专利名称：槲皮素长效脂质体粉针剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种槲皮素长效脂质体粉针剂及其制备方法，更具体地说，是涉及一种采用聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)修饰普通脂质体表面得长效脂质体，长效脂质体包裹具有生物活性的槲皮素的一种槲皮素长效脂质体粉针剂及其制备方法。
背景技术：
槲皮素(3，3，4，5，7-phentahydroxyflavone)及其衍生物是植物界分布最广的黄酮类化合物，广泛存在于食用蔬菜和水果如山渣、苹果、洋葱、茶叶、蜂蜜、葡萄等(Frankel et al.，1993；Hertog et al.，1993，1996)以及多种中草药如柏叶、高良姜、款冬花、三七、银杏等(Formica JV et al.，1995)之中。槲皮素也具有和其它的黄酮类化合物一样的相同基本结构，是由连接羟基的三个环状分子构成，槲皮素的化学结构式为 由于槲皮素的资源丰富易得，且具有很强的生物活性和广泛的药理作用而倍受重视。从本世纪初开始，国内外学者对槲皮素的提取、纯化、结构测定、理化性质、合成衍生物、药理与临床等方面进行了大量的研究工作。有关槲皮素的多种生物活性及药理作用已得到证实，它具有抗氧化活性(Hayek T et al.，1997；Chopra M et al.，2000)、抗癌(VermaAK et al.，1988；Deschner EE et al.，1991；Pereira MA et al.，1996)、抗炎症(Ferry DRet al.，1996)、抗聚集(Pignatelli P et al.，2000)、扩张冠状血管(Perez-Vizcaino F etal.，2002)等功效。
但是，由于植物中提取的槲皮素难溶于水及许多药用溶剂，因而利用槲皮素制备理想的药用制剂较困难，进而阻碍了槲皮素在临床的应用。为提高槲皮素的水溶性，改善它在体内的吸收，国内外的研究者们采取了多种方法，如将槲皮素溶于二甲亚砜有机溶剂，用于临床研究，但由于二甲亚砜的剂量过大会导致人体内的红血球溶解，而且使用后会散发出难闻的气味而被终止(Muther RS et al.，1980；Marshall LF et al.，1984)。又如，研究者们还对槲皮素的化学结构进行适当的修饰，采用将亲水基团引入其结构上，制备槲皮素的水溶性的衍生物，使其在体内的吸收、分布、代谢和排泄等运转过程得以改善，发挥其药理作用(P.J.Mulholland et al.，2001)。但是采取化学修饰的方法使得槲皮素的药理作用受到影响，而且化学修饰存在分离、纯化等问题。因此，目前还没有合适而经济的途径将槲皮素作为药物应用于临床和工业化生产。这就迫切需要改变槲皮素的制剂剂型，选择理想的给药载体使既能克服槲皮素水溶性和药代动力学差的缺陷，并使有效药物靶向作用于肝、肠部位，又不会带来过敏反应等副作用。本发明者则是针对此问题作出的本发明。
大家知道，脂质体作为定向药物载体，属于靶向给药系统的一种新剂型。60年代末，Rahman(Rahman Y E，et al.Proc Soc Exp Biol Med，1979，146(4)1173)等人首先将脂质体作为药物载体应用。由于脂质体具有类细胞结构，能改变被包封药物的体内分布，使药物主要在肝、脾、肺和骨髓等组织器官中蓄积，从而提高药物疗效，减小药物治疗剂量，降低药物毒性。因此脂质体作为多类药物的载体在许多疾病治疗中显示了它明显的优越性。
长效脂质体通常是在普通脂质体表面掺入一些可降解的生物材料，如聚乙二醇(PEG)类脂衍生物、吐温、Brij(Zhang Xiaobin，Hou Xinpul.2003，12(2)71-75)等，其中聚乙二醇的类脂衍生物(Alexander L.Klibanov，Kazuo Maruyama，et al.，1990，268(1)235-237)制备的长效脂质体，因其有原料易得、价格适中、无免疫毒性等特点而具有优越性，长效脂质体的组成中含有PEG类脂衍生物的PEG部分提供了长效脂质体亲水表面，降低了血浆蛋白与细胞表面配体的相互作用，从而减少单核吞噬细胞系统(MPS)的摄取，延长血循环时间，使得长效脂质体能够有效到达病变部位。
脂质体可通过高压乳匀法(Hamilton R L J，Goerke J，et al.，1980，21(5)981-992)、薄膜超声法(Huang C，1969，8(1)344)、乳化分散法(Szoke F J，Papahadjopoulos D，etal.，1978，75(9)4194-4198)等方法制备。
发明内容
针对现有槲皮素及其槲皮素的水溶性的衍生物在药物研究和应用中所存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种槲皮素长效脂质体粉针剂，该粉针剂不仅可使具有生物活性的槲皮素能充分溶解于用于静脉滴注的溶剂中，从而延长槲皮素在体内的血液循环时间，使得槲皮素能够有效到达病变部位，改善其在体内的吸收；本发明的另一目的是提供一种上述槲皮素长效脂质体粉针剂的制备方法，该方法不仅改进所用原料及用量，优化制备参数，且操作方便，适用于大规模连续生产。
