专利名称：：治疗神经变性的方法和组合物的制作方法
技术领域：
：本文所述的方法和组合物属于神经变性(如神经变性疾病)及其治疗领域。背景神经变性疾病如帕金森病、阿耳茨海默病和肌萎缩侧索硬化(ALS)的特征是神经元和神经组织的死亡和/或变性。由于终末分化的神经元受到其增殖能力的限制，所以一种治疗以神经变性为特征的病症的可能方法是提供新神经细胞替代由于细胞死亡或损伤而丢失的细胞。因此，尝试在动物实验中，利用胚胎或成年的神经干细胞、ES细胞和胚胎神经细胞进行神经细胞移植。然而，这种应用面临如何在人体应用的巨大障碍。胚胎干细胞或神经细胞的应用牵扯到伦理问题，如何保证其稳定供应也是一个问题。虽然证明ES细胞具有分化能力使其吸引了许多关注，但诱导特定细胞类型分化所需的成本和劳动，以及移植后形成畸胎瘤的风险都是阻碍这种技术的稳定应用的因素。另一方面，接受成年神经干细胞移植的患者承受着极大的风险和负担，因为这些细胞发现于非常局限的中枢神经系统核心部位(即深入脑内)，因此必须经开颅术提取。最后，通过移植其它类型的多潜能细胞，如造血干细胞来治疗神经变性和神经损伤的尝试的成功实践有限，因为难以控制移植细胞的分化。由于使用胚胎细胞、成年神经干细胞和各种成年多潜能细胞治疗神经变性疾病存在上述困难，所以需要治疗神经变性疾病的新的方法和组合物。发明概述如本文所述治疗神经变性疾病的新方法利用移植到神经变性部位时通过诱导周围的非神经细胞分化成神经元或神经组织、促进受损或即将死亡的神经细胞恢复和/或促进宿主神经元的存活作用于周围细胞的细胞。其它新治疗方法包括移植能抑制介导或以其他方式参与神经元细胞死亡和/或变性过程的宿主细胞作用的细胞。因此，本文公开了神经再生方法，可用于(例如)治疗神经变性和神经变性疾病。这类方法包括在神经变性部位或其附近移植经诱导取得某些促进神经再生的特性的骨髓衍生细胞。因此，在某些实施方式中，本文公开的用于神经再生和治疗神经变性的方法包括在神经变性部位或其附近移植骨髓贴附性基质细胞或骨髓衍生的神经再生细胞。本文公开的方法和组合物可用于治疗中枢神经系统或周围神经系统中的变性。例如，本文公开的方法和组合物可用于治疗中枢神经系统失调，例如，帕金森病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、中风和阿耳茨海默病。周围神经系统神经元的神经变性或物理损伤也可用本文所述的方法和组合物治疗。在某些实施方式中，骨髓衍生的神经再生细胞是骨髓基质细胞(也称为骨髓贴附性基质细胞)经过修饰产生的，它们经过修饰后表达Notch胞内结构域⑴ICD)的氨基酸序列。在某些实施方式中，用包含编码Notch胞内结构域的序列的核酸或多核苷酸转染骨髓基质细胞，由所述转染细胞产生的骨髓衍生的神经再生细胞用于移植。在某些实施方式中，Notch胞内结构域由人Notch-I蛋白的氨基酸1703-2504组成。Ellison等(1991)Cell66649-661。如果不希望受任何具体理论的限制，在某些实施方式中，移植的骨髓贴附性基质细胞和骨髓衍生的神经再生细胞在神经变性部位或其附近通过支持宿主神经纤维(如轴突)的生长行使其再生作用。在其它实施方式中，移植的骨髓贴附性基质细胞和骨髓衍生的神经再生细胞通过促进神经变性部位或其附近的宿主神经元存活行使其再生作用。这些再生作用可能由移植细胞分泌一种或多种营养因子而引起。或者，再生可能由移植细胞产生一种或多种促进宿主神经元生长和/或存活的胞外基质分子而引起。再生作用也可能由分泌的可扩散因子(如生长因子)和不可扩散的因子(如胞外基质)的联合作用而引起。因此，本发明包括但不限于以下实施方式1.一种治疗神经变性的方法，其中所述方法包括在神经变性部位或其附近移植骨髓贴附性基质细胞或骨髓衍生的神经再生细胞。2.如实施方式1所述的方法，其特征在于，所述神经变性部位位于中枢神经系统。3.如实施方式1所述的方法，其特征在于，所述神经变性部位位于周围神经系统。4.如实施方式2所述的方法，其特征在于，所述神经变性与帕金森病相关联。5.如实施方式1所述的方法，其特征在于，所述骨髓衍生的神经再生细胞是用包含编码Notch胞内结构域(OTCD)的序列的多核苷酸转染的骨髓基质细胞的后代。6.如实施方式5所述的方法，其特征在于，所述NI⑶由Notch-I蛋白的氨基酸1703-2504构成。7.如实施方式1所述的方法，其特征在于，所述骨髓贴附性基质细胞或骨髓衍生的神经再生细胞支持神经变性部位或其附近宿主神经纤维的生长。8.如实施方式7所述的方法，其特征在于，所述神经纤维是轴突。9.如实施方式1所述的方法，其特征在于，所述骨髓贴附性基质细胞或骨髓衍生的神经再生细胞促进神经变性部位或其附近宿主神经元的存活。10.如实施方式1所述的方法，其特征在于，所述骨髓贴附性基质细胞或骨髓衍生的神经再生细胞分泌一种或多种营养因子。11.一种神经再生方法，其中所述方法包括在神经变性部位或其附近移植骨髓贴附性基质细胞或骨髓衍生的神经再生细胞。12.如实施方式11所述的方法，其特征在于，所述神经变性部位位于中枢神经系统。13.如实施方式11所述的方法，其特征在于，所述神经变性部位位于周围神经系统。14.如实施方式12所述的方法，其特征在于，所述神经变性与帕金森病相关联。15.如实施方式11所述的方法，其特征在于，所述骨髓衍生的神经再生细胞是用包含编码Notch胞内结构域(OTCD)的序列的多核苷酸转染的骨髓基质细胞的后代。16.如实施方式15所述的方法，其特征在于，所述NI⑶由Notch-I蛋白的氨基酸1703-2504构成。17.如实施方式11所述的方法，其特征在于，所述骨髓贴附性基质细胞或骨髓衍生的神经再生细胞支持神经变性部位或其附近宿主神经纤维的生长。18.如实施方式17所述的方法，其特征在于，所述神经纤维是轴突。19.如实施方式11所述的方法，其特征在于，所述骨髓贴附性基质细胞或骨髓衍生的神经再生细胞促进神经变性部位或其附近宿主神经元的存活。20.如实施方式11所述的方法，其特征在于，所述骨髓贴附性基质细胞或骨髓衍生的神经再生细胞分泌一种或多种营养因子。21.一种向受损的宿主神经组织提供营养支持的方法，其中所述方法包括在所述宿主的神经变性部位或其附近移植骨髓贴附性基质细胞或骨髓衍生的神经再生细胞。22.如实施方式21所述的方法，其特征在于，所述营养支持促进宿主神经细胞存活。23.如实施方式21所述的方法，其特征在于，所述营养支持防止宿主神经细胞死亡。24.如实施方式23所述的方法，其特征在于，所述细胞死亡是通过凋亡进行的。25.如实施方式21所述的方法，其特征在于，所述营养支持提高宿主神经细胞功能。26.如实施方式21所述的方法，其特征在于，所述营养支持刺激宿主神经细胞生长。27.如实施方式26所述的方法，其特征在于，刺激神经纤维向外生长。28.如实施方式27所述的方法，其特征在于，所述神经纤维是轴突。29.如实施方式27所述的方法，其特征在于，所述神经纤维是树突。30.如实施方式26所述的方法，其特征在于，形成新突触。31.如实施方式21所述的方法，其特征在于，所述营养支持有利于将宿主干细胞募集到受损组织处。32.如实施方式21所述的方法，其特征在于，所述受损神经组织位于中枢神经系统。33.如实施方式21所述的方法，其特征在于，所述受损神经组织位于周围神经系统。34.如实施方式32所述的方法，其特征在于，所述受损神经组织与帕金森病相关联。35.如实施方式21所述的方法，其特征在于，所述骨髓衍生的神经再生细胞是用包含编码Notch胞内结构域(OTCD)的序列的多核苷酸转染的骨髓贴附性基质细胞的后代。36.如实施方式35所述的方法，其特征在于，所述NI⑶由Notch-I蛋白的氨基酸1703-2504构成。37.如实施方式21所述的方法，其特征在于，所述骨髓贴附性基质细胞或骨髓衍生的神经再生细胞分泌一种或多种营养因子。38.如实施方式37所述的方法，其特征在于，所述骨髓贴附性基质细胞或骨髓衍生的神经再生细胞分泌以下因子中的一种或多种血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、骨形态发生蛋白4、Dkk-Ι、成纤维细胞生长因子_7、结合肝素的表皮生长因子样生长因子、白介素_6、白介素_8、单核细胞趋化蛋白-1、基质金属蛋白酶-1、血小板衍生生长因子AA和转化生长因子α。附图简要说明图1显示经ΜΑΡ2染色评估，原代大鼠神经元培养物中MASC分泌的因子对神经突生长的影响。神经元在完全神经基础培养基(阳性对照；左上图)或αΜΕΜ(阴性对照冲上图)中培养，或在αMEM中与不同数量的通过半透膜由大鼠神经元分离的MASC(如图所示)共同培养2天(右上图和下方三幅图)。图2显示根据胞内LDH实验测定，与MASC和NRC共同培养的原代大鼠皮层神经元中存活神经元的相对数量。最左边的5个图柱显示在无血清αMEM中来自捐献者42(D42)的MASC与皮层神经元共同培养的测定结果。横坐标表示加入神经元共同培养物中的D42MASC数量(xlO3)。左起第6个图柱显示在完全神经元培养基(“完全ΝΒ”)中培养而未经共同培养的阳性对照神经元的胞内LDH。在该图右侧，评估了与MASC和NRC共同培养的影响。右起第四个图柱显示在完全神经元培养基(“完全ΝΒ”)中培养但未经共同培养的阳性对照培养物中神经元的相对数量。最右边的三个图柱显示用无血清αMEM中培养过的神经元获得的结果。右起第三个图柱显示未经共同培养的神经元的结果；右起第二个图柱显示与5，000个D31MASC共同培养的神经元的结果；最右边的第一个图柱显示与5，000个D31NRC共同培养的神经元的结果。图3显示根据胞内LDH实验测定，与MASC和NRC共同培养的原代大鼠皮层神经元中存活神经元的相对数量。