专利名称：一种源自灰树花子实体的α－葡聚糖、其制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种源自灰树花子实体的α-葡聚糖，本发明还公开其制备方法及其用于防治糖尿病的用途。
背景技术：
灰树花(Grifola frondosa)分类学上属担子菌亚门、层菌纲、无隔担子菌亚纲、非褶菌目、多孔菌属中的一种大型真菌，是一种药、食兼用的珍稀食用菌。其子实体中富含氨基酸、多糖以及微量元素等多种营养成份，其中的灰树花多糖是主要的生物活性成份。灰树花多糖具有显著的抗肿瘤、降血糖、抗肝炎、抗HIV病毒、稳定血压、改善脂肪代谢以及改善免疫系统功能等功效。因此目前已被开发成多种保健品，主要作为生物反应调节剂，已成为癌症患者放化疗过程中重要的辅助药物。
Kubo等在对灰树花子实体多糖提取过程中发现，其50％乙醇沉淀的水提物(X组分)具有降血糖作用，主要成分为糖肽，未见进一步纯化与结构确证报道。口服灰树花子实体粗粉及其X组分可使KK-Ay小鼠(遗传型2型糖尿病模型)血糖降低(见Biol Pharm Bull1994，17(8)1106-1110)。X组分一次给药28mg(相当于700mg/kg)可使KK-Ay小鼠血糖下降19.88％(见Diabetes Obes Metab 2002，4(1)43-48)。临床需要疗效更好、纯度更高的药物。
发明内容
本发明公开了一种从灰树花子实体中提取的新的葡聚糖，简称MT-α-glucan，所述灰树花子实体优选中国浙江产的灰树花子实体。
更为具体地，本发明公开了一种源自灰树花子实体的α-葡聚糖，其结构为a构型，相对分子量为30万-200万道尔顿，在200-400nm无紫外特征吸收峰。优选的相对分子量为30万-100万道尔顿。
本发明的α-葡聚糖可以用下列方法制备将灰树花子实体粉碎，有机溶剂回流除去脂溶性物质，离心去除有机层，加水加热提取，提取液用乙醇沉淀，沉淀复溶后，用大孔型阴离子交换层析，在经凝胶过滤层析，即得。
在制备的一开始可以将灰树花子实体先干燥，然后再粉碎。
有机溶剂可以选择一般常用的去脂用的溶剂，本发明中优选两种复合溶剂1、乙醇和乙醚；2、乙醇和石油醚。
复合溶剂中两者的体积比优选为乙醇∶乙醚或石油醚＝0.75-1.25∶1。
有机溶剂所加的体积优选每克灰树花子实体粉末加5-10ml有机溶剂。
离心速度优选在8000rpm以上。
用于沉淀的乙醇的加入量优选到终体积含醇量30-70％，收集乙醇沉淀物。
乙醇沉淀物加水的量优选脱脂后的灰树花子实体粉末的8-10倍重量。
本发明中大孔型阴离子交换层析为符合药品生产标准的树脂即可，如D290、D296、AB-8、D3520、DEAE-Sepharose Fast Flow等，优选AB-8或DEAE-Sepharose Fast Flow。
其中凝胶过滤层析优选TOSHO公司的ToyopearlHW-75或Amersham Bioscience公司的Sephacryl S300HR。
药理试验表明，本发明的α-葡聚糖一次给药仅450mg/kg可使KK-Ay小鼠血糖下降29.63％，说明本发明的α-葡聚糖具有较佳的降血糖功效，并且降糖效果大大优于背景技术中的X组分(X组分一次给药28mg(相当于700mg/kg)可使KK-Ay小鼠血糖下降19.88％)。因此，本发明的α-葡聚糖可用于制备预防和/或治疗2型糖尿病的药物。
下面是本发明的部分药理药效学试验及数据一、对遗传型2型糖尿病KKay小鼠模型的治疗作用1急性治疗试验5只雌性KKay小鼠，体重范围在40±2g，一次灌胃(ig)给MT-α-glucan(实施例1制得)，给药剂量为450mg/kg。于给药前、给药后4h、8h、12h、24h分别测定血糖值，观察给药当天的血糖变化。试验结果见表1，图1。
表1 HSH一次给药后不同时间对KKay小鼠血糖(mmol/L)的影响 n＝5，x±s.与自身0h相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与阴性对照组相比，#P＜0.05，##P＜0.01图1是MT-α-glucan一次给药对KKay糖尿病小鼠当天的血糖变化。
结果表明，给药后4、8、12h血糖明显下降，以给药后8h降血糖作用最为明显，血糖下降29.63％，随后血糖水平逐渐上升，给药后24h恢复到给药前水平。
