用包含带电荷的季氨基的聚合物的核酸载体的修饰的制作方法

专利名称：用包含带电荷的季氨基的聚合物的核酸载体的修饰的制作方法
用包含带电荷的季氨基的聚合物的核酸载体的修饰
技术领域：
本发明涉及修饰优选用于递送治疗性转基因或活性的粒子载体(包括病毒、病毒片段及自组装合成的载体)的生物学和/或物理-化学性质的改良的方法。本发明也涉及已根据本发明修饰造成它们的生物学和/或物理-化学性质修饰或变化的核酸载体、它们的制备方法及它们在各领域(包括医学)中的各生物技术策略中的用途。
背景技术：
微生物，包括病毒，在贯穿生物技术的广领域有许多应用。它们涉及医学、农业、工业生产工艺(显然包括油及酿造工业)及生物除污。已鉴定了许多有用的应用及功能，及开发用于所述生物学试剂。但是，常它们的活性的发展或增强被它们的精细的性质限制，限制它们实现理论上可能的但实际上超过它们的范围的任务的能力。在此情况下，这相当常遇到，将常期望再改造病毒或微生物的性质以赋予其就其所需的目的更适当的性质。由此、生物学杀昆虫剂(例如杆状病毒)的有用性可受不适当的靶特异性及不利的在环境中的存活特征所限；硫代谢细菌可在石油化学工业被不充分的发散及分布模式而有用的应用受限；及在人或兽医学基因治疗中，期望介导治疗性基因的递送的病毒的有用性可被在靶组织中转基因表达的无效受限。体细胞基因治疗领域在近年因为其改善许多不同的类型的疾病的治疗的有效性而受到关注，所述疾病包括遗传疾病(例如囊性纤维化、肌肉营养不良、酶缺陷)及由年龄相关的或损伤相关的生理劣化所致的疾病(癌，心脏病，成年型糖尿病)。但是，尽管该领域快速及广泛发展，包括超过100例临床试验的起始，对患者的清楚的治疗性益处的例子非常少。一项反义技术最近被许可给人使用，但尚无基因治疗策略仍满足它们的原许诺，及在可预见的将来在常规临床应用中无可能获得批准。相关的技术领域已知为‘病毒治疗’，其中裂解病毒(其可或不可加工为载荷治疗性基因)能在癌细胞之内选择性地复制，导致肿瘤之内的病毒扩增，肿瘤细胞的裂解及感染扩展到裂解复制循环重复的相邻肿瘤细胞中。缺失治疗性功效的原因部分反映患者群(被募集参加这些实验治疗的多数患者已患病颇重，从而甚至有效治疗可显示少的治疗性益处)，但主要反映达到的治疗性基因表达的不充分的水平、持续时间及分布。简言之，复杂的治疗策略的成功的应用被不充分的用于基因递送及表达的载体限制。迄今探究的用于基因治疗应用的2种主要类型的载体是非-病毒(通常基于阳离子脂质体)载体及病毒(通常反转录病毒、腺病毒、后来是腺伴随病毒(aav)及慢病毒) 载体。开发用于病毒治疗的裂解病毒包括腺病毒(全部血清型)、疱疹病毒、披膜病毒(有名的是α病毒例如辛德毕斯及西门利克森林病毒)、心脏病毒(有名的是义！^⑽ Valley病毒)、痘苗病毒、肺泡口炎病毒、新城疫病毒、麻疹病毒及呼肠孤病毒。病毒是作为用于基因递送的载体的明显的选择，由于这基本上是它们在自然中的唯一功能。随后病毒至今在基因治疗中显著使用，形成大部分载体用于临床研究。腺病毒的限制它们的成功的应用的主要特征是它们的免疫原性。尽管它们是专业病原体，进化了百万年成为高度有效基因递送载体，它们的宿主类似地发展了非常有效的保护机理。来自癌患者的血清及腹水流体含甚至以高稀释度可完全阻止病毒体外感染的抗体。涉及腺病毒的典型的人流程导致显著的炎症应答、以及无效的靶细胞感染。尽管非-病毒系统具有得多更佳安全性记录，及更容易大量产生，它们具有低特异性转染活性。靶组织中的基因表达效率也是与非-病毒系统相关的主要问题。对于目前可用的用于治疗疾病的载体的成功的应用的另一主要限制是通过直接应用或通过动脉内施用直接将它们施用到疾病位点的需求。尚无载体能在静脉内注射后靶向特异性细胞。阳离子脂质系统阻塞它们遇到的第一毛细管床、肺部床、而腺病毒/反转录病毒被肝脏快速摄取及(在动物研究中)介导局部毒性。尽管局部施用对于治疗某些疾病 (例如器官上皮囊性纤维化)可行，其他疾病具有更广泛的分布(有名的是临床癌及动脉粥样硬化)，且静脉内靶向的基因递送对于成功的基因治疗的可能性是关键性的。已经开发基因递送载体(例如基于DNA的聚电解质复合物或聚合物-修饰的病毒)来克服这些问题。描述于WO 98/44143的一种用于辅助病毒的临床应用的方法用有单官能基的聚合物(例如带有末端胺-反应性基团的聚(乙二醇)(PEG))修饰病毒表面。此可导致被血清抗体感染的降低的中和。此方法(经对于5型腺病毒的CAR受体)保持关于靶细胞的正常受体-结合及感染，但呈现不介导正常感染性的消失(以去除非-靶细胞的不想要的感染)，也不辅助病毒再-靶向选定的受体的问题，以获得有用的及治疗性地-相关的向性。WO 00/74722描述通过用具有多个反应性基团的多价聚合物包被提供来修饰生物学元件(例如病毒)的生物学和/或物理化学性质的方法。此方法可致使一些生物学元件在宿主生物学系统中靶向或再-靶向到特定位点及可与用于基因治疗或抗肿瘤治疗的病毒载体联用。但是，这些既有的方法不能够完全包被核酸载体，它们也不能够选择性地包被那些最易被抗体识别的载体的区。意外地发现，当采用包括带正电的季氨基的反应性聚合物时，核酸载体被更快速且有效包被。而且，意外地发现，当用本发明包被时，可掩盖某些核酸载体区，其将经历被抗体识别。所述区一般带负电或是在核酸载体表面的酸区。发明概述本发明因此提供聚合物修饰的核酸载体，其中核酸载体共价连接于聚合物，该聚合物包括一个或多个带正电的季氨基。