包含来自细胞系产生的流感病毒的红血球凝聚素的病毒颗粒、组合物、制造方法和它们的应用的制作方法

专利名称：：包含来自细胞系产生的流感病毒的红血球凝聚素的病毒颗粒、组合物、制造方法和它们的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及免疫学和疫苗学领域。具体地，本发明涉及改进的病毒颗粒、包含所述病毒颗粒的组合物和它们的应用。
背景技术：
：医疗的一个极为重要的目标是用于预防的现代疫苗的开发和用于疾病治疗的治疗物质的有效递送。迄今为止，病毒颗粒是已知的适用于抗原递送的囊泡和/或治疗物质的载体。病毒颗粒是由脂质和至少一种病毒包膜蛋白组成的复合体，由体外过程制备。月旨质是从卵或植物中提纯，或者合成制造，一小部分的脂质源于提供包膜蛋白的病毒。本质上，病毒颗粒表示再生的、空的病毒包膜，所述病毒包膜缺乏包含源病毒遗传物质的核壳体。病毒颗粒不能复制，而是纯的融合活性囊泡。这些病毒颗粒的功能体现在它们的膜融合活性与完整病毒的明确的低PH依赖型膜融合活性极为相似，这是由病毒融合蛋白单独介导。如同病毒，病毒颗粒通过受体介导的内吞作用或与细胞膜融合而快速地被内在化。通常，使用的病毒颗粒是被称作为免疫增强重组流感病毒颗粒(IRIVs)。IRIVs是球形的、单层囊泡，其平均直径是150nm，包括双层脂质膜，主要由磷脂组成，优选地是磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)。IRIVs包含插在磷脂双分子膜中的所述功能型病毒包膜糖蛋白红血球凝聚素(HA)和神经氨酸苷酶(NA)。所述生物活性的HA不仅赋予病毒颗粒制剂(formulation)的结构稳定性和同质性，还通过维持病毒融合活性显著影响了免疫特性。任选地，所述IRIVs包括多于一种病毒株的红血球凝聚素分子，因此形成了融合的IRIVs0已通过将A型流感病毒株的红血球凝聚素(HA)合并至卵磷脂组成的脂质体中开发IRIVs。流感病毒表面糖蛋白HA明确地指导病毒颗粒至抗原呈递细胞，并导致和它们的内体膜(endosomalmembrane)融合。这一过程提供了抗原至免疫活性细胞的最佳处理和说明。T淋巴细胞被激活产生细胞因子，从而刺激B淋巴细胞形成大量特异性抗体。而且，与抗原_病毒颗粒复合体的直接接触也使对B淋巴细胞的刺激作用发生。病毒颗粒在现代疫苗接种/治疗中是高效的佐剂/载体系统，具有作为抗原递送囊泡的出色特性和强大的免疫原潜质，同时伴随地使副作用风险最小。此外，病毒颗粒显示了佐剂(W092/19267)，反式佐剂(trans-adjuvant)(欧洲专利申请EP05027624)和非特异性免疫刺激效果(欧洲专利申请EP06027120)。在50多年中，流感病毒疫苗在胚胎的鸡卵中培养。但是，传统的标准方法非常冗长和麻烦。当前的卵源疫苗的生产，从新确定的病毒株的分离到最终的产品，需要上至9个月。这可能妨碍对未曾预料的要求的回应，如大流行(pandemic)株的发现、产品失败和季节性流行性感冒病毒的变异。而且，传统的卵基的(egg-based)方法需要大量的卵，病毒分离对卵的适应和大量的纯化以减少污染的卵蛋白的量和将卵蛋白致敏症的风险降到最小。相反地，基于细胞系的方法对于病毒的繁殖更快并且更加灵活，并且可以允许在卵中不能充分生长的株的生产(如，1997年香港禽流感)。而且，细胞系用来制造病毒有几个与生成的疫苗的安全性有关的优势在疫苗制剂中不存在抗生素添加剂，不需要有毒的防腐剂(例如硫柳汞)；内毒素水平降低；不会引起卵致敏症；在无蛋白和血清的培养基中生长(无外源因子/BSE)；病毒疫苗产品是高纯度的。最近，相当大的努力用来开发细胞培养系统用于疫苗生产。多数已知的细胞培养体系是基于哺乳动物细胞系，例如=Vero细胞，MDCK细胞，BHK细胞和PerC6细胞。已经有许多关于基于哺乳动物细胞培养体系的疫苗开发的报道。但是，在所述哺乳细胞培养体系生产的病毒疫苗遭受对哺乳动物细胞源的蛋白的自体免疫反应的风险。病毒颗粒融合过程对有效的抗原/药物递送是必要的(SchoenP等，1999)。因此，本领域需要开发在融合活性和免疫原性具有改进性质的病毒颗粒。
发明内容本发明通过提供包含来自鸟细胞系产生的流感病毒的红血球凝聚素(HA)的新的病毒颗粒满足了这个需要。相对于包含源于以标准程序用鸡卵生产的流感病毒的红血球凝聚素的病毒颗粒，这些新的病毒颗粒的特性在于改进的融合活性和改进的免疫原性。因此，第一个方面，本发明涉及一种包含红血球凝聚素的病毒颗粒，其中所述红血球凝聚素来自鸟细胞系产生的流感病毒。“鸟细胞系”在本发明中的含义是为了均一性从来自通常同类的鸟组织源(如一种器官)的细胞群体中选择的细胞培养物。本术语排除鸟卵，例如鸡卵。因此，“来自鸟细胞系产生的流感病毒的HA”意味着HA来自在源于鸟组织的细胞培养物中生长的病毒，而不是来自生长在卵中的病毒。优选的鸟细胞系包括，但不限于原代细胞系，例如鸡胚成纤维细胞(CEF)；7戈久/7戈生细胞系(permanent/immortalizedcelllines)，例如DF-I(US5672485)，PBS(US5989805)和HDl1。此外，本发明涉及一种包含红血球凝聚素的病毒颗粒，其中相比于包含来自鸡卵产生的流感病毒的、并具有同样初级结构或肽序列的HA的病毒颗粒的融合活性，所述病毒颗粒的融合活性至少高50%。在一个优选实施方案中，根据本发明的病毒颗粒更进一步具有免疫原性，该免疫原性，相比于包含来自鸡卵产生的流感病毒的HA的病毒颗粒的免疫原性，明显地高。优选地，根据本发明的病毒颗粒具有融合活性，该融合活性，相比于包含来自哺乳动物细胞产生的流感病毒的HA的病毒颗粒的融合活性，至少高30%。令人惊奇地，已发现病毒颗粒的融合活性的性质依赖于流感病毒制备的方法，其中病毒颗粒被重组。在一个优选实施方案中，包含在根据本发明的病毒颗粒中的HA来自细胞系产生的流感病毒。优选地，HA来自鸟细胞系产生的流感病毒。Vivalis的专利申请(W02006/108846)涉及鸟胚干细胞，优选地，EBx细胞系，用于病毒载体和病毒制备的应用。但是，W02006/108846既没有公开也没有建议从源于细胞系的病毒获得的HA在病毒颗粒中的应用。所述病毒颗粒可以是融合病毒颗粒，其中所述HA源于至少两种不同的流感病毒株。此外，所述病毒颗粒可以冻干。在本发明的一个优选实施方案中，所述病毒颗粒装载抗原。在更进一步的优选实施方案中，本发明的病毒颗粒是裸露的/空的。在另一方面，本发明涉及包含根据本发明的病毒颗粒的组合物。在一个优选实施方案中，所述组合物是疫苗。在另外一个优选实施方案中，所述组合物有免疫原性并且进一步包括脂质体和至少一种抗原分子。优选地，所述至少一种抗原分子陷入所述脂质体中。在另一个方面，本发明涉及根据本发明的病毒颗粒在药物组合物中作为抗原递送载体以产生抗多种起源的抗原的免疫反应的应用。根据本发明的病毒颗粒也可以用于制备用于疫苗或免疫接种的药物组合物。此外，本发明涉及缺少装载的抗原的免疫刺激病毒颗粒。因此，本发明涉及根据本发明的病毒颗粒作为非特异性免疫刺激剂用于制备药物组合物以产生有效的抗多种起源的抗原的免疫反应的应用。最后，本发明涉及本发明的病毒颗粒的应用，所述病毒颗粒用于制备治疗或预防疾病或紊乱的药物组合物。在另一个方面，本发明涉及一种包括根据本发明的病毒颗粒或组合物的试剂盒。另一方面涉及一种用根据本发明的病毒颗粒或组合物对实验体(subject)进行疫苗接种或免疫的方法，包括将所述病毒颗粒或所述组合物给药在实验体上以引起免疫反应。本发明还包括一种对需要的实验体用本发明的病毒颗粒或组合物治疗或预防疾病或紊乱(例如传染性疾病和/或癌症)的方法，包括将所述病毒颗粒或所述组合物给药到所述实验体。在另一方面，本发明涉及制备本发明的病毒颗粒的方法，包括步骤用清洁剂或短链磷脂处理全流感病毒，分离包含HA的片段(HAcontainingfraction)和去除清洁剂，得到重组的病毒颗粒。可选择地，分离步骤可以包括添加磷脂。本发明还涉及通过所述方法得到的病毒颗粒。图1显示了病毒颗粒制品的免疫印迹分析，所述病毒颗粒制品使用了感染流感病毒A/NewCaledonia的鸡细胞系的红血球凝聚素(甬道1和4)，鸭细胞系(甬道2和5)或者来自胚卵繁殖的病毒(甬道3和6)。斑点A利用流感病毒A特异性多克隆兔血清显影，斑点B利用识别红血球凝聚素亚体HAl上的特定抗原决定基的单克隆抗体显影。图2显示了流感病毒颗粒的融合活性。上图实验2，实施例4.5，显示在表2的融合活性结果的图形表示；下图细胞源流感病毒颗粒卵源流感病毒颗粒的融合活性比率。柱表示在不同的稀释步骤中的样品之间的平均比率，不同的稀释步骤中0.8ml总体积中HA的浓度范围是1-6μgHA。图3和图4表示老鼠中免疫原性研究的结果。从图4中可见，包含来自(鸟)细胞系产生的流感病毒的HA并装载有异源抗原⑴K39)的病毒颗粒具有改进的免疫原性。图3A显示了用于制备本发明的病毒颗粒的病毒的来源(细胞系/细胞培养物或者卵)，在一次免疫后，对抗卵源HA的抗体滴度没有明显的影响。