专利名称：天花粉蛋白注射剂的生产方法
技术领域：
本发明涉及一种植物蛋白注射剂的生产方法。具体涉及一种天花粉蛋白注射剂及其原料药天花粉蛋白的生产方法。
背景技术：
天花粉蛋白(Trichosanthin)是从中药天花粉(栝楼块根)(trichosanthese kirilowiiMaxim)中提取的植物蛋白，天花粉蛋白由19种氨基酸组成，不含半胱氨酸，其N-端为ASP，C端微观不均一为Ala和Met。pI为9.4，分子量为27141，不含糖和磷，是一个单链碱性简单蛋白质，含有247(246)个氨基酸残基，并发现在巴比妥缓冲液中有获得结晶(汪猷主编，天花粉蛋白(第二版)，2000，科学出版社，21-28页)。研究表明，天花粉蛋白是早、中期妊娠引产药物，对于宫外孕、葡萄胎、恶性葡萄胎等疾病也有良好治疗效果。(汪猷主编，天花粉蛋白(第二版)，2000，科学出版社，242-268页)。1989年美国发现天花粉蛋白能抑制人艾滋病病毒(HIV)的复制和繁殖(美国专利4,795,739、美国专利4,985,541)，并用于治疗艾滋病，在美国用天花粉蛋白治疗艾滋病有统计的病例已达500多例，没有统计的达数千例，经天花粉蛋白治疗后，大多数病人能延长生存期，提高生活质量。
制备天花粉蛋白注射剂的原料药天花粉蛋白是一种大分子植物蛋白，因其疏水性氨基酸占45％的结构特殊性很容易集聚和沉淀，即发生变性，使得天花粉蛋白注射剂及其原料药的生产具有很大的难度。目前报道的天花粉蛋白的提取、分离、纯化方法主要包括以下步骤将天花粉生药洗净、去皮、切块、绞碎、离心，得天花粉原汁，调节pH至4左右，然后经二次丙酮分级沉淀，离心得沉淀物，加水溶解、透析、离心取上清液，冷冻干燥得到精制天花粉蛋白，将精制天花粉蛋白加入缓冲液中进行晶体培养，得到天花粉蛋白晶体，最后经过干燥得到天花粉蛋白(金善炜等，化学学报，1981，39917-925；中国专利申请No.89102920.6)。在天花粉蛋白原料药的生产工艺中，冷冻干燥制取精制天花粉蛋白是难点之一，天花粉蛋白在冷冻干燥时很容易变性，冷冻干燥条件控制不好会造成原料药的溶解度下降，而且在制备天花粉蛋白注射剂时，往往会出现一部分原料药不溶解。
现有技术在制备天花粉蛋白注射剂时，通常采用在置有干燥剂五氧化二磷的干燥器中对结晶天花粉蛋白进行真空干燥，将干燥后的结晶天花粉蛋白作为原料药。由于天花粉蛋白特殊性质，常规使用的原料药在配制注射剂时，用溶液重新溶解有30-50％的结晶天花粉蛋白不能溶解，从而造成大量结晶天花粉蛋白的损失。由于天花粉蛋白的疏水性氨基酸含量较大的结构特殊性，使得保持良好稳定性成为天花粉蛋白注射剂生产工艺上的难题。
发明内容
本发明的目的是提供一种天花粉蛋白注射剂的制备方法，该方法在原料药的生产工艺及使用、稳定剂的使用上对现有工艺方法进行改进，以克服现有技术的缺陷。利用本发明方法制备的天花粉蛋白注射剂稳定性良好，配制时原料药损失小。
本发明方法对现有的天花粉蛋白注射剂的制备工艺的改进主要集中在以下方面1、原料药的生产工艺上，优化精制天花粉蛋白的冷冻干燥条件，筛选出利于保持天花粉蛋白品质，防止其变性的冷冻干燥时间以及升温条件；在天花粉蛋白晶体培养中加入无机盐，从而培养出的结晶质量好，产量高的结晶天花粉蛋白。
2、采用湿的结晶天花粉蛋白为原料配制注射剂，即培养生成的结晶天花粉蛋白经过过滤后，不经过干燥，直接用于配制天花粉蛋白注射剂。