也提供修饰核酸载体的生物学和/或物理化学性质的方法，所述方法包括使所述核酸载体与聚合物反应，该聚合物包括一个或多个带正电的季氨基及一个或多个反应性基团，从而将核酸载体通过一个或多个共价连键连接到聚合物，以获得聚合物修饰的核酸载体。也提供可通过本发明的方法获得的聚合物修饰的核酸载体。也提供组合物，其包括本发明的聚合物修饰的核酸载体及适宜稀释剂或载质。也提供基因治疗方法(包括遗传疫苗接种)，该方法包括给需要所述治疗的患者施用有治疗活性的、非毒性量的本发明的聚合物修饰的核酸载体或本发明的组合物，该聚合物修饰的核酸载体包括治疗性遗传物质。也提供本发明的聚合物修饰的核酸载体在制备用于疫苗接种或基因治疗的药物中的用途，其中所述聚合物修饰的核酸载体包括治疗性遗传物质。发明详述如本文所用，术语"核酸载体"指包括核酸的媒质。一般而言，核酸载体包括治疗性遗传物质。需知，本文中使用术语"治疗性遗传物质"来广义表示施用以获得治疗效果的任何遗传物质或核酸，例如通过治疗性地有用的蛋白或RNA的表达。需知，在本发明的聚合物修饰的核酸载体中，通常不存在未反应的反应性基团。但是，可有其中一些未反应的反应性基团保留在聚合物修饰的核酸载体中的情况，从而可导入生物学活性剂，例如。在那些情况中，因此，聚合物修饰的核酸载体还包括一个或多个反应性基团。一般而言、聚合物与核酸载体的连接及后者的修饰导致核酸载体在宿主生物学系统中与会与其正常相互作用的其他分子相互作用的能力的抑制，或导致核酸载体与会与其正常结合的位点或受体结合的能力的抑制。核酸载体的某些期望相互作用，当然，将保留。 聚合物与核酸载体的连接一般导致抑制与分子(例如将正常中和核酸载体的血清抗体)相互作用的核酸载体的能力。一般而言、核酸载体是选自下列的微生物病毒、细菌、噬菌体、真菌、孢子、真核细胞核或含遗传信息的其他微生物片段或成分。优选病毒及病毒粒子。更优选地，核酸载体是含治疗性遗传物质的病毒载体或有固有的治疗性活性的病毒。原理上，任何已知的病毒可在本发明中使用作为核酸载体。病毒优选重组遗传加工的病毒。重组病毒任选含转基因。需知，本文中使用术语"转基因" 来表示对于病毒不是天然的核酸。例如、转基因可编码生物学有功能的蛋白或肽、反义分子或标记物分子。病毒是RNA或DNA病毒，及可选来自以下科及组之一腺病毒科；苜蓿花叶病毒属；雀麦花叶病毒科；α隐病毒属；分病毒科；杆状病毒科；杆状DNA病毒属；β隐病毒属；分病毒科；二联病毒属；双粒病毒科；双RNA病毒科；雀麦草花叶病毒；雀麦草花叶病毒科；大麦黄化花叶病毒属；马铃薯Y病毒科；布尼亚病毒科；嵌杯病毒科；毛状病毒组；石竹隐潜病毒组；麝香石竹斑驳病毒属病毒组；花椰菜花叶病毒组；线形病毒组；鸭跖草黄斑驳病毒组；豇豆花叶病毒组；冠状病毒科；ΡΜ2噬菌体组；环状构象病毒科；潜隐病毒组；隐病毒组；黄瓜花叶病毒属病毒CD6噬菌体组；囊病毒科；质型弹状病毒属；弹状病毒科；康乃馨环斑病组；石竹病毒病毒组；蚕豆萎蔫病毒组；碗豆耳突花叶病毒；豆病毒属病毒组；斐济病毒呼肠病毒科；纤丝病毒科；黄病毒科；真菌传棒状病毒组；双粒病毒组； 贾第虫病毒组；嗜肝DNA病毒科；疱疹病毒科；大麦病毒组；Hybrigeminiviruses ；双粒病毒科；悬钩子病毒属；等轴不稳定环斑病毒组；丝杆病毒科；甘薯轻型斑驳病毒属；马铃薯 Y病毒科；虹膜病毒科；轻病毒科；脂毛病毒科；黄矮病毒组；玉米褪绿斑驳病毒属；橙桑花叶病毒属；玉米雷亚多非纳病毒组；玉米褪绿矮缩病毒组；微病毒科；Monogeminiviruses ； 双粒病毒科；肌病毒科；Nanaviruses ；坏死病毒组；蠕传多角体病毒组；野田村病毒科；核型弹状病毒属；弹状病毒科；正粘病毒科；水稻矮缩病毒呼肠病毒科；Ourmia甜瓜病毒属；乳多空病毒科；副粘病毒科；欧防风黄点病毒组；分病毒科；包括腺伴随病毒的细小病毒科；豌豆耳突花叶病毒组；藻DNA病毒科；植物呼肠病毒属呼肠病毒科；小RNA病毒科；Plasmarviridae ；短尾病毒科；多DNA病毒科；马铃薯X病毒组；马铃薯Y病毒属；痘病毒科；呼肠病毒科；逆转录病毒科；弹状病毒科；根前毛菌噬菌体组；黑麦草花叶病毒属马铃薯Y病毒科；卫星RNA;卫星病毒属Jequi病毒属fequi病毒科；南方菜豆花叶病毒组；管状病毒科；南方菜豆花叶病毒组；SSVI-型噬菌体；覆盖层病毒科；纤细病毒属； Tetravirirdae ；烟草花叶病毒组；烟草脆裂病毒组；披膜病毒科；蕃茄丛矮病毒属；蕃茄斑萎病毒属；布尼亚病毒科；环曲病毒组；全病毒科；芜箐花叶病毒属；芜箐花叶病毒组；植物病毒卫星；伞形植物病毒属；未指定的马铃薯Y病毒；马铃薯Y病毒科；未指定的棒状病毒；弹状病毒科；巨脉病毒属；矮化病毒属Aequi病毒科；未分组的病毒。一般而言，核酸载体是在宿主中与特定位点或受体正常相互作用的病毒，其中所述带有带正电的季氨基的单价或多价反应性聚合物掩盖病毒的正常受体-结合活性和/或能使其在宿主中重新靶向新的或不同的位点或受体。核酸载体可为反转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、杆状病毒、疱疹病毒、乳多泡病毒或痘病毒。对于一些应用而言，核酸载体可为基于腺病毒、疱疹病毒、痘苗病毒或α病毒的重组病毒。优选地、核酸载体是基于腺病毒、疱疹病毒、细小病毒、痘病毒、披膜病毒、轮状病毒或小核糖核酸病毒的病毒。腺病毒是尤其优选的。腺病毒包括非-人腺病毒例如禽类腺病毒CEL0。在核酸载体是具有外部包膜的病毒的一些情况中，将其与聚合物反应之前的初步步骤可包括剥离包膜。适宜于用作核酸载体的核酸载体成分可由例如、病毒核心或原病毒(来自例如痘病毒)提供。