最左边的5个柱显示在无血清αMEM中来自捐献者42(D42)的MASC与皮层神经元共同培养的测定结果。横坐标表示加入神经元共同培养物中的D42MASC数量(xlO3)。在该图右侧，评估了在无血清αMEM中与MASC和NRC共同培养的影响。右起第五个图柱显示未经共同培养的神经元的结果；右起第三个和第四个图柱分别显示与5，000个或10，000个039默5(共同培养的神经元的结果；最右边的第一个和第二个图柱分别显示与5，000个和10，000个D39NRC共同培养的神经元的结果。图4显示进行氧气/葡萄糖耗竭(OGD)的原代神经元的培养物，随后与或不与骨髓贴附性基质细胞(MASC)或神经再生细胞(NRC)共同培养时的细胞损伤(表示为与对照相比LDH释放的改变倍数)。该图显示由六位捐献者的细胞所获结果汇集的数据。对所有样品而言，相对于仅OGD的ρ<0.05。图5显示进行氧气/葡萄糖耗竭(OGD)的原代神经元的培养物，随后与或不与来自骨髓贴附性基质细胞(MASC)或神经再生细胞(NRC)的不同类型的条件培养基(conditionedmedium,CM)共同培养时的细胞损伤(表示为与对照相比LDH释放的改变倍数)。“来自NB的CM”指来自神经元培养基中培养的捐献者细胞(MASC或NRC)的条件培养基；“来自OGD的CM”指来自在其本身经OGD-损伤神经元调节的神经元培养基中培养的捐献者细胞的条件培养基；“来自对照的CM”指来自在其本身经非损伤神经元调节的神经元培养基中培养的捐献者细胞的条件培养基。对所有样品而言，相对于仅OGD的ρ<0.05。图6显示进行氧气/葡萄糖耗竭(OGD)的原代神经元的培养物，随后与不同稀释度的来自骨髓贴附性基质细胞(MASC)或神经再生细胞(NRC)的条件培养基(CM)共同培养时的细胞损伤(表示为与对照相比LDH释放的改变倍数)。条件培养基以11、110、125、150,1100或1200稀释，如图所示。对照神经元(NB/B27Med)与神经元培养基(组成见实施例7)共同培养。捐献者细胞条件培养基拯救受损神经元的能力是剂量依赖性的。*相对于仅OGD的ρ<0.05；#相对于CM11的ρ<0.05；§相对于CM110的ρ<0.05；平均值士SD。图7显示进行氧气/葡萄糖耗竭(OGD)的大鼠海马切片，随后与或不与骨髓贴附性基质细胞(0GD+MASC)或神经再生细胞(0GD+NRC)共同培养时的细胞损伤(表示为与对照相比LDH释放的改变倍数)。该图显示将海马切片与来自六位捐献者的MASC或NRC共同培养的结果。对所有样品而言，相对于仅OGD的ρ<0.05。图8显示进行氧气/葡萄糖耗竭(OGD)的大鼠海马切片，随后与或不与来自骨髓贴附性基质细胞(MSC)或神经再生细胞(NRC)的条件培养基(CM)共同培养24小时后的细胞损伤(表示为与对照相比LDH释放的改变倍数)。对所有样品而言，相对于仅OGD的ρ<0.05。图9显示进行氧气/葡萄糖耗竭后，再在神经元培养基中(仅OGD；左侧图柱)，经过在海马切片存在下培养48小时的NRC稀释的条件培养基中(0GD+来自对照切片的NRCCM(125)；中间图柱)或在OGD损伤的海马切片存在下培养48小时的NRC稀释的条件培养基中(0GD+来自OGD切片的NRCCM(125)；右侧图柱)培养24小时的原代神经元培养物中的细胞损伤(表示为与对照相比LDH释放的改变倍数)。*相对于仅0⑶组ρ<0.05；#相对于OGD+来自对照切片的NRCCM的ρ<0.05。发明详述术语“移植物”、“移植体”和“植入物”可互换使用，指将外源性细胞置入对象或组织中的特定位置。“自体移植”指将对象的自身细胞移植到该对象中(例如，从对象的一个部位取出细胞，转移到同一对象的不同部位，在取出和转移动作之间可以对细胞进行或不进行另外的处理)。“同种异体移植”指将细胞转移至对象，所述细胞获自不同个体。术语“骨髓基质细胞”、“骨髓贴附性基质细胞”、“骨髓粘附性干细胞”、“髓干细胞”、“骨髓干细胞”、“间充质干细胞”和“MASC”指由骨髓获得的有丝分裂的多潜能细胞，在骨髓的正常发育过程中能够产生许多分化细胞类型例如骨细胞，以及通常发现于结缔组织的细胞，包括但不限于软骨细胞和脂肪细胞。MASC可以是人细胞，或者是来自其他哺乳动物或脊椎动物的细胞。“神经再生细胞”、“神经元再生细胞”、“NRC”和“骨髓衍生的神经再生细胞”可互换使用，指骨髓贴附性基质细胞衍生的有丝分裂细胞，它们具有促进受损神经细胞，如神经元、胶质细胞和其前体生长和存活和/或防止其凋亡和死亡的能力。因此，它们不同于原代神经元前体细胞，例如，可获自胚胎或成年组织，例如海马区和室周室管膜下区。NRC可以是人细胞，或者是来自其他哺乳动物或脊椎动物的细胞。“营养因子”或“生长因子”是促进受损细胞(例如神经元、星形胶质细胞或少突胶质细胞)的再生、生长和/或存活的任何分子。这种因子可由除受损细胞以外的细胞分泌；例如，由植入神经损伤部位的骨髓贴附性基质细胞或神经再生细胞，或者由所述移植细胞的后代分泌。神经系统的变性疾病(无法重建)包括在人群中具有高发病率的各种不同病症，包括损伤诱导的脊柱伤害、脑血管损伤、青光眼(可导致失明)和神经变性病症，如帕金森病、ALS和阿耳茨海默病。因此，本文所述的神经再生方法和组合物满足了人类健康的急切需求。ALS(肌萎缩侧索硬化)是脊髓运动神经元细胞死亡导致控制肌肉收缩的神经功能丧失，从而阻碍整个机体的肌肉(包括涉及呼吸的肌肉)运动并在发病2-3年内导致患者死亡的病症。目前对ALS还没有有效的治疗手段。如果能够由自身骨髓获得支持乙酰基胆碱能神经元再生的细胞，则可进行自体移植，这能够带来极大的好处，甚至可治愈ALS。阿耳茨海默病是特征为痴呆的病症，其中中枢神经系统中细胞发生死亡，伴随出现胞内神经纤维缠结和含有_淀粉样蛋白沉积的胞外斑块。尚无可行的治疗手段。帕金森病的特征是合成神经递质多巴胺(DA)的一组神经元的死亡。这些神经元位于中脑黑质密部，向前脑区域，如尾状核和壳发出轴突，总称为纹状体。纹状体中的DA对于运动控制至关重要，该脑区中缺乏DA导致静止性震颤、运动徐缓、运动启动困难和姿势性缺陷。这使得患者无法正常地启动和控制运动。这种疾病是慢性进行性疾病，目前无法治愈帕金森病，也没有任何治疗能抑制或逆转DA神经元的损失。上述疾病和特征为神经变性的其它疾病或症状可通过在神经变性部位或其附近提供新神经细胞、刺激受损或即将死亡的神经细胞生长和/或再生和/或促进受损或即将死亡的神经细胞存活进行治疗。因此，本文所述的方法和组合物可用于治疗任何类型的神经变性或神经损伤，包括但不限于帕金森病、阿耳茨海默病和ALS。神经变性部位可通过解剖学方法鉴定，或者可根据所治疗疾病的病理学状况了解。而且，此种技术的应用不仅限于临床治疗领域，还可用于人工器官的工程改造(预计是将来发展的重要领域)等领域。例如，在细胞培养水平产生神经细胞和/或神经再生细胞将有利于产生混合型人工器官等。本发明提供通过在神经变性或神经损伤部位或其附近移植骨髓贴附性基质细胞或骨髓_衍生的神经再生细胞(即，骨髓贴附性基质细胞经诱导后诱导受损神经细胞的生长、存活和/或再生的能力增强而衍生的细胞)，治疗神经变性疾病的方法和组合物。可以对门诊患者进行骨髓抽吸，以方便地提取骨髓基质细胞，由于其高度增殖的特性，可以在相对较短的时间内大量培养。而且，它们用作本发明方法和组合物的原料的另一个优点是它们能够进行自体移植(即，移植衍生自患者自身骨髓干细胞的细胞而形成新的神经和神经组织)。因为不会产生免疫排斥，所以省去了给予免疫抑制剂的步骤，从而实现更安全的治疗。而且，由于骨髓干细胞可从骨髓库获得，所以从供应角度来看此种方法也是有利的。骨髓贴附性基质细胞可通过以下方法获得，在α-MEM+10%FBS+L-谷胺酰胺中培养骨髓吸出物3天，然后吸掉未贴壁细胞。详见实施例1。在某些实施方式中，骨髓衍生的神经再生细胞通过以下方法获得，该方法包括用包含编码Notch胞内结构域(OTCD)的序列的多核苷酸转染骨髓贴附性基质细胞，如通过引用将其内容纳入本文的美国专利申请公开号2006-0166362(2006年7月27日)所述，和通过引用将其内容纳入本文的Dezawa等(2004)J.Clin.Invest.113:1701_1710所述。在其它实施方式中，如通过引用将其内容纳入本文的美国专利申请公开号2006-0251624(2006年11月9日)所述获得这类细胞。或者，如通过引用将其内容纳入本文的美国专利申请公开号2003-0003090(2003年1月2日)所述获得这类细胞。一种获得神经再生细胞的示范性方法见下文实施例2所述。可将本文所述细胞悬浮于生理相容性载体以便移植。如本文所用的术语“生理相容性载体”指与制剂的其他成分相容且对接受者无害的载体。本领域技术人员熟悉生理相容性载体。合适载体的例子包括细胞培养基(如伊格尔最低必需培养基)、磷酸盐缓冲盐水、汉克斯平衡盐溶液+/_葡萄糖(HBSS)和多电解质溶液如Plasma-LyteA(巴克斯特公司(Baxter))。通过本领域已知的任何方法，包括例如，注射所述细胞或手术植入进行骨髓贴附性基质细胞或骨髓衍生神经再生细胞的移植。细胞可以在缓冲液或悬浮液中，通过“移植体形成单元(GFU)”或与基质或支持材料结合进行移植。参见例如，美国专利号6，989，271和美国专利申请公开号2006-0216276，通过引用纳入本文。给予患者的细胞悬液的体积取决于植入部位、治疗目的和溶液中的细胞含量。通常，给予患者的细胞量为“治疗有效量”。本文所用的“治疗有效量”指对特定疾病进行有效治疗所需的移植细胞的数量。例如，治疗帕金森病时，移植治疗有效量的细胞通常能降低与该疾病有关的症状，如强直、运动不能和步态失调的数量和/或严重程度，任选能增加表达酪氨酸羟化酶的神经纤维。