图3B显示了HA有改进的免疫原性在用来自EBx细胞产生的病毒的HA配成的病毒颗粒进行第一次免疫后，有更高的抗EBx源HA的抗体滴度。图4显示了抗异源抗原M39的抗体的个体滴度。这通过计算对应的包括在每个平皿中的对照血清的最大OD值的20%OD值的稀释度完成。在所示实施例中，关于异源抗原UK39的免疫原性，从包含来自卵产生的病毒的HA的病毒颗粒与包含来自细胞系产生的病毒的HA的病毒颗粒中观测到的区别明显用Wilcoxon检测，鸡细胞培养物卵的P=O.002，鸭细胞培养物卵的ρ=0.009。图5显示了相比于包含来自卵的病毒制备的HA的病毒颗粒，通过包含来自(鸟)细胞系的病毒制备的HA、并载有异源抗原的病毒颗粒，CD8+T细胞对异源抗原(非HA)的改进的诱导。具体实施例方式本文中所使用的术语“病毒颗粒”指通过体外过程制备的囊泡，所述囊泡包括脂质和至少一种病毒包膜蛋白。所述脂质是从生物有机体(如卵、植物、动物、细胞培养物、细菌、病毒)中纯化的，或者合成产生(化学合成)。病毒颗粒可以是重组的病毒包膜，所述重组的病毒包膜源于多种病毒并且缺少有传染性的核壳体和源病毒的遗传物质，如免疫增强重组流感病毒颗粒(IRIV)。因此，病毒颗粒是特殊形式的脂质囊泡，在其脂质膜中包括至少一种病毒包膜蛋白。本文中所使用的术语“病毒包膜蛋白”指任何由包膜病毒编码的蛋白，本发明的病毒颗粒部分或全部来自所述包膜病毒，所述蛋白存在于病毒颗粒脂质层中。当病毒包膜蛋白在病毒或病毒颗粒与目标细胞膜的融合中起作用时，它们有时作为“病毒融合蛋白”起作用。本发明的病毒颗粒可以包括多于一种类型的包膜蛋白。包含在病毒颗粒的膜中的所述额外的蛋白没有必要来自包膜病毒，但是可以来自任何生物体(包括微生物，如细菌、真菌或寄生虫)。所述包膜蛋白可以是重组蛋白，假设蛋白的生化性质允许它与脂质膜物理性接触。这些包膜蛋白说明了病毒颗粒的功能性。相比于病毒体系，病毒颗粒是安全的，因为病毒的传染性核壳体已经被去除。迄今为止，病毒颗粒主要作为疫苗使用，通过将抗原合并在病毒颗粒的表面上或者内部。相比于病毒样微粒(VLPs)，基于蛋白在适当的表达系统中重组表达，病毒颗粒不是自然形成的，而是控制的体外过程的结果，这允许病毒颗粒的大规模的工业生产。本发明所用的术语“抗原递送载体”指含有在它的内部或融合至它的膜或与它的表面联合的至少一种疾病特异性抗原的病毒颗粒。本发明所用的术语“融合活性”指病毒颗粒与细胞的和/或合成的膜的融合能力。在体内时，病毒颗粒与细胞外部膜或内部膜融合，与脂质体的融合被认为是测定体内病毒颗粒融合活性的模型系统(SmitJM等，2003)。已经证明，流感病毒和病毒颗粒与脂质体的融合同与生物靶向膜(biologicaltargetmembranes)的融合具有相似的特性(StegmannT.等，1989)。本文中所用的术语“细胞膜”指在细胞中自然形成的生物膜，如细胞的外部膜或包含在细胞中的内体的膜。相反，术语“合成膜”指人工膜，如脂质体的脂质膜。合成膜的例子是脂质体膜，所述脂质体膜仅由磷脂酰胆碱(PC)和DPPG(双棕榈酰-磷脂酰基-甘油)(di-palmityl-phosphatidyl-glycerol)组成的且缺少典型地包含在细胞膜中的蛋白。病毒和病毒颗粒的融合活性通常通过荧光能量共振转移(FRET)检验评价(StruckDK等，1981)。这个检验描述了一种光物理过程，所述光物理过程通过一个个体(供体)的激发态能量非辐射转移至另一个个体(受体)引起所述个体(供体)的荧光淬灭。供体的发射光谱和受体的吸收光谱重叠是必须的。淬灭效应严格地依赖两分子之间的距离在分子接近中诱发某些变化的每一个事件(event)促进反淬灭以及能量释放，这可以被监测到。因此，FRET代表了一种有价值的体外测验，用于研究许多生物现象，如在病毒微粒和生物细胞膜之间的融合。基于FRET的不同的融合检测已被开发用于证明病毒膜(病毒或病毒颗粒)与脂质体或血影细胞体外融合活性(SmitJM等，2003)。一些这样的检测包括标签目标膜(脂质体)，其它的标签试样，即病毒或病毒颗粒。但是，标签试样的需要并不与药物产品的cGMP适应性质量控制一致。基于避免标签试样的FRET的更灵敏的融合检测已由PevionBiotech开发(AmackerM.等，2005)。本发明的病毒颗粒的融合活性可以由下面的实施例中所描述的FRET检测测量。为了测定根据本发明的病毒颗粒的融合活性是否比另一种病毒颗粒提高，进行以下步骤(a)测量包含来自细胞系产生的病毒的不同数量的HA的病毒颗粒的融合活性，以及测量相应的包含来自卵产生的病毒的同样数量的HA的病毒颗粒的融合活性；(b)确定(a)的融合活性的比率(即包含细胞源HA的病毒颗粒比相应的包含卵源HA的病毒颗粒)，和(c)将结果比率平均。因此，为比较融合活性，需要对每一种病毒颗粒不同数量的HA进行多重测量。在一个优选实施方案中，融合活性用包含0.8ml总体积内范围在3-6μg的HA的病毒颗粒测量。计算的实施例，见下面实施例的4.5节。如果由上述测定的平均比率得出大于1.5的值，给定的病毒颗粒的融合是“高于50%”。本文中所用的术语“免疫原性”指特定物质(抗原)激发免疫反应的能力。为测定根据本发明的病毒颗粒的免疫原性是否明显地更高(即改进了)，用根据本发明的病毒颗粒或组合物对实验体进行免疫，所述病毒颗粒或组合物包含HA或与另外的特异性(异源)抗原结合的HA，并且记录所述实验体血清中抗HA或所述抗原的抗体滴度。为了比较，用相应的包含来自卵产生的病毒的HA的病毒颗粒或组合物对另一个实验体进行免疫。如果由本发明的病毒颗粒(包含来自细胞系产生的病毒的HA)，相比于相应的包含来自卵产生的病毒的HA的病毒颗粒或组合物，引发的抗体滴度的Wilcoxon检测产生低于0.05的ρ值，病毒颗粒的免疫原性是“明显地改进”或“明显地更高”。计算的实施例，见下面实施例的5.1节。术语“细胞系源”、“源于细胞系”和“细胞系产生的”可互换使用，意思是某物来源于或产生于细胞系，或细胞培养物。本文中使用的术语“装载抗原”意思是病毒颗粒包含额外的不同于HA的抗原(即“异源抗原”或“非HA抗原”)。所述抗原可以合并至所述病毒颗粒(如包含在其内)，吸收至/绑定在所述病毒颗粒的表面，结合进所述病毒颗粒的脂膜中等等。装载抗原的病毒颗粒可以用作抗原递送载体。本文中所用的术语“融合病毒颗粒”指包含来自至少两种不同流感病毒株的红血球凝聚素的病毒颗粒。本文所用的涉及病毒颗粒的术语“空的”和“裸露的”可互换使用，指该特征的病毒颗粒在内腔中不包含疾病特异性抗原、也没有在它们的双层脂上负载任何特异性抗原的事实。同样的，“裸露的”或“空的”病毒颗粒除了内腔中的周围的溶液不包含任何物质，除了在它的脂质膜内的病毒包膜蛋白HA和可能的痕量神经氨酸苷酶(NA)也没有蛋白。本文所用的术语“治疗的”、“治疗”等等指为抵抗已经感染或怀疑已经被感染的疾病或紊乱采取的行为，不管相应的症状是否已经出现。同样，“治疗”和“治疗的”指在这样的实验体中消除疾病或紊乱或者至少改善它们的症状，如果症状已经存在，就是减轻；或者，如果没有症状存在，在严重程度上减轻或者完全排除这些症状的发作。本文所用的术语“预防疾病的(prophylactic)”、“预防(prophylaxis)”、“防止(prevent)”、“防止(prevention)”等等指，当实验体没有被怀疑在过去感染疾病，但是存在一种实验体在现在或将来正处于或将要处于感染特别的疾病或紊乱的预料而采取的防止实验体感染疾病的行为。此外，这些术语指，当实验体已经接受接种疫苗/免疫，但是其效果不能长期持续而采取的防止实验体感染疾病的行为。本文所用的术语“制药的”指组合物和/或药剂的特性，能够赋予它们适于对活的动物给药的特性，优选是人。本文所用的术语“增强”、“免疫增强”、“刺激”、“免疫刺激”(immimostimulating)、“免疫刺激”(imimmostimulatory)等等可以互换使用，用于表示混合或提高的免疫功能，可以导致负载抗原的病原体或恶性肿瘤的毁灭或消除，和/或导致对它们的免疫性。本文所用的术语“非特异的”(non-specific)、“非特异的”(imspecific)等等指主张的病毒颗粒的一般的免疫刺激活性，意思是免疫系统在其防止、抗击和/或消除许多疾病或紊乱的任何一个的能力的加强，而不只是单一的疾病或紊乱。相反地，特异性免疫刺激活性指免疫系统的防止、抗击和/或消除特定疾病或紊乱的刺激。例如，接种疫苗抗特定的疾病是引发特异性免疫刺激活性的例子。本文使用的术语“疾病”和“紊乱”指身体或精神的异常性，导致不适、功能紊乱或者悲痛，并且可分为可传染的、不传染的、肿瘤、免疫或新陈代谢的紊乱或疾病。流感病毒流感病毒(正粘病毒科病毒)是封装有节段基因组的负链RNA病毒。基于在它们的核蛋白和基质蛋白之间的显著的抗原区别，它们被分为两个属一种包括流感病毒A和B，另一种由流感病毒C组成。这三种病毒类型在病原性和基因组结构上也不同。A型广泛存在于恒温动物，B型和C型主要是人病原体。