病毒核心之一例是可通过公开于Russell，W. C.，Μ.，K.，Skehel, J.J. (1972). “ The preparation and propertiesof adenovirus cores" Journal of General Virology 11，35-46的方法及其修饰制备的腺病毒核心。一般而言，核酸载体是病毒或病毒核心。本发明实施中使用的细菌核酸载体可包括，例如实验基因治疗中使用的细菌(例如沙门氏菌属)、用作生物学杀虫剂的细菌或杆状病毒(杀虫剂农药)(例如核 polydedrosis病毒NPD、非封闭病毒NV、颗粒体病毒或苏云金芽孢杆菌)、作为降解油污泥 /泄漏有用的细菌株或其遗传修饰形式(例如肠杆菌科、硝酸盐阴性、假单胞菌属、微球菌属、丛毛平胞菌属、黄单胞菌属、无色杆菌属或Vidrio-气胆胞菌)、负责在油中将硫还原成 H2S的细菌株(例如petrotoga snobilis、petrotoga miotherma、致黑脱硫肠状菌、脱硫弧菌属)或能氧化来自油的硫的细菌株(例如红球菌属株ECRD-1)。适宜于用作核酸载体的细菌的其他实施例选自下列之一日本甲虫立克次小体、 日本甲虫芽胞杆菌、苏云金杆菌(包括其亚种，以色列亚种、库斯塔克亚种及球形杆菌)、乳病芽胞杆菌、球形杆菌、坏死梭菌、铜绿假单胞菌及嗜线虫致病杆菌。适宜于用作核酸载体的噬菌体是例如来自以下科之一藻病毒，人字形噬菌体，丝杆病毒属，轻病毒科，长尾病毒科，微病毒科，短杆病毒属，原生病毒科，Corticoviridae，卫星噬菌体、肌病毒科，短尾病毒科，T-偶噬菌体。特定噬菌体之一例是MV-L3，PI, P2，P22，P29, SPOI，T4, T7, MV-L2, PM2, Fl, MV-L51, oul74，06，MS2, M13, Qp，覆盖层病毒科(例如 PRD1)。适宜于用作核酸载体的真菌是例如来自下列家族之一担子菌纲(其产生担孢子，其包括下列类，例如腹菌纲、层菌纲、锈菌纲、黑粉菌纲)、白僵菌属、绿僵菌属、虫霉属或雕蚀菌属。适宜于用作核酸载体的孢子是担孢子、放线菌属、节杆菌属、细杆菌属、梭菌属、 红球菌属、高温单孢菌属或烟曲霉菌。适宜于用作核酸载体的细菌的其他实施例是选自下列之一日本甲虫立克次小体、日本甲虫芽胞杆菌、苏云金杆菌(包括其亚种，以色列亚种、库斯塔克亚种及球形杆菌)、乳病芽胞杆菌、球形杆菌、坏死梭菌、铜绿假单胞菌及嗜线虫致病杆菌。在一实施方式中，核酸载体通过核酸与带正电的聚合物和/或脂质之间的自装配形成。术语核酸包括合成的分子，例如siRNA、反义RNA及反义DNA。通常、核酸是mRNA或 DNA。在此实施方式中，由此形成的聚电解质载体通常带有静阴性表面带电性。由此，核酸及带正电的脂质或聚合物的带电性比(+/_) —般小于1. 0。优选0. 8 0. 9的带电性比。一般而言，存在于本发明的聚合物修饰的核酸载体的聚合物是多价聚合物。—般而言，通过2或多个连键将聚合物连接到核酸载体，使用的聚合物是多价聚合物，即其包括多个反应性基团。聚合物和核酸载体之间的连键的数优选3或多个、更优选 4或多个。连键的数可为例如12或14个。具有更高的数连接的优势是聚合物修饰的核酸载体更稳定。聚合物主链优选基于如下单体单元N-2-羟基丙基甲基丙烯酰胺(HPMA)、 N-(2-羟基乙基)-1-谷氨酰胺(HEG)、乙二醇-寡肽或是聚唾液酸或聚甘露糖聚合物。优选HPMA。其中主链基于乙二醇-寡肽，寡肽基优选包括1 4肽基。一般情况下，本发明中使用的聚合物使用活基多聚化方法(例如如ScaleS，C. W.； Vasilieva, Y. A. ；Convertine, A. J. ；Lowe, Α. B. ；McCormick, C. L. Biomacromolecules 2005,6,1846-1850 ；Yanjarappa, Μ. J. ；Gujraty, K. V. ；Joshi, Α. ；Saraph, Α. ；Kane, R.S. Biomacromolecules 2006,7,1665-1670 ；Convertine, A. J. ；Ayres, N. ；Scales, C. W.； Lowe, Α. B. ；McCormick, C. L. Biomacromolecules2004, 5，1177-1180 中所述的 ATRP (原子转移自由基多聚化)或RAFT(可逆添加-片段化链转移)，其通过引用整体并入本文)制备。相关教导也可见于 iMacromolecular design via reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT)/xanthates(MADIX) polymerization.，Perrier, Sebastien ；Takolpuckdee, Pittaya. J. Polym. Sci.，Part A Polym. Chem. (2005)，43 (22)，5347-5393，其通过引用并入本文。一般而言、聚合物和/或其与核酸载体之间的连键可水解或酶解。可期望由水解性降解性提供的不稳定性，由于其允许调节核酸载体被保护的时间。由此，如果聚合物用组织-特异性靶向基团(即本文定义的生物学活性剂)提供，可将聚合物(或聚合物和核酸载体之间的连键)设计为，只要其在崩解、游离核酸载体而与组织相互作用之前使修饰的核酸载体达到靶组织之内的适当的位置，聚合物保护核酸载体。或者，聚合物可设计为以产生核酸载体的释放的最佳动力学的速度崩解。