片剂。
发明内容
本发明的目的在于证明噻萘普汀的新用途，即在制药中的新用途，为治疗或预防MDMA所致神经毒性提供新的药品。
本发明通过实验证明在与人类娱乐性使用的剂量相似时，可导致实验动物的神经毒性损害，多次使用可导致5-HT的长期耗竭。以实验大鼠为例，MDMA造成其5-HT能神经毒性，功能改变包括前脑组织5-HT及其代谢产物5-HIAA的长期减少，5-HT摄取位点(即5-HT转运体SERT)减少及色氨酸羟化酶的活性降低；形态学上可引起5-HT能神经末梢的损害。
本发明通过实验证明在对实验大鼠给予MDMA之后5小时给予噻萘普汀(30mg/kg，灌胃，每天两次)治疗，能减少额叶皮层、海马和纹状体三个脑区5-HT的耗竭，并对SERTmRNA的表达下调具有明显的抑制作用；神经病理学的结果显示噻萘普汀还能抑制MDMA所致的银染色阳性面积的减少，并使胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达下调，这间接反映神经损伤的程度有所减轻；在对实验大鼠给予MDMA之前7天、在对实验大鼠给予MDMA之后半小时给予噻萘普汀(15mg/kg，灌胃，每天两次)治疗，也有上述效果。因此可将噻萘普汀用来治疗或预防MDMA所致神经毒性的药品。
本发明采用高效液相色谱法(HPLC)检测5-HT，原位杂交法检测SERTmRNA的表达，银染色法显示神经末梢的损害，免疫组化SP法检测GFAP的表达。
本发明具有以下有益效果1、本发明对已知化合物噻萘普汀发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。
2、本发明对MDMA中毒的治疗提供了一种有效的新药品，可抵御毒品对人们的危害，具有明显的社会效益和经济效益。
图1是各组实验大鼠额叶皮层5-HT的含量图；图2是各组实验大鼠海马5-HT的含量图；图3是各组实验大鼠纹状体5-HT的含量图；图4是用原位杂交法检测MDMA组的SERTmRNA表达结果图；图5是用原位杂交法检测既给予MDMA、又给予噻萘普汀(给予MDMA之后半小时给予噻萘普汀，15mg/kg，灌胃，每天两次)治疗实验组的SERTmRNA表达结果图；图6是用原位杂交法检测生理盐水对照组的SERTmRNA表达结果图；图7是给予MDMA实验组的银染色结果图；
图8是既给予MDMA、又给予噻萘普汀(给予MDMA之后半小时给予噻萘普汀，15mg/kg，灌胃，每天两次)治疗实验组的银染色的结果图；图9是生理盐水对照组的银染色结果图；图10是免疫组化SP法检测MDMA组的GFAP表达结果图；图11是免疫组化SP法检测既给予MDMA、又给予噻萘普汀(给予MDMA之后半小时给予噻萘普汀，15mg/kg，灌胃，每天两次)治疗实验组的GFAP表达结果图；图12是免疫组化SP法检测生理盐水对照组的GFAP表达结果图。
具体实施例方式
1、材料与方法1.1材料1.1.1动物 Wistar雄性大鼠90只，体重180±2克，购自四川大学实验动物中心，将动物随机分为6组，每组15只。实验前让动物在清洁恒温(20℃±2℃)恒湿(湿度50％)饲养室适应3天，每天抓取一次，并单笼饲养，整个实验过程中自由饮水及进食。
1.1.2药品和试剂 MDMA由中国药品生物制品检定所提供。噻萘普汀为法国施维雅药厂生产(批号OE3086)。以上药品均用生理盐水溶解，给药体积为1ml/kg。SERTmRNA原位杂交试剂盒购自武汉博士德公司。10％水合氯醛(由四川大学华西医院药房提供，批号020524)，用于动物麻醉。胶质纤维酸性蛋白GFAP(兔单克隆抗体，稀释度为1∶300)购自北京中山公司。
1.2、方法1.2.1动物实验过程 6组中随机选取一组为MDMA实验组(B组)，另一组为生理盐水组(A组)，噻萘普汀高剂量干预组(C组)和低剂量干预组(D、E、F组)。B组给予MDMA(8×20mg/kg每天两次，8am 8pm i.p×4天)制成亚急性中毒模型(Hegadoren KM，Baker GB，Bourin M.3，4-methylenedioxy analogues of amphetaminedefining therisks to humans.Neurosci Biobehav Rev，1999；24539-553)；C组在给予MDMA之后5小时给予噻萘普汀(30mg/kg，灌胃，每天两次))；D、E、F组分别在给予MDMA之前7天、在给予MDMA的同时、在给予MDMA之后30分钟给予噻萘普汀(15mg/kg，灌胃，每天两次)；A组注射等体积的生理盐水。