A型流感病毒根据从病毒体表面突出的红血球凝聚素(HA)和神经氨酸苷酶(NA)表面糖蛋白的抗原特性进一步细分。现在有15种HA和9种NA亚型。A型流感病毒广泛感染多种动物，包括鸟、猪、马、人和其它哺乳动物。水禽作为所有已知的A型流感病毒亚型的自然宿主，也许是人类大流行性感冒株的遗传物质的来源。流感病毒在复制中积聚点突变，因为它们的RNA聚合酶复合体没有校正活性。改变了表面糖蛋白的抗原部分的氨基酸的突变可以通过允许它规避先前存在的免疫性为病毒株提供选择的优势。所述HA(红血球凝聚素)是流感病毒主要的抗原决定簇，诱导和结合中和抗体。HA分子通过结合确定的宿主(呼吸的)细胞的受体(唾液酸残基)引发感染。HA分子由两个不同域组成，从病毒体表面突出的由HA多肽的HA2、部分HAl组成的主干结构，和整个地由HAl组成的球形头部。抗HA蛋白的抗体防止受体结合，并且在防止用同样株再次感染方面非常有效。通过抗原漂移，其中现在传播的HA基因的突变防止了抗体的结合；或者通过抗原性转变，其中病毒获得了新亚型的HA，HA可以躲避先前获得的免疫性。这些变化还在HA比NA积聚到更大的程度。其它病毒蛋白的变化发生的更慢。同样地，抗原漂移的压力在人-适应的流感株中最大，在猪-和马-适应株中居中，在鸟-适应株中最小。流感病毒株可以通过个别的基因片段的序列比较而遗传性地表征。当开发抗年度流行性流感病毒株的疫苗工作继续进行时，世界已经被大流行性流感的恐惧预占领了。全世界的健康和监管机构目前都在致力于为大流行性的流感做准备而开发策略。病毒颗粒根据本发明的病毒颗粒可以被用来递送物质(如抗原分子，药物和/或基因)至靶细胞。与脂质体不同，病毒颗粒提供了有效进入细胞的优势，这由病毒包膜蛋白触发，随后接着病毒颗粒内含物的细胞内释放。此外，如果某些活性病毒包膜蛋白合并至它们的膜内，病毒颗粒可以在与细胞膜融合后立即释放它们的内含物至细胞质中，如因此阻止治疗性物质在内体的酸性环境中的降解。根据本发明的病毒颗粒在疫苗学领域特别有用，被期望于对与特定疾病或紊乱相关的抗原激发免疫反应。在这样的例子中，抗原通常封装入或绑定到病毒颗粒，然后递送这种抗原至将进行疫苗接种的宿主的免疫系统。由于特定抗原递送的功效，发生的预防和/或治疗是必然特效于与抗原结合的疾病或紊乱。病毒颗粒可以进一步同时装载几种不同的B细胞和T细胞抗原决定基(Poltl-Frank等(1999))，包括普遍的辅助性T细胞抗原决定基(Kumar等(1992))，和其它本领域技术人员已知的。因此，病毒颗粒在现代接种疫苗中是高效佐剂，作为抗原递送载体具有较高的性能和强大的免疫原性潜能，同时伴随地使副作用风险最小。免疫增强重组流感病毒颗粒(IRIVs)的功能体现在它们的膜融合活性与完整病毒的明确的低PH依赖型膜融合活性极为相似，这是由病毒包膜蛋白单独介导。如同病毒，流感病毒颗粒通过受体介导的内吞作用或调理作用被迅速地内在化。相比于病毒系统，病毒颗粒是安全的，因为感染性的病毒核壳体已经被移除。因此，根据本发明的病毒颗粒表现了可用于递送广泛多样不同物质的出色的载体系统，或者封装在它们水性内腔中，或者在它们的膜上联合重组(co-reconstitution)。不同受体在病毒颗粒膜内的联合重组，更进一步地，允许病毒颗粒靶向不同的细胞或组织。病毒颗粒主要作为疫苗使用，通过在它们的表面上添加抗原，或者通过在病毒颗粒内腔中封装抗原，或者在与装载抗原的脂质体联合使用时通过利用它们的佐剂作用。IRIVs由流感病毒包膜重组，作为它们的病毒相似物，利用同样的细胞受体介导的内吞作用。受体结合和流感病毒与内体的膜融合活性已知是由主要的病毒包膜糖蛋白HA介导(Bimgener等(2002))。类似于病毒载体，内体内腔中合适的酸性pH引发了病毒颗粒与内体膜的融合，从而释放封装物质进入细胞的细胞质中，如DNA、RNA或者蛋白质。因此，封装在病毒颗粒中的外源抗原可以进入MHC-I类途径，而不需要重新蛋白合成。病毒颗粒表面显示的蛋白经融合保留在内体间隔(endosomalcompartment)，所以被认为可以在MHC-II类途径中使用。商业上可用的病毒颗粒疫苗(INFLEXALv，EPAXAL)已经显示出非常有效和安全(Gluck等(2000))。病毒颗粒作为递送系统的潜力已经证明适合于核酸和多肽基疫苗，如，适合于疟疾(Poltl-Frank等(1999))。近来的报道认为合成的多肽疫苗与病毒颗粒一起皮下(s.c.)给药能够诱导强大的CTL免疫性(Amacker等(2005))。病毒颗粒的制备病毒颗粒的制备是本领于技术人员熟知的。制备病毒颗粒的合适方案在如EP538437和Mischler和Metcalfe(2002)中描述。在流感病毒用聚辛乙二醇单癸醚溶解、核壳体(病毒糖蛋白和脂质将保留在上清夜)沉降和用疏水树脂(Bio-BeadsSM2)除去上层清夜中清洁剂之后，根据本发明的病毒颗粒可以由原始的病毒膜脂质和纤突糖蛋白重组。制备流感病毒病毒颗粒的方案在W092/19267中给出，对于通用的病毒颗粒在W004/071492中给出。包含来自不同流感病毒株的HA的病毒颗粒的制备可以用等量的这些病毒的蛋白完成，所述病毒用非离子型清洁剂聚辛乙二醇单癸醚溶解。在用Bio-BeadsSM2去除清洁剂后，可以形成包含不同类型包膜蛋白的病毒颗粒。用卵源材料或者细胞系源材料制备病毒颗粒的方案是同样的。本发明的病毒颗粒来源的流感病毒亚型是流感病毒HlNl，流感病毒H1N2，流感病毒H2N2，流感病毒H3N2，流感病毒H3N8，流感病毒H5m，流感病毒H5N2，流感病毒H5N3，流感病毒H5N8，流感病毒H5N9，流感病毒H7W，流感病毒H7N2，流感病毒H7N3，流感病毒H7N4，流感病毒H7N7，流感病毒H9N2和/或流感病毒H10N7。更进一步，至少一种病毒包膜蛋白可以源于流感病毒A/Bangkok/1/79，流感病毒A/Beijing/32/92，流感病毒A/Brazil/11/78,流感病毒A/Califomia/7/2004(H3N2)，流感病毒A/Chile/1/83，流感病毒A/Christchurch/4/85,流感病毒A/England/42/72，流感病毒A/Fujian/411/2002(H3N2)，流感病毒A/Guizhou/54/89，流感病毒A/HongKong/1/68，流感病毒A/Johnannesburg/33/94,^#A/Leningrad/360/86,^^^Ι#A/Mississippi/1/85,流感病毒A/Moscow/10/99(H3N2)，流感病毒A/NewCaledonia/20/99(HlNl)，流感病毒A/Panama/2007/99-RESVIR-17)，流感病毒A/Philippines/2/82，流感病毒A/PortChalmers/1/73,流感病毒A/Scotland/840/74，流感病毒A/Shangdong/9/93，流感病毒A/Shanghai/11/87，流感病毒A/Sichuan/2/87，流感病毒A/Singapore/6/86，流感病毒A/Sydney/5/97，流感病毒A/Texas/1/77，流感病毒A/USSR/90/77，流感病毒A/Victoria/3/75,流感病毒A/Wisconsin/67/2005(H3N2)，流感病毒A/Wuhan/359/95，流感病毒A/ffyoming/3/2003X-147)，流感病毒B/HongKong/330/2001,流感病毒B/Jilin/20/2003,流感病毒B/Malaysia/2506/2004，流感病毒B/Shanghai/361/2002，流感病毒A/Beijing/262/95，流感病毒B/Victoria/98926/70，流感病毒B/Singapore/222/79,流感病毒B/USSR/100/83，流感病毒B/Yamagata/16/88，流感病毒B/Panama/45/90，流感病毒B/HongKong/5/72，流感病毒B/AnnArbor/1/86,流感病毒A/Bayem/7/95，流感病毒B/Shangdong/7/97)，和/或B/Jiangsu/10/2003。IRIVs包括双层脂质膜，主要由磷脂组成，优选地是磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)。对比脂质体，IRIVs包含插在磷脂双分子膜中的功能性病毒包膜红血球凝聚素HA和神经氨酸苷酶(NA)。生物活性HA通过维持病毒融合活性显著地促进免疫特性。IRIVs作为非特异性地增强免疫反应的有效和高效的手段。已知它们还具有极好的安全性(GlUck等(2000))，意味着它们适用于在人类非特异性免疫刺激的药物治疗中使用。本发明的病毒颗粒也可以是融合病毒颗粒，意味着它包括来自至少两种不同病毒株的病毒包膜HA蛋白，例如来自病毒株X-31和A/Sing或上述任何病毒株。另外，其它已知的病毒包膜蛋白也可以用于构造能够承受连续和分开的融合事件的融合病毒，如其它许多种中的疱疹性口炎病毒(VSV)G蛋白，塞姆利基森林病毒(SFV)El蛋白，或仙台病毒F蛋白，呼吸道合胞病毒(RSV)的G蛋白或F蛋白，或丙型肝炎(HCV)E蛋白。