本发明的基本思想一方面提供一种由具有生物活性的槲皮素、不同分子质量的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、卵磷脂、胆固醇和赋形剂组成的槲皮素长效脂质体粉针剂；另一方面提供一种采用具有可降解生物材料的不同分子质量的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺修饰卵磷脂和胆固醇组成的普通脂质体表面，得长效脂质体，长效脂质体包裹槲皮素作为槲皮素的定向药物载体，并改进所用原料及用量、制备参数来制备槲皮素长效脂质体粉针剂的方法。该方法不仅得到高的包封率和较窄的粒径分布的槲皮素长效脂质体，而且改善了槲皮素的药理作用使槲皮素易溶解于药用溶剂中、延长其在体内的血液循环时间、改善其在体内的吸收，以发展具有生物活性的槲皮素在药物中的研究和应用。
本发明的目的通过由以下措施构成的技术方案来实现的。
本发明槲皮素长效脂质体粉针剂，它由具有生物活性的槲皮素20-50份、聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺5-15份、卵磷脂40-60份、胆固醇5-15份，以及赋形剂0.1-5份组成，其中聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇的分子质量为2000-8000，卵磷脂与胆固醇的用量配比为3-12∶1，其组份均以重量计。
本发明所用聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺为自制，合成方法是依据文献Alexander L.Klibanov，Kazuo Maruyama，et al.，1990，268(1)235-237所得。
上述方案中，所用聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇的分子量为2000时，加入聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺的量为5-15份，优选为10-15份。
上述方案中，所用聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇的分子量为4000时，加入聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺的量为5-15份，优选为5-11份。
上述方案中，所用聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇的分子量为8000时，加入聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺的量为5-15份，优选为8-10份。
上述方案中，所说赋形剂为山梨醇，或甘露醇，或葡萄糖，或蔗糖，或海藻糖。
实现上述方案中任一所述槲皮素长效脂质体粉针剂的制备方法，采用薄膜超声法制得，按照本发明，用不同分子质量的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺修饰卵磷脂和胆固醇组成的普通脂质体表面得长效脂质体，长效脂质体包裹具有生物活性的槲皮素，该方法所用原料及用量、工艺参数及主要工艺步骤如下(1)槲皮素20-50份，聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺5-15份，卵磷脂40-60份，胆固醇5-15份，其中聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇的分子质量为2000-8000，卵磷脂与胆固醇的配比为3-12∶1，以上原料均为固态，以毫克或克或千克计量，有机溶剂三氯甲烷和甲醇为液态，它们的体积配比为1-4∶1，以毫升或升计量；将计量好的槲皮素、聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺、卵磷脂、胆固醇溶解于按上述比例配比好的三氯甲烷和甲醇有机溶剂中，使所得溶液浓度为1mg/ml-3mg/ml，然后置于密闭瓶内，在室温条件下搅拌至完全溶解；(2)将上述完全溶解的溶液转移至与旋转蒸发器连接的烧瓶内，烧瓶侵入温度为30℃-50℃的恒温水浴中，然后抽真空旋转蒸发除去有机溶剂，至烧瓶壁上形成一层均匀的薄膜；(3)将形成有薄膜的烧瓶放入真空干燥箱中，在室温条件下干燥2小时，进一步除去残留的有机溶剂；(4)将灭菌水加入干燥后的烧瓶中，使瓶壁的薄膜完全浸没，用超声破碎仪超声分散，其超声功率为100w-1000w，超声时间为0.5-3小时，即得槲皮素长效脂质体溶液；(5)在槲皮素长效脂质体溶液中加入赋形剂，冻干后，存放于4℃-8℃的低温条件下压盖密封保存备用。
上述方案中，所用聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇的分子质量为2000时，加入聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺的量为5-15份，优选为10-15份。
上述方案中，所用聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇的分子质量为4000时，加入聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺的量为5-15份，优选为5-11份。
