专利名称：以角质层中的氧化蛋白质为指标的角质层的透明性·保水性的评价方法
技术领域：
本发明涉及以角质层中的氧化蛋白质为指标的角质层的透明性·保水性的评价方法；以角质层的透明性·保水性为指标的角质层中的蛋白质的氧化度的检测方法；进而涉及通过抑制角质层中的蛋白质的氧化来保持、提高角质层的透明性·保水性的方法。
背景技术：
从进行用于维持更健康皮肤的正确的皮肤护理的观点出发，正确把握肤质(或皮肤状态)是很重要的。因此，在用化妆品进行皮肤护理时，人们通过例如向美容技术者问诊等来评价化妆品使用者的肤质。另外，为了客观地评价肤质，也使用各种测量仪器，根据观察或测定出的参数来评价皮肤状态或机能。
近年来，鉴于皮肤与随着年龄增长的老化、光老化的关系，角质层氧化蛋白质的研究日益盛行。作为主要的氧化蛋白质，是受到氧化而结果导入了羰基的蛋白质，一般包括，蛋白质中的称作Lys、Arg、Pro的氨基酸残基的NH2基直接氧化形成羰基而生成的物质；和脂质氧化成过氧化脂质，进一步分解成活性高的醛，其与蛋白质结合而生成的物质。对氧化蛋白质与老化相关的研究逐渐丰富，人们认识到在老化(脑、肝、成纤维细胞)、阿尔茨海默氏病、早老症(Werner综合征)等中，氧化蛋白质增加。
可以认为，在皮肤中，皮肤表面的皮脂被自由基氧化而生成过氧化脂质，由此使得蛋白质开始氧化，过氧化脂质一旦生成，氧化便连锁地进行，不仅仅对肌肤表面造成刺激，而且直至角质层深处、对细胞造成损害。因此，为了对皮肤的氧化蛋白质的性状例如存在量、分布状态等进行评价，把握肤质或皮肤状态，然后确定皮肤护理法的策略、选择化妆品，人们期待可以以任意的形式应用其评价结果。但是，现在虽然预测到氧化蛋白质与皮肤的损伤之间存在着不清楚的关系，但是尚未明确角质层蛋白质的氧化对皮肤的性状实际上有怎样的影响。
发明内容
人们已经预测到如果能够将皮肤上存在的氧化蛋白质的评价结果用于肤质的改善等，则在皮肤学·化妆学方面是非常有用的，例如可以成为在近年的化妆品业界等中进行的适当的皮肤护理法等的以建议为目的的提供咨询服务的有利手段。
本发明者鉴于上述事实，研究了角质层蛋白质对皮肤性状的影响，结果发现，随着角质层蛋白质的氧化的进行，角质层的保水性和透明性消失。虽然可以在一定程度上预测出由于紫外线的照射、干燥、老化等的原因，角质层的保水性·透明性丧失，但是角质层的保水性·透明性的下降与角质层蛋白质的氧化相关是本发明者首次发现的事实，该事实的查明从皮肤学、化妆品学的角度出发，是非常有意义的。
因此，基于上述事实的查明，本发明的第一观点，是提供一种以角质层中的氧化蛋白质为指标的用于评价角质层的透明性和/或保水性的方法。在优选的方式中，角质层氧化蛋白质的检测是通过对从皮肤取出的角质层样品中的氧化蛋白质的羰基进行特异的荧光标记，检测该荧光来进行的。氧化蛋白质的羰基的特异的荧光标记，优选通过对氧化蛋白质使用含有肼基的荧光物质例如荧光素-5-氨基硫脲、德克萨斯红酰肼(texas redhydrazide)等来进行。
从其他观点出发，本发明提供一种以角质层的透明性和/或保水性为指标的用于检测角质层中的蛋白质的氧化度的方法。
进而，本发明提供一种通过抑制角质层中的蛋白质的氧化来保持·提供角质层的透明性和/或保水性的方法。
通过明确角质层蛋白质的氧化对肌肤的影响，可以提供以角质层氧化蛋白质为指标的皮肤护理方法。
图1是显示丙烯醛处理导致的猪皮角质层水分保持力下降的图表。
图2是显示丙烯醛处理导致的猪皮角质层水分保持力下降的图表。
图3是显示次氯酸(20mM、1hn)引起的猪皮角质层水分保持力下降的图表。