如之前所示(Tsurudome等1992)，来自不同病毒株的HA融合蛋白明显表现出不同的融合和灭活的温度特性。例如，在大约PH5.0，X-31在低温时有效地引发融合；然而在同样的pH，来自PR8/34或A/Singapore病毒的HA需要升高的温度(>25°C)。因此融合病毒颗粒可以在它们的膜内包括在两个不同的温度介导融合的蛋白。不同的温度灵敏性是融合蛋白的特别有利的特性，因为它能便利和简单地控制融合反应。例如，包含来自X-31和PR8/34病毒体的HA分子的病毒颗粒能够在pH5时促进两个不同的融合反应第一个在低温(4-10°C)，第二个在升高的温度(>25°C)。但是，其它具有不同融合特性的融合蛋白，包括对温度、离子浓度、酸度、细胞类型和组织类型特异性的敏感性等是本领域已知的。具有不同融合特性的融合蛋白可以来自不同的流感病毒株，如MRC-11、X-97，NIB24、NIB26、X-47、A/Johannesburg/33和A/Singapore，仅举几例。本发明的病毒颗粒优选地包括脂质，所述脂质选自由阳离子脂质、合成脂质、糖月旨、磷脂、胆固醇或它们的衍生物组成的组。磷脂优选地包括磷脂酰胆碱、鞘磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酸、心磷脂、有不同的脂肪酰基组合物的磷脂酰肌醇。阳离子脂质优选地选自由D0TMA(N-[(l-(2，3-二油酰氧)丙基]-N.N.N-三甲基氯化)(N-[(l-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N.N.N-trimethylammoniumchloride)>DOTAP(N-[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵)、(N_[l_(2，3-dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchloride)、DODAC(N.N—双+7V_酉先"N.N.-M化二甲基胺)(N.N-dioleyl-N.N.-dimethylammoniumchloride)、DDAB(溴化双十二烷基双甲基胺)(didodecyldimethylammoniumbromide)、TC-Chol(胆固醇N-(三甲基铵乙基)氨基甲酸氯)(cholesterylN-(trimethylammonioethyl)carbamatechloride)、DC-Chol(胆固醇N-(二甲基胺基乙醛基)氨基甲酸氯)(cholesterylN-(dimethylammonioethyl)carbamatechloride)或其它阳离子胆固醇衍生物和硬脂胺或其它脂族胺，DPPE(双棕榈酰磷脂酰乙醇胺)(dipalmitoylphosphatidylethanolamines)、DOGS(双油酰-甘油-琥珀酸盐)(Dioleoyl-Glycero-Succinate)、DOSPA(2，3_二油酰氧-N-[2(甲酰胺精胺)乙烷基]-N，N-二甲基-1-丙胺三氟乙酸盐)(2，3_diοIeoyIoxy-N-[2(sperminecarboxamido)ethyl]-N,N-dimethyl-l-propanaminiumtrifluoroacetate),DOSPER(1，3-二油酰氧_2_(6-甲酰精)丙胺)(1，3-dioleoyloxy-2-(6-carboxyspermyl)propylamide)、THDOB(N.N.N'.N'-四甲基-N.N‘-二(2-羟基)-2，3，-二油酰氧-1，4-丁烷二铵碘化物)(N.N.N'.N'-tetramethyl-N.N'-bis(2-hydroxyethyl)~2,3,-dioleoyloxy-1,4-butanediammoniumiodide)、DOPA(双油酰-sn-磷酸甘油)(Dioleoyl-sn-Glycero-Phosphate)、DOTP(双油酰对苯二酸盐)(dioctyltere-phthalate)、DOSC(双油酰琥珀酰甘油)(dioleoyl-succinyl-glycerol)、D0TB(双油酰-e-(4'-三甲基色氨酸胺)_丁酰甘油)(dioleoyl-e-(4'-trimethylammonio)-butanoyl-sn-glycerol)、DOPC(双油酰-sn-磷酸胆碱甘油)(DioleoyΙ-sn-Glycero-Phosphocholine)等等组成的组。特别优选地，阳离子脂质选自阳离子胆固醇衍生物，如TC-Chol(胆固醇N-(三甲基铵乙基)氨基甲酸)(cholesterylN-(trimethylammonioethyl)carbamate)或DC-Chol(胆固醇N-(二甲基铵乙基)氨基甲酸)(cholesterylN-(dimethylammonioethyl)carbamate)。它们可以制备成小的单层脂质体与PC(磷脂酰胆碱)在一种混合物中。本发明的病毒颗粒可以优选地包括卵源的PC，和更优选地，1-油基-S-棕榈酰-rac-甘油-2-磷脂酰乙醇胺(l-oleyl-S-palmitoyl-rac-glycero-2-phosphatidylethanolamine)。本发明的病毒颗粒的膜优选地包括1.9-37摩尔％DC-Chol或TC-Chol，与膜的总脂质含量相关。在一个特别优选实施方案中，膜中DC-Chol或TC-Chol的含量是膜的总脂质含量的1.9-16摩尔％。膜的剩余的脂质含量优选地包括磷脂，最优选地比例为41的磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺。还可以使用共乳化剂以提高病毒颗粒的刚性(rigidity)和/或密封性(sealing)，共乳化剂的例子是带电的或中性的胆固醇酯，如胆固醇硫酸盐，具有留醇骨架的衍生物，如植物来源的衍生物，例如谷留醇、豆留醇和它们的混合物。根据本发明的病毒颗粒可以通过例如相似于W097/41834的例13和6公开的制备含DOTAP的病毒颗粒的方法中的任一个方法而获得，除了DOTAP由DOSPER代替，并且如同TO97/41834所公开的最终病毒颗粒膜的DOSPER的浓度适当地调整，特别地，按重量计没有超过病毒颗粒总脂质含量的30%。基本地，制备本病毒颗粒的方法可以包括以下步骤a)制备含有非离子型清洁剂的缓冲溶液，并且更进一步包括DOSPER和其它脂质和至少一种病毒包膜蛋白；b)根据总的膜的脂质，调整脂质浓度至按重量计DOSPER是5_30%，并且至按重量计其它脂质是95-70%的平衡，所述其它脂质包括磷脂酰胆碱(PC)或它的衍生物和任选地磷脂酰乙醇胺(PE)和/或不同于DOSPER的阳离子脂质；和c)通过透析去除清洁剂或通过用微载体小球处理溶液，得到所述的病毒颗粒制剂。本发明的病毒颗粒的应用根据本发明的病毒颗粒可用于制备用于治疗或预防至少一种疾病或紊乱的药物。(至少一种)疾病或紊乱可以是传染性的、非传染性的、肿瘤的、免疫的或代谢的疾病或紊舌L。在一个实施方案中，本发明的应用需要将本发明的病毒颗粒使用至健康的实验体，所述实验体面临临时增加的暴露于一种或多种传染性疾病或紊乱，或者(仍然)健康的实验体，所述实验体紧跟着怀疑接触一种或多种传染性疾病或紊乱但在症状出现或诊断之前。作为治疗或预防实验体的行为的分类在上面讨论。本发明应用还可以应用于一种或多种已经存在的疾病或紊乱的治疗，任选地作为该疾病或紊乱的特定治疗的补充。在一个实施方案中，至少一种传染性疾病或紊乱可以是病毒性疾病或紊乱，细菌性疾病或紊乱，真菌性疾病或紊乱，寄生疾病或紊乱，或朊蛋白疾病或紊乱。根据另一个实施方案，动物是哺乳动物。哺乳动物优选是人，黑猩猩、猕猴、长臂猿、猿猴、短尾猿猴、小鼠、老鼠、猫、狗、马、兔子、骆驼、骆驼(llama)、反刍动物、马或猪。优选的反刍动物可以是母牛、公牛、山羊、绵羊、野牛、水牛、鹿或牡鹿。在另一个实施方案中，药物适合于通过漱口、斑贴(如皮肤斑贴)、舌下喷雾(如鼻咽喷雾)、口服(如药片、胶囊、囊片、糖衣丸)、栓剂(如直肠栓剂或阴道栓剂)、或者滴剂(如眼滴剂)，在肌肉、内皮层、静脉内(如注射)、表皮(topically)、腹膜内、肠胃外、表皮、气管内、耳内、关节内、眼内、局部(locally)给药。给药可以是单一剂量，或是按照需要要求，在按照临床医生认为合适间隔的间隔时间的多剂量。根据本发明的病毒颗粒的重复使用是可能的。本发明的病毒颗粒与其它化合物如佐剂或免疫刺激剂的联合可以增效地提高整体效果。病毒颗粒的数量和类型，刺激位点和共刺激信号(感染、暴露于过敏原等)限定了所述整体效果。效果是瞬时的，以小时到星期为单位。达到的效果的持续时间取决于药剂量、药剂时间、选择的给药途径和给药的药物组合物。根据发明的应用制备的药物以药学上可接受的制剂给药。这样的制剂可以常规地包括药学上可接受的盐浓度、缓冲剂、防腐剂、相容性载体、补充的免疫增强剂如佐剂和细胞因子和任选地其它治疗剂。