1.2.2取材过程 每组随机选5只大鼠在末次给药后4小时经10％水合氯醛(30mg/kg)腹腔注射麻醉，断头处死，剥离脑组织，经矢状位切开，随机取一侧半球，参照《The rat brain in stereotaxic coordinates》(Paxinos G，Watson C.The rat brain in stereotaxiccoordinates，1986；2nd edition.Academic Press INC.(London)LTD，London.Figure1～25)，修块后迅速置于冰冻切片机中，行8μm连续冠状切片，取含有纹状体、海马及额叶皮层等脑结构的切片，置于-70℃冰箱中备用。另一侧大脑半球置于10％福尔马林中固定，石蜡包埋，制成厚度为8μm的连续切片备用(因Bielschowsky及Glee Marsland氏改良银浸染法需要在损伤后短时间内处死，方能取得最佳染色效果(Gallyas F，Zaborszky L，Wolff JR.Experimental studies of mechanisms involved in methods demonstrating axonal and terminal degeneration.Stain Technol，1980，55281-290)。
每组剩下的10只大鼠中随机选5只在末次药物注射后7天断头处死，取材方法同上，冰冻切片为8μm连续冠状切片，石蜡切片为4μm的连续切片备用。
每组中最后5只大鼠在末次药物注射后7天，将之拉脱颈髓并断头，快速剥离脑组织，在冰上分离出海马、前脑额叶皮层和纹状体，置于液氮中速冻后，储存于-70℃冰箱中备测。测定前将上述组织融化，称重，在超声匀浆机(型号Sonics&materials Inc.(203)-744-4400)上匀浆。
1.2.3神经递质5-HT的检测 将前述匀浆置于高效液相色谱仪(HPLC)进行检测。方法如下取用流动相稀释的5-羟色胺(5-HT)标准溶液100μl(或大鼠脑组织100μl)，加入2ml离心管内，分别加入16ng/ml2，4-二羟基苄胺(I.S)和10％HClO4溶液30μl，混匀，高速离心(12000/min，4℃)8min，取上清液100μl进样，记录色谱峰高，由标准系列中5-HT与I.S的峰高比对浓度作标准曲线，求出回归方程。然后由样品中5-HT与I.S的峰高比在回归方程上求出浓度。
仪器与色谱条件Waters510泵，Gilson 141-ECD(玻璃碳工作电极，Ag-AgCl参比电极)，U6K进样器，460电化学检测器，高速离心机，旋涡振荡器。江苏淮阴KROMASILC18柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为0.05mol/L NaAc-Hac(PH3.0)∶CH3OH∶0.05mol/LEDTA-Na2(78∶20∶2)，流速1.0ml/min，每1L流动相加入十二烷基硫酸钠100mg；氧化电压为0.69V。
1.2.4SERTmRNA原位杂交检测 按试剂盒说明书提供的方法进行设计的探针为针对Serotenin transporter(SERT)的寡核苷酸探针，经地高辛标记。试剂盒内容胃蛋白酶(×10；Pepsin)2ml；预杂交液2ml；Serotenin transporter寡核苷酸探针杂交液2ml；封闭液5ml；生物素化鼠抗地高辛5ml；SABC-POD 5ml；生物素化过氧化物酶5ml。
SERT靶基因的mRNA序列为
①5’-GGCGC TTCCC CTACA TATGT TCCCA GAATG-3’②5’-AGGTG GTGTG GGTGA CAGCC ACCTT CCCTT-3’③5’-TGGTT CTGGA GGATC TGCTG GGTGG CCATC-3’实验中所用缓冲液及其配制3％柠檬酸-100ml蒸馏水中加柠檬酸(C6H8O7·H2O)，pH2.0；2×SSC-1000ml蒸馏水中加NaCl 17.6g，柠檬酸三钠(C6H5O7Na3·2H2O，分子量294)8.8g；0.5×SSC-300ml蒸馏水中加100ml 2×SSC即可；0.2×SSC-270ml蒸馏水中加30ml 2×SSC即可；0.5MPBS-1000ml蒸馏水中加NaCl 30g，Na2HPO4·12H2O 6g，NaH2PO4·2H2O0.4g，pH7.2-7.6。