可将细胞植入脑实质、含有脑脊液的空间，如蛛网膜下腔空间或脑室，或神经外植入。本文所用术语“神经外”指不属于中枢神经系统或周围神经系统的患者区域，如腹腔神经节或坐骨神经。“中枢神经系统”包括硬膜内的所有结构。通常，通过注射到对象脑内给予细胞。针头的准确大小取决于所治疗的物种，但对任何对象而言，针头的直径优选应不大于1mm。本发明用于神经再生的方法和组合物可用于治疗中枢和周围神经系统中的神经变性。适合如本文所述进行治疗的中枢神经系统疾病包括例如，中风、帕金森病、阿耳茨海默病、ALS和各种类型的脊髓损伤或脑外伤。适合如本文所述进行治疗的周围神经系统疾病包括例如，外周神经的物理损伤；药物诱导性、糖尿病性或自发性神经病；神经性疼痛；感觉或运动缺陷；运动障碍；遗传性感觉和运动神经病；感染性多神经病和炎性神经病。在某些实施方式中，移植细胞，包括骨髓贴附性基质细胞和/或其后代在植入后发生进一步分化，变成神经元(如胆碱能神经元或多巴胺能神经元)和/或神经胶质细胞。然而在某些实施方式中，这类分化的细胞保持骨髓基质细胞的某些特征性免疫学标记物。在其它实施方式中，移植细胞诱导受损的神经元和/或神经胶质细胞的恢复。这种恢复可由细胞间(移植细胞和受损的神经细胞之间)接触介导，或由拯救该受损神经细胞的移植细胞分泌的一种或多种因子(可扩散或不可扩散)介导。在多种神经疾病(如ALS)的治疗中，拯救星形胶质细胞和/或小胶质细胞可能至关重要，因为这些细胞类型可进而分泌支持运动神经元存活和生长的因子。在其它实施方式中，移植细胞诱导内源性细胞(如成纤维细胞、间充质细胞、基质细胞、内皮细胞和/或神经干细胞)分化成新的神经元和/或胶质细胞。这种恢复可由细胞间(移植细胞和一种或多种内源性细胞之间)接触介导，或通过分泌诱导内源性细胞分化的因子而介导。在另一实施方式中，移植细胞分泌能诱导现有神经过程生长至神经变性部位，从而逆转神经变性和/或恢复因变性损失的神经组织的营养因子。以下某些实施例显示本文所述方法和组合物在6-羟基多巴胺(6-0HDA)处理的大鼠脑中的应用，这种大鼠是大家熟知和认可的帕金森病模型。在这种模型中，6-0HDA引起多巴胺能神经元发生进行性丢失，以模拟帕金森病的病理状况。这些具体结果表明，骨髓衍生的神经再生细胞能够复原受损或患病的多巴胺能神经元，因此，可用作帕金森病和其它类型神经变性的细胞疗法。其它实施例证明，在培养的神经元和海马切片中，骨髓贴附性基质细胞或神经再生细胞能够逆转氧气/葡萄糖耗竭造成的损伤。其它实施例记载了骨髓贴附性基质细胞和神经再生细胞分泌的多种营养因子的鉴定和定量测定。实施例实施例1制备骨髓贴附性基质细胞(MASC)将从人捐献者获得的骨髓吸出物分成12.5ml等份，装入50ml试管中，将12.5ml生长培养基(含10%FBS的0|^11，补充有青霉素/链霉素和2mML-谷胺酰胺)加入各试管。通过翻转混合试管内容物，将该试管于200xg离心8分钟。弃去上层透明相，用新鲜的生长培养基将下层相的体积调整至25ml，再次混合该试管并离心。再次弃去上层。再次将各试管中下层相的体积调整至25ml，然后将所有试管的内容物集中到250ml试管中。通过台盼蓝排除法测定细胞浓度并测定有核细胞数后，将细胞接种于T225培养瓶，每瓶含有40ml生长培养基，接种密度为100XIO6有核细胞/瓶。将该培养瓶放入CO2培养箱中于37°C培育3天，期间MASC在培养瓶中贴壁。3天后，通过振荡培养瓶和抽出培养基去除未贴壁细胞。用40ml补充有青霉素/链霉素的αMEM洗涤各培养瓶3次；然后将40ml预热(37°C)生长培养基加入各瓶，将培养瓶放入CO2培养箱中于37°C培养细胞。在此期间，每3-4天用40ml新鲜的生长培养基换液，监测细胞的集落生长情况和细胞密度。当该培养物达到25-30%汇合(通常每个集落10，000-20，000个细胞，10-14天)时，收获MASC(M0代)进行进一步传代。一次收集最多至10个T-225培养瓶中的MASC。除去培养瓶中的培养基，用20mlDPBSw/oCa/Mg(DPBS-/-，海克隆公司(HyClone))洗涤贴壁细胞2次。每瓶加入IOml0.25%胰蛋白酶/EDTA(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen,Carlsbad,CA))，培养瓶在室温下孵育约5分钟。细胞脱离时，将细胞集落分成单个细胞，通过加入IOml生长培养基并温和混合使胰蛋白酶失活。从培养瓶中吸出细胞悬液，集中到250ml试管中。将该试管200xg离心8分钟。小心去除上清液，将湿细胞团块重悬于生长培养基，估计细胞浓度约为IXIO6个细胞/毫升。测定活细胞数，将细胞接种于含生长培养瓶的T225培养瓶，浓度为2XIO6个细胞/瓶(Ml代)。培养细胞3_5天，或直到85-90%汇合，每2-3天更换一次培养基。至85-90%汇合时，通过胰蛋白酶消化收获Ml代细胞，如上所述以2XIO6个细胞/T225培养瓶的密度再次接种，产生M2代培养物。如果需要，每3天向M2培养物提供一次新鲜培养基。M2代培养物达到85-90%汇合(通常3_5天内)时，收获它们进行转染，以产生NRC(下述实施例2)或冻存待用(下述实施例30)。实施例2制备神经再生细胞(NRC)由M2代培养物收获的MASC，或由按照实施例3所述冻存的M2代MASC(如实施例4所述融化并再激活)直接制备NRC。A.制备转染混合物用编码Notch胞内结构域的质粒转染M2代MASC产生神经再生细胞。质粒(pCI-Notch)包含pCI-neo主链(威斯康星州麦迪逊的普洛麦格公司(Promega，Madison,WI))，其中将编码人Notch-I蛋白的氨基酸1703-2504，即编码胞内结构域的序列引入多克隆位点。对于每瓶MASC，使用5ml含有40μg质粒和0.2mlFugene6溶液的转染混合物。为了制备转染混合物，用玻璃移液管将合适量的Fugened)溶液(取决于准备转染的细胞的瓶数)加入装在250ml无菌试管中的αΜΕΜ中。温和混合该溶液，室温培育5分钟。然后，将合适量的质粒DNA逐滴加入Fugene/αMEM混合物中，温和混合，室温培育30分钟。将pCI-NotchDNA加入Fugene<t>/MEM混合物之前，取出5ml加入15ml的试管中，在其中加入40ugpEGFP质粒。使用该溶液转染一瓶细胞，作为转染效率的对照。B.转染为进行转染，通过胰蛋白酶消化收获M2代MASC(如实施例1所述)，以每T225培养瓶2.5XIO6个细胞的密度接种于40ml生长培养基。细胞达到50-70%汇合(通常在18-24小时内)时，每瓶用35ml转染培养基(^1^11+10%83，无青霉素/链霉素)替换其生长培养基，以便准备进行感染。引入转染培养基3小时后，通过移液将5ml转染混合物(上述章节A)直接加入各T-225培养瓶的培养基中(不接触生长表面)，然后温和混合。用40ygpEGFP质粒转染对照T-225培养瓶，以测定转染效率。用转染培养基于37°C培育培养物24小时后，用0|^11+10%83+青霉素/链霉素替换转染培养基。C.选择转染细胞转染后48小时，每瓶用40ml选择培养基(含有100μg/mlG-418的生长培养基)替换培养基，选择已掺入质粒DNA的细胞。选择开始3天后提供新鲜的选择培养基，5天后再次提供。7天后，除去选择培养基，向细胞提供40ml生长培养基。然后，培养该培养物约3周(18-21天)，每2-3天更换新鲜培养基。选择开始后约3周，当存活细胞开始形成集落时，收集细胞。用移液管吸除培养基，在室温下向每个培养瓶中加入20ml无Ca2+/Mg2+的DPBS。温和冲洗培养物表面，吸除洗涤溶液，重复该冲洗步骤。然后，将IOml预热(37°C)的0.25%胰蛋白酶/EDTA加入各培养瓶中，冲洗生长表面，在室温下培育培养瓶5-10分钟。用显微镜监测培养物，以保证细胞完全脱离。脱离完成后，每瓶加入IOml生长培养基使胰蛋白酶失活。从培养物表面上冲下混合物，用IOml移液管吹打4-5次进行混合，将该悬液转移到50ml的无菌锥形离心管中。把由若干培养瓶收集的细胞集中到一个试管中。如果存在任何团块(clump)，则使它们沉降下来，将悬浮液转移至一个新鲜试管中。细胞悬液在200xg于室温离心8分钟。吸除上清液。通过轻拍试管使细胞团松散，向各试管中加入IOml无Ca2+/Mg2+的DPBS，用IOml移液管温和吹打4_5次重悬细胞，获得均一的悬液。P.扩增转染的细胞测定经转化、选择的细胞悬液中的细胞数量，将这些细胞接种子T-225培养瓶，接种密度为2XIO6个细胞/瓶(提供约30%活细胞接种)。此培养物称为M2P1(#1代)。M2P1培养物每2-3天用新鲜培养基换液，当细胞达到90-95%汇合(通常在传代后4-7天)时，收获细胞，以2XIO6个细胞/瓶再接种，产生M2P2代。当M2P2培养物达到90-95%汇合时，收获它们进行冻存(实施例3)或进一步研究。实施例3:冻存按照以下步骤冷冻储存MASC和NRC。通常冻存M2代后的MASC，且通常冻存M2P2代后的NRC。每次处理4-5瓶，从培养瓶中吸出培养基，每瓶加入IOml0.25%胰蛋白酶/EDTA(室温)，温和冲洗培养物表面不超过30秒，吸除液体。然后，将IOml预热(37°C)的0.25%胰蛋白酶/EDTA加入各培养瓶中，冲洗生长表面，在室温下培育培养瓶5-10分钟。通过显微镜镜检监测培养物，以保证细胞完全脱离。脱离完成后，每瓶加入IOmlαMEM生长培养基，冲洗培养物表面，用IOml移液管吹打4-5次以便将脱离的细胞混合。将细胞悬液转移到无菌的250ml锥形离心管中，去除较大的细胞团块。将由15-20个培养瓶收集的细胞集中到一个250ml的试管中。