图4是显示次氯酸处理导致的人胳膊皮肤角质层水分保持力下降的图表。
图5是显示丙烯醛处理导致的猪皮角质层透明性下降的图表。
具体实施例方式
在第一观点中，提供一种以角质层中的氧化蛋白质为指标的用于评价角质层的透明性和/或保水性的方法。
如果角质层或肌肤的“透明性”高，则肌肤显示宛如透明的状态，在美容上显示非常好的外观。另外，在角质层或肌肤的“保水性”高的皮肤中，肌肤处于娇嫩、湿润的健康的状态。因此，在美容学上，肌肤具有“透明性”·“保水性”是非常重要的，一般来说，角质层、肌肤的“透明性”、“保水性”是通过美容技术者等的美容专家的主观的感观试验、需要麻烦的操作、昂贵的装置·设备的皮肤样品的光学检查、水分检查等来进行的。本发明通过以角质层中的氧化蛋白质为指标，更详细地说，通过检测角质层中的氧化蛋白质的存在量、分布状态等，可以用更简单且客观的手段来研究角质层、以及肌肤的“透明性”·“保水性”。
人们进行了大量的关于角质层氧化蛋白质的研究，也已知其各种各样的检测方法。在本发明中，对角质层氧化蛋白质的检测方法没有特别的限定，可以利用本领域周知的各种方法。例如，J.J.Thiele et al.FEBS Letter1998 Feb 6，422(3)，403-406中记载的角质层氧化蛋白质的检测方法，是通过将胶带粘附在皮肤表层上，并进行剥离即所谓的胶带剥离操作，来获得粘附有角质层的胶带(“胶带角质层”)，用ELISA检测氧化蛋白质的方法。J.J.Thiele et al.J.Invest.Dermatol.1999Sep.113(3)，335-359中记载的方法，是通过从胶带角质层中提取蛋白质，对可溶性成分进行DNPH标记，实施SDS-PAGE，使用抗DNP抗体进行蛋白质印迹，来进行氧化蛋白质的检测。C.S.Sander et al.J.Invest.Dermatol.2002，Apr，118(4)，618-625中记载的方法，是通过用DNPH标记人皮肤组织切片，用抗DNP进行染色，来检测氧化蛋白质。
在本发明的优选的方式中，角质层氧化蛋白质的检测是通过对从皮肤取出的角质层样品中的氧化蛋白质的羰基进行特异的荧光标记，检测该荧光来进行的。该检测可以在荧光显微镜下进行。氧化蛋白质的羰基的特异的荧光标记，优选通过对氧化蛋白质使用含有肼基的荧光物质例如荧光素-5-氨基硫脲、德克萨斯红酰肼等来进行。根据该方法，通过例如对由荧光显微镜获得的检测结果进行图像化，可以简易地获得皮肤角质层的氧化蛋白质在皮肤上的性状的二维信息，可以谋求在例如化妆品等的销售时的咨询服务时应用该氧化蛋白质的信息。
在本发明中，来源皮肤的角质层样品，可以是来源身体的任一部分的样品，另外，可以是这样的样品(组织或细胞)的培养物。作为该样品的来源的身体的部位或区域的典型例，可以列举出，脸的脸颊、额头、指甲和躯干等。
这样的样品可以通过所谓的外科手段等的侵入方法而得到，但是，在特别是以评价肤质为目的的情况下，为了简便，优选通过非侵入式方法从皮肤中取得。作为非侵入式方法，可以列举出例如，该技术领域中常用的胶带剥离、擦拭法等。
由于胶带剥离通过在皮肤表面粘附胶带片，并实施剥离，可以将皮肤的二维状态直接转印到该胶带上，所以在本发明中是特别优选的。如果通过胶带剥离来采取胶带角质层、不进行裁断、以保持原样的状态对氧化蛋白质进行特异的荧光染色，则可以得到对应于实际的皮肤的二维性状的氧化蛋白质的二维信息。
胶带剥离的优选方法是，首先，将皮肤表层用例如酒精等进行净化来消除皮脂、污渍等，将切成合适尺寸(例如5×5cm)的胶带片轻轻地放在皮肤表面上，对整个胶带施加均匀的力，压平，然后用均匀的力将胶带剥离。胶带可以是市售的玻璃纸胶带等，例如可以使用ScotchSuperstrength Mailing Tape(3M公司制)等。