2慢性治疗试验雌性KKay小鼠32只，体重范围在40±2g，随机分为4组模型组、本发明MT-α-glucan高、低剂量组(450、150mg/kg，每日分2次给予)、阳性对照组(罗格列酮，1mg/kg)，每组8只。另取8只雌性C57小鼠为正常对照组(因C57为KKay的遗传背景小鼠)。每日ig给药，每日2次，正常和模型对照组ig等容积CMC-Na，连续给药2周。于给药前1天、给药后4、8、14天，小鼠禁食4h后尾尖取血，用血糖仪测定血糖值；于给药第12天，上午给药前、给药后4h、8h、12h、24h尾尖取血，测定随机血糖值，观察一天内血糖的动态变化。试验结果见表2，表3和图2。
表2 MT-α-glucan给药不同时间对KKay糖尿病小鼠的降血糖作用
n＝8，x±s.与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01表3 MT-α-glucan连续给药11天对KKay小鼠一天24h内血糖动态变化的影响
n＝8，x±s.与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01图2是胰腺病理组织学照片，结果表明，与正常组相比，模型组胰岛体积明显增大。MT-α-glucan给药组胰岛体积明显减小。说明本发明MT-α-glucan具有减轻胰岛素抵抗，提高胰岛素敏感性的作用。
二、对营养型2型糖尿病小鼠模型的预防作用
C57BL/6J小鼠，雄性，40只，3周龄，随机分为4组正常对照组、模型组、本发明MT-α-glucan高、低剂量组(900、300mg/kg)，每组10只。除正常对照组外，其余各组喂高糖高脂饲料(10％猪油，10％蔗糖，10％鲜鸡蛋，70％基础饲料)3周后，腹腔注射(ip)链脲佐菌素(STZ，以柠檬酸缓冲液配制，0.05M，pH4.5)100mg/kg，再喂高糖高脂饲料5周。每日ig给药，正常和模型对照组ig等容积CMC-Na，连续给药8周。于ip STZ前1天、ip ST2后1、2、3、4、5周，小鼠禁食4h后尾尖取血，用血糖仪测定血糖值。试验结果见表4和图3。
表4 MT-α-glucan对营养型2型糖尿病小鼠空腹血糖(mmol/L)的影响
n＝10，x±s.与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01图3是胰腺病理组织学照片，结果表明，与正常组相比，模型组胰岛体积明显减小，结构破坏。MT-α-glucan给药组胰岛体积明显增大，胰岛结构正常。说明本发明MT-α-glucan对胰岛具有一定的保护作用。
本发明的MT-α-glucan经急性毒性试验结果表明，小鼠ig给药一日最大给药量(MTD)为19.2g/kg，相当于有效剂量120倍。说明本发明产品安全低毒，几乎无毒副反应。
本发明还公开了一种药物组合物，其中含有本发明的MT-α-glucan及药学上可接受的载体，所述的药学上可接受的载体是惰性的，可以用药剂学常规方法制备本发明的MT-α-glucan的多种制剂。
图1本发明的MT-α-glucan一次给药对KKay糖尿病小鼠当天的血糖变化。
图2本发明灰树花子实体多糖MT-α-glucan对KKay糖尿病小鼠的胰腺组织学结果(a正常组、b模型组、c MT-α-glucan组、d罗格列酮组)(均为苏木紫-伊红染色，放大倍数200)。
图3本发明灰树花子实体多糖MT-α-glucan对营养型2型糖尿病小鼠的胰腺组织学结果(a正常组、b模型组、c MT-α-glucan高剂量组、d MT-α-glucan低剂量组)(均为苏木紫-伊红染色，放大倍数200)。
图4是本发明灰树花子实体多糖MT-α-glucan HPGPC检测分子量图谱(a 38万道尔顿组分、b 43万道尔顿组分)。
图5是本发明分子量为38万道尔顿灰树花子实体多糖MT-α-glucan红外光谱(IR)。
图6是本发明分子量为43万道尔顿灰树花子实体多糖MT-α-glucan红外光谱(IR)。
图7是本发明分子量为38万道尔灰树花子实体多糖MT-α-glucan核磁共振氢谱(1H-NMR)。
图8是本发明分子量为43万道尔灰树花子实体多糖MT-α-glucan核磁共振氢谱(1H-NMR)。
图9是本发明分子量为38万道尔灰树花子实体多糖MT-α-glucan核磁共振碳谱(13C-NMR)。
图10是本发明分子量为43万道尔灰树花子实体多糖MT-α-glucan核磁共振碳谱(13C-NMR)。
具体实施例方式
实施例1取100g干燥的灰树花子实体粉末加入500ml乙醇乙醚(1∶1)混合液，70℃回流6小时。8000rpm离心，收集沉淀。