在室温下将该试管200xg离心8分钟。吸除上清液。通过轻拍试管使细胞团松散，每管加入约25mlDPBS(-/-)。用IOml移液管温和吹打4_5次重悬细胞，获得均一的悬液。使各样品经移液通过设置在50ml试管管颈的无菌70μm筛以去除悬液中的团块。将细胞悬液集中在250ml离心管中，去除其余的任何团块。用DPBS(_/_)将最终体积调整至200ml，室温下200xg离心样品8分钟。吸除上清液。通过拍打使细胞团块松散，向试管中加入20mlDPBS(-/-)，用IOml移液管充分混合和温和吹打以重悬细胞。用DPBS(-/")调整最终体积，直至估计浓度约为0.5-1.OXIO6个细胞/毫升，通常每个T225培养瓶收获约4-5ml，或者40个培养瓶收获约200ml。对该悬液进行活细胞计数，然后200xg离心8分钟。吸出上清液，将细胞沉淀重悬于冷冻存溶液(CryoStorsolution)(华盛顿州玻塞尔的BLS公司(BioLifeSolutions,Bothell，WA))，浓度为12XIO6个细胞/毫升。将Iml等份分配到小管中，密封并放置在4°C的冷冻器(CryoCooler)中。将小瓶转移到CryoMed(TF公司(ThermoForma))冷冻架上进行冷冻。实施例4:融化和恢复将冷冻细胞(MASC或NRC)储存在液氮中。需要进行实验时，如下所述将它们快速融化并进行培养。将一管冷冻细胞放入37°C水浴中直到融化。将融化的细胞悬液(Iml)立即加入IOml生长培养基中，温和重悬。200xg离心该悬液，去除上清液，将细胞重悬于生长培养基至估计浓度为IO6个细胞/毫升。通过台盼蓝排除法对活细胞计数，以2XIO6个细胞/T225培养瓶的密度接种细胞。细胞在37°C的CO2培养箱中培养3_4天，直到细胞继续生长。实施例5植入大鼠脑内的骨髓衍生的神经再生细胞的存活通过立体定位法，向成年雄性无胸腺大鼠的背外侧纹状体中植入38，000个骨髓衍生的神经再生细胞(获得方法基本如实施例2所述)。在移植后2小时、48小时和14天处死大鼠。利用人核(HuNu)抗体进行免疫细胞化学实验以定位灌注切片中移植的人细胞，从而确定细胞存活。切片用Nissl或苏木精-伊红复染，以评估移植造成的潜在毒性。移植后5小时、48小时和14天移植细胞的存活率分别为14%、12%和9%。与移植细胞存活率低于的胎儿细胞和神经祖细胞移植体的许多研究相比，这是出色的细胞存活水平。实施例6在帕金森病大鼠模型中移植骨髓衍生的神经再生细胞后诱导多巴胺能神经元本实施例证明，在帕金森病大鼠模型中，移植骨髓衍生的神经再生细胞能诱导多巴胺能神经元的生长和再生。在大鼠中广泛研究了控制神经元生长(如神经突向外生长)、发育、再生和衰老的生理学原理，发现其与人体的情况类似。具体说，可通过向纹状体内注射6-羟基多巴胺(6-0HDA)，在大鼠中获得黑质纹状体突出部的部分损伤，这类似于人类帕金森病的发病机理。在两个独立实验中，用6-羟基多巴胺(6-0HDA)处理大鼠脑；随后在某些6-0HDA-损伤脑中的病损部位植入骨髓衍生的神经再生细胞。移植细胞存活并保持酪氨酸羟化酶(TH)-阴性，而同时诱导TH-阳性(即多巴胺能)神经纤维向着移植部位生长。安非他明诱导的c-fos蛋白的核转运是多巴胺释放的指标，在一些情况下也观察这个指标。结果证明，骨髓衍生的神经再生细胞参与大鼠帕金森病模型中多巴胺能神经元的恢复、再生和募集。A.加工用于移植的骨髓衍生的神经再生细胞如上述实施例2所述制备的骨髓衍生的神经再生细胞冻存在液氮中待用。融化时，将含有细胞的冻存小瓶立即放入37°C水浴中，保持至内容物完全融化。迅速取出小瓶，将细胞转移至含有IOml冷生长培养基(α-MEM+10%FBS)的15ml锥形离心管中。在旋转槽转头中，室温下200xg离心该制备物，形成细胞团块。小心去除上清液，加入DPBSw/oCa2+-Mg2+使最终细胞浓度约为0.5XIO6个细胞/毫升。在此步骤进行细胞计数，以获得准确的细胞数量并检查活力。然后，室温下200xg离心细胞8分钟。向细胞团块中加入1.4mlDPBSW/0Ca2+-Mg2+以重悬细胞，将细胞转移至1.5ml试管中。然后，200xg离心样品8分钟。去除大部分缓冲液，然后于200xg再次快速离心细胞1分钟，用P-200移液器(pipettor)去除剩余的缓冲液。然后估计团块体积，用以下公式计算最终目标体积S活细胞产量(细胞)目所需的细胞浓度(细胞ζ微升)在植入前，进行细胞计数以检查最终浓度和活力。细胞植入后，也检查其余细胞的细胞数量和活力，以保证植入步骤的质量。B.产生6-0HDA损伤在两个独立实验中，通过向右侧纹状体内注射6-0HDA，对38个成年雄性费氏(Fisher)344大鼠进行单侧损伤。用异氟烷麻醉大鼠，随后将头部固定在装有用于连续异氟烷麻醉的鼻锥的立体定位装置中。连续监测呼吸和疼痛反射。在头骨中线上作切口，拉开皮肤，注射针头设置在前因点0位上。标出注射位点的各组坐标，钻孔。注射坐标是:A/P:+0.2，M/L-3.0，D/V-5.5。以1毫米/分钟的速率将注射针头(10μ1汉密尔顿注射器，26G针头)深入到位。达到注射位置后，在开始注射前将针头保持在该位置4分钟。然后开始注射(注射溶液0.2mg/ml抗坏血酸和16微克6-OHDA，注射体积2.8微升，速率0.5微升/分钟)。注射后，将针头保持在该位置4分钟，以使注射溶液从注射部位扩散开。然后缓慢拔出针头(1毫米/分钟)。用不连续缝合法缝合皮肤(至少5针)，用福格拉(Fougera)双抗微生物软膏和LMX4外用麻醉剂处理伤口以防止动物的感染和不适。C.环孢霉素治疗每天皮下注射10mg/kg环孢霉素A以防止针对移植细胞的免疫反应。在注射前，用无菌盐水15稀释山地明(50mg/ml)(最终浓度为10mg/ml)。在细胞移植前24小时开始注射，在该实验其余时间持续每天注射。D.移植6-0HDA处理后7天，在损伤部位移植骨髓衍生的神经再生细胞。向19只大鼠的受损纹状体中立体定位注射0.5μ1骨髓衍生的神经再生细胞悬液进行移植，所述细胞悬液是PBS配制的不同细胞剂量(6，000-21，OOO个细胞/微升)。9只对照大鼠不接受进一步处理(只有损伤的组)。10只对照大鼠以相同坐标接受PBS。在损伤位点周围作10次沉积(Cbposit)，每个针头轨迹上沉积2次(坐标:1-2.:Α/Ρ+O.5，M/L:_2·5，D/V-4.4/-5·8；3-4.:Α/Ρ+O.5，M/L:_3·5，D/V:_4·8/_6·2；5-6.:Α/Ρ:0·0，M/L:_3·0，D/V:-4.8/-6·2；7-8.:Α/Ρ:_0·3，M/L:_2·7，D/V:_4·2/_5·4；9-10.:Α/Ρ:_0·3，M/L:_3·8，D/V:-5.0/-6.2)。用10μ1汉密尔顿注射器和26G针头(直，尖头呈30度角)进行注射。改变注射方案以适合细胞注射。在注射前和注射后将针头保持原位1分钟。注射参数是0.5微升/沉积，1微升/分钟速率。在手术开始时建立额外注射部位的新钻孔，以达到额外注射部位。移植的细胞数为6，000个细胞/移植(η=3)、8，000个细胞/移植(η=3)、12，000个细胞/移植(η=4)和21，000个细胞/移植(η=3)。Ε.处死移植后3周，处死大鼠并检测其脑中是否存在多巴胺能(即TH-阳性)神经元。处死前2小时，通过IP注射给予大鼠DL-安非他明(5mg/kg)，以诱导接受多巴胺能轴突突出部的纹状体目标神经元中表达c-fos。然后，将过量戊巴比妥给予大鼠。用盐水(400ml)、然后是4%多聚甲醛(400ml)进行心内灌注前，检查角膜和夹趾反射以保证足够的麻醉程度。F.组织加工用多聚甲醛进行心内灌注之后，取出脑，封闭后固定过夜，然后相继转移至10%、20%和30%蔗糖溶液中(在组织浸没在每种溶液后进行转移)。从每个脑获得40μm厚的冷冻冠状切片，保持在_20°C的冷冻保护溶液中，直至染色。G.免疫细胞化学/染色催化多巴胺合成中的限速步骤的酪氨酸羟化酶(TH)的免疫反应性用作检测是否存在多巴胺能神经元的试验。采用两种方法。首先，用PBS洗涤冷冻切片三次，然后在含有0.3%曲通XlOO和3%正常山羊血清(封闭溶液)的PBS中室温封闭1小时。然后将第一抗体(兔抗-TH，开米康公司(ChemiCOn)，l1000)加入封闭溶液中，在轨道振荡器上继续室温孵育过夜。然后，用PBS简单洗涤切片，与第二抗体(生物素化山羊抗-兔，1500)在室温下孵育2小时。用VectastainABC试剂盒和DAB底物试剂盒(载体实验室公司(VectorLaboratories))，按照生产商方案进行DAB染色。在第二种方法中，用Tris-缓冲盐水(TBS)洗涤获自纹状体的冷冻切片3次，在0.3%H2O2的TBS溶液中培育15分钟，在10%正常山羊血清(NGS)、0.5%曲通X-100(TX-100)的TBS溶液中室温封闭20分钟，用TBS/0.1%TX-100简单洗涤。利用以1%NGS和0.3%TX-100的TBS溶液12000稀释的多克隆兔抗-TH抗体(开米康公司)，在轨道振荡器上室温(RT)孵育切片过夜。然后，用TBS/0.1%TX-100简单洗涤切片，利用以1%NGS和0.1%TX-100的TBS作1500稀释的生物素化山羊抗-兔抗体(载体实验室公司)室温培育2.5小时，然后在TBS中与亲和素-过氧化物酶偶联物(VectastainABCElite，载体实验室公司)培育2小时。用50mM乙酸钠、IOmM咪唑缓冲液(pH7.0)配制的DAB(20mg/ml)、0.8%硫酸镍、0.005%H2O2进行观察。在每个步骤之间用0.1%TX-100的TBS溶液洗涤数次。通过对人核有丝分裂器蛋白或核基质蛋白(hNuMA)的染色，检测组织切片中存活的骨髓衍生的神经再生细胞。