给药的病毒颗粒的优选的数量取决于要治疗或预防的疾病或紊舌L。一般地，剂量范围是大约lng/kg至100mg/kg被认为是有效的，所述的千克指的是治疗的动物的身体重量。优选的范围认为是lOng/kg至10μg/kg。绝对量将取决于多种因素，包括选择的用于给药的组合物，给药是单剂量或多剂量，和个体病人的参数包括年龄、身体状况、身高、体重和疾病阶段。给药的途径和方法(regimen)将依赖于将要治疗的疾病或紊乱的阶段或严重度(severity)而变化，并且由熟练的医生确定。由本发明应用制备的药剂适合于肠胃外给药。这里，药剂包括溶解或悬浮在可接受的载体中的病毒颗粒，优选地是水性载体。可以使用多种水性载体，如水、缓冲水、0.4%盐水、0.3%氨基乙酸、透明质酸等等。这些组合物可以用惯常的、已知的灭菌技术灭菌或过滤灭菌。由此得到的水溶液可以按现状封装使用，或者冻干，冻干制剂在给药前与灭菌溶液混合。由本发明应用制备的药剂可以额外地包括药学上可接受的辅助物质以接近生理条件，如PH调节和缓冲剂、官能调节剂(tonicityadjustingagents)、润湿剂等等，例如其中乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、去水山梨糖醇月桂酸酯、油酸三乙醇胺。制备可肠胃外给药的化合物的实际方法是本领域技术人员已知或显然明白的，更详细的描述在例如雷明顿药剂学科学和实践(“雷明顿的药剂学科学”)GermaroARed.第20版，2000Williams和WilkinsPA，美国，它通过引文的方式并入本发明。根据本发明应用制备的药剂还可以以口服剂型给药，如药片、胶囊(每一个包括定时释放和缓释制剂)、药丸、粉剂、颗粒、甘香洒剂、酊剂、溶液、悬浮液、糖浆或乳状液，或者通过注射。例如，以药片或胶囊的形式口服，活性药物成分可以与口服的、无毒的药学上可接受的插入载体如乙醇、甘油、水等等结合。相似地，根据本发明应用制备的药剂还可以使用在静脉内(通过大药丸(bolus)或输液方法)，皮下、局部地具有或不具有梗塞，或肌肉内。在优选实施方案中，根据本发明应用制备的药剂使用在肌肉内、皮下、皮内、粘膜或透皮。所有的这些形式都是制药学领域普通技术人员熟知的。将用于给药的根据本发明应用制备的药剂的剂量方法根据多种因素选择，包括物种、年龄、重量、性别和患者的医疗状况、需要治疗的疾病或紊乱的阶段或严重度、使用的病毒颗粒的特定类型。本领域普通的内科医生能够容易地确定和给出有效量的药剂以预防，相反地，或者停止恶性肿瘤或者传染性疾病或者紊乱的发展。获得有效且无毒性或者可接受毒性的范围内的最佳精确药物浓度需要基于病毒颗粒至靶位点有效性的动力学的方法。该过程包括考虑病毒颗粒的分布、均衡和去除，这在熟练的医生的能力之内，能够不超过实验范围地解决。在一个实施方案中，根据本发明应用制备的药剂可以单一日剂量给药，或者总日剂量可以在分开的几剂中给药，例如每日2、3、或4次。在另一个实施方案中，有预见地周使用或月使用。根据发明应用制备的药剂的日剂量可以在每天每成人lOng/kg至大约IOyg/kg病毒颗粒的范围内变化。对于口服给药，根据本发明应用制备的药剂优选地以药片形式提供，根据在治疗期间患者的迹象和症状的用于症状调节的剂量，药片包括从0.001至1，OOOmg病毒颗粒，优选地0.01至lOOmg，更优选地，0.05至50mg，最优选地0.1至20mg。药片可以例如包含0.001,0.01,0.05,0.1,0.5、1、2·5、10、20、50或100毫克的病毒颗粒。根据本发明应用制备的药剂中的一个实施方案，一般在每天0.0001mg/kg至大约50mg/kg身体重量的剂量水平提供有效量的病毒。更具体的，在每天0.0001mg/kg至7mg/kg身体重量的范围内。如果是儿童使用，剂量可以适当的减少。此外，根据本发明应用制备的药剂可以以鼻内形式给药，或者通过本领域普通技术人员已知的皮内形式。以皮肤递送系统形式给药的，给药剂量贯穿剂量方法应当是持续的而不是间歇的。根据本发明应用制备的药剂可以与一类有利于达到药物控制释放的生物分解聚合物联合，例如聚乳酸、聚ε“已内酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯和交联的或两亲嵌段共聚物的水凝胶。用于表皮给药的根据本发明应用制备的药剂的合适制剂可以是，例如，溶液形式、乳剂、药膏、凝胶、洗液、洗发剂或者适用于皮肤使用的气溶胶制剂。这些包含根据本发明应用制备的药剂的表皮药学组合物按重量计包括大约0.005%至5%的活性化合物，即病毒颗粒，所述活性化合物与药学上可接受的载体混合。不管根据本发明应用制备的药剂以哪种路径给药，都将以有效量给药。有效量是药学制剂单独或与更多的剂量刺激所希望的非特异性免疫刺激反应的药学制剂量。此外，当期望或必须，合适的粘合剂、润滑剂、分解剂和着色剂也可以合并至根据本发明应用制备的药剂中。合适的粘合剂包括但不限于淀粉、凝胶、天然糖如葡萄糖或乳糖、玉米甜味剂、天然或合成的胶如阿拉伯树胶、黄芪胶或海藻酸钠、羟甲基纤维素、聚乙二醇、蜡等等。在这些剂型中使用的润滑剂包括但不限于油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、醋酸钠、氯化钠等等。分解剂包括但不限于淀粉、甲基纤维素、阿加(aga)、膨润土、黄原胶等等。由本发明应用制备的液状药剂可以由悬浮剂或分散剂适当地调味，例如合成的或天然的胶，如黄芪胶、阿拉伯胶、甲基纤维素等等。其它的可以使用的分散剂是甘油等等。对于肠胃外给药，需要无菌悬浮液或溶液。等渗制剂一般包括合适的防腐剂，在需要静脉内给药时使用。包含活性药物成分的表皮制剂可以与多种本领域熟知的载体材料混合，如乙醇、芦荟凝胶、尿囊素、甘油、维生素A或E油、矿物油、PPG2豆蔻丙酸等等，以形成例如乙醇溶液、表皮清洁剂、清洁乳霜、皮肤凝胶、皮肤润肤液和乳膏或凝胶制剂的洗发剂。在一个实施方案中，由本发明应用制备的药剂可以进一步包括至少一种佐剂增强和/或介导免疫反应，例如先天免疫反应、Th1或Th2反应。合适的佐剂可以通过激活巨噬细胞和/或刺激特定的淋巴细胞以增强免疫反应。合适的佐剂可以是适合病原体识别受体(PRR)活化的任何配体。免疫反应增强化合物被分类为佐剂或细胞因子。佐剂可以通过提供抗原贮主(巨噬细胞外或其中)增强免疫反应，激活巨噬细胞，刺激特定淋巴细胞。本领于熟知的多种佐剂，特定的例子包括弗氏佐剂(完全或不完全)，分歧杆菌如BCG、母牛分支杆菌(M.VaCCae)或短小棒状杆菌、霍乱毒素或破伤风毒素、大肠杆菌热不稳定毒素、quil-皂角苷混合物如QS-21(SmithKlineBeecham)，MF59(Chiron)和多种油/水乳剂(如IDEC-AF)。其它可以使用的佐剂包括但不限于矿物盐或矿物凝胶如氢氧化铝、磷酸铝和磷酸钙；表面活性物质如溶血卵磷脂、复合多元醇、聚阴离子、多肽、钥孔戚血蓝素和二硝基酚；免疫刺激分子如皂角苷、胞壁酰二肽和三肽衍生物，短核酸延伸如CpG二核苷酸、CpG寡核苷酸、单磷酰脂A和聚磷腈，微粒的或极微粒(microparticulate)的佐剂，如乳剂、脂质体、病毒颗粒、螺旋型或免疫刺激复合佐剂。由于细胞因子的淋巴细胞刺激特性，它们也是有用的。许多用于这样目的的细胞因子将是本领域普通技术人员已知的，包括白细胞介素-2(IL-2)、IL-12、GM-CSF和许多其它的。此外，来自趋化因子家族的配体，如RANTES(活化正常T细胞表达和分泌调控)、格兰氏阳性菌的脂蛋白、酵母细胞壁成分、双链RNA、格兰氏阴性菌的脂多糖、鞭毛蛋白、富含鸟嘧啶的单链病毒RNA、细胞因子信号传导抑制因子小干扰RNA(SOCSsiRNA)、泛DR抗原决定基(PADRE)和它们的混合物是合适的。为了治疗和预防癌症和/或转移，由本发明应用制备的药剂可以与药学上可接受的用于表皮给药的载体联合给药。额外地，为了治疗和预防癌症、肿瘤和/或转移，或病毒感染，由本发明应用制备的药剂可以与其它在治疗这种恶性肿瘤有用的物质一起使用。对于与多于一种活性剂组合治疗，活性剂可以同时给药，或者它们可以在间隔时间里分别给药。本发明另一个方面涉及通过使用根据本发明的病毒颗粒，动物免疫系统的非特异性刺激。依靠身体免疫系统的非特异性刺激(唤醒命令)，期望提高抗疾病的广泛抵抗力，特别是抗感染和肿瘤疾病。这种非特异性刺激可以通过病毒颗粒给药实现。单一或重复的给药可以发生在暴露于传染性物质或疾病诊断之前、之中或之后，分别作为预防药、后防御药(metaphylactic)、治疗剂或佐剂治疗。提供本发明的特定实施方案和下面的实施例以证明要求保护的发明的功效，而不是解释成限制发明的范围。对于提及的特定材料的范围，仅仅是为了解释的目的，并没有想要限制发明。