可期望由酶促可降解性提供的不稳定性，由于其允许设计聚合物(或聚合物和核酸载体之间的连键)用于通过选择的酶选择性地切割。所述酶可存在于靶位点，赋予修饰的核酸载体在靶位点激发的解离的可能性，由此释放核酸载体而与靶组织相互作用。酶也可为可造成修饰的核酸载体在靶细胞的选定的细胞分区中的解离的细胞内酶，以增强核酸载体的活性。或者，酶-切割位点可设计为促进修饰的核酸载体响应适当的生物学活性解离(例如到达表达金属硫蛋白酶的侵袭或转移性肿瘤细胞)。在其他变化中，可在适当的时间或位点施用能活化修饰的核酸载体的酶，以介导修饰的核酸载体的所需的解离及随后核酸载体与组织的相互作用。在至少一些实施方式中，用于修饰核酸载体的聚合物优选交联，以至于形成水凝胶。水凝胶优选水解性地不稳定或可通过酶(例如基质金属硫蛋白酶2或9)降解。这是以便核酸载体固定在水凝胶之内及从而可调节核酸载体的释放。由此，根据本发明的优选的特征，本发明的方法在可能促进交联及水凝胶形成的条件下(例如高浓度的试剂，无过量存在)或在试剂(例如可能促进交联的二胺)的存在下实施。含修饰的核酸载体的水凝胶的形成将通常使用描述于 Subr, V.，Duncan, R. and Kopeck, J. (1990) “ Release of macromolecules and daunomycin from hydrophilic gels containing enzymatically degradable bonds"，J. Biomater. Sci. Polymer Edn.，1 (4)61—278 的化学方法进对亍。本发明中使用的聚合物一般在聚合物主链或在侧链，优选在侧链包括一个或多个带正电的季氨基。一般而言、一个或多个带正电的季氨基各自直接或经间隔物基团连接于聚合物主链。一般而言，间隔物基团如本文定义。在一实施方式中，所述间隔物基团是本文定义的基团L。聚合物中带正电的季氨基的数优选例如以基于聚合物的总重量提供0.25 IOmol %、更优选0. 5 7. 5mol%及最优选1. 5 5mol %的带正电的季氨基。通常，带正电的季氨基在聚合物之内随机间隔。当聚合物是单价聚合物，即具有仅1个反应性基团时，带正电的季氨基优选定位接近于反应性基团。一般而言，连接于聚合物主链的带正电的季氨基选自本文定义的式la、lb、Ic、Id 及Ie的带正电的季氨基。优选式Ia的带正电的季氨基。通常，各带正电的季氨基均经一个或多个可降解的或可生物降解的连键、优选1 个可降解的或可生物降解的连键连接到聚合物。这些连接可为带正电的季氨基和聚合物主链之间的直接键或，或者，所述间隔物基团内的键。一般而言，所述连接指可还原的、可水解的或别样地可切割的键。所述键的实施例包括二硫键、酰胼键、缩醛部分或可酶学地切割的键。二硫键、-S-S- 一般使用弱的还原条件(例如金属亚硫酸盐)或使用适宜地选择的酶(例如硫氧还蛋白)切割。一般而言，选择切割条件以便载体活力不受影响。酰胼键-N-N- —般使用弱的氧化性或还原性条件切割。而且，一般选择切割条件以便载体活力不受影响。缩醛部分为本领于技术人员熟知及容易使用含水酸切割。酶学地可切割的键一般如本文中关于反应性基团和聚合物主链之间的连键讨论。在一些实施方式中，将核酸载体及带正电的季氨基经可降解的键连接到聚合物。 在此实施方式中，核酸载体和聚合物之间的键及带正电的季氨基和聚合物之间的键可在相同的条件下切割。但是，优选核酸载体和聚合物之间的键及带正电的季氨基和聚合物之间的键不在相同的条件下切割。由此，可切割带正电的季氨基和聚合物之间的键而保持核酸载体和聚合物主链之间的键完整。以此方式，可从聚合物修饰的核酸载体除去带正电的季氨基，保留附接到核酸载体的聚合物。发现正常感染核酸载体(例如根据本发明修饰的病毒)丧失它们的原感染性。感染性可通过将生物学活性剂偶联于聚合物来恢复或取代。生物学活性剂是可选在其与核酸载体结合前或后偶联于聚合物。优选地，在靶向试剂(即生物学活性剂)具有多个反应性基团的情况中，其在聚合物包被核酸载体后偶联于聚合物，以避免其干扰偶联反应，但在其他情况中，在包被核酸载体之前将其连接到聚合物即可。一般而言，生物学活性剂偶联于或包括于聚合物。生物学活性剂可使用与用于连接反应性聚合物和核酸载体的相同类型的反应性基团合并入，或其可使用不同的化学偶联。在后者，将使用异源多官能反应性聚合物(例如含混合的ONp酯及硫醇基)。优选根据本发明合并所述生物学活性剂以改善靶向、组织渗透、药代动力学或免疫刺激或悬浮。生物学活性剂可为例如，生长因子或细胞因子、糖、激素、脂质、磷脂、脂肪、 载脂蛋白、细胞粘接促进剂、酶、毒素、肽、糖蛋白、血清蛋白质、维生素、矿物、佐剂分子、核酸、免疫调节元件或识别受体的抗体，例如生长因子受体或识别组织-特异性抗原或肿瘤-相关的抗原。试剂可为Sialyl Lewis X，其可用于靶内皮组织。抗体优选用作的生物学活性剂，以使修饰的核酸载体再-靶向不同的靶位点，其可包括例如，各受体、不同的细胞、细胞外环境及其他蛋白。可使用广范围的不同的形式的抗体，包括单克隆抗体、多克隆抗体、二体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体、camalid 抗体、Fab片段、Fc片段及Fv分子。对于用于靶向肿瘤而言，适宜生物学活性剂为例如抗体识别癌相关的抗原例如癌胚胎抗原或α -甲胎蛋白、腱糖蛋白、HER-2原癌基因、前列腺特异性抗原或MUC-I或识别与肿瘤-相关的内皮细胞相关的抗原(例如血管内皮生长因子(VEGF)、Tiel、Tie2、P-选择素、E-选择素的受体或前列腺-特异性膜抗原(PSMA))的抗体。