在IOmM柠檬酸钠缓冲液，pH8.5中80°C培育30分钟回收抗原后，用PBS洗涤纹状体切片3次，在5%NGS,5%BSA和1%TX-100的PBS溶液中室温封闭1小时。在用封闭缓冲液150稀释的小鼠单克隆抗-hNuMA抗体(卡巴开公司(Calbiochem))中4°C孵育切片48小时。用0.02%TX-100的PBS溶液洗涤切片数次，与偶联于Cy3(杰克逊免疫研究公司(JacksonImmunoResearch))的第二抗体在室温下孵育90分钟以便检测信号，所述第二抗体是用不含TX-100的封闭缓冲液1250稀释的。用赫斯特33，342染料(5μg/ml，在PBS中；英杰公司(Invitrogen))处理切片15分钟，以进行赫斯特(Hoechst)核染色。对于hNuMA和TH的双染，采用如上所述的相同方案。用封闭缓冲液150和1500稀释的小鼠单克隆抗-hNuMA抗体(卡巴开公司)和多克隆兔抗-TH抗体(开米康公司)同时应用。用偶联于Cy3和Cy2(杰克逊免疫研究公司)的第二抗体室温孵育切片90分钟以便观察，所述抗体是用不含TX-100的封闭溶液1250稀释的。与第二抗体一起孵育后，如上所述进行赫斯特核染色。H.c-fos的核易位通过诱导c-fos表达和c-fos蛋白的核易位测定细胞因对安非他明的反应而释放多巴胺的能力。在对c-fos表达和易位的分析中，在处死之前2小时给大鼠注射dl-安非他明。Dl-安非他明使得来自完整DA纤维的DA的胞外水平增加。DA刺激目标纹状体神经元，导致立即早期反应基因产物c-fos易位至这些神经元的细胞核。移植后3周，通过经心灌注固定剂处死大鼠，对脑切片进行染色以测定c-fos免疫反应性。经免疫细胞化学测定安非他明诱导的纹状体细胞核表达c-fos。用PBS洗涤冷冻切片3次，在0.3^H2O2的PBS溶液中培育15分钟，在3%NGS、2%牛血清白蛋白(BSA)、0.05%TX-100的PBS溶液中室温封闭1小时。然后，将切片在多克隆抗-c-fos抗体(圣克鲁兹公司(SantaCruz))中室温孵育过夜，所述抗体是用1%NGS、1%BSA和0.05%TX-100的PBS溶液11000稀释的。用0.05%TX-100的PBS溶液洗涤切片数次，然后用NGS和1%BSA1500稀释的生物素化山羊抗-兔第二抗体(载体实验室公司)培育2.5小时。然后，用亲和素-过氧化物酶偶联物(VectastainABCElite，载体实验室公司)的PBS溶液培育2小时。用50mM乙酸钠、IOmM咪唑缓冲液(ρΗ7·0)配制的DAB(20mg/ml)、0·8%硫酸镍、0.005%H2O2进行观察。在每个步骤之间用0.05%ΤΧ-100的PBS溶液洗涤数次。如上所述对细胞进行染色以测定c-fos-免疫反应性后，用Neurolucida软件(7.50.4版，佛蒙特州威利斯顿的MBFB公司(MicroBrightFieldBioscience,ffilliston,VT))对阳性细胞核计数。根据所检测水平的不同，采样方法略有差异。在移植水平(距前囟点0.48mm)，在2X放大倍数下设置网格，使其中心对应于移植中心。使用“轮廓”函数绘制三条轮廓曲线；网格两侧各一条，另一条在下方。该轮廓在任一侧限定的面积为0.25mm2(面积等于250μmX1000μm)。下方轮廓限定的面积为上述数值的一半，即0.125mm2。接下来，将放大倍数提高到20X，激活NeuroLucida“曲径扫描”功能。然后，观察到细胞时用计算机鼠标标记，以便以180X180-μm增量检测c-fos阳性细胞的轮廓。用脑切片中线中心作为参比，在移植体对侧建立镜像点。再一次设置网格，使其中心对应于这个镜像点。在2X放大倍数下绘制三张轮廓图，在20X放大倍数下标出c-fos阳性细胞。I.多巴胺能神经元的其它功能测试(DA依赖性行为)用于恢复和/或再生多巴胺能神经元的其它测试包括安非他明诱导的旋转和前肢爪放置。在损伤/移植部位注射荧光金(fluorogold)(倒转示踪剂)以标记多巴胺能神经元，测定移植后荧光金_阳性神经元的数量。通过对如下所述各种标记物的染色测试移植细胞和周围宿主细胞的表型。神经元标记物ΜΑΡ2、βIII微管蛋白；胶质细胞标记物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)；骨髓贴附性基质细胞标记物⑶105。J.结果在所有移植骨髓衍生的神经再生细胞的大鼠中，在移植部位周围观察到致密的酪氨酸羟化酶(TH)免疫反应性纤维(多巴胺能神经元的特征)，而在注射PBS的对照大鼠的受损部位观察到少量酪氨酸羟化酶_免疫反应性纤维或未观察到这种纤维。虽然经过对人特异性核基质蛋白表达的检测，只有少量移植的骨髓衍生的神经再生细胞在移植部位存活，但在存活的移植细胞内没有观察到酪氨酸羟化酶免疫反应性，这表明骨髓衍生的神经再生细胞不分化成多巴胺能神经元并且在移植体周围观察到的酪氨酸羟化酶免疫反应性纤维来自宿主的脑。在对TH和人核基质蛋白进行共同染色的切片中，hNuMA和TH染色之间没有清晰的重叠，提供了证明移植周围TH阳性纤维来源于宿主的证据。此外，观察到存活细胞数量和移植附近的TH-免疫反应性纤维密度之间正相关。这种作用在接受较高剂量的细胞移植的大鼠中最显著。在第一个实验中，接受21，000个细胞/微升的所有三只大鼠的存活细胞数量和TH-IR纤维密度均高于接受低剂量细胞的大鼠。在第二个实验中，接受20，000个细胞/微升的6只大鼠中，5只存活细胞数量较高，而全部6只在移植部位附近的TH-IR纤维增加。测定c-f0S的表达和细胞核易位时，6只大鼠中2只表现出在移植部位附近c-fos阳性细胞核的水平非常高。在其它大鼠中也观察到移植的神经再生细胞周围的c-fos阳性核的热点。这些观察结果表明，TH-免疫反应性纤维增加与一些大鼠中NRC移植体附近安非他明诱导的可用DA增加相关联，但不是整个纹状体、也不是所有移植体中。总之，这些结果表明，将骨髓衍生的神经再生细胞移植到神经变性部位能诱导宿主多巴胺能神经元向该移植物生长、存活和/或再生，这种作用可能是通过分泌一种或多种营养因子造成的。因此，移植骨髓衍生的神经再生细胞提供了一种恢复帕金森病和其它神经变性疾病中的多巴胺能神经元的技术。实施例7与MASC和NRC共同培养能提高原代神经元的存活和神经突向外生长。本实施例显示原代皮层神经元在完全神经元培养基中生长良好，但在无血清αMEM中生长较差、形成的神经突较少且较短。然而，在不支持神经突发生的培养基(即无血清αΜΕΜ)中培养原代皮层神经元且通过半透膜由MASC或NRC分离这种神经元时，神经突向外生长水平提高。这表明MASC和NRC均产生支持神经元生长和神经突发生的可溶性因子。对于给定量的MASC或NRC而言，其拯救作用程度相似。Α.制备培养物平板实验前1天，用10μg/ml聚-D-赖氨酸(密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich，St.Louis，M0))的水溶液包被Millicell96孔细胞培养插板(密理博(Millipore)MAcAc(^SSJWSOjym)的下层隔室。在室温下培育该平板1小时，然后吸出赖氨酸溶液，干燥该平板10分钟，用PBS洗涤，加入完全神经元培养基(补充有2%B-27和0.5mMGlutaMAX的神经基础(Neurobasal)培养基)。加入神经元培养基的经处理的平板储存于4°C待用。B.制备捐献者细胞如实施例1-3所述制备和冻存捐献者细胞(MASC和NRC)。融化准备测试的细胞(来自捐献者D31和D39的MASC和NRC)以及来自捐献者D42的MASC(在本实施例中用作内标)，接种于含有αΜΕΜ和10%FBS、青霉素和链霉素(生长培养基)的Τ225培养瓶中，密度为2Χ106个细胞/瓶，37°C/5%CO2下培养5-7天。对于MASC，培养基中还补充有2mML-谷胺酰胺。用小体积的0.25%(w/v)胰蛋白酶，ImMEDTA替换培养基，以便使细胞与板脱离，收集到50ml试管中，加入生长培养基(5-10ml)使胰蛋白酶失活。200xg离心该试管5分钟，将细胞团块重悬于5-10ml完全培养基。用血球计数板(HS公司(HausserScientific))对一部分细胞溶液计数。对D42标准捐献者细胞，将细胞浓度调整至4XIO5/ml，对待测细胞(D31和D39的MASC和NRC)调整至2X105/ml。准备Millicell96-孔细胞培养插板(密理博MACAC02S5，孔径0.4μm)进行细胞接种，即将25微升/孔的生长培养基加入该插板。每孔中加入前一自然段所述细胞悬液之一的一部分，以便提供所需的捐献者细胞数量；例如，向平板孔中分别加入20、6.7,2.2和0.75X103个细胞/插板，50、17、5.5和2μ1密度为4X105/ml的细胞悬液，以及0、33、44.5和48μ1生长培养基。然后，将插入部分降低至96孔加液隔室，其中含有250微升/孔相同的生长培养基。细胞在37°C、5%CO2中培养过夜，第二天用于共培养实验。C.制备大鼠皮层神经元大鼠皮层(E17)获自依利诺斯州斯普林菲尔德的布雷比特公司(BrainBits，Springfield,IL)，装在该供应商提供的培养基中。为了分离和制备皮层神经元，除去该培养基，替换以2ml含有0.25%(w/v)胰蛋白酶、ImMEDTA(加利福尼亚州卡尔斯巴德的吉布科/英杰公司(Gibco/Invitrogen，Carlsbad,CA))的溶液。在37°C水浴中培育该混合物5-7分钟。去除胰蛋白酶溶液，用2ml补充有10%胎牛血清(FBS)的αMEM冲洗该组织。