3、配制天花粉蛋白注射剂时，采用多聚乙二醇、人血白蛋白等水溶性大分子化合物作为稳定剂。
4、在生产冻干粉针剂时，优化冷冻干燥条件。
本发明中天花粉蛋白注射剂包括常规使用的水针剂(如注射液、皮试液等)和粉针剂。
本发明方法包括以下步骤用注射用水溶解结晶天花粉蛋白、调节pH、加活性炭搅拌、静置一小时后过滤、滤液中加入稳定剂、无菌过滤得到注射液经分装注射液制成水针剂或经冷冻干燥制成粉针剂。
本发明方法中，结晶天花粉蛋白可以采用未干燥的湿的结晶天花粉蛋白或干燥的结晶天花粉蛋白，其中优选湿的结晶天花粉蛋白，使用湿的结晶天花粉蛋白时95％以上的结晶天花粉蛋白都能溶解；稳定剂采用水溶解性大分子化合物，如分子量为5000-20000的多聚乙二醇、人血白蛋白等。稳定剂的用量为1-20％(g/v)。湿的结晶天花粉蛋白中天花粉蛋白的含量可用紫外光谱或劳埃法(Lowry)测定，根据注射剂的有效剂量(如注射液为每支1.2mg/ml，皮试液为每支0.05mg/ml，粉针剂为1.2mg/支)及估计损耗率(以可溶蛋白计，为20％左右)计算结晶天花粉蛋白的用量。用酸调节pH值至3.5-5，所用的酸可以为醋酸、盐酸、硫酸、磷酸等。在生产粉针剂时，冷冻干燥的时间应控制在45-48小时；干燥过程中升温速度应控制在每小时升2℃。升温最高温度不能超过45℃。在此条件下得到的粉针剂在注射使用时用生理盐水溶解时溶解度大，澄明度清。
本发明方法中配制注射剂所用的原料药结晶天花粉蛋白的制备包括以下步骤将天花粉(栝楼块根)洗净、去皮、切块、绞碎、离心得到天花粉原汁，静置过夜沉淀，上清液调节pH值后，经二次丙酮分级沉淀，离心得到沉淀物，加水溶解、透析、离心取上清液，冷冻干燥得到精制天花粉蛋白，将精制天花粉蛋白加入缓冲液中进行晶体培养，得到天花粉蛋白结晶，经过滤得到湿的天花粉蛋白结晶。湿的天花粉蛋白结晶经过真空干燥后得到干燥的天花粉蛋白结晶。
上述制备方法中，上清液的pH值应调节至4左右。为防止天花粉蛋白在冷冻干燥时变性，冷冻干燥的时间不宜过长或过短，一般在30-45小时，最佳为35-40小时，在干燥过程中升温速度不宜过快，一般是每小时升2℃。升温最高温度不能超过45℃，最佳为40℃。在此冷冻干燥条件下所得到的精制天花粉蛋白进一步制备的天花粉蛋白结晶在配置注射剂时溶解度大，不溶物少。上述方法中缓冲液可采用pH为8-8.8的巴比妥缓冲液，其中优选pH为8.6的巴比妥缓冲液，培养天花粉蛋白晶体时在巴比妥缓冲液中加入0.1-0.9％(g/v)的无机盐，在此条件下培养出的结晶成型好，表观上具有晶体较大，且在阳光下闪闪发亮的特点。所得到的天花粉蛋白晶体产量可以比一般方法得到的天花粉蛋白晶体产量高出30％～50％左右。所用的无机盐可采用氯化钠、氯化钾、硝酸钠、磷酸钠、醋酸钠等。
有益效果1、本发明方法采用湿的结晶天花粉蛋白为原料配制注射剂，原料溶解度大，损失小，可提高注射剂的产量。
2、本发明方法采用多聚乙二醇、人血白蛋白等水溶性大分子化合物作为稳定剂，得到的注射剂稳定性好，制备粉针剂时可保证冷冻干燥不变性。利用本发明方法制备得到的注射剂稳定性好，保质期可长达三年。
3、本发明优化了精制天花粉蛋白的冷冻干燥条件，在天花粉蛋白晶体培养中加入无机盐，从而培养出的晶体纯度高，不含杂质多糖、没有热原。
具体实施例方式
下面通过实施例对本发明方法作进一步阐述，但不限制本发明。
实施例1 结晶天花粉蛋白的制备(不使用无机盐培养晶体)