除了其它的特定说明，使用的生物化学和分子生物学程序，如在下面这些中所阐述的那些Voet，生物化学，Wiley,1990；Stryer，生物化学，W.H.Freeman,1995；Bodanszky，肽化学，实践教科书(PracticalTwxtbook)，第2版，Springer-Verlag，柏林，1993；Sambrook等，分子克隆，冷泉港出版社，2001；Ausubel等(Eds)，分子生物学通用方案，JohnWiley和Sons，2000。不需要创造性能力的训练和背离发明的范围，本领域技术人员可以开发等同方法或反应物。可以理解，在这里描述的组合物和程序中可以形成多种变化，仍然保持在本发明的范围内。发明人意于将这样的变化包括在发明的范围内。实施例内容1.病毒2.病毒繁殖3.病毒颗粒制备3.1试剂3.2标准病毒颗粒的制备(IRIV)3.3具有整合的异源抗原的标准病毒颗粒的制备(IIRIV)3.4包含TC-chol的标准病毒颗粒的制备(TIRIV)3.5包含异源抗原的TlRIVs的制备3.6用于制备病毒颗粒的异源抗原4.分析检测4.1SDS-PAGE4.2微粒尺寸测量平均直径/多分散性(表1)4.3SRD(HA含量)4.4蛋白质印记4.5FERT提高融合5.免疫原性实验5.1提高的抗原性5.2Y-干扰素染色提高的免疫原性5.3来自于卵产生的病毒的HA和来自于细胞培养物产生的病毒的HA的比较1、病毒使用的病毒是流感病毒A/NewCaledonia/20/99(HlNl)和流感病毒A/Singapore/6/86(HlNl)。2、病毒繁殖病毒在胚卵尿囊腔中(Gerhard，1996)或者在源于鸟胚干细胞的细胞系中(W02006/108846)繁殖。在胚卵尿囊腔中繁殖的病毒从BernaBiotechAG(Bern，瑞士)获得；在源于鸟胚干细胞的细胞系中繁殖的病毒从Vivalis(Roussay，法国)获得。卵源的病毒通过蔗糖梯度超速离心法纯化和浓缩，并通过BPL灭活。鸟细胞系(EBxJl(EB14)或鸭)产生的病毒从来自于感染流感病毒A的EBx细胞培养物的细胞培养物上层清液获得。分析之前通过超速离心法浓缩和纯化上清液。病毒蛋白的量化通过单一径向扩散(SRD)(伍德等，1997)完成。红血球凝聚素/磷脂比例根据Bottcher(Bottcher等，1961)测定，SDS-PAGE之后HA的量化用如Ball，1986描述的考马斯提取法。3、病毒颗粒的制备3.1试剂1.辛二醇单正十二醚(OEG，C12E8),二甲亚砜(DMSO)，盐酸羟胺，1，2-二棕榈酰基_sn_甘油-3-舞酉先基-rac-(1-甘油)(1，2_Dipalmitoyl_sn_glycero_3_phospho_rac_(1-glycerol))(PG)，乙腈，磷酸三乙胺(TEAP)溶液，蔗糖，链霉素，4-羟乙基哌嗪乙磺酸，青霉素和RPMI培养基分别购自FlukaChemieGmbH禾口Sigma(Buchs，瑞士)。蔗糖(Eur.Phar.)购自]^代1^(0丨6衍1)11，瑞士)。FCS购自GibcoBRL(Basel，瑞士)。磷脂酰胆碱(PC)从Lipoid获得(Cham，瑞士)。1-油酰-3-棕榈酰-rac-甘油-2-磷酸醇胺(l-Oleoyl-3-palmitoyl-rac-glycero-2-phosphoethanolamine)(PE)从Bachem获得(Bubendorf,Jfnf士)。Bio-BeadsSM2从Bio-Rad实验室购买(Glattbrugg，瑞士)。1，2_二棕榈酰-sn_甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[4-(ρ-马来酰亚胺基甲基)环己胺_羧胺](1，2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanoIamine-N-[4-(p-maleimidomethyl)cyclohexane-carboxamide])(N-MCC-PE)购自AvantiPolarLipids(Alabaster,美国)。N-(4，4-二氟-5，7-二苯基-4-bora-3a,4a-二氮杂-s-indacene-S-丙酰)-L-磷脂酰乙醇胺(N-(4，4-difluoro-5,7-diphenyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-S-propionyl)_1，2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)(Bodipy530/550-DHPE),荧光素若丹明B1，2_二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺三乙基胺盐(LissaminerhodamineB1，2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolaminetriethylammoniumsalt)(N-Rh-DHPE)禾口biotin-DHPE(N-(生物素基)-1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，三乙基胺盐)(biotin-DHPE(N-(biotinoyl)_1，2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanoIamine,triethylammoniumsalt))来自MolecularProbesEurope(Leiden,荷兰)。葡聚糖凝胶G-50USAmershamBiosciences(Otelfingen,im±)。IL—2■自EuroCetusB.V.(H^l斯特丹，荷兰)。N-丁二酸，S-乙酰基巯基乙二醇酯(N-succinimidyl-S-acetylthioacetate)(SATA)购自PierceBiotechnology(Rockford，美国)。胆固醇N-(三甲基铵乙基)氨基甲酸氯(CholesterylN-(trimethylammonioethyl)carbamatechloride)(TC-chol)购自MerckEprova(Schaffhausen,Jfnfdr)。3.2标准病毒颗粒(免疫刺激重组流感病毒颗粒，IRIVs)的制备对于4ml的终体积，32mg卵PC，8mgPE在3ml含有IOOmMOEG的PBS(PBS/0EG)中溶解。包含2mgHA的灭活流感病毒在4°C时以100，OOOXg离心1小时，离心物溶解于Iml的PBS/0EG。清洁剂溶解的磷脂和病毒混合成终体积4ml并超声处理1分钟。该混合物在18°C下以100，OOOXg离心1小时。然后通过两次使用1.5g的湿SM2Bio-Beads(BioRad，Glattbrugg，瑞士)在室温下摇动1小时去除清洁剂而形成病毒颗粒。病毒颗粒然后过滤灭菌(0.22^111)，并且41保存。3.3具有整合的异源抗原的标准病毒颗粒(IIRIVs)的制备对于4ml的终体积，32mg卵PC，8mg的PE和有用量的异源抗原-PE结合物在3ml含IOOmM的OEG的PBS(PBS/0EG)中溶解。灭活的包含2mgHA的流感病毒A/Singapore/6/86在4°C下以100，OOOXg离心1小时，离心物溶解于Iml的PBS/0EG。清洁剂溶解的磷脂和病毒混合并超声处理1分钟。该混合物在18°C下以100，OOOXg离心1小时。然后通过两次用1.5g的湿SM2Bio-Beads(BioRad，Glattbrugg，瑞士)在室温下摇动1小时去除清洁剂而形成病毒颗粒。病毒颗粒然后经过滤灭菌，并4°C保存。3.4包含TC-Chol的病毒颗粒(TIRIVs)的制备TIRIVs通过清洁剂去除方法制备。对于4ml的终体积，32mg的卵PC，8mg的PE，5mg的胆固醇N-(三甲基铵乙基)氨基甲酸氯(TC-Chol)和200mg蔗糖用3ml包含IOOmMOEG的PBS(PBS/0EG)溶解。含l_2mgHA的灭活流感病毒在4°C下以100，OOOXg离心1小时，离心物用Iml的PBS/OEG溶解。清洁剂溶解的脂质和病毒混合并超声处理1分钟。该混合物在18°C下以100，OOOXg离心1小时。然后通过室温下每次用1.5g湿Bio-BeadsSM2每次60分钟摇动2次去除清洁剂而形成病毒颗粒。病毒颗粒经过滤灭菌(0.22μm)并均分至灭菌玻璃瓶(vials)中。封闭的玻璃瓶在-70°C冷冻，然后在-40°C冻干20小时并且在10°C冻干2小时。封闭的玻璃瓶冷冻保存直至使用。3.5包含异源抗原的TlRIVs的制备为得到包含选择的异源抗原的TIRIVs，将抗原以期望得到的浓度溶解在水中。冷冻的、冻干的TlRIVs从冷藏装置中取出，在等量的溶解的异源抗原(4°C)添加至冻干剂中之前，在室温平衡2-5分钟。玻璃瓶立刻在漩涡仪中间档混合10秒，并保存在4°C直至使用。可选择地，在实施例5中描述的制备过程中，连接至PE的肽可以添加至TIRIVs。在溶液进行超声处理和过滤灭菌前以期望的浓度添加肽。其它制备步骤保持不变。冻干的TIRIVs的重组用等量的水完成。