用作发挥允许应用的柔性的一般的接头的作用的生物学活性剂的适宜多目的蛋白是蛋白G(此将结合抗体，允许用来自多数物种的任何IgG类抗体表面修饰)，蛋白A(其具有类似于蛋白G的性质)，亲和素(其以允许任何生物素标记的元件掺到表面的非常高的亲和性结合生物素)，链霉亲和素(其具有类似于亲和素的性质)，外亲和素(extravidin) (其具有类似于亲和素的性质)，金环蛇毒素-结合肽(其结合金环蛇毒素融合蛋白)，麦胚凝集素(其结合糖)，六组氨酸(其允许在镍螯合柱上温和纯化)，GST (其允许通过亲和层析温和纯化)。用作生物学活性剂的适宜生长因子或细胞因子是例如脑来源的神经营养因子、纤毛神经营养因子、b-内皮生长因子、表皮生长因子(EGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、粒细胞集落-刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落-刺激因子、生长激素释放激素、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子-I、胰岛素样生长因子-II、白细胞介素_la、白细胞介素-lb、白细胞介素2、白细胞介素3、白细胞介素4、白细胞介素5、白细胞介素6、白细胞介素7、白细胞介素8、白细胞介素9、白细胞介素10、白细胞介素11、白细胞介素12、白细胞介素13、角质形成细胞生长因子、瘦素、肝脏细胞生长因子、巨噬细胞集落刺激因子、巨噬细胞炎症蛋白la、巨噬细胞炎症蛋白lb、单核细胞趋化蛋白1，2_甲氧基雌二醇、b-神经生长因子、2. 5s神经生长因子、7s神经生长因子、神经营养因子-3、神经营养因子-4、血小板来源的生长因子AA、血小板来源的生长因子AB、血小板来源的生长因子BB、性激素结合球蛋白、干细胞因子、转化生长因子-β 1、转化生长因子-β 3、 肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子β、血管内皮生长因子及血管内皮生长因子C。用作用于掺入的生物学活性剂的适宜糖是单糖、二糖或多糖，包括分支的多糖，例如、D-半乳糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、L-岩藻糖及乳糖。糖一般通过氨基衍生化掺入。适宜于用作生物学活性剂的激素是例如，肾上腺髓质素、促肾上腺皮质激素、绒毛膜促性腺激素、皮质酮、雌二醇、雌三醇、促卵泡激素、促胃液素1、高血糖素、促性腺激素、生长激素、氢化可的松、胰岛素、瘦素、黑色素细胞刺激激素、褪黑激素、缩宫素、甲状旁腺素、 催乳素、孕酮、胰泌素、促血小板生成素、促甲状腺素、甲状腺刺激激素及加压素。用作用于靶向聚合物修饰的核酸载体或用于提供立体保护的生物学活性剂的适宜脂质、脂肪或磷脂是例如，胆留醇、甘油、糖脂、长链脂肪酸，尤其不饱和的脂肪酸，例如油酸、血小板活化因子、鞘磷脂、磷脂酰胆碱或磷脂酰丝氨酸。用作生物学活性剂的适宜细胞粘接促进剂可由以下提供，例如，纤连蛋白、层粘连蛋白、凝血酶敏感蛋白、玻连蛋白、聚阳离子、整联蛋白或由寡肽序列结合整联蛋白或四跨距跨膜蛋白提供。用作也可提供立体保护的生物学活性剂的适宜载脂蛋白是例如，高-密度脂蛋白或低-密度脂蛋白或其成分。用作生物学活性剂的为促进修饰的核酸载体通过特定环境的迁移率的适宜酶是例如，能降解细胞外基质的酶(例如明胶酶、例如1 11型基质金属蛋白酶、或透明质酸酶)、能降解核酸的酶(例如脱氧核糖核酸酶I、脱氧核糖核酸酶II、核酸酶、核糖核酸酶 Α)、能降解蛋白的酶(例如羧肽酶、纤溶酶、组织蛋白酶、内蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K、凝血酶、胰蛋白酶、组织类型纤溶酶原活化物或尿激酶类型纤溶酶原活化物)、酶辅助检测 (例如荧光素酶、过氧化物酶、b-半乳糖苷酶)或其他有用的酶，例如淀粉酶，内切糖苷酶， 内_b-半乳糖苷酶，半乳糖苷酶，肝素酶，HIV反转录酶，b-羟基丁酸脱氢酶，胰岛素受体激酶，溶菌酶，神经氨酸酶，氧化氮合酶，蛋白二硫化物异构酶。用作生物学活性剂来结合受体或来与细胞膜相互作用的适宜毒素是例如，霍乱毒素B亚基，响尾蛇毒素B亚基，树眼睛蛇毒素，蓖麻毒素B链。用作生物学活性剂的适宜肽可由以下提供，例如，转铁蛋白、绿/蓝/黄色荧光蛋白、肾上腺髓质素、淀粉样肽、血管紧张素I、血管紧张素II、Arg-Gly-Asp、房肽素、内皮缩血管肽、纤维蛋白肽A、纤维蛋白肽B、加兰肽、促胃液素、谷胱甘肽、层粘连蛋白、神经肽、 Asn-Gly-Arg、含整联蛋白结合基序的肽、使用噬菌体库鉴定的靶向肽、含核定位序列的肽及含线粒体归巢序列的肽。用作生物学活性剂的适宜血清蛋白质是例如，白蛋白、补体蛋白、转铁蛋白、纤维蛋白原或纤溶酶原。用作生物学活性剂的适宜维生素或矿物是例如，维生素B 12、维生素B 16或叶