上述方案中，所用聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇的分子质量为8000时，加入聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺的量为5-15份，优选为8-10份。
上述方案中，所说赋形剂为山梨醇，或甘露醇，或葡萄糖，或蔗糖，或海藻糖。
本发明选用修饰普通脂质体表面的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇的分子质量为2000-8000，由于聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺为直链分子结构，链长随分子量的增大而增长，在制备长效脂质体时加入聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺使其嵌入脂质体膜中，可以有效延长槲皮素在体内的血液循环时间，使槲皮素长效脂质体可以有效地达到病变部位，改善其在体内的吸收和稳定的作用，提高了槲皮素的药代动力。
使用聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇分子质量为2000时，由于分子质量相对较小，形成的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺的分子链段长度较短，即需增大聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺的用量，才能保证在制备过程使脂质体具有长效性。因此，使用聚乙二醇分子质量为2000的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺时，加入量为5-15份，优选为10-15份。
使用聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇分子质量为4000时，由于其分子质量适中，更有利于脂质体的稳定性和长效性，因此，加入聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺的量为5-15份，优选为5-11份。
使用聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇分子质量为8000时，聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺的粘度随着分子量的增大而增大，如果聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺用量太大，由于其粘度大，使旋转蒸发制备脂质体的薄膜不均匀，超声后脂质体颗粒的大小不均，使长效脂质体的稳定性差，反之，如聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺的用量减小又会影响脂质体的长效性，因此，当聚乙二醇分子质量为8000时，加入聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺的量为5-15份，优选为8-10份。
本发明所用卵磷脂与胆固醇的质量比对脂质体粒径大小有影响，由表1可知，卵磷脂与胆固醇的重量比为3∶1和4∶1时脂质体颗粒的均匀性和包封率较好，因此卵磷脂与胆固醇的重量比优选为4∶1。
表1 卵磷脂与胆固醇比例优化表
卵磷脂的相变温度为30℃-50℃，在卵磷脂中加入胆固醇可改变其卵磷脂的相变温度，相变温度可影响脂质薄膜的成形，进而影响脂质体颗粒的大小和均匀，此温度可通过旋转蒸发时恒温水浴温度来调控。本发明中制备槲皮素长效脂质体粉针剂时，加入卵磷脂、胆固醇、槲皮素、聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺后，制备脂质薄膜时的温度为30℃-50℃，优选温度为40℃。而胆固醇对脂质膜的流动性产生调节功能，增加膜的流动性，能提高脂质体的稳定性和包封率。
本发明所用有机溶剂三氯甲烷与甲醇比例对脂质体粒径大小也有影响，由表2可知，有机溶剂三氯甲烷与甲醇所用的优化比例为1∶1和3∶1，优选为3∶1，体积以毫升或升计量。
表2 三氯甲烷(CHCl3)与甲醇(CH3OH)溶剂优化表
本发明所用超声破碎仪破碎分散薄膜的时间与其功率有关，延长破碎时间，增大破碎功率，所制备的脂质体粒径越小，但超声破碎时间过长，功率过大，会破坏脂质体膜的完整性，进而影响到药物的包封率。因此，本发明中制备槲皮素脂质体粉针剂所选用超声破碎时间为0.5-3小时，超声破碎功率为100-1000W，就能保证获得较好的粒径粒度和高的包封率。
采用葡聚糖凝胶柱色谱检测，选用安玛西亚的葡聚糖凝胶柱SephadexG-75装柱，重蒸馏水洗脱，以394nm监测并收集洗脱峰，由检测的出的结果知本发明制备的槲皮素长效脂质体的包封率为95％。
本发明槲皮素长效脂质体粉针剂及其制备方法具有以下特点1、本发明槲皮素长效脂质体粉针剂，槲皮素用长效脂质体包裹后，能充分溶解于进行静脉滴注的药用溶剂中，如5％的葡萄糖溶液，生理盐水。