操作程序如下1)冷冻切片按下述方法固定固定液为4％多聚甲醛/0.1M PBS(PH7.2-7.4)，含有1/1000DEPC。室温固定20-30min，蒸馏水分洗涤；2)新鲜配制0.5％H2O2/甲醇室温处理30min以灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水洗涤3次；3)暴露mRNA核酸片段切片上滴加3％柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶，37℃消化2min，0.5M PBS洗3次×5min，蒸馏水洗1次；4)预杂交按每张切片20μl加预杂交液，放入湿盒，置于37℃恒温箱孵育4小时，吸取多余液体，不洗；5)杂交按每张切片20μl杂交液，加在切片上，将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上，恒温箱37℃杂交过夜；6)杂交后洗涤揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×SSC洗涤，5min×2次，0.5×SSC洗涤15min×1次，0.2×SSC洗涤15min×1次；7)滴加封闭液37℃30min，甩去多余液体，不洗；8)滴加生物素化鼠抗地高辛37℃孵育60min，0.5M PBS洗5min×4次；9)滴加SABC37℃孵育20min，0.5M PBS洗5min×3次；10)滴加生物素化过氧化物酶37℃孵育20min，0.5M PBS洗5min×4次；11)DBA显色使用DBA显色试剂盒-1ml蒸馏水加显色剂A，B，C各一滴，混匀，加至标本上显色，用自来水适时终止；
12)酒精脱水，二甲苯透明，加拿大胶封片。
阴性对照切片上不加含探针的杂交液，以PBS替代，其余步骤相同。
1.2.5Bielschowsky及Glee Marsland氏改良银浸染法观察各组神经元、轴索及树突的变化。以上切片均请病理学专家盲法读片。改良银浸染方法如下1)石蜡切片8μm，二甲苯脱蜡，浸入纯酒精；2)用0.2％火棉胶封盖切片，以免脱片；3)擦掉多余的火棉胶，再入70％酒精硬化，蒸馏水洗三次；4)入20％硝酸银水溶液25～30min，置于37℃孵箱；5)蒸馏水洗2次，入10％甲醛自来水溶液浸二次，每次10秒，切片呈黄色，除掉多余的甲醛溶液；6)切片浸于Glee氏铵银液30秒；7)排去切片上多余的铵银液，浸入10％甲醛自来水溶液，每次1min，切片呈棕黄色，甲醛呈黑色，蒸馏水洗；8)调色于0.2％氯化金水溶液5min；9)蒸馏水洗后入5％硫代硫酸钠溶液固定5min，自来水清洗；10)吸干、酒精脱水(因金属沉淀常附于火棉胶膜上，纯酒精浸泡可溶解胶膜)，二甲苯透明，树胶封固。
1.2.6免疫组织化学染色采用SP法(Streptavidin-biotin immuno peroxidase methed)，步骤如下1)4μm厚石蜡组织切片裱于经3-氨基丙基三乙氧硅烷(3-amino-propyltriethoxylsilane，APES，Sigma)硅化的切片上，置37℃恒温箱48小时；2)二甲苯脱蜡10min×2，依次通过梯度乙醇(100％、95％、80％、70％)水化各5min，蒸馏水洗5min×2；3)置于新鲜配制的3％过氧化氢溶液，避光室温放置20min，以阻断内源性过氧化物酶；4)蒸馏水洗5min×2；5)切片放入0.01M枸橼酸盐缓冲液内(pH6.0)，微波抗原修复15min，冷却至室温后取出切片，0.01MPBS(pH7.2)洗5min×2；6)用正常羊血清(即用型)37℃孵育25min，封闭非特异性抗原抗体反应；
7)弃去多余血清，直接滴加一抗(稀释度1∶300)，37℃孵育30min后，置4℃冰箱过夜；8)0.01M PBS洗5min×3，滴加生物素标记二抗(即用型)，37℃孵育30min；9)0.01M PBS洗5min×3，滴加链亲和素-过氧化物酶复合物(即用型)，37℃，孵育30min；10)0.01M PBS洗5min×3，用新鲜配制的DAB在光学显微镜观察下显色，自来水冲洗，适时终止；11)Harris苏木素复染细胞核，1％盐酸酒精分化，充分水洗返蓝，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
2、结果2.1神经递质5-HT的检测结果给予MDMA7天后，与生理盐水组比较，大鼠额叶皮层、海马和纹状体的5-HT均有下降(P＜0.05)，三个脑区的下降率分别为68.14％、74.27％和37.38％，其中海马的5-HT降低最明显。在给予MDMA之前7天、在给予MDMA之后半小时再给予噻萘普汀(15mg/kg，灌胃，每天两次)，5-HT降低不明显；在给予MDMA之后5小时再给予噻萘普汀(30mg/kg，灌胃，每天两次)，5-HT降低也不明显，说明两个剂量之间的噻萘普汀对5-HT功能的损害具有预防和治疗作用。详情见表1-1、表1-2和图1、图2、图3。