天花粉100kg洗净、去皮、切块、绞碎、离心，得天花粉原汁约20000ml，静置过夜，沉淀天花粉淀粉，滤除沉淀，得到上清液A。用2mol/LHCL调节上清液A的pH值至4，使上清液A冷至5℃以下，缓慢加入冷的工业丙酮16000ml，静置片刻，用冷冻离心机离心(1500转/分)15分钟，弃去沉淀，得到上清液B，冷至5℃以下，缓慢加入冷的丙酮8000ml，静置片刻，冷冻离心机离心(2500转/分)20分钟，收集沉淀，用2000ml纯化水溶解并静置过夜，然后冷冻离心(3500转/分)20分钟得到上清液C，对纯水透析36-48小时，冷冻离心(3500转/分)20分钟得到上清液D，冷冻干燥上清液D得到精制天花粉蛋白136g，冷冻干燥的条件为在-45℃预冻3小时，然后抽真空并缓慢升温，升温幅度为每小时升高2℃，冷冻干燥40小时，最后升温至40℃；将精制天花粉蛋白溶于1360ml纯水，冷冻离心(3500转/分)20分钟，弃去不溶解沉淀，得到上清液E，用透析纸扎成小袋放入PH为8.6的巴比妥缓冲液(由10.3克巴比妥钠和1.84克巴比妥溶于1000毫升纯水中配制而成)中，在冰箱中(5℃)平衡透析7天，得到湿的结晶天花粉蛋白，从表观上看，该湿的结晶晶体表观比较细小，抽滤真空干燥，得到干燥的结晶天花粉蛋白30g。
实施例2 结晶天花粉蛋白的制备(使用无机盐培养晶体)取天花粉176kg，按照实施例1所述的操作方法，制得精制天花粉蛋白240.5g，将精制天花粉蛋白溶于3550ml纯水，冷冻离心(3500转/分)20分钟，弃去不溶解沉淀，得到上清液E，用透析纸扎成小袋放入含0.7％(g/v)醋酸钠的巴比妥缓冲液(PH8.6)，在冰箱中(5℃)平衡透析7天，得到湿的结晶天花粉蛋白，从表观上看，该湿的结晶晶体较大，且在阳光下闪闪发光，经抽滤真空干燥，得到干燥的结晶天花粉蛋白80.5克。
与对比例1所述的原料药生产方法相比，实施例1在晶体培养时使用了0.7％的无机盐(醋酸钠)，利用该方法培养得到的结晶成型好，且干燥的结晶天花粉蛋白产量高于未使用无机盐的实施例1方法。
实施例3 结晶天花粉蛋白的制备(使用无机盐培养晶体)取天花粉150kg，按照实施例1所述的操作步骤，制得精制天花粉蛋白195g，冷冻干燥的条件为在-45℃预冻3小时，然后抽真空并缓慢升温，升温幅度为每小时升高2℃，冷冻干燥35小时，最后升温至45℃；将精制天花粉蛋白溶于2880ml纯水，冷冻离心(3500转/分)20分钟，弃去不溶解沉淀，得到上清液E，用透析纸扎成小袋放入含0.1％(g/v)氯化钠的巴比妥缓冲液(PH8.8)，在冰箱中(5℃)平衡透析7天，得到湿的结晶天花粉蛋白，从表观上看，该湿的结晶晶体较大，且在阳光下闪闪发光。经抽滤真空干燥，得到干燥的结晶天花粉蛋白59.6克。
实施例4 天花粉蛋白注射液的制备按照实施例2所述的方法制备得到湿的结晶天花蛋白60g，经紫外光谱法(参照标准方法SOP-ZL-2001-01)测定，含天花粉蛋白27g，加入17400ml注射用水，离心除去不溶物，用盐酸调pH至4，加入17g活性炭轻轻搅拌，静置一小时左右，过滤，在滤液中加入1％(g/v)多聚乙二醇(分子量15000)，无菌过滤，以每支1.2mg/ml的量分装，得到成品16180支注射液。不溶物经干燥后称量为1.3克，占4.8％。