将2ml杜贝克(Dulbecco)改良型PBS配制的0.25mg/mlDNA酶I溶液加入胰蛋白酶消化的组织中，通过涡旋30秒混合该悬液。用Iml微量移液器尖头吹打以便进一步混合该悬液。弃去剩余的大块组织。然后，将细胞悬液放入15ml离心管中，200xg离心1分钟。去除上清液，将细胞重悬于2-3ml完全神经元培养基(补充有2%B-27和0.5mMGlutaMAX的神经基础(Neurobasal)培养基)。将该神经元细胞悬液的一部分分配到微量离心管中，浓度为40，000个细胞/管，离心沉淀细胞，吸除培养基，将细胞沉淀冻存于-20°C。将这些细胞用作LDH实验的标准品(参见下述章节F)。D.大鼠原代皮层神经元与MASC或NRC的共同培养在实验当天，在37°C培养箱中将按照上述章节A所述准备聚赖氨酸包被的下层隔室预热约30分钟。除去下层隔室中的神经元培养基，用αMEM替换，只有若干小孔中的神经元培养基被保留，用作阳性对照。将按照上述章节C所述制备的大鼠皮层神经元接种到下层隔室的小孔中，密度为5，000个细胞/孔(96孔板)，使其在37°C贴壁1小时。同时，将上述章节B所述的捐献者细胞转移到无血清αMEM中，即去除膜上方孔中的培养基，用75μ1无血清αMEM替换，然后将上层隔室插入也含有无血清αMEM的下层隔室中，37°C培育约30分钟。然后，将含有无血清αMEM培养的捐献者细胞(MASC和NRC)的上层隔室插入含有无血清αMEM培养的原代皮层神经元的下层隔室中。在37°C、5%C02条件下共同培养5-6天。就阳性对照而言，下层隔室中的孔含有神经元培养基而非无血清αMEM,且相应的插板隔室中不含捐献者细胞。E.免疫细胞化学共同培养后，通过测定MAP-2(神经元标记物)表达测试某些培养物的神经突向外生长概况。在此测定中，用4%多聚甲醛(宾夕法尼亚州福特华盛顿的EMS公司(ElectronMicroscopySciences,FortWashington,PA))固定下层小孔的细胞20分钟，然后用0.3%曲通X-100、5%正常驴血清(宾夕法尼亚州西格鲁甫的杰克逊免疫研究实验室公司(JacksonImmunoresearchLaboratories,WestGrove,PA))在室温下封闭1小时。将MAP-2抗体(小鼠单克隆，密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇公司)加入封闭溶液，继续在室温下培育1小时。培育1小时后，用PBS洗涤细胞，并用11000稀释的偶联Cy3的驴抗-小鼠IgG的AffiPureF(ab')2片段(交叉反应最小，宾夕法尼亚州西格鲁甫的杰克逊免疫研究实验室公司)在室温下培育细胞1小时。用PBS洗涤细胞，然后向孔中加入PBS，在Axiovert40CFL(德国蔡司公司(Zeiss，Germany))上分析染色情况；用AxioCamMRm拍摄照片。图1显示通过对MAP-2进行免疫细胞化学分析(如前一自然段所述)测定，与MASC共同培养对原代大鼠皮层神经元的神经突向外生长的影响。MAP-2标记揭示出在完全神经元培养基中培养神经元时广泛长出神经突(图1的左上图)，在无血清αMEM中培养神经元时神经突较少且较短(图1的中上图)。神经元与MASC在αMEM中共同培养时，神经突(process)的数量与神经元共同培养的MASC数量正相关(图1，右上图和下方图片)。在与NRC共同培养时，观察到共同培养对原代皮层神经元神经突长出具有相似的支持性作用。F.细胞存活的LDH试验通过测定胞内乳酸脱氢酶(LDH)的水平，评估在无血清αMEM中与MASC和NRC共同培养的某些神经元样品的存活。在这些样品中，取出含有捐献者细胞的插板，吸除下层隔室的培养基，然后用PBS洗涤下层隔室。每孔加入0.15ml2%(ν/ν)曲通Χ_100以裂解贴附于该平板的细胞。从各孔中取出0.Iml曲通裂解物，转移至新孔中用罗氏(Roche)LDH测定试剂盒进行LDH测定。用连续稀释的冻存细胞制备标准曲线，所述冻存细胞按照上述章节C所述获得、在500μ12%曲通Χ-100中裂解。在LDH测定中，按照生产商说明书制备100μ1来自LDH试剂盒的试剂A和B的混合物，将该混合物加入各孔中。约20-30分钟后，用SpectraMaxPlus(分子设备公司(MolecularDevices))以490nm波长和650nm参比波长测定颜色。通常，进行发色时使含有最高细胞浓度的标准品产生的读数约为IOD单位。用SoftMaxPro软件分析测量值，用二次拟合构建标准曲线。图2和3显示两个独立实验的结果，其中用胞内LDH实验来测定在无血清αMEM中与来自两位不同捐献者的MASC和NRC共同培养后存活神经元的相对数量。在这两个实验中，也使用D42MASC作为内标。在每个实验中测定D42MASC细胞，以保证该测定检测神经元存活水平差异的能力。在图2所示实验中，来自捐献者31的相同数量的MASC和NRC(5XIO3/孔)对神经元存活产生类似的影响(图2，最右侧的两个图柱)。此种影响低于用相同数量D42MASC获得的结果(可从图2最左侧五个图柱显示的D42MASC滴定曲线看出)。在图3所示实验中，测定两个不同浓度(10X103/孔和5X103/孔)的来自捐献者39(D39)的MASC和NRC。同样，MASC和NRC提供的拯救活性水平相似(图3，最右侧的4个图柱)。然而在该实验中，D39MASC和NRC的活性高于作为标准品的D42MASC(可从D42MASC的滴定曲线看出(图3的最左侧五个图柱)。实施例8与骨髓基质细胞或神经再生细胞共培养后拯救受损的神经细胞为了提供体外神经损伤模型，对原代皮层神经元进行氧气/葡萄糖耗竭(OGD)，在24小时内导致严重的细胞损伤。OGD后，立即将神经元与人骨髓贴附性基质细胞或人神经再生细胞共同培养，这两种细胞的制备方法如实施例1和2所述。通过0.4μπι孔径的膜从氧气/葡萄糖耗竭处理的神经元中分离这些捐献者细胞，所述膜允许分子通过但排斥细胞间接触。在这两种情况下，捐献者细胞的存在拯救了经OGD的神经细胞，如下所述。将来自E17SD(Sprague-DaWley)大鼠的皮层神经元接种到聚-d-赖氨酸-包被的12孔板中，密度为6，000个细胞/厘米2，用补充有2%B-27和0.5mMGlutaMAX的神经基础培养基(神经元培养基)在37°C/5%CO2下培养。体外成熟14天后，对神经元进行0GD(0%氧气，用无葡萄糖的杜贝克改良型伊格尔培养基培养)60分钟。将对照培养物保持在大气氧气条件(正常氧压)下的神经元培养基中相同时间。然后，立即将培养基再次更换为神经元培养基，将含有神经再生细胞、骨髓贴附性基质细胞或仅含培养基的插板放入孔中。所有组均采用神经元培养基(η=每种细胞类型6个匹配的捐献者；即MASC获自六个不同的捐献者，每个捐献者培养物的一部分用于产生NRC)。每组用2-4个孔的细胞进行实验。插板的基材是聚对苯二甲酸乙二酯(PET)膜，孔径为0.4μm，允许分子交换但排斥细胞间接触。将骨髓贴附性基质细胞或神经再生细胞接种到放入合适生长培养基中的插板上，在放入具有神经元的孔之前冲洗并更换为神经元培养基。在加入含有神经元的孔时，插板(0.9cm2)上的捐献者细胞为80-100%汇合。OGD后24小时时，定量测定培养神经元释放的乳酸脱氢酶(LDH)(即胞外LDH)并用合适的对照条件标准化，以评估细胞损伤/死亡。对照条件(非OGD)下的神经元也接受含有神经再生细胞、骨髓贴附性基质细胞或只有培养基的插板，以说明捐献者细胞的LDH释放，因为LDH能够穿过分隔捐献者细胞与神经元的膜。因此，结果报道为，进行0GD、然后与含有不同类型的捐献者细胞或仅含培养基的插板共同培养的神经元与对照条件(非OGD)下与含有相同的捐献者细胞类型或培养基的插板共同培养的神经元相比，LDH释放的增加倍数。用印第安纳州印第安纳波利斯的罗氏应用科学公司(RocheAppliedScience,Indianapolis,IN))的“细胞毒性检测试剂盒(LDH)”测定LDH。LDH测定的详情见实施例7，需要注意在本实施例中，测定胞外LDH作为细胞死亡的衡量；而在实施例7中，从培养基中分离细胞并进行裂解，以测定胞内LDH。图4所示结果说明，与神经元只接触培养基相比，受损神经元接触骨髓贴附性基质细胞或神经再生细胞能显著降低OGD后造成的细胞损伤/死亡(通过测定胞外LDH确定)(P<0.05)。而且，因为捐献者细胞不与受损神经元直接接触，所以观察到的细胞死亡减少与捐献者细胞分泌的一种或多种营养因子相一致。实施例9与来自骨髓基质细胞或神经再生细胞的条件培养基共培养后拯救受损的神经细胞为了进一步证明骨髓贴附性基质细胞或神经再生细胞分泌的营养因子能拯救受到缺血性冲击的神经元，将OGD损伤的神经元与来自骨髓贴附性基质细胞或神经再生细胞的条件培养基一起培养。为了制备条件培养基，利用以下培养基之一培养捐献者细胞(η=每种细胞类型5个匹配的捐献者，2-4孔/组)24小时1)新鲜神经元培养基(组成同上)，2)OGD损伤神经元在其中培养了24小时的神经元培养基，或3)对照神经元在其中培养了24小时的神经元培养基。然后，由捐献者细胞培养物收集条件培养基，并加入已进行OGD的培养的神经元或未进行OGD的对照神经元中。24小时后测定LDH释放。结果见图5。在所有情况下，0⑶后24小时，接触条件培养基的受损神经元的细胞损伤显著降低(通过LDH释放测定，与未进行0⑶的对照细胞相比)(ρ<0.05)。在三种类型的捐献者细胞_条件培养基之间没有观察到差异，这表明与捐献者细胞共同培养的这24小时期间，受损神经元释放的任何物质对捐献者细胞_条件培养基拯救受损神经元的能力没有显著影响。此外，骨髓贴附性基质细胞或神经再生细胞的条件培养基的拯救作用没有显著性差异。