3.6用于配制病毒颗粒的异源抗原使用的异源抗原来自恶性疟原虫(UK39)的疟疾来源抗原UK39(W02004/106366)，和HCV核心132丙肝病毒源抗原(丙型肝炎核心132)。4、分析化骑4.ISDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)将要分析的样品与Invitrogen(巴塞尔，瑞士)提供的合适的样品缓冲液、与或不与还原剂(Invitrogen)混合，85°C孵育2分钟。5_10μ1的样品上样至聚丙烯酰胺凝胶基质中(Irwitrogen，巴塞尔，瑞士)，并根据产品说明书电泳。凝胶进一步通过蛋白免疫印迹分析和/或通过使用SliverQuest试剂盒(Invitrogen，巴塞尔，瑞士)、依据生产商提供的“快速染色法”方案的银染色法染色。4.2微粒尺寸测量(平均肓径/多分散性)在下表中，给出了以mg/ml的红血球凝聚素浓度和病毒颗粒微粒的平均直径。最后一行给出的多分散性是溶液中微粒尺寸同质性的表征。多分散性在0.3以下的微粒溶液被认为是可用作疫苗的病毒颗粒，值小于0.1被认为是非常同质的(同质性通过使用ZetasizerlOOOHS仪器的动态光散射测量)。尺寸测量由使用预装有标准IOmW氢-氖激光器(λ=633nm)和雪崩光电二极管(APD)的ZetasizerlOOOHS仪器(Malvern仪器)的动态光散射完成。5-20μ1的样品加至过滤的PBS缓冲液，最终玻璃瓶体积lml。在25°C温度、90°固定散射角下完成测量。通过选择合适的拟合(fitting)评估尺寸分布。4.3SRD分析(HA浓度测量)单向免疫扩散测验根据伍德等(Wood等，1977)记述的过程完成，所述单向免疫扩散测验用于测量上述卵源流感病毒和细胞源流感病毒的红血球凝聚素。病毒体通过在两性洗涤剂(Calbinchem)中室温孵育30分钟而裂解，并在室温下在装载有抗体的琼脂糖凝胶中免疫扩散72小时。测量抗原-抗体联合体的沉淀区域直径，病毒制品的抗原含量通过利用如提供者NIBSC所传达的含有已知的HA含量的全病毒参考批(batch)(NIBSC，伦敦)的标准曲线计算。用于细胞基流感病毒批的HA量化的全病毒参考批是来自NIBSC的卵基的标准的副本，以及使用的抗血清(antisera)。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表1对异源疟疾源抗原UK39的不同制剂中的IRIV的平均尺寸和多分散性的测定。尺寸和多分散性通过使用ZetasizerlOOOHS仪器(Malvern仪器)的动态光散射测量。4.4蛋白免疫印迹胚卵产生的流感病毒和鸟细胞系产生的流感病毒的比较分析包括病毒产物的SDS-PAGE和免疫印迹分析，以获得关于病毒红血球凝聚素在两种细胞类型中的合成和处理的信息=SDS-PAGE用以分析病毒悬浮液的纯度和蛋白含量并且用以确定HA和NA的蛋白/蛋白尺寸。需分析的样品在上述的SDS-PAGE中电泳。凝胶转移至生产商(Invitrogen，巴塞尔，瑞士)提供的适当的转膜缓冲液中。平行地，PVDF膜(Invitrogen，巴塞尔，瑞士)用甲醛预孵育，同样转移至转膜缓冲液中。每个凝胶4-5层吸水纸和2张Watman纸(Biorad，Reinach，瑞士)用转膜缓冲液浸湿并集合斑点。转膜在25V，125mA,17W每凝胶、作用1小时30分钟下完成。膜主要在含有0.2%的吐温20的PBS中洗涤，非特异结合抗体或血清在5%牛奶的PBS中孵育2小时而封闭。再一次在PBS/0.2%吐温20中清洗膜后，斑点用第一抗体/血清在室温下孵育1-2小时，第一抗体/血清根据抗体在含有0.5%牛奶的PBS/0.2%吐温中稀释1100直到110000。膜在PBS/0.2%吐温20中洗5分钟，洗三次，并在适当的山葵过氧化物酶(HRP)标记的第二抗体中孵育，第二抗体用含有0.5%牛奶的PBS/0.2%吐温20稀释11000至120000。在PBS/0.2%吐温20中清洗膜5次后，根据生产商的使用说明通过使用SuperSignalWestDura试剂盒(Pierce，洛桑，瑞士)化学发光而完成显影。4.5FRET化验对于通过荧光能量共振转移(FRET)的体外融合测量，使用以下的化验0.75摩尔%Bodipy530/550-DHPE和0.25摩尔%N-Rh-DHPE合并至包含PC/PG(7030)的脂质体。在终体积为0.8ml的5mMpH7.5磷酸钠缓冲液、IOOmMNaCl的2.5mlPMMA微瓶(VWR，Dietikonj^i)中在连续摇动下完成荧光测量。典型地，1μ1标记的脂质体(0.3nmol磷脂)与5-20μ1的病毒颗粒混合，通过添加3.75-7μ1的IM盐酸引发融合，导致ρΗ为4.5。在激发和发射波长分别为538nm和558nm下，每5秒记录荧光的增加量，激发缝隙是2.5nm,发射缝隙是15.Onm。测量用装有自动调温瓶支架和磁搅拌装置的LS55发光分光计(PerkinElmerInstruments,Schwerzenbach，瑞士)完成。机器温度设定为42°C，使得样品温度为35°C-37°C。无限探针稀释(infiniteprobedilution)的最大荧光在加入TritonX-100(0.5%体积/体积终浓度)之后达到。为了校准荧光量，脂质体的最初剩余荧光设为0，无限探针稀释的荧光为100%(最大荧光)。用于FRET化验的样品应当包括总量为0.5-10μg的HA。对于病毒颗粒制剂分析，2-6yg的HA被证明是最佳的。样品中HA浓度由SRD预先测定。根据制剂中特定的HA浓度，FRET化验所需的病毒颗粒制剂的体积是3-40μ1(对应于2-6μg的HA)。如果病毒颗粒样品的体积少于40μ1，差量通过添加PBS补偿。需要强调的是如果在FRET化验中使用不同量的病毒颗粒，HA和病毒颗粒脂质的比例保持不变，如表2中所示的系列测量。FRET结果的解释由于在FRET化验中得到的百分比值是不定的，绝对范围/边界值很难确定。相反，不同样品间的比率是相对确定的。在总体积0.8ml中，化验中使用的HA的量是3-6μg。用这个范围内的不同值(如3、4、5、6yg)的多个测量值能够做出剂量反应曲线，以提供额外的信息(如系统的饱和度)。^融合活性(％)样品描述HA量(昭)-；--；-_____买验1买验21UK39IRIV-鸡_52__46__39_3A__28__23___1.6__29__26_____08__29__182___54__54Λ3.54233UK39IRIV-鸭---_L8__22__38___LO__28__133_52__19__14,3.6158UK39IRIV-卵---_L8__18__13___0.9丨6I5表2在对异源疟疾源抗原Μ39的不同制剂中的IRIV融合活性的评估。对于每一个制剂，测量了4个具有不同HA量的数据。对于用FRET分析的每一个HA浓度，结果(以％融合活性表示)在包含来自鸡和卵源的病毒的HA的IRIVs之间比较。这通过计算对于每个检测的HA浓度的两个样品的比率完成。然后，计算不同HA浓度下的比率的平均值。直接读出值(％融合活性)在不同HA浓度(剂量相关)间变化明显，在用同样样品的不同检验路线(testruns)中也变化明显(检验可变性)。相反，平均比率显示了更少的变化，因此，表示了能够在样品之间重复比较的确定的读出值。5μg39%14%=2.783μg238=2.872μg2613=2.01μg185=3.6平均值结果为2.81(图2，下图)。5、免疫原件研究小鼠中免疫原件研究抗体反应如果没有其它说明，至少10只BALB/c鼠的组用0.Iml不同浓度的空的IRIVs或装载异源抗原的IRIVs(IIRIVs)肌肉注射(i.m.)免疫来评估免疫反应。在这个实验中，疟疾抗原M39用作异源抗原。实施间隔三个星期的两次接种，第二次免疫后两个星期收集血清样品。⑶8+T细胞反应如果没有其它说明，HLA-A2转基因鼠用0.Iml空的TlRIVs或装载异源抗原的TlRIVs皮下免疫以评估免疫反应。实施间隔三个星期的两次接种，第二次免疫后两星期收集脾细胞。5.1用ELISA法的免疫学分析(B细胞反应)至少10只BALB/c鼠的组被肌肉注射免疫两次，间隔三个星期，并收集血清。只要对照组使用同样的过程，免疫的进度表、剂量和数量可以变化。通过ELISA检验血清以测量抗体抗流感病毒HA的反应(图3)和抗源于恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)的异源抗原UK39的反应(图4)。对于每种血清，测定抗特定抗原的抗体滴度。这通过计算相应于包含在每个平皿中的控制血清的最大OD值的20%OD值的稀释度完成。记录每个组中所有的单独滴度，通过使用Wilc0x0n检验法检验数据(血清滴度)比较这些组。结果的ρ值小于0.05说明95%的可能性两个组不相等。这里，Wilcoxon检验法用于说明改进的病毒颗粒是“明显地更具免疫原性的”，即当卵源病毒颗粒和viroplus病毒颗粒比较时，Wilcoxon检验法对于血清滴度的检验产生了ρ值<0.05。