本发明的优选的方式中可利用的对氧化蛋白质的羰基进行特异的荧光标记的荧光物质，优选为具有可与氧化蛋白质的羰基结合的肼基-NHNH2的物质。这样的荧光物质的例子，可以列举出，荧光素-5-氨基硫脲、德克萨斯红酰肼等。
在使用这样的含肼基的荧光物质的情况下，氧化蛋白质的检测具体来说，例如可以如下那样实施(1)通过例如胶带剥离来采取角质层样品；(2)使适当缓冲液(例如100mM的MES-Na缓冲液(pH5.5))中的含肼基的荧光物质与样品在室温下反应数小时(例如1小时)；(3)在反应结束后，用适当的生理溶液(例如缓冲液磷酸缓冲生理食盐液(PBS))充分洗涤后，用荧光显微镜检测氧化蛋白质；(4)任选地，进行荧光显微镜拍照。
氧化蛋白质的特异的荧光标记也可使用生物素酰肼与荧光标记抗生物素蛋白的组合。由于生物素酰肼也具有肼基，所以其可结合在蛋白质的羰基上。在这种情况下，首先使生物素酰肼结合在氧化蛋白质上，然后通过生物素-抗生物素蛋白结合来使荧光标记抗抗生物素蛋白与生物素酰肼结合，结果使氧化蛋白质被荧光标记。生物素酰肼可以采用该领域公知的例如ピア一ス社制造销售的产品。另外，荧光抗生物素蛋白可使用例如荧光素抗生物素蛋白等。
在使用这样的含肼基荧光物质的情况下，氧化蛋白质的检测具体来说例如可以如下那样实施(1)通过例如胶带剥离来采取角质层样品；(2)使适当的缓冲液(例如100mM的MES-Na缓冲液(pH5.5))中的生物素酰肼与样品在室温下反应数小时(例如1小时)；(3)在反应结束后，用适当的生理溶液(例如缓冲液磷酸缓冲生理食盐液(PBS)充分洗涤后，使荧光标记抗生物素蛋白在室温中反应数小时(例如1小时)；(4)用荧光显微镜检测氧化蛋白质；(5)任选地，进行荧光显微镜拍照。
也可以通过使二硝基苯肼作用·结合在氧化蛋白质的羰基上，用荧光色素标记其二硝基苯酚部分，来进行氧化蛋白质的特异的荧光标记。因此，在本发明更优选的方式中，可以用荧光免疫测定法等来检测与氧化蛋白质的羰基结合了的二硝基苯肼的二硝基苯酚部分。
在利用这样的二硝基苯肼进行荧光标记的情况下，氧化蛋白质的检测具体来说例如可以如下那样实施(1)通过例如胶带剥离来采取角质层样品；(2)使适当的缓冲液(例如100mM的MES-Na缓冲液(pH5.5))中的二硝基苯肼(DNPH)与样品在室温下反应数小时(例如1小时)；(3)在反应结束后，用适当的生理溶液(例如缓冲液磷酸缓冲生理食盐液(PBS))充分洗净后，在抗DNP抗体例如兔DNP抗体(ZYMED公司制)的同样的生理溶液中，在室温反应数小时(例如1小时)；(4)在反应结束后，用同样的生理溶液充分洗净，使特异的荧光标记的二级抗体例如荧光素标记抗兔Ig(アマシヤムフアルマシアバイオテク社制)等与上述抗DNP抗体在室温反应数小时(例如1小时)；(5)用荧光显微镜检测氧化蛋白质；(6)任选地，进行荧光显微镜拍照。
根据其他观点，本发明提供一种以角质层的透明性和/或保水性为指标的用于检测角质层中的蛋白质的氧化度的方法。如上所述，本发明者发现了角质层蛋白质的氧化对肌肤的“透明性”·“保水性”的影响，但角质层蛋白质的氧化也可能对皮肤的包括肌肤老化在内的其他各种性状产生影响。因此，以角质层的“透明性”·“保水性”为指标，可以对以角质层蛋白质的氧化引起的皮肤老化为主的各种其他性状进行早期发现·处理。如上所述，角质层、肌肤的“透明性”·“保水性”，可以通过美容技术者等的美容专家的主观的感观试验、皮肤样品的光学检查、水分检查等来进行。