2、本发明槲皮素长效脂质体粉针剂，溶解于药用溶剂中作为针剂滴注，不仅可改善其在体内的吸收，并能延长其在体内的血液循环时间，从而进一步提高槲皮素的药代动力。
3、本发明槲皮素长效脂质体粉针剂在低温4℃～8℃条件下可长期保存备用，具有好的稳定性，见表3。
表3 槲皮素长效脂质体粉针剂在低温4～8℃下稳定性试验数据
4、本发明提供的制备方法，由于用不同分子质量的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺修饰有卵磷脂和胆固醇成分的普通脂质体表面，并优化制备参数，制得具有较高的包封率和较窄的粒径分布的长效脂质体药物载体，用长效脂质体载体包裹具有生物活性的槲皮素，达到改善槲皮素的药理作用、使槲皮素易溶解于药用溶剂中、延长其在体内的循环时间、改善其在体内的吸收。
四
图1本发明槲皮素长效脂质体透射电镜的照片图。
图2本发明槲皮素长效脂质体形态和粒度曲线分布示意图。
由图1透射电镜照射的照片可知，本发明槲皮素长效脂质体膜呈指纹状，螺旋结构清晰；由图2的曲线分布可知本发明槲皮素长效脂质体的粒径分布范围较窄，平均粒径为100±25nm。
五具体实施例方式
下面的实施例及生物活性实验是对本发明的进一步详细说明，但不意味着对本发明的任何限制。
1、本发明对小鼠的急性毒性试验①取BABL/c小鼠20只，6～8周，雌雄各半，禁食12小时，正常饮水，采用尾静脉给药的方式，尾静脉给药的最大剂量为槲皮素的含量为40mg/ml，每只剂量为0.2ml，相当于人日用量的480倍，用药后小鼠并未出现明显的中毒症状及死亡情况，连续观察一周，动物全部存活，活动自如，毛发光滑，饮食正常，一周后解剖动物，肉眼及显微镜观察内脏器官，未出现明显的病理学改变。
2、本发明药代动力学实验①取BABL/c小鼠20只，6～8周，雌雄各半，随机分为对照组即第一组和实验组即第二组，每组10只第一组槲皮素普通脂质体中槲皮素的含量为5mg/ml，每只小鼠剂量0.2ml，尾静脉给药一次。
每只小鼠给药后5分钟、15分钟、30分钟、60分钟、120分钟、180分钟、240分钟取眼球血，肝素抗凝，离心取血浆，同时将其内脏组织如心、肺、肝、脾、肾分别取出，匀浆后，萃取，用HPLC检测槲皮素及其代谢物不同时间的浓度及其在各器官的分布。
第二组槲皮素长效脂质体中槲皮素的含量为5mg/ml，每只小鼠剂量0.2ml，尾静脉给药一次。
每只小鼠给药后5分钟、15分钟、30分钟、60分钟、120分钟、180分钟、240分钟、300分钟、360分钟、480分钟、720分钟、1440分钟取眼球血，肝素抗凝，离心取血浆，同时将其内脏组织如心、肺、肝、脾、肾分别取出，匀浆后，萃取，用HPLC检测槲皮素及其代谢物不同时间的浓度及其在各器官的分布。
采用HPLC检测小鼠血药浓度结果可以看出，槲皮素普通脂质体组小鼠给药15分钟其血药浓度达到最高值。槲皮素长效脂质体组小鼠给药4小时其血药浓度达到最高值。即加入聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺的槲皮素长效脂质体明显的延长了药物在小鼠体内的循环时间。并且各器官检测发现注射槲皮素长效脂质体粉针剂后，同一时间取组织检测在肝脏、肺的槲皮素及其代谢物浓度最高。房室模型采用二室模型。
表4 小鼠体内血药浓度的测定结果
本发明药理试验及结果②取BABL/c小鼠40只，6～8周，雌雄各半，随机分为5组，第一组和第二组为对照组，第三组、第四组和第五组为实验组，在小鼠右前肢腋下种植5×105个C26结肠癌细胞株，在肿瘤长至0.5×0.5cm大小时，各组药理实验分别如下第一组生理盐水组，每周2次尾静脉给0.2ml生理盐水。
第二组脂质体组，脂质体浓度为5mg/ml，每只剂量0.2ml，每周2次尾静脉给药。
第三组槲皮素长效脂质体中槲皮素的含量为0.05mg/ml，每只剂量0.2ml，每周2次尾静脉给药。
第四组槲皮素长效脂质体中槲皮素的含量为0.5mg/ml，每只剂量0.2ml，每周2次尾静脉给药。
第五组槲皮素长效脂质体中槲皮素的含量为5mg/ml，每只剂量0.2ml，每周2次尾静脉给药。
以上各组连续给药4周，每周测肿瘤的大小，统计数据，治疗组中槲皮素浓度为0.05mg/ml剂量组的治疗效果最明显，增大剂量其变化不大，治疗组对比生理盐水组其抑制肿瘤率达到50％。在治疗过程中观察小鼠的体重、毛发、行动和喂食治疗组均比生理盐水对照组好，而且将治疗组小鼠的肝、肺、肾、脑、心组织检测，都没有病变反应。
从以上结果，可以进一步得出本发明的有益效果如下本发明将具有生物活性的槲皮素用长效脂质体载体包裹，制备成槲皮素长效脂质体粉针剂，在制备过程中改进所用原料配方比例和优化制备参数，增强了槲皮素的水溶性和稳定性，并且在制备槲皮素脂质体的组成中加入一定比例的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺，其作用是阻止了血浆蛋白吸附于脂质体的表面，如没有聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺的槲皮素脂质体，血浆蛋白很快粘附于脂质体的表面上，激发起单核巨噬细胞系统对脂质体从血循环中的快速清除。含有聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺的脂质体可以很大程度地阻止吸附作用，延长血循环时间，因此载药脂质体可以有效地达到病变部位。在体内癌增长部位及感染、炎症部位，以及病变引起毛细血管地通透性增加，含有槲皮素的长效脂质体能够增加在这些部位的聚集量，而正常组织其完整的毛细管使大部分的脂质体不能渗透。在病变部位的槲皮素脂质体，由于药物的缓释直接作用于病变部位，增加了治疗效果，即为实现了药物的主动靶向，延长了槲皮素在体内的循环时间，提高了槲皮素的生物利用度。