比较例1天花粉蛋白注射液的制备(常规方法，不使用稳定剂)取实施例1所制备的干燥结晶天花粉蛋白18g，加入7600ml注射用水，离心除去不溶物，用盐酸调pH至4，加入7.2g活性炭轻轻搅拌，静置一小时左右，无菌过滤，以每支1.2mg/ml的量分装，封口得到6130支注射液。不溶物经干燥后称量为6.4克，占35.56％。
比较例1采用干燥结晶天花粉蛋白为原料药配制注射液，在配制时有35.56％的结晶天花蛋白不能溶解，而实施例4采用湿的结晶天花粉蛋白为原料药配制注射液，其结晶天花蛋白的溶解率达到95.2％。此外经稳定性实验表明，利用本发明方法制备的注射液在37℃保存3个月后，其色泽、澄明度、pH值及生物活性指标仍符合卫生部标准WS1-201-87标准的规定，质量稳定；而常规方法制备的注射液则出现色泽、澄明度变差，生物活性指标降至不符合标准，具体实验结果见表1。
实施例5 天花粉蛋白粉针剂的制备按照实施例2所述的方法制备得到湿的结晶天花粉蛋白30克，经紫外光谱法(参照标准方法SOP-ZL-2001-01)测定含天花粉蛋白14.5g，加入9200ml注射用水，离心除去不溶物，用盐酸调pH至4，加入6g活性炭轻轻搅拌，静置一小时左右，过滤，在滤液中加入1％(g/v)人血白蛋白，无菌过滤，以每支1.2mg/ml的量分装，冷冻干燥后再封口得天花粉蛋白的粉针剂8150支，冷冻干燥的条件为在-50℃预冻4小时，然后抽真空并缓慢升温，升温幅度为每小时升高2℃，冷冻干燥45小时，最后升温至40℃。湿结晶溶于注射用水时所产生的不溶物经干燥后称量为0.5克，占3.4％。
实施例6 天花粉蛋白粉针剂的制备按照实施例2所述的方法制备得到湿的结晶天花粉蛋白25g，经紫外光谱法(参照标准方法SOP-ZL-2001-01)测定含天花粉蛋白12.2g，加入7800ml注射用水，离心除去不溶物，用盐酸调pH至4，加入5g活性炭轻轻搅拌，静置一小时左右，过滤，在滤液中加入15％(g/v)多聚乙二醇(分子量15000)，无菌过滤，以每支1.2mg/ml的量分装于安瓿瓶，冷冻干燥后再封口得天花粉蛋白的粉针剂6780支，冷冻干燥的条件为在-50℃预冻4小时，然后抽真空并缓慢升温，升温幅度为每小时升高2℃，冷冻干燥45小时，最后升温至45℃。湿结晶溶于注射用水时所产生的不溶物经干燥后称量为0.4克，占3.2％。
比较例2天花粉蛋白粉针剂的制备(常规方法，不使用稳定剂)取实施例1所制备的干燥结晶天花粉蛋白22g，加入8900ml注射用水，离心除去不溶物，用盐酸调pH至4，加入8.8g活性炭轻轻搅拌，静置一小时左右，无菌过滤，以每支1.2mg/ml的量分装于安瓿瓶，冷冻干燥后再封口得天花粉蛋白的粉针剂7140支，冷冻干燥的条件为在-50℃预冻4小时，然后抽真空并缓慢升温，升温幅度为每小时升高2℃，冷冻干燥45小时，最后升温至45℃。干燥结晶溶于注射用水时所产生的不溶物经干燥后称量为8.6克，占39.10％。
比较例2采用干燥结晶天花粉蛋白为原料药，在用注射用水溶解时有39.10％的结晶天花蛋白不能溶解，而实施例6采用湿的结晶天花粉蛋白为原料药，其结晶天花蛋白的溶解率达到96.8％。此外经稳定性实验表明，利用本发明方法制备的粉针剂在37℃保存3个月后，其色泽、水溶性、pH值及生物活性指标仍符合卫生部标准WS1-201-87的规定，质量稳定；而常规方法制备的粉针剂则出现色泽、水溶性变差，生物活性指标降至不符合标准，具体实验结果见表1。