另外，本发明通过抑制角质层中的蛋白质的氧化，可以提供一种保持角质层的透明性和/或保水性的方法。角质层蛋白质的氧化的抑制，可以通过将适当的抗氧化剂、例如抗坏血酸、维生素E等周知的化合物溶解在适当的溶剂中，适量应用于肌肤等来实现。
下面列举具体例来更具体地说明本发明。另外，本发明并不仅限于这些例子。
实施例试验1以角质层氧化蛋白质为指标的角质层的“保水性”的评价(1)将干燥猪皮(アロアスク、大鹏药品工业株式会社)在水中浸渍3天。取出猪皮，在0、1、10、100mM的丙烯醛(东京化成工业株式会社)溶液中浸渍3小时，进行氧化处理。通过使丙烯醛作用于蛋白质，来进行氧化，生成醛蛋白质加成体。氧化处理后，用水洗涤1小时，洗净后，使角质层侧朝上在培养皿上开始干燥(湿度50％、温度25℃)，用スキコン200(アイ·ビイ·エス株式会社)测定15分钟后的角质层水分量。
将角质层水分量的结果以皮肤电导率值的形式示于图1。如图1所表明的那样，可以观察到丙烯醛导致的氧化处理浓度依赖性的水分量下降。即，可以观察到氧化处理导致角质层水分保持力下降。
试验2以角质层氧化蛋白质为指标的角质层的“保水性”的评价(2)将黑猪皮肤用10mM的丙烯醛(东京化成工业株式会社)溶液氧化处理1小时。用水洗涤1小时后，充分拭去水分，利用スキコン200来经时地测定角质层水分量的变化。
其结果示于图2中。在猪皮肤中，可以观察到丙烯醛的氧化处理导致角质层水分保持力下降。
试验3以角质层氧化蛋白质为指标的角质层的“保水性”的评价(3)将黑猪皮肤在20mM的次氯酸中处理1小时。用水洗涤1小时后，充分拭去水分，利用スキコン来经时地测定角质层水分量的变化。
其结果示于图3中。在猪皮肤中，可以观察到次氯酸的氧化处理也导致角质层水分保持力下降。
试验4以角质层氧化蛋白质为指标的角质层的“保水性”的评价(4)将人胳膊皮肤在PBS或20mM的次氯酸中闭塞处理1小时。用水洗涤1小时后，充分拭去水分，利用スキコン来经时地测定角质层水分量的变化。
其结果示于图4中。在人皮肤中，也可以观察到氧化处理导致的角质层水分保持力的下降。
试验5以角质层氧化蛋白质为指标的角质层的“透明性”的评价将干燥猪皮(アロテスク、大鹏药品工业株式会社)在水中浸渍3天。取出猪皮，在0、1、10、100mM的丙烯醛(东京化成工业株式会社)溶液中浸渍3小时，进行氧化处理。在氧化处理后，用水洗涤1小时。洗净后，使角质层侧朝上在培养皿上开始干燥(湿度50％、温度25℃)，目视观察干燥24小时后的猪皮的外观。
其结果示于图5。如图5所表明的那样，没有实施氧化处理的猪皮的透明度高，与此相对，如果用丙烯醛处理，则透明度呈浓度依赖性地降低。
权利要求
1.一种用于评价角质层的透明性和/或保水性的方法，以角质层中的氧化蛋白质为指标。
2.如权利要求1所述的用于评价角质层的透明性和/或保水性的方法，通过对从皮肤采取的角质层样品中的氧化蛋白质的羰基进行特异的荧光标记，对该荧光进行检测，来进行角质层氧化蛋白质的检测。
3.一种用于检测角质层中的蛋白质的氧化度的方法，以角质层的透明性和/或保水性为指标。
4.一种保持·提高角质层的透明性和/或保水性的方法，通过抑制角质层中的蛋白质的氧化来进行。
全文摘要
本发明提供一种以角质层中的氧化蛋白质为指标的角质层的透明性·保水性的评价方法。
文档编号A61K8/00GK1930473SQ20058000716
公开日2007年3月14日 申请日期2005年3月4日 优先权日2004年3月5日
发明者岩井一郎, 平尾哲二 申请人:株式会社资生堂