表1-1大鼠不同脑区5-HT的检测结果(ng/g)(噻萘普汀15mg/kg)
*P＜0.05，与MDMA组比较，在统计学上有显著性差异。
表1-2大鼠不同脑区5-HT的检测结果(ng/g)(噻萘普汀30mg/kg)
*P＜0.05，与MDMA组比较，在统计学上有显著性差异。
2.2SERTmRNA原位杂交检测结果生理盐水组的SERTmRNA原位杂交结果见图6和表2-1、表2-2，MDMA组的SERTmRNA原位杂交结果见图4和表2-1、表2-2，给予MDMA 7天之后大鼠额叶皮层、海马和纹状体的SERTmRNA的表达均有一定程度的降低(P＜0.05)，说明MDMA可导致SERTmRNA的表达下调。在给予MDMA之前7天、在给予MDMA之后半小时给予噻萘普汀(15mg/kg，灌胃，每天两次)，SERTmRNA的表达有上调，见表2-1和图5；在给予MDMA之后5小时再给予噻萘普汀(30mg/kg，灌胃，每天两次)，SERTmRNA的表达也有上调，见表2-2。说明不同时间给予噻萘普汀对大鼠额叶皮层、海马和纹状体的SERTmRNA表达的降低具有抑制作用(P＜0.05)。
表2-1三个脑区SERTmRNA原位杂交结果(阳性细胞计数x±S)(噻萘普汀15mg/kg)
*P＜0.05，与MDMA组比较，在统计学上有显著性差异。
表2-2三个脑区SERTmRNA原位杂交结果(阳性细胞计数x±S)(噻萘普汀30mg/kg)
*P＜0.05，与MDMA组比较，在统计学上有显著性差异。
2.3银染色的结果生理盐水组的银染色结果见图9、表3-1、表3-2，MDMA组的银染色结果见图7、表3-1、表3-2，与生理盐水组比较，MDMA可造成神经元轴索脱髓鞘改变，树突减少，在5-HT能神经元集中的脑区上述变化显著；在给予MDMA之前7天、在给予MDMA之后半小时给予噻萘普汀(15mg/kg，灌胃，每天两次)，以及在给予MDMA之后5小时再给予噻萘普汀(30mg/kg，灌胃，每天两次)，银染色阳性面积接近生理盐水组，神经毒性损害较单用MDMA组明显减轻，见表3-1、表3-2和图8。
表3-1大鼠三个脑区银染的阳性面积(x±S)(噻萘普汀15mg/kg)
*P＜0.05，与MDMA组比较，在统计学上有显著性差异。
表3-2大鼠三个脑区银染的阳性面积(x±s)(噻萘普汀30mg/kg)
*P＜0.05，与MDMA组比较，在统计学上有显著性差异。
2.4GFAP免疫组织化学染色的结果生理盐水组的GFAP表达结果见图12和表4-1、表4-2，MDMA组的GFAP表达结果见图10、和表4-1、4-2，从上述图和表中可以看出，给予MDMA 7天之后，额叶皮层、海马、纹状体的GFAP表达较生理盐水组增多；在给予MDMA之前7天、在给予MDMA之后半小时给予噻萘普汀(15mg/kg，灌胃，每天两次)，以及在给予MDMA之后5小时再给予噻萘普汀(30mg/kg，灌胃，每天两次)，三个脑区的GFAP表达显著减少，见表4-1、表4-2和图11。
表4-1GFAP阳性细胞计数(x±S)(噻萘普汀15mg/kg)
*P＜0.05，与MDMA组比较，在统计学上有显著性差异。
表4-2GFAP阳性细胞计数(x±S)(噻萘普汀30mg/kg)
*P＜0.05，与MDMA组比较，在统计学上有显著性差异。
权利要求
1.噻萘普汀在制备治疗或预防3，4亚甲二氧甲基苯丙胺所致神经毒性的药中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所给噻萘普汀的剂量为15mg/kg～30mg/kg。
全文摘要
本发明公开了噻萘普汀在治疗或预防3，4亚甲二氧甲基苯丙胺(MDMA)所致神经毒性的药中的应用。在对实验大鼠给予MDMA之后5小时给予噻萘普汀(30mg/kg，灌胃，每天两次)，在对实验大鼠给予MDMA之前7天、在对实验大鼠给予MDMA之后半小时给予噻萘普汀(15mg/kg，灌胃，每天两次)均能减少额叶皮层、海马和纹状体三个脑区5－HT的耗竭，并对SERTmRNA的表达下调具有明显的抑制作用；神经病理学的结果显示噻萘普汀还能抑制MDMA所致的银染色阳性面积的减少，并使胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达下调，这间接反映神经损伤的程度有所减轻。
文档编号A61P5/00GK1823785SQ200510022359
公开日2006年8月30日 申请日期2005年12月23日 优先权日2005年12月23日
发明者王雪, 祝三平, 李静, 黄明生, 孙学礼 申请人:四川大学华西医院