实施例7 天花粉蛋白皮试液的制备取实施例2所制备的湿的结晶天花粉蛋白0.4g，经紫外光谱法(参照标准方法SOP-ZL-2001-01)测定含天花粉蛋白0.38g，加3700ml注射用水，离心除去不溶物，用盐酸调pH至4，加3.6g活性炭轻轻搅拌，静置一小时左右，无菌过滤，分装每支0.05mg/ml，得到天花粉蛋白皮试注射液3050支。
实施例8注射剂的稳定性实验将天花粉蛋白注射剂置于37℃恒温恒湿箱中存放3个月，检查项目如下外观检查颜色是否变深；澄明度检查灯检是否有沉淀物析出，粉针剂一瓶加1ml生理盐水溶解后再测定；药液pH值检查用25型pH计测定药液pH值，粉针剂两瓶加10ml蒸馏水溶解后再测定；生物活性测试取7只怀孕10-12天的小鼠，每只皮下注射天花粉蛋白0.05mg，5天后处死剖腹，计数死胎及吸收点数，按下列公式计算疗效百分率
测试注射剂为实施例4和比较例1制备的注射液、实施例6和比较例2制备的粉针剂。
实验结果见表1。
表1 天花粉蛋白注射剂37℃加速试验结果
权利要求
1.一种天花粉蛋白注射剂的生产方法，包括如下步骤用注射用水溶解结晶天花粉蛋白、调节pH、加活性炭搅拌、静置一小时后过滤、滤液中加入稳定剂、无菌过滤得到注射液经分装注射液制成水针剂或经冷冻干燥制成粉针剂；其特征在于结晶天花粉蛋白可以采用未干燥的湿的结晶天花粉蛋白或干燥的结晶天花粉蛋白；稳定剂采用水溶解性大分子化合物。
2.根据权利要求1所述的天花粉蛋白注射剂的生产方法，其特征在于稳定剂为分子量为5000-20000的多聚乙二醇或人血白蛋白，其用量为1-20％(重量体积比)。
3.根据权利要求1所述的天花粉蛋白注射剂的生产方法，其特征在于生产粉针剂的冷冻干燥的时间为45-48小时，在干燥过程中升温速度为每小时升2℃，升温最高温度不能超过45℃。
4.权利要求1所述的天花粉蛋白注射剂的原料药的生产方法，包括如下步骤将天花粉洗净、去皮、切块、绞碎、离心得到天花粉原汁，静置过夜沉淀，上清液调节pH，经二次丙酮分级沉淀，离心得到沉淀物，加水溶解、透析、离心取上清液，冷冻干燥得到精制天花粉蛋白，将精制天花粉蛋白加入缓冲液中进行晶体培养，得到天花粉蛋白结晶，经过滤得到湿的天花粉蛋白结晶；湿的天花粉蛋白结晶经过真空干燥后得到干燥的天花粉蛋白结晶。
5.根据权利要求4所述的原料药的生产方法，其特征在于冷冻干燥的时间为30-45小时，在干燥过程中升温速度为每小时升2℃，升温最高温度不能超过45℃。
6.根据权利要求5所述的原料药的生产方法，其特征在于冷冻干燥的时间为35-40小时，升温最高温度为40℃。
7.根据权利要求4所述的原料药的生产方法，其特征在于培养天花粉蛋白晶体时在巴比妥缓冲液中加入0.1-0.9％(重量体积比)的无机盐。
8.根据权利要求7所述的原料药的生产方法，其特征在于无机盐为氯化钠或氯化钾或硝酸钠或磷酸钠或醋酸钠。
全文摘要
本发明涉及一种天花粉蛋白注射剂的生产方法。与现有方法相比，该方法的特点在于采用湿的结晶天花粉蛋白为原料药，采用水溶性大分子化合物作为稳定剂。本发明还提供了原料药的生产方法，其特点在于优化了冷冻干燥条件，晶体培养时使用无机盐。
文档编号A61P31/00GK1827161SQ200510024210
公开日2006年9月6日 申请日期2005年3月4日 优先权日2005年3月4日
发明者金善炜, 吕继湘, 王安文, 谢菊芳, 邱兴奎 申请人:上海金山制药有限公司