一般而言，核酸载体的修饰具有在生物学宿主中将核酸载体再靶向不同的受体的效应。由此观察到，根据本发明的聚合物修饰的核酸载体可合成，以使靶向高度特异性组的细胞，例如肿瘤细胞。但是，同时发现，根据本发明的聚合物修饰的核酸载体通常不被中和抗体致使失活。此被认为是因为修饰的核酸载体被聚合物罩住。核酸载体被聚合物罩住已发现具有其他潜在优点，包括增加的架存期及更佳抗性低PH。而且，可能使用相比对于既有的未修饰的核酸载体可行的技术更攻击性的技术纯化所述核酸载体。任选聚合物可偶联于放射性同位素，以便允许例如在生物学环境中检测核酸载体。在一实施方式中，核酸载体的修饰具有修饰非含水环境中核酸载体的溶解度及分散性及稳定性特征的效应。在此实施方式中，核酸载体通常是具有油降解活性的微生物。 优选地，核酸载体是杆状病毒粒子。在此实施方式中，聚合物一般掺入油烯基或其他疏水基团。待包被的病毒粒子正常必需经高度纯化及无污染蛋白或肽。包被反应正常在 7. 4 8. 4的pH范围之内进行，优选在7. 8 8. 0进行。任何适宜缓冲液可用于实现期望的 PH，除了可与聚合物反应缓冲液(例如基于Tris的缓冲液)之外。反应可在生理盐(150mM NaCl)浓度及可用于稳定病毒制剂的其他稳定剂(例如Mg2+或Ca2+)的存在下发生。反应处理期间不建议使用叠氮化钠或其他防腐剂。于室温1小时后聚合物包被反应达到饱和， 但在更低温度可需要更长持续时间。对于再靶向或额外的官能性而言，可能在如前所述的包被反应期间添加额外的生物学试剂(例如抗体、配体或肽)，见例如Fisher KD, Stallwood Y, Green NK5Ulbrich K, Mautner V, Seymour Lff. Polymer-coated adenovirus permits efficient retargeting and evades neutralising antibodies. Gene Ther. Mar 2001 ；8(5) :341-348,期通过引用并入本文。另外，包被可用聚合物前-缀合物到靶向元件进行，见例如Stevenson M, Hale AB, Hale SJ, Green NK, Black G, Fisher KD, Ulbrich K, Fabra A, Seymour Lff. Incorporation of a laminin-derived peptide (SIKVAV) on polymer-modified adenovirus permits tumor-specific targeting via alpha6-integrins. Cancer Gene Ther. Apr2007 ；14(4) :335_345，其通过引用并入本文。需知，本文中使用术语"反应性基团"表示显示显著的化学反应性(尤其有关与其他分子的互补反应性基团(一般与核酸载体表面上的基团)偶联或连接反应)的基团。一般而言、反应性基团是能与存在于核酸载体表面的基团形成共价键的基团，例如与胺基团、硫醇、羟基、醛、酮、酪氨酸残基、羧酸或糖基团。所述存在于核酸载体表面的基团可通过遗传加工导入，例如，通过加工腺病毒来含在纤维分子中带有游离的硫醇的半胱氨酸残基。但是，通常所述存在于核酸载体表面的基团是天然存在的基团。在一实施方式中，反应性基团能与核酸载体表面的胺基团形成共价键。在此实施方式中适宜类型的反应性基团的实施例包括酰氯、酰基-噻唑烷-2-硫酮、马来酰亚胺、 N-羟基-琥珀酰亚胺酯(NHS酯)硫-N-羟基-琥珀酰亚胺酯(硫-NHS酯)、4_硝基苯酚酯、环氧化物、2-亚氨基-2-甲氧基乙基-1-硫代糖苷、氰尿酰氯、咪唑基甲酸酯、琥珀酰亚胺基琥珀酸酯、琥珀酰亚胺基戊二酸酯、酰叠氮、酰腈、二氯三嗪、2，4，5_三氯苯酚、二氢恶唑酮及氯仿。这样的基团容易与胺反应。优选酰基-噻唑烷-2-硫酮及硫-NHS酯。优选酰基-噻唑烷-2-硫酮，由于它们在水溶液中的高反应性及相对稳定性。在另一实施方式中，反应性基团能与核酸载体表面的硫醇基形成共价键。在此实施方式中适宜类型的反应性基团的实施例包括烷基卤、卤代乙酰胺及马来酰亚胺。在另一实施方式中，反应性基团能与核酸载体表面的羟基形成共价键。在此实施方式中适宜类型的反应性基团的实施例包括氯仿及酰卤。或者，核酸载体表面的羟基可用氧化剂(例如高碘酸盐)氧化，然后是与包括胼、羟胺或胺的反应性基团反应。在另一实施方式中，反应性基团能与核酸载体表面的酪氨酸残基形成共价键。在此实施方式中适宜类型的反应性基团的实施例包括磺酰氯及碘乙酰胺。在另一实施方式中、反应性基团能与核酸载体表面的醛或酮基形成共价键。在此实施方式中，适宜类型的反应性基团的实施例包括酰胼、氨基脲、脂肪族伯胺、芳族胺及碳酰胼。在另一实施方式中，反应性基团能与核酸载体表面的羧酸形成共价键。此可如下实现，例如，使用水溶性碳二亚胺(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)活化羧酸，然后是与胺作为反应性基团反应。在另一实施方式中，反应性基团能与核酸载体表面的糖反应形成共价键。此可如下实现，例如，用半乳糖氧化酶的糖的酶-介导的氧化以形成醛，然后是与醛反应性化合物 (例如酰胼)作为反应性基团反应。聚合物上反应性基团的数优选例如为提供基于聚合物总重量的0. 5 IOmol %、 更优选1 6mol%及最优选2 5mol%的反应性基团。一般而言，聚合物是生物学惰性聚合物。聚合物主链通常经所述反应性基团取代。通常，聚合物是具有经一个或多个反应性基团取代的主链的生物学惰性聚合物。这些反应性基团可直接或经间隔物基团连接于聚合物主链。间隔物基团的实施例包括寡肽连接。所述寡肽连接优选包括1 4个肽基、尤其2或4个。适宜连键的实施例包括-Gly-Gly-，-Glu-Lys-Glu-；及-Gly-Phe-Leu-Gly-。在乙二醇-寡肽聚合物的情况中， 其是经反应性基团，任选经如上定义的间隔物基团取代的寡肽基。