沉淀加入1000ml蒸馏水，121℃提取30分钟。8000rpm离心，收集上清液，加入95％乙醇到终体积含醇量50％，得到沉淀，4℃沉降12小时。8000rpm离心得沉淀，无水乙醇、丙酮、乙醚依次洗涤。得到的样品糖含量为66.7％。
沉淀用水复溶，以50mg/ml上样4.0ml，选用D296树脂，3ml/min蒸馏水洗脱，收集穿透峰。得到样品18.7mg，含糖量为80％。
浓缩上述样品，以1ml/min上HW75树脂，得到相邻的两个峰。
采用HPGPC检测分子量两峰分别在38万道尔顿和43万道尔顿。(见图4，(a 38万道尔顿组分、b 43万道尔顿组分)。
红外光谱(IR，图5、图6)、核磁共振氢谱(1H-NMR，图7、图8)和核磁共振碳谱(13C-NMR，图9、图10)分析均为α构型葡聚糖。图5、图6显示在920cm-1和858cm-1附近的吸收峰证明为α吡喃糖特征吸收。图7、图8显示1H-NMR图中Cl质子的化学位移值大于5.0ppm，证明是α吡喃糖。图9、图10显示13C-NMR图中Cl化学位移值在97-101ppm，证明是α吡喃糖。
单糖组成分析通过气相色谱(GC)法、1，3，5-吡唑酮(PMP)-衍生化法测定单糖组成，均证明灰树花子实体多糖MT-α-glucan为葡聚糖。
实施例2
取100g干燥的灰树花子实体粉末加入500ml乙醇石油醚(1∶1)混合液，70℃回流6小时。8000rpm离心，收集沉淀。
沉淀加入800ml蒸馏水，121℃提取30分钟。8000rpm离心，收集上清液，加入95％乙醇到终体积含醇量50％，得到沉淀，4℃沉降12小时。8000rpm离心得沉淀，无水乙醇、丙酮、乙醚依次洗涤。得到的样品糖含量为70.1％。
沉淀复溶于水溶液，以50mg/ml上样4.0ml，选用DEAE-Sepharose Fast Flow树脂，3ml/min蒸馏水洗脱，收集穿透峰。得到样品15.3mg，含糖量为84％。
浓缩上述样品，以1ml/min上HW75，得到相邻的两个峰。采用HPGPC检测分子量两峰分别在80万道尔顿和87万道尔顿。
实施例3取100g干燥的灰树花子实体粉末加入700ml乙醇乙醚(1∶1.2)混合液，70℃回流6小时。8000rpm离心，收集沉淀。
沉淀加入800ml蒸馏水，121℃提取30分钟。8000rpm离心，收集上清液，加入95％乙醇到终体积含醇量55％，得到沉淀，4℃沉降12小时。8000rpm离心得沉淀，无水乙醇、丙酮、乙醚依次洗涤。得到的样品糖含量为68.1％。
沉淀复溶于水溶液，以50mg/ml上样4.0ml，选用DEAE-Sepharose Fast Flow树脂，3ml/min蒸馏水洗脱，收集穿透峰。得到样品14.6mg，含糖量为81％。
浓缩上述样品，以1ml/min上Sephacryl S300HR，得到相邻的两个峰。采用HPGPC检测分子量两峰分别在105万道尔顿和112万道尔顿。
权利要求
1.一种源自灰树花子实体的α-葡聚糖，其特征在于其结构为a构型，相对分子量为30万-200万道尔顿，在200-400nm无紫外特征吸收峰。
2.权利要求1的α-葡聚糖，其特征是相对分子量为30万-100万道尔顿。
3.权利要求1或2的α-葡聚糖的制备方法，包括将灰树花子实体粉碎，有机溶剂回流除去脂溶性物质，离心去除有机层，加水加热提取，提取液用乙醇沉淀，沉淀溶于水中，用大孔型阴离子交换层析，再经凝胶过滤层析，即得。
4.权利要求3的制备方法，其中有机溶剂是乙醇和乙醚或乙醇和石油醚的复合溶剂。
5.权利要求4的制备方法，其中乙醇∶乙醚或石油醚的体积比是0.75-1.25∶1。
6.权利要求3的制备方法，其中每克灰树花子实体粉末加5-10ml有机溶剂。
7.权利要求3的制备方法，其中加水的量是脱脂后的灰树花子实体粉末的8-10倍重量。
8.权利要求3的制备方法，其中凝胶过滤层析选用ToyopearlHW-75或Sephacryl S300HR。
9.一种治疗糖尿病的药物组合物，其中含有权利要求1的α-葡聚糖及药学上可接受的载体。
10.权利要求1的α-葡聚糖用于制备预防和/或治疗2型糖尿病的药物的用途。
全文摘要
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种源自灰树花子实体的α－葡聚糖，其结构为a构型，相对分子量为30万－200万道尔顿，在200－400nm无紫外特征吸收峰。本发明还公开其制备方法及其用于防治糖尿病的用途。
文档编号A61P3/10GK1974603SQ20061009826
公开日2007年6月6日 申请日期2006年12月8日 优先权日2006年12月8日
发明者吴梧桐, 雷红, 马迅 申请人:中国药科大学