本发明制备槲皮素长效脂质体粉针剂所用主要仪器旋转蒸发仪，超声破碎仪，真空干燥器，冻干机。
实施例1将60mg卵磷脂，6mg胆固醇，12mg的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺，聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇的分子质量为2000，20mg的槲皮素溶解于三氯甲烷和甲醇的100ml有机溶剂中，其中三氯甲烷75ml，甲醇25ml，在密闭的瓶中搅拌至卵磷脂、胆固醇、聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺和槲皮素完全溶解，将完全溶解的溶液置于250ml的烧瓶中，将烧瓶与旋转蒸发仪相连，烧瓶侵入40℃的恒温水浴中，抽真空旋转蒸发除去有机溶剂，在烧瓶壁上形成一层均匀的薄膜，然后将其放入真空干燥箱中，在室温条件下干燥2小时，加入100ml的灭菌水，用超声破碎仪进行超声分散，超声仪功率为200W，超声时间为1小时，将1mg的山梨醇溶解在槲皮素长效脂质体溶液中，再将其放置于冻干机中形成冻干粉，即为黄绿色絮状槲皮素脂质体粉针剂。将其抽真空或充入惰性气体密封，放置于温度为4℃-8℃条件下保存备用。
实施例2将0.50g卵磷脂，0.10g胆固醇，0.09g的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺，聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇的分子量为3000，0.30g的槲皮素溶解于三氯甲烷和甲醇的1L有机溶剂中，三氯甲烷和甲醇的体积比为v∶v＝1∶1，在密闭的瓶中搅拌至卵磷脂、胆固醇、聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺和槲皮素完全溶解，将完全溶解的溶液置于2.5L的茄形烧瓶中，将茄形烧瓶与旋转蒸发器相连，烧瓶侵入30℃的恒温水浴，抽真空旋转蒸发除去有机溶剂，在烧瓶壁上形成一层均匀的脂质薄膜，然后将其放入真空干燥箱中，在室温条件下干燥2小时，加入1L的灭菌水，用超声破碎仪进行超声分散，超声功率为800W，超声时间为2小时，将0.005g的山梨醇溶解在槲皮素长效脂质体溶液中，再将其放置于冻干机中形成冻干粉，即为黄绿色絮状槲皮素脂质体粉针剂。将其抽真空或充入惰性气体密封，放置于温度为4℃-8℃条件下保存备用。
实施例3将45mg卵磷脂，8mg胆固醇，8mg的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺，聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇的分子量为2000，35mg槲皮素溶解于三氯甲烷和甲醇200ml的有机溶剂中，三氯甲烷和甲醇的体积比为v∶v＝4∶1，体积以毫升ml或升L计量，在密闭的瓶中搅拌至卵磷脂、胆固醇、聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺和槲皮素完全溶解，将该溶解的溶液置于500ml的茄形烧瓶中，将茄形烧瓶与旋转蒸发器相连，烧瓶侵入35℃的恒温水浴，抽真空旋转蒸发除去有机溶剂，在烧瓶壁上形成一层均匀的薄膜，然后将其放入真空干燥箱中，在室温条件下干燥2小时，加入200ml的灭菌水，用超声破碎仪进行超声分散，超声功率为600W，超声时间为1小时，再将4mg的甘露醇溶解在槲皮素长效脂质体溶液中，然后将其放置于冻干机中形成冻干粉，即为黄绿色絮状槲皮素脂质体粉针剂。将其抽真空或充入惰性气体密封，放置于温度为4℃-8℃条件下保存备用。
实施例4将39.9mg卵磷脂，5mg胆固醇，5mg的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺，聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇的分子量为3000，50mg槲皮素溶解于三氯甲烷和甲醇250ml的有机溶剂中，三氯甲烷和甲醇的体积比为v∶v＝2∶1，体积以毫升ml或升L计量，在密闭的瓶中搅拌至卵磷脂、胆固醇、聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺和槲皮素完全溶解，将该溶解的溶液置于500ml的茄形烧瓶中，将茄形烧瓶与旋转蒸发器相连，烧瓶侵入50℃的恒温水浴，抽真空旋转蒸发除去有机溶剂，在烧瓶壁上形成一层均匀的薄膜，然后将其放入真空干燥箱中，在室温条件下干燥2小时，加入250ml的灭菌水，用超声破碎仪进行超声分散，超声功率为400W，超声时间为1小时，将5mg的蔗糖溶解在槲皮素长效脂质体溶液中，再将其放置于冻干机中形成冻干粉，即为黄绿色絮状槲皮素脂质体粉针剂。将其抽真空或充入惰性气体密封，放置于温度为4℃-8℃条件下保存备用。