为了测定这种拯救作用是否具有剂量反应性，在神经元培养基中培养捐献者细胞(η=每种细胞类型5个匹配的捐献者，2-4孔/组)24小时以获得条件培养基。将此种条件培养基以11、1IOU25、150,1100或1200稀释度加入已进行0⑶的神经元或加入对照神经元中，在条件培养基中培养神经元24小时。图6所示结果表明，条件培养基(来自骨髓贴附性基质细胞和神经再生细胞)对受损神经元的拯救具有剂量依赖性。实施例10与经过受损神经细胞预培养的神经再生细胞共同培养后拯救受损的神经细胞为了测定受损的神经环境是否影响捐献者细胞拯救受损神经元的能力，将骨髓贴附性基质细胞(η=1位捐献者)或神经再生细胞(η=3位捐献者)接种于PET插板(见实施例7)上，与经OGD损伤24小时的神经元或未损伤的对照神经元预培养24小时。预培养后，将含有骨髓贴附性基质细胞或神经再生细胞的插板放入含有正好在加入插板之前已进行OGD的神经元或未损伤的对照神经元的孔中。再经过24小时后，测定LDH释放(2_4孔/组)。此实验的结果表明，与受损或未受损神经元预培养的骨髓贴附性基质细胞和神经再生细胞均能拯救OGD-损伤的神经元。MASC和NRC具有基本相同的拯救活性，与对照或OGD-损伤的神经元预培养不影响MASC或NRC的拯救活性。(这可能是由于在本实验中使用未稀释的条件培养基，且拯救作用超出了该实验的鉴别范围。)这些结果表明，捐献者细胞可能对影响一种或多种可扩散营养因子产生和/或分泌的受损神经细胞的某些信号(cue)起反应。实施例11制备原代海马切片按照以下步骤，由9日龄SD大鼠幼崽的脑获得大鼠器官型海马切片(OHS)1)怀孕雌性大鼠(P9)来自马萨诸塞州威尔明顿的查尔斯河实验室(CharlesRiverLaboratories,Wilmington,ΜΑ)。在处死以前，动物饲养在查尔斯河实验室提供的含有足够食物和水的密封纸板箱内。在处理前保持动物的时间小于5小时。2)通过解剖取出幼崽，每次一只。将单个幼崽放入装有干冰(用于产生CO2)的空气密封容器中。3)从容器中取出麻醉的幼崽，迅速浸入玻璃烧杯中盛放的70%乙醇中，然后迅速用剪刀斩首。去除头骨外的所有皮肤。4)将尸体转移到生物安全柜中。从头骨中取出脑并放入冰冷的缓冲液(如PBS)中。5)用弯钳从脑中分离出海马结构，放在组织切片台(麦克韦恩公司(Mcllwain))上，切成400μm切片。6)将切片放在单孔膜插板(密理博公司(Millipore)，见实施例7和8)上，进而放入含有50%汉克斯改良型伊格尔培养基、25%汉克斯平衡盐溶液、25%马血清和青霉素/链霉素；补充有8.5mMHEPES、5.5mM葡萄糖和0.5mMGlutMAX的细胞培养板内。7)将含有OHS的平板储存于35°C的CO2培养箱中。8)培养4-6天后，将OHS用于实验。实施例12与骨髓基质细胞或神经再生细胞共培养后拯救受损的海马切片为了用体内模型研究骨髓贴附性基质细胞和神经再生细胞对受损神经元的营养支持，使用海马脑切片。选择海马区的原因是该结构内含有良好限定的神经元通路以及有足够的文献介绍器官型海马切片的培养。在插板(密理博公司)上培养海马切片(P9大鼠，剥离时400μπι)，其基材为聚对苯二甲酸乙二酯(PET)膜，孔径为0.4μm，允许分子交换，但阻止细胞间接触。将该插板放入含有50%汉克斯改良的伊格尔培养基、25%汉克斯平衡盐溶液、25%马血清和青霉素/链霉素；补充有8.5mMHEPES、5.5mM葡萄糖和0.5mMGlutaMAX的孔中。1天后，将该培养基缓慢更换为补充有2%B-27和1.OmMGlutaMAX的神经基础培养基(“切片培养基”)。培养4-6天后，对切片进行0GD(0%氧气和无葡萄糖的DMEM)90分钟。对照培养物接受切片培养基，并在大气氧气条件(正常氧压)下保持相同时间。OGD后，立即将插板(η=每种细胞类型6个匹配的捐献者，4-6个插板/组)转移至含有(1)切片培养基培养的骨髓贴附性基质细胞(70-100%汇合)，(2)切片培养基培养的神经再生细胞(70-100%汇合)或(3)仅含切片培养基的孔中。24和48小时后定量测定LDH释放。图7所示结果表明，OGD后在捐献者细胞(即骨髓贴附性基质细胞或神经再生细胞)存在下培养24和48小时的切片发生的细胞损伤水平显著低于只用切片培养基培养的切片(P<0.05)。也通过碘化丙锭摄入分析切片内的细胞，以评估切片内的何种细胞发生损伤。实施例13移植骨髓基质细胞或神经再生细胞后拯救受损的海马切片将捐献者细胞(即骨髓贴附性基质细胞或神经再生细胞)直接注射到海马切片中，以检测发生细胞间直接接触时捐献者细胞如何影响宿主组织，也研究损伤环境对捐献者细胞的影响。为便于对捐献者细胞的观察，用包含在CMV启动子转录控制下的编码绿色荧光蛋白(GFP)的序列的慢病毒感染这些细胞。以感染复数(MOI)为3病毒颗粒/细胞进行感染后，约50-60%捐献者细胞(神经再生或骨髓贴附性基质细胞；η=每种细胞类型1个匹配的捐献者)产生荧光，在培养物中观察到至少1个月的稳定荧光。将0.5μ1细胞(浓度约为1，000个细胞/微升)吸移到海马切片表面上，以便将这些GFP阳性捐献者细胞递送至海马切片。移植到正常或损伤(如缺血性)脑切片内后，用共聚焦显微术进行监测，以便比较厚(200-400μπι)切片内GFP阳性捐献者细胞的行为，如存活、增殖、迁移和组织整合。例如，在递送捐献者细胞后的不同时间点(如2小时)通过共聚焦显微术监测切片，以确定捐献者细胞数量、位置(解剖学位置和ζ-维度(z-dimension)位置)和形态。在注射后2天和5天，重复此分析，并与基线水平作比较，以评估存活/增殖、迁移和整合。也利用碘化丙锭掺入来评估宿主和捐献者细胞的活力。后续分析包括固定该组织切片和对增殖、细胞死亡和表型标记物进行染色。比较移植细胞位置以及使宿主神经细胞再生或恢复的位置能提供有关移植细胞介导的营养作用程度的信息。也通过分析移植细胞的数量和位置确定其细胞分裂和易位的程度。评估移植细胞和周围宿主细胞的形态，通过细胞化学和免疫学技术分析移植细胞和周围宿主细胞的分化状态。实施例14与来自骨髓基质细胞或神经再生细胞的条件培养基共培养后拯救受损的海马切片也检测捐献者细胞条件培养基影响受损海马组织切片的程度。在本研究中，通过将新鲜切片培养基加入种板的捐献者细胞(η=每种细胞类型5个匹配的捐献者，5-6孔/组)制备条件培养基。培养24小时后，收集捐献者细胞条件培养基，加入包含具有已进行OGD的海马切片的插板的孔或包含未进行OGD的对照切片的孔中。24小时后测定LDH释放。图8显示捐献者细胞_条件培养基能显著提高受损切片的活力(P<0.05)，骨髓贴附性基质细胞或神经再生细胞的条件培养基的拯救作用无显著性差异。实施例15与经受损海马切片预培养的神经再生细胞产生的条件培养基共同培养后拯救受损神经元为了测定受损神经环境是否影响捐献者细胞拯救受损神经元的能力，将神经再生细胞(η=3位捐献者)接种于6孔板，与OGD损伤的海马切片或未损伤对照切片共同培养48小时(参见实施例12)。进行此预培养后，去除培养基，用神经元培养基125稀释两种类型的神经再生细胞条件培养基，并加入含有神经元的孔中，该神经元在临加入条件培养基之前接受OGD(参见实施例8)。再经过24小时后，测定LDH释放(4孔/组)。图9显示该实验的结果。相对于采用与未损伤对照切片共同培养的神经再生细胞产生的条件培养基培养的受损神经元，采用与受损脑切片共同培养的神经再生细胞产生的条件培养基培养的受损神经元细胞损伤水平显著降低(P<0.05)。这些结果进一步证明，捐献者细胞对影响捐献者细胞产生和/或分泌一种或多种可扩散营养因子的受损神经细胞的某些信号起反应。实施例16骨髓基质细胞和神经再生细胞的营养因子分泌上述数据证明，骨髓基质细胞和基质细胞衍生的神经再生细胞能够通过提供一种或多种营养因子拯救受损的神经细胞。为了开始鉴定所涉及的重要营养因子，定量测定捐献者细胞-条件培养基中具体候选营养因子的蛋白质水平。在补充有10%胎牛血清和青霉素-链霉素的αMEM中培养骨髓基质细胞和神经再生细胞(η=每种细胞类型5个匹配的捐献者)，直至细胞密度约为15，000个细胞/厘米2。然后，用Opti-MEM培养基替换该培养基(约200，000个细胞/毫升)，72小时后收集条件培养基。用Quantibody定制试验(RB公司(RayBiotech，Inc.))定量测定以下10种细胞因子的含量骨形态发生蛋白-7ΦΜΡ-7)、脑衍生的神经营养因子(BDNF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胶质细胞系衍生的神经营养因子(⑶NF)、肝细胞生长因子(HGF)、肝素结合性表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)、神经生长因子(b-NGF)、血小板衍生生长因子(PDGF-BB)、胰岛素样生长因子-I(IGF-I)和血管内皮生长因子(VEG-F)。结果列于表1。发现大量肝细胞生长因子和血管内皮生长因子(即在受测标准品范围内)，骨髓干细胞_或神经再生细胞_条件培养基中的浓度没有显著性差异。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>丨‘0.0"=比最低标准浓度低0.1-0.5实施例17骨髓基质细胞和神经再生细胞的营养因子分泌的进一步分析在补充有10%胎牛血清和青霉素-链霉素的αMEM中培养骨髓基质细胞和神经再生细胞(η=每种细胞类型5个匹配的捐献者)，直至细胞密度约为15，000个细胞/厘米2。然后，用Opti-MEM血清减少的培养基替换该培养基(约200，000个细胞/毫升)，72小时后收集条件培养基。