在一些实施方式中，所述间隔物是本文定义的基团L。本发明中使用的聚合物优选含一个或多个所述反应性基团的合成的亲水聚合物。更优选地，本发明中使用的聚合物优选含多个所述反应性基团的合成的亲水多价聚合物。用于本发明的适宜聚合物的实施例公开于WO 98/19710及包括 polyHPMA-GlyPheLeuGly-ONp, poIyHPMA GlyPheLeuGly-NHS, poIyHPMA-Gly-Gly-ONp、 polyHPMA-Gly-Gly-NHS,聚(pEG-寡肽(_0Νρ))、聚(pEG-GluLysGlu (ONp) )、pHEG-ONp、 pHEG-NHS。这些化合物的制备公开于WO 98/19710。WO 98/19710全文通过引用并入本文。在本发明的方法的一实施方式中，各带正电的季氨基均经一个或多个可降解的或可生物降解的连键、一般通过含可还原的或可水解的键的接头连接于聚合物主链，及所述方法包括切割所述带正电的季氨基和聚合物主链之间的可降解的或可生物降解的连键的额外的步骤。
一般而言，在本发明的聚合物修饰的核酸载体中，聚合物掩盖将经历被可中和聚合物修饰的核酸载体的活性的抗体识别的核酸载体区。一般而言，所述区带负电的或是核酸载体表面的酸区。当核酸载体是腺病毒时，所述带负电的区一般是腺病毒六位体蛋白的带负电的区，例如，基序147-162 (EDEEEEDEDEEEEEEE)。所述区一般不向聚合物上的反应性基团反应， 及通常排斥稍微带负电的聚合物，例如基于HPMA的聚合物。由此，在聚合物中掺入带正电的季氨基将聚合物与这些区静电性地相联，及最小化这些区和聚合物之间的任何可能的斥力。此因此增加载体和包括带正电的季氨基的聚合物之间的反应速度。本发明的组合物一般适宜于体外使用或用于植物或动物。当组合物用于动物(尤其哺乳动物动物)时，载质优选是药学可接受的添加剂、稀释剂或赋形剂。优选的组合物无来自微生物及热源的污染。本发明的聚合物修饰的核酸载体可以各种剂型施用。由此，它们可经口(例如作为水性或油性悬浮液)施用。本发明的聚合物修饰的核酸载体也可肠胃外施用，经皮下、静脉内、肌内、胸骨内、腹膜内、真皮内、透皮或通过输注技术施用。优选腹膜内及真皮内施用。 聚合物修饰的核酸载体可通过以气雾剂的形式经吸入器或喷雾器吸入来施用。用于口服施用的制剂例如可伴随聚合物修饰的核酸载体含增溶剂、例如环糊精或修饰的环糊精；稀释剂，例如乳糖、右旋糖、蔗糖、纤维素、玉米淀粉或马铃薯淀粉；润滑剂、 例如硅石、滑石粉、硬脂酸、镁或硬脂酸钙、和/或聚乙二醇；结合剂；例如淀粉、阿拉伯胶、 明胶、甲基纤维素、羧甲纤维素或聚乙烯吡咯烷酮；分解剂、例如淀粉、藻酸、藻酸盐或甘醇酸淀粉钠；泡腾混合物；染料；甜味剂；润湿剂，例如卵磷脂，聚山梨酯，月桂基硫酸酯；及一般而言，药物制剂中使用的非毒性及药理学无活性物质。用于口服施用的液体分散液可为溶液、糖浆剂、乳液及悬浮液。溶液可含增溶剂例如环糊精或修饰的环糊精。糖浆剂可作为载质含例如蔗糖或蔗糖与甘油和/或甘露糖醇和 /或山梨糖醇。悬浮液及乳液可作为载质含例如天然的胶、琼脂、藻酸钠、果胶、甲基纤维素、羧甲纤维素或聚乙烯醇。用于肌内注射的悬浮液或溶液可伴随活性化合物含药学可接受的载质，例如无菌水，橄榄油，油酸乙酯，甘醇，例如丙二醇；增溶剂、例如环糊精或修饰的环糊精及如果需要，适宜量的利多卡因盐酸盐。用于静脉内或输注的溶液可作为载质含例如无菌水及增溶剂，例如环糊精或修饰的环糊精，或它们优选可取无菌，含水，等渗剂盐溶液形式。将治疗有效量的本发明的聚合物修饰的核酸载体施用于患者。用于病毒治疗的聚合物-修饰的溶瘤病毒的情况中，典型的剂量将含IO7 IO13病毒粒子，取决于个体病毒。 本发明的聚合物修饰的核酸载体一般是以非毒性量施用于患者。本发明的聚合物修饰的核酸载体在进行基因治疗或遗传-疫苗接种治疗中对于将治疗性遗传物质体内递送给患者有用，例如，其中所述聚合物修饰的核酸载体是根据本发明的聚合物修饰的核酸载体，其包括治疗性遗传物质。基因治疗跨人疾病全领域有用，包括、但不限于，治疗癌(包括适宜于直接注射的局部可接近肿瘤结节、以及要求系统治疗的转移性癌)、帕金森病、X-SCID、镰形细胞病、 Lesch-Nyhan综合征、苯丙酮尿症(PKU)、亨庭顿霍乱、迪谢纳肌肉营养不良、血友病、囊性1
纤维化、溶酶体的储存疾病、心血管疾病及糖尿病。本发明的聚合物修饰的核酸载体也可用于递送病毒疫苗。针对HIV、结核、疟疾、流感、癌及其他疾病的疫苗接种面世。疫苗可以初始追加方案给予(即通过多次施用)或与佐剂组合。本发明的聚合物修饰的核酸载体在进行微生物治疗(包括病毒治疗)中对于将治疗剂体内递送给患者有用，例如，其中所述聚合物修饰的核酸载体是根据本发明的聚合物修饰的核酸载体。在某些实施方式中，本发明的聚合物修饰的核酸载体可与其他药物(例如在治疗癌中有效的其他药物)组合使用。本发明也提供单价或多价聚合物，包括(a) —个或多个带正电的季氨基及(b) — 个或多个反应性基团。这些聚合物可为用于本发明的方法的优选聚合物。聚合物通常包括主链及侧链。侧链附接于聚合物主链。在一实施方式中、一个或多个带正电的季氨基是一个或多个式Ia的带正电的季
氨基
权利要求
1.聚合物修饰的核酸载体，其中所述核酸载体共价连接于聚合物，该聚合物包括一个或多个带正电的季氨基。
2.根据权利要求1的聚合物修饰的核酸载体，其中所述核酸载体包括治疗性遗传物质。