实施例5将40mg卵磷脂，10mg胆固醇，12mg的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺，聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇的分子量为4000，35mg的槲皮素溶解于三氯甲烷和甲醇的150ml有机溶剂中，三氯甲烷和甲醇的体积比为v∶v＝3∶1，体积以毫升ml或升L计量，在密闭的瓶中搅拌至卵磷脂、胆固醇、聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺和槲皮素完全溶解，将该溶解的溶液置于250ml的茄形烧瓶中，将茄形烧瓶与旋转蒸发器相连，烧瓶侵入45℃的恒温水浴，抽真空旋转蒸发除去有机溶剂，在烧瓶壁上形成一层均匀的薄膜，然后将其放入真空干燥箱中，在室温条件下干燥2小时，加入150ml的灭菌水，用超声破碎仪进行超声分散，超声功率为400W，超声时间为1.5小时，将1mg的葡萄糖溶解在槲皮素长效脂质体溶液中，再将其放置于冻干机中形成冻干粉，即为黄绿色絮状槲皮素脂质体粉针剂。将其抽真空或充入惰性气体密封，放置于温度为4℃-8℃条件下保存备用。
实施例6将0.60g卵磷脂，0.08g胆固醇，0.10g的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺，聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇的分子量为5000，0.20g的槲皮素溶解于三氯甲烷和甲醇的1L有机溶剂中，三氯甲烷和甲醇的体积比为v∶v＝1∶1，体积以毫升ml或升L计量，在密闭的瓶中搅拌至卵磷脂、胆固醇、聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺和槲皮素完全溶解，将该溶解的溶液置于2.5L的茄形烧瓶中，将茄形烧瓶与旋转蒸发器相连，烧瓶侵入40℃的恒温水浴，抽真空旋转蒸发除去有机溶剂，在烧瓶壁上形成一层均匀的薄膜，然后将其放入真空干燥箱中，在室温条件下干燥2小时，加入1L的灭菌水，用超声破碎仪进行超声分散，超声功率为600W，超声时间为2小时，再将5mg的海藻糖溶解在槲皮素长效脂质体溶液中，再将其放置于冻干机中形成冻干粉，即为黄绿色絮状槲皮素脂质体粉针剂。将其抽真空或充入惰性气体密封，放置于温度为4℃-8℃条件下保存备用。
实施例7将40mg卵磷脂，5mg胆固醇，5mg的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺，聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇的分子量为4000，49.5mg槲皮素溶解于三氯甲烷和甲醇200ml的有机溶剂中，三氯甲烷和甲醇的体积比为v∶v＝4∶1，体积以毫升ml或升L计量，在密闭的瓶中搅拌至卵磷脂、胆固醇、聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺和槲皮素完全溶解，将该溶解的溶液置于500ml的茄形烧瓶，将茄形烧瓶与旋转蒸发器相连，烧瓶侵入45℃的恒温水浴，抽真空旋转蒸发除去有机溶剂，在烧瓶壁上形成一层均匀的薄膜，然后将其放入真空干燥箱中，在室温条件下干燥2小时，加入200ml的灭菌水，用超声破碎仪进行超声分散，超声功率为600W，超声时间为1小时，再将2mg的甘露醇溶解在槲皮素长效脂质体溶液中，再将其放置于冻干机中形成冻干粉，即为黄绿色絮状槲皮素脂质体粉针剂。将其抽真空或充入惰性气体密封，放置于温度为4℃-8℃条件下保存备用。
实施例8将45mg卵磷脂，9mg胆固醇，5mg的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺，聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇的分子量为6000，40mg槲皮素溶解于三氯甲烷和甲醇300ml的有机溶剂中，三氯甲烷和甲醇的体积比为v∶v＝2∶1，体积以毫升ml或升L计量，在密闭的瓶中搅拌至卵磷脂、胆固醇、聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺和槲皮素完全溶解，将该溶解的溶液置于500ml的茄形烧瓶，将茄形烧瓶与旋转蒸发器相连，烧瓶侵入35℃的恒温水浴，抽真空旋转蒸发除去有机溶剂，在烧瓶壁上形成一层均匀的薄膜，然后将其放入真空干燥箱中，在室温条件下干燥2小时，加入300ml的灭菌水，用超声破碎仪进行超声分散，超声功率为800W，超声时间为1小时，再将1mg的海藻糖溶解在槲皮素长效脂质体溶液中，再将其放置于冻干机中形成冻干粉，即为黄绿色絮状槲皮素脂质体粉针剂。将其抽真空或充入惰性气体密封，放置于温度为4℃-8℃条件下保存备用。