使用酶联免疫吸附实验(ELISA)分析以探测在血清样品中抗异源抗原或HA的抗体。主要地，96孔微量滴定板(Nunc，FisherScientific，Wohlen，瑞士)在4°C下在合适的缓冲液体系中每孔用100μ1感兴趣的抗原包被过夜，如疟疾抗原Μ39磷脂酰乙醇胺结合物在Polysorb微量滴定板上在PBS(ρΗ7.4)包被成10μg/ml溶液，HA蛋白(灭活的全病毒或病毒颗粒制剂)在Maxisorb微量滴定板上在pH9.40.05M碳酸盐缓冲液中包被成1μg/ml溶液。包被后，平板用含有5%奶粉的PBS室温封闭至少2小时，然后用含有0.05%吐温20的PBS清洗3次。接着，平板在含有0.05%吐温20和0.5%奶粉的PBS中用系列稀释度(起始150)的鼠血清在37°C孵育2小时。每一个平板必须包括阳性对照血清。经过另一个清洗循环，平板用HRP结合的羊抗鼠Ig抗体(BDBioscience,巴塞尔，瑞士)在37°C孵育1小时。经过最后一轮清洗后，加入OPD-底物(邻苯二胺药片，Fluka，BuchS，瑞士，每个药片用50ml柠檬酸盐缓冲液+20μ1双氧水)，平板在黑暗中室温孵育直至比色反应充分进行，加入100μ1IMH2SO4停止反应，在SpectraMaxPlus酶标仪(分子装置，BucherBiotech，巴塞尔，瑞士)上在492nm下读出光学密度(OD)。如图4中所示，包含来自卵产生的病毒的HA的IlRIVs(装载UK39的IRIVs)和包含来自细胞系产生的病毒的HA的IlRIVs在免疫原性上观察到明显的区别对于鸡细胞培养物卵的P=0.002和对于鸭细胞培养物卵的ρ=0.009。相比于联合来自卵源的病毒的HA配制成的病毒颗粒的M39，联合来自Ebx源的病毒的HA配制成的病毒颗粒的M39具有改进的免疫原性。灰色虚线标记了OD值以计算抗M39滴度，所述抗M39滴度以每个平板中包含的对照的最大0D492值的20%计算。5.2诵i寸细胞内的γ-干扰素染卢,的免,疮分析(Tmm^m.)细胞内的Y-干扰素染色脾细胞(12xl06)用10μg/ml的特定肽或非相关肽(阴性对照)在37°C且存在5μg/ml的布雷菲德菌素A的5%CO2下在RPMI完全培养基孵育4小时，所述RPMI完全培养基含有2mML-谷氨酸盐、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、5mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸、5%的FCS和5x10_5M的2-巯基乙醇。细胞用FITC-结合的抗-⑶8的抗体染色，渗透，且依据生产商的说明(BDPharmingen，圣地亚哥，美国)使用Cytofix/Cytoperm试剂盒用PE-结合的抗Y-干扰素的抗体染色。数据在BDLSRII流式细胞仪上获得，用FlowJo软件分析。产生Y-干扰素的细胞的频率计为Y-干扰素阳性和⑶8阳性细胞在所有CD8阳性细胞中的百分比。特定肽细胞的百分比通过从用特定肽刺激样品中的百分比中减去用非相关肽刺激样品中的百分比而获得用细胞培养物源的流感病毒制备的TlRIVs(鸭EBxTIRIVs)或卵源病毒制备的TIRIVs,都装载异源抗原HCV核心132，皮下免疫HLA-A2转基因鼠两次，间隔3星期。对于两种制品，HA的量相同。对照鼠用不含有异源抗原的TlRIVs免疫。最后一次免疫后两星期，对异源抗原特异的CD8+T细胞的频率用细胞内Y-干扰素染色测定。所示的是平均值士标准方差。5.3来自卵产生的病毒的HA和来自细胞培养物产生的病毒的HA的比较如图1所示，多克隆抗体和单克隆抗体与卵源和鸟细胞培养物源的材料的反应不同。多克隆血清与来自鸟细胞系产生的病毒的HA和来自卵产生的病毒的HA均反应，而单克隆抗体只和来自卵源病毒的HA反应。HA的去糖基化A型流感病毒的不同株(A/Singapore(H1/N1)，A/NC(H1/N1)，A/Panama(H3/N2))在胚卵中增殖，来自各自制品的HA由多克隆抗体识别，说明多克隆抗体不是株系特异的。对于糖基化，使用Sigma-Aldrich(Buchs，瑞士)的“酶蛋白去糖基化试剂盒”。根据生产商的说明制备产品。来自三个株的病毒制品的去糖基化在所有的案例中导致信号的完全损失，抗HA的多克隆血清识别的较小尺寸的条带表示去糖基化的蛋白(表3)。流感病毒在哺乳动物细胞系中的继代和蛋白免疫印迹分析制备含有MDCK-或Vero细胞的两个6孔平板每孔5x10s细胞培养在Episerf培养基中。第二天，细胞用在胚卵或EBx细胞中生长的病毒感染，使用或不使用胰岛素以分别地产生有感染性的病毒体(通过赋予细胞活性的HA分裂)或者限制复制至一次继代(通过缺乏胰岛素时保持HA为非活性HAtl形态)。1天(对于MDCK)或3天(对于Vero细胞)之后通过刮下细胞而收获细胞，只要病毒感染分别导致细胞的消减或诱导可视的CPE。感染的细胞随后使用多克隆抗-HA-兔血清或者HA特定单克隆抗体进行蛋白免疫印迹分析。但是，用单克隆抗体染色仅对于从感染的卵(对照)中分离的病毒呈阳性，但是对于来自仅在哺乳动物细胞(缺乏胰岛素时获得的MDCK或Vero细胞，只产生不能再次感染细胞的病毒)中一次继代的病毒的HA-样品呈阴性。因此，一次继代足以用单克隆抗体去除信号。一次继代排除氨基酸交换的可能性，因此，可以排除导致结合损失的抗原决定基在氨基酸水平的修饰。缺乏胰岛素时，HAO不能分成HAl和HA2。由于缺少抗体结合，可以排除由胰岛素产生的HA的分裂导致的抗原决定基的破坏。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>表3源于在卵或细胞系中繁殖的流感病毒的红血球凝聚素的比较。权利要求一种包含红血球凝聚素(HA)的病毒颗粒，其特征在于，所述HA来自鸟细胞系产生的流感病毒。2.根据权利要求1的病毒颗粒，其特征在于，所述病毒颗粒的融合活性相比于包含来自鸡卵产生的流感病毒的HA的病毒颗粒的平均融合活性至少高50%。3.根据权利要求1或2的任何一项的病毒颗粒，其特征在于，所述病毒颗粒的免疫原性相比于包含来自鸡卵产生的流感病毒的HA的病毒颗粒的免疫原性明显更高。4.根据权利要求1-3的任何一项的病毒颗粒，其特征在于，所述HA来自至少两种不同的流感病毒株。5.根据权利要求1-4的任何一项的病毒颗粒，其特征在于，所述病毒颗粒是冻干的。6.根据权利要求1-5的任何一项的病毒颗粒，其特征在于，所述病毒颗粒装载有抗原。7.根据权利要求1-5的任何一项的病毒颗粒，其特征在于，所述病毒颗粒是空的。8.一种包含根据权利要求1-7的任何一项的病毒颗粒的组合物。9.根据权利要求8的组合物，其特征在于，所述组合物是疫苗。10.根据权利要求8或9的任何一项的组合物，其特征在于，所述组合物有免疫原性，并且更进一步包括脂质体和至少一种抗原分子。11.根据权利要求10的组合物，其特征在于，所述至少一种抗原分子包陷在所述的脂质体中。12.根据权利要求1-6的任何一项的病毒颗粒在药物组合物中作为抗原递送载体以产生抗抗原的免疫反应的应用。13.根据权利要求7的病毒颗粒作为用于制备药物组合物的非特异性的免疫刺激剂以产生抗不同来源的抗原的免疫反应的应用。14.根据权利要求1-7的任何一项的病毒颗粒用于制备用于疫苗或免疫的药物组合物的应用。15.根据权利要求1-7的任何一项的病毒颗粒用于制备用于治疗或预防疾病或紊乱的药物组合物的应用。16.一种包含根据权利要求1-7的任何一项的病毒颗粒或根据权利要求8-11的任何一项的组合物的试剂盒。17.一种用根据权利要求1-7的任何一项的病毒颗粒或根据权利要求8-11的任何一项的组合物对实验体接种疫苗或免疫的方法，包括用所述的病毒颗粒或所述的组合物向实验体给药。18.一种对需要的实验体用根据权利要求1-7的任何一项的病毒颗粒或根据权利要求8-11的任何一项的组合物治疗或预防疾病或紊乱的方法，包括用所述的病毒颗粒或所述的组合物向所述实验体给药。19.根据权利要求18的方法，其特征在于，所述疾病或紊乱选自传染性疾病或癌症。20.一种制备根据权利要求1-7的任何一项的病毒颗粒的方法，包括步骤a)用清洁剂或短链磷脂处理全流感病毒，b)分离包含HA的片段，任选地添加磷脂，c)去除所述清洁剂，得到病毒颗粒制剂。21.根据权利要求20的方法获得的病毒颗粒。全文摘要本发明涉及包含具有改进的融合活性的红血球凝聚素(HA)的病毒颗粒，优选地，包含在所述病毒颗粒中的所述HA来自细胞系产生的流感病毒。本发明还涉及包含根据本发明的病毒颗粒的组合物和试剂盒。更进一步，本发明涉及包括所述病毒颗粒的应用和方法，及其制备方法。文档编号A61K9/127GK101815505SQ200880021416公开日2010年8月25日申请日期2008年6月13日优先权日2007年6月22日发明者克里斯蒂娜·莫泽,妮科尔·韦斯特菲尔德,安德烈亚斯·卡默,西尔维娅·拉西,里纳尔多·楚尔布里根,马里奥·阿马克申请人:佩维恩生物技术股份公司