3.根据权利要求1或权利要求2的聚合物修饰的核酸载体，其中所述聚合物与核酸载体的连接及后者的修饰导致所述核酸载体在宿主生物学系统中与会与其正常相互作用的其他分子相互作用的能力的抑制，或所述核酸载体与会与其正常结合的位点或受体结合的能力的抑制。
4.根据以上权利要求中任一项的聚合物修饰的核酸载体，其中所述核酸载体是选自下列的微生物病毒、细菌或噬菌体、真菌、孢子、真核细胞核或含遗传信息的其他微生物片段或成分。
5.根据以上权利要求中任一项的聚合物修饰的核酸载体，其中所述核酸载体是含治疗性遗传物质的病毒载体。
6.根据以上权利要求中任一项的聚合物修饰的核酸载体，其中所述核酸载体是在宿主中与特定位点或受体正常相互作用的病毒，其中所述带有带正电的季氨基的聚合物掩盖病毒的正常受体-结合活性，和/或能使其在宿主中重新靶向新的或不同的位点或受体。
7.根据以上权利要求中任一项的聚合物修饰的核酸载体，其中所述核酸载体是基于腺病毒、疱疹病毒、细小病毒、痘病毒、披膜病毒、轮状病毒或小核糖核酸病毒的病毒。
8.根据权利要求1 3中任一项的聚合物修饰的核酸载体，其中所述核酸载体通过核酸与带正电的聚合物和/或脂质之间的自装配形成。
9.根据权利要求8的聚合物修饰的核酸载体，其中所述核酸是siRNA或反义RNA或反义 DNA。
10.根据权利要求8的聚合物修饰的核酸载体，其中所述核酸是mRNA或DNA。
11.根据以上权利要求中任一项的聚合物修饰的核酸载体，其中所述聚合物是多价聚合物。
12.根据以上权利要求中任一项的聚合物修饰的核酸载体，其中所述聚合物通过至少 2个连键，一般通过至少3个连键连接到所述核酸载体。
13.权利要求11或12的聚合物修饰的核酸载体，其中所述聚合物主链基于如下单体单元N-2-羟基丙基甲基丙烯酰胺(HPMA)、N-(2-羟基乙基)-1-谷氨酰胺(HEG)、乙二醇-寡肽、或是聚唾液酸或聚甘露糖聚合物。
14.根据以上权利要求中任一项的聚合物修饰的核酸载体，其中所述聚合物和/或其与核酸载体之间的连键可水解或酶解。
15.根据以上权利要求中任一项的聚合物修饰的核酸载体，其中所述用于修饰核酸载体的聚合物交联而形成水凝胶。
16.以上权利要求中任一项的聚合物修饰的核酸载体，其中各带正电的季氨基均直接或经间隔物基团连接于聚合物主链。
17.权利要求16的聚合物修饰的核酸载体，其中各带正电的季氨基均经一个或多个可降解的或可生物降解的连键，一般通过含可还原的或可水解的键的接头连接到聚合物主链。
18.权利要求16或权利要求17的聚合物修饰的核酸载体，其中所述一个或多个可降解的或可生物降解的连键包括二硫键、酰胼键、缩醛部分或可酶学地切割的键。
19.根据以上权利要求中任一项的聚合物修饰的核酸载体，其中生物学活性剂偶联于或包括于聚合物。
20.权利要求19的聚合物修饰的核酸载体，其中所述生物学活性剂是下列之一种或多种生长因子或细胞因子、糖、激素、脂质、磷脂、脂肪、载脂蛋白、细胞粘接促进剂、酶、毒素、 肽、糖蛋白、血清蛋白质、维生素、矿物、和/或识别受体的抗体。
21.权利要求19的聚合物修饰的核酸载体，其中所述生物学活性剂是抗体或抗体片段。
22.以上权利要求中任一项的聚合物修饰的核酸载体，其中所述核酸载体的修饰具有在生物学宿主中将核酸载体再靶向不同的受体的效应。
23.修饰核酸载体的生物学和/或物理化学性质的方法，所述方法包括使所述核酸载体与聚合物反应，该聚合物包括一个或多个带正电的季氨基及一个或多个反应性基团，从而将核酸载体通过一个或多个共价连键连接到聚合物，以获得聚合物修饰的核酸载体。
24.根据权利要求23的方法，其中所述核酸载体附加地包括权利要求2 10中任一项的特征和/或其中所述聚合物附加地包括权利要求11 19中任一项的特征。
25.根据权利要求23或权利要求M的方法，其中所述聚合物是具有被一个或多个所述反应性基团取代的主链的生物学惰性聚合物。
26.权利要求23 25中任一项的方法，其中各反应性基团均直接或经间隔物基团连接于聚合物主链。
27.根据权利要求23 沈中任一项的方法，其中一个或多个带正电的季氨基各自经权利要求17或权利要求18中定义的一个或多个可降解的或可生物降解的连键连接于聚合物主链，且其中所述方法包括切割所述一个或多个带正电的季氨基和聚合物主链之间的可降解的或可生物降解的连键的额外的步骤。
28.聚合物修饰的核酸载体，其可通过权利要求23 27中任一项的方法获得。
29.权利要求1 22或观中任一项的聚合物修饰的核酸载体，其中所述聚合物掩盖将经历被可中和聚合物修饰的核酸载体的活性的抗体识别的核酸载体的区，所述区一般带负电或是核酸载体表面的酸区。
30.组合物，其包括权利要求1 22、观或四中任一项定义的聚合物修饰的核酸载体， 及适宜稀释剂或载质。
31.基因治疗方法，该方法包括给需要所述治疗的患者施用有治疗活性的、非毒性量的权利要求1 22J8或四中任一项定义的聚合物修饰的核酸载体或权利要求30中定义的组< 合物，该聚合物修饰的核酸载体包括治疗性遗传物质。
32.权利要求1 22J8或四中任一项定义的聚合物修饰的核酸载体在制备用于疫苗接种或基因治疗的药物中的用途，其中所述聚合物修饰的核酸载体包括治疗性遗传物质。
全文摘要
本发明提供聚合物修饰的核酸载体，其中核酸载体共价连接于聚合物，该聚合物包括一个或多个带正电的季氨基。
文档编号A61K48/00GK102245215SQ200880132292
公开日2011年11月16日 申请日期2008年12月11日 优先权日2008年12月11日
发明者K·乌尔布里希, L·W·西摩 申请人:普西奥库斯治疗有限公司