实施例9将55mg卵磷脂，10mg胆固醇，5mg的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺，聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇的分子量为8000，25mg的槲皮素溶解于三氯甲烷和甲醇的100ml有机溶剂中，三氯甲烷和甲醇的体积比为v∶v＝3∶1，体积以毫升ml或升L计量，在密闭的瓶中搅拌至卵磷脂、胆固醇、聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺和槲皮素完全溶解，将该溶解的溶液置于100ml的茄形烧瓶中，将茄形烧瓶与旋转蒸发器相连，烧瓶侵入40℃的恒温水浴，抽真空旋转蒸发除去有机溶剂，在烧瓶壁上形成一层均匀的薄膜，然后将其放入真空干燥箱中，在室温条件下干燥2小时，加入100ml的灭菌水，用超声破碎仪进行超声分散，超声功率为200W，超声时间为2小时，再将4mg的蔗糖溶解在槲皮素长效脂质体溶液中，再将其放置于冻干机中形成冻干粉，即为黄绿色絮状槲皮素脂质体粉针剂。将其抽真空或充入惰性气体密封，放置于温度为4℃-8℃条件下保存备用。
实施例10将40mg卵磷脂，10mg胆固醇，14.8mg的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺，聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇的分子量为7000，35mg的槲皮素溶解于三氯甲烷和甲醇的200ml有机溶剂中，三氯甲烷和甲醇的体积比为v∶v＝4∶1，体积以毫升ml或升L计量，在密闭的瓶中搅拌至卵磷脂、胆固醇、聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺和槲皮素完全溶解，将该溶解的溶液置于500ml的茄形烧瓶中，将茄形烧瓶与旋转蒸发器相连，烧瓶侵入40℃的恒温水浴，抽真空旋转蒸发除去有机溶剂，在烧瓶壁上形成一层均匀的薄膜，然后将其放入真空干燥箱中，在室温条件下干燥2小时，加入200ml的灭菌水，用超声破碎仪进行超声分散，超声功率为700W，超声时间为1小时，再将3mg的葡萄糖溶解在槲皮素长效脂质体溶液中，再将其放置于冻干机中形成冻干粉，即为黄绿色絮状槲皮素脂质体粉针剂。将其抽真空或充入惰性气体密封，放置于温度为4℃-8℃条件下保存备用。
实施例11将0.40g卵磷脂，0.05g胆固醇，0.05g的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺，聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇的分子量为8000，0.47g的槲皮素溶解于三氯甲烷和甲醇的1L有机溶剂中，三氯甲烷和甲醇的体积比为v∶v＝1∶1，体积以毫升ml或升L计量，在密闭的瓶中搅拌至卵磷脂、胆固醇、聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺和槲皮素完全溶解，将该溶解的溶液置于2.5L的茄形烧瓶中，将茄形烧瓶与旋转蒸发器相连，烧瓶侵入50℃的恒温水浴，抽真空旋转蒸发除去有机溶剂，在烧瓶壁上形成一层均匀的薄膜，然后将其放入真空干燥箱中，在室温条件下干燥2小时，加入1L的灭菌水，用超声破碎仪进行超声分散，超声功率为800W，超声时间为2小时，再将0.001g的海藻糖溶解在槲皮素长效脂质体溶液中，再将其放置于冻干机中形成冻干粉，即为黄绿色絮状槲皮素脂质体粉针剂。将其抽真空或充入惰性气体密封，放置于温度为4℃-8℃条件下保存备用。
实施例12
将39mg卵磷脂，5mg胆固醇，5mg的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺，聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇的分子量为8000，50mg的槲皮素溶解于三氯甲烷和甲醇的150ml有机溶剂中，三氯甲烷和甲醇的体积比为v∶v＝2∶1，体积以毫升ml或升L计量，在密闭的瓶中搅拌至卵磷脂、胆固醇、聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺和槲皮素完全溶解，将溶解的溶液置于250ml的茄形烧瓶中，将茄形烧瓶与旋转蒸发器相连，烧瓶侵入30℃的恒温水浴，抽真空旋转蒸发除去有机溶剂，在烧瓶壁上形成一层均匀的薄膜，然后将其放入真空干燥箱中，在室温条件下干燥2小时，加入150ml的灭菌水，用超声破碎仪进行超声分散，超声功率为400W，超声时间为1小时，再将5mg的山梨醇溶解在槲皮素长效脂质体溶液中，再将其放置于冻干机中形成冻干粉，即为黄绿色絮状槲皮素脂质体粉针剂。将其抽真空或充入惰性气体密封，放置于温度为4℃-8℃条件下保存备用。
权利要求
1.一种槲皮素长效脂质体粉针剂，其特征在于它由具有生物活性的槲皮素20-50份、聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺5-15份、卵磷脂40-60份、胆固醇5-15份和赋形剂0.1-5份组成，其中聚7二醇-磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇的分子质量为2000-8000，卵磷脂与胆固醇的用量配比为3-12∶1，其组份均以重量计。