用半定量定制试验(Quantibody试验，佐治亚州诺克洛斯的RB公司(RayBiotech，Inc.，Norcross,GA))确定30种选择的细胞因子中那些可以在捐献者细胞_条件培养基中检测到，并比较不同样品之间细胞因子水平的相对量。使阵列接触来自MASC和NRC的条件培养基(按照本自然段前部所述方法获得)。结果总结在表2中。第一列说明所测定的因子。第二列显示其中特定因子水平是Opti-MEM中该因子水平的1.5倍以上的MASC条件培养基制备物的数量(总数是5)。第三和第四列显示，给定因子在五个样品中的平均水平，表示为与只接触Opti-MEM的阵列相比标准化信号强度的改变倍数(第三列)和标准差(第四列)。与仅Opti-MEM相比改变倍数为1.5倍或更高表明在条件培养基中检测到的这种细胞因子是由于存在捐献者细胞而产生的。第五列显示其中特定因子水平是Opti-MEM中该因子水平的1.5倍以上的NRC条件培养基制备物的数量(总数是5)。第六和第七列显示，给定因子在五个样品中的平均水平，表示为与只接触Opti-MEM的阵列相比标准化信号强度的改变倍数(第六列)和标准差(第七列)。与仅Opti-MEM相比改变倍数为1.5倍或更高表明在条件培养基中检测到的这种细胞因子是由于存在捐献者细胞而产生的。第八列显示使某种具体因子在NRC-条件培养基中的含量高于在MASC-条件培养基中的含量的捐献者数量(总数是5)。第九和第十列分别显示NRC-条件培养基与MASC-条件培养基中每种受测因子的水平之比和标准差。这些结果表明，在来自MASC或NRC的捐献者细胞条件培养基中发现以下10种细胞因子骨形态发生蛋白-4(BMP-4)、Dickkopf-I(Dkk-I)、成纤维细胞生长因子-7(FGF-7)、肝素结合性表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)、白介素_6(IL-6)、白介素-8(IL-8)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-I)、基质金属蛋白酶-1(MMP-I)、血小板衍生生长因子(PDGF-AA)和血管内皮生长因子(VEGF)。与骨髓基质细胞-条件培养基相比，发现这些因子中有四种在神经再生细胞-条件培养基中的水平升高，这四种因子是Dkk-1、IL-6、IL-8和MCP-I。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>粗体超过仅OptlMEM的1.5X，表明在条件培养基中检测到细胞因子是由于存在捐献者细胞实施例18肝素存在下的营养因子分泌已知某些生长因子含有肝素结合域，因此，虽然由捐献者细胞分泌，但因为它们结合细胞上的内源性肝素而可能不溶解于培养基中。为了检测MASC和/或NRC产生的这类因子，将细胞转移到Opti-MEM后向培养物中加入肝素(50yg/ml)，然后每天加入一次肝素，直到收集条件培养基(共3天)。如果捐献者细胞产生和分泌这类肝素结合性生长因子，那么培养基中的外源性肝素将竞争结合，从而增加它们收集到条件培养基中的机会。如实施例17所述测定条件培养基。结果列于表3。第一列说明所测定的因子。第二列说明来自单个MASC样品的条件培养基中给定因子的水平。第三列显示来自同一捐献者(D46)的MASC样品中该因子的水平，其中条件培养基产生过程中存在肝素。第四列显示来自单个NRC样品的条件培养基中给定因子的水平，所述NRC样品与第2和第3列显示的MASC来自同一捐献者。第五列显示来自同一捐献者(D46)的NRC样品中该因子的水平，其中条件培养基产生过程中存在肝素。第六列说明来自单个NRC样品的条件培养基中给定因子的水平，所述NRC样品获自不同捐献者(D47)。第七列显示来自捐献者D47的NRC样品中该因子的水平，其中条件培养基产生过程中存在肝素。第八列显示来自所有三个样品(D46MASC、D46NRC和D47NRC)的含肝素培养物中该因子水平的增加倍数的平均值。结果证明，与不存在肝素时相比，向培养基中加入肝素能提高条件培养基中分泌的三种因子的水平(DKK-I、IL-6和VEGF)。此外，在捐献者细胞-条件培养基中也观察到肝细胞生长因子(HGF)水平升高，而在没有肝素的情况下未检测到(参见实施例16)。最后，在一位捐献者中，也观察到转化生长因子α水平升高(TGF-α，在没有肝素的情况下也未检测到)。这些结果指出，存在捐献者MASC和NRC分泌的肝素结合因子。表3.<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>实施例19=MASC和NRC分泌的营养因子的定量测定如实施例16和17所述，由MASC和NRC收集条件培养基(η=每种细胞类型8个匹配的捐献者)，条件培养基中实施例16-18鉴定的各因子的浓度用Quantibody定制试验(RB公司)测定。表4所示结果确认了之前的发现。除BMP-4和HB-EGF之外，所有检测的细胞因子均存在于骨髓基质细胞和/或神经再生细胞调节的培养基中(在该试验所用标准品的范围内)。也确认了实施例17提供的结果，即与骨髓基质细胞-条件培养基相比，发现这些蛋白中有四种(DKK-I、IL-6、IL-8和MCP-I)在神经再生细胞-条件培养基中的水平升高。无法检测到两种细胞类型中的BMP-4以及无法检测到NRC中的HB-EGF可能是由它们的水平超出此种特定试验标准品的范围所致。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>‘0.0’=比最低标准浓度低0.1-0-0.权利要求一种向损伤的宿主神经组织提供营养支持的方法，其中所述方法包括在所述宿主的神经变性部位或其附近移植骨髓粘附性基质细胞或骨髓衍生的神经再生细胞。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述营养支持促进宿主神经细胞存活。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述营养支持防止宿主神经细胞死亡。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述细胞死亡是通过凋亡进行的。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述营养支持提高宿主神经细胞功能。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述营养支持刺激宿主神经细胞生长。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，刺激神经纤维向外生长。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述神经纤维是轴突。9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述神经纤维是树突。10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，形成新突触。11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述营养支持有利于将宿主干细胞募集到受损组织处。12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述受损神经组织位于中枢神经系统。13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述受损神经组织位于周围神经系统。14.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述受损神经组织与帕金森病相关。15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述骨髓衍生的神经再生细胞是用包含编码Notch胞内结构域(OTCD)的序列的多核苷酸转染的骨髓贴附性基质细胞的后代。16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述NICD由Notch-I蛋白的氨基酸1703-2504构成。17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述骨髓粘附性基质细胞或骨髓衍生的神经再生细胞分泌一种或多种营养因子。18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述骨髓粘附性基质细胞或骨髓衍生的神经再生细胞分泌以下因子中的一种或多种血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、骨形态发生蛋白4、Dkk-Ι、成纤维细胞生长因子_7、结合肝素的表皮生长因子样生长因子、白介素_6、白介素_8、单核细胞趋化蛋白-1、基质金属蛋白酶-1、血小板衍生生长因子AA和转化生长因子α。全文摘要本文公开了使用骨髓贴附性干细胞和其后代，如骨髓衍生的神经再生细胞治疗各种神经变性疾病的方法和组合物。在某些实施方式中，植入神经变性部位的骨髓衍生的神经再生细胞能刺激宿主神经元的生长和/或存活。文档编号A61P25/02GK101801396SQ200880103528公开日2010年8月11日申请日期2008年8月14日优先权日2007年8月15日发明者A·格拉瓦斯基,C·塔特,I·阿兹曼,M·D·博恩,T·维拉格,森敬太申请人:桑比欧公司