2.按照权利要求1所述的粉针剂，其特征在于所用聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇的分子量为2000时，加入聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺的量为5-15份，优选为10-15份。
3.按照权利要求1所述的粉针剂，其特征在于所用聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇的分子量为4000时，加入聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺的量为5-15份，优选为5-11份。
4.按照权利要求1所述的粉针剂，其特征在于所用聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇的分子量为8000时，加入聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺的量为5-15份，优选为8-10份。
5.按照权利要求1所述的粉针剂，其特征在于所说赋形剂为山梨醇，或甘露醇，或葡萄糖，或蔗糖，或海藻糖。
6.实现权利要求1-5中任一所述槲皮素长效脂质体粉针剂的制备方法，采用薄膜超声法，其特征在于采用不同分子质量的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺修饰卵磷脂和胆固醇组成的普通脂质体表面得长效脂质体，长效脂质体包裹具有生物活性的槲皮素，该方法所用原料及用量、工艺参数及工艺步骤如下(1)槲皮素20-50份，聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺5-15份，卵磷脂40-60份，胆固醇5-15份，其中卵磷脂与胆固醇的配比为3-12∶1，所用聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇的分子质量为2000-8000，以上原料均为固态，以毫克或克或千克计量，有机溶剂三氯甲烷和甲醇为液态，它们的体积配比为1-4∶1，以毫升或升计量；将计量好的槲皮素、聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺、卵磷脂、胆固醇溶解于按上述比例配比好的三氯甲烷和甲醇有机溶剂中，使所得溶液浓度为1mg/ml-3mg/ml，然后置于密闭瓶内，在室温条件下搅拌至完全溶解；(2)将上述完全溶解的溶液转移至与旋转蒸发器连接的烧瓶内，烧瓶侵入温度为30℃-50℃的恒温水浴中，然后抽真空旋转蒸发除去有机溶剂，至烧瓶壁上形成一层均匀的薄膜；(3)将形成有薄膜的烧瓶放入真空干燥箱中，在室温条件下干燥2小时，进一步除去残留的有机溶剂；(4)将灭菌水加入干燥后的烧瓶中，使瓶壁的薄膜完全浸没，用超声破碎仪超声分散，其超声功率为100w-1000w，超声时间为0.5-3小时，即得槲皮素长效脂质体溶液；(5)在槲皮素长效脂质体溶液中加入赋形剂，冻干后，存放于4℃-8℃的低温条件下压盖密封保存备用。
7.按照权利要求6所述的方法，其特征在于所用聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇的分子质量为2000时，加入聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺的量为5-15份，优选为10-15份。
8.按照权利要求6所述的方法，其特征在于所用聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇的分子质量为4000时，加入聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺的量为5-15份，优选为5-11份。
9.按照权利要求6所述的方法，其特征在于所用聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇的分子质量为8000时，加入聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺的量为5-15份，优选为8-10份。
10.按照权利要求6所述的方法，其特征在于所用赋形剂为山梨醇，或甘露醇，或葡萄糖，或蔗糖，或海藻糖。
全文摘要
本发明涉及一种槲皮素长效脂质体粉针剂及其制备方法。该粉针剂由槲皮素，聚乙二醇－磷脂酰乙醇胺、卵磷脂、胆固醇和赋形剂组成；该粉针剂的制备方法，将聚乙二醇－磷脂酰乙醇胺5－15份、卵磷脂40－60份、胆固醇5－15份、槲皮素20－50份，组份均以重量计，上述原料溶解于三氯甲烷和甲醇配比为1－4∶1有机溶剂中，用已有薄膜超声法制得槲皮素长效脂质体溶液，在该溶液中加入赋形剂冻干后得槲皮素长效脂质体粉针剂。本发明优化工艺参数制得的槲皮素长效脂质体粉针剂能充分溶于用于静脉滴注的溶剂中，改善了槲皮素在体内的吸收，延长其在体内血液循环时间，进而提高了槲皮素的生物利用度。
文档编号A61P39/00GK1813677SQ20051002223
公开日2006年8月9日 申请日期2005年12月6日 优先权日2005年12月6日
发明者魏于全, 范琳玉, 陈俐娟 申请人:四川大学