专利名称：一种建立亚临床肝性脑病的实验模型的方法
技术领域：
本发明属生物医学领域，涉及实验模型的建立方法，具体涉及一种建立亚临床肝 性脑病的实验动物模型的方法
背景技术：
肝病是当今最为常见的严重影响人类健康的疾病之一，亚临床肝性脑病(SHE)是 指慢性肝病病人无明显肝性脑病的临床表现，常规神经精神功能检查正常，但采用精细的 智力试验和/或电生理检测方能确诊的肝性脑病。肝性脑病为慢性肝病的常见并发症，在 肝硬化患者中发病率甚高，其潜隐性大，不易被发现。临床患者通常虽形似正常，但其操作 能力和应激能力有减低，尤其从事高空、机械、驾驶等精细工种的患者更易发生意外。随着 我国人民生活水平提高，驾车者逐渐增加，若忽视了对SHE早期诊断和治疗，对患者和社会 均会带来不利影响。据临床观察报道，目前亚临床肝性脑病(SHE)发病率呈增高趋势，已引起临床学 家的重视。SHE的防治研究正在起步，其发生机制亦在深入研究，但迄今尚无建立理想的 SHE的动物模型，阻碍了该疾患的研究进展。目前对亚临床性肝性脑病(SHE)的研究，仍采用肝硬化动物模型。四氯化碳 (CCL4)高脂低蛋白复合因素造成的实验性大鼠肝硬化模型是国内外广泛采用的经典动物 模型，与人类坏死后性肝硬化病理改变相似。其发生发展大体可分为三期(1)变性坏死 期在实验第一周，出现肝细胞气球样变、坏死与间质轻度的炎症反应；第二周以严重的肝 脂肪变为特征；(2)纤维增生期在实验第3-4周，以弥漫性纤维增生为特点；(3)假小叶形 成期在实验第5-6周，特点是结节形成肝小叶改建。据国外亚临床性肝性脑病的流行病学 报道肝硬化患者亚临床性肝性脑病的发病率为10% _70%，这说明并不是所有的肝硬化 患者均发生亚临床性肝性脑病。现有技术公开的以四氯化碳(CCL4)高脂低蛋白复合因素 造成的实验性大鼠肝硬化模型，这种模型在第5-6周假小叶形成期，是否就发生亚临床性 肝性脑病，目前，尚未见有关报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种建立亚临床肝性脑病(SHE)的实 验模型的方法本发明根据无肝性脑病(HE)症状和体征的肝硬化患者，当其智力测试和/或诱发 电位异常者既诊断为SHE的基础上，采用肝硬化的动物模型进行动态的学习、记忆测试或 神经系统和大脑功能的测试，直至动态监测至其智力测试或诱发电位测试异常并与正常动 物比较有统计学意义，即为建立了 SHE动物模型。本发明方法包括如下步骤1)建立四氯化碳(CCL4)高脂低蛋白复合因素造成实验性大鼠肝硬化的经典动物 模型及对照组动物模型；
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2)以动物学习、记忆实验方法观察并记录实验动物入水后搜索目标所需的时间 (潜伏期)、采用的策略和它们的游泳轨迹，分析实验动物的学习、记忆和空间认知等能力；3)对所造模型进行神经电生理测试，检测其神经系统和大脑功能的变化，对照组 与模型组潜伏期出现异常且有统计学意义时，进行神经电生理测试，直至诱发电位出现异 常，且与对照组比较有统计学意义时，SHE模型即建立成功。常用的动物学习、记忆实验方法有跳台法、避暗法、穿梭箱和迷津等。Morris方法 是迷津之一。本发明中，所述的动物学习、记忆实验方法选择Morris水迷津法。本发明所涉及的学习和记忆是脑的重要功能之一。学习是指新行为(经验)的获 得和发展。通过学习获得的经验的保持和再现，即记忆。记忆包括识记、保存、再认和回忆 过程。其中，学习、记忆有赖于全脑的整合功能，也即完成记忆过程离不开知觉、情绪、注意、 意图等心理功能，也离不开早已贮存的知识和经验。现有技术公开了人和动物的内部心理过程无法直接观察到，只能根据可观察到的 刺激反应推测脑内发生的过程，对脑内记忆过程的研究只能从人类或动物学习或执行某项 任务后间隔一定时间，测量它们的操作成绩或反应时间来衡量这些过程的编码形式、贮存 量、保持时间和它们所依赖的条件等等。学习、记忆实验方法的基础是条件反射，各种方法 均由此衍化出来。本发明经对实验动物进行Morris水迷津潜伏期检测，结果显示，造模前两组潜伏 期比较无显著意义(P > 0. 05)，第6周及第8周，两组潜伏期组间比较差异无显著性(P > 0. 05)，第10周模型组与正常组比较，潜伏期明显延长，组间比较有显著意义(P < 0. 05)。人类记忆区分为三种存贮系统，即感觉记录系统，短时存贮系统和长时存贮系统。 研究认为，“感觉记忆”即感知事物后在极短时间内的记忆，与脑的电活动有关。“短时记忆” 和“长时记忆”与脑的神经细胞的突触效能或脑的化学变化有关。本发明采用神经系统的监测技术检测亚临床肝性脑病实验模型的神经系统和大 脑功能的变化。本发明中，优选诱发电位记录技术。所述的诱发电位(EPs)是指神经系统(包括外周或中枢，感觉和运动系统)接受 内、外界“刺激”所产生的特定电活动，是了解神经系统和大脑功能的重要工具。诱发电位 记录的是CNS对外源性的刺激的反应。神经冲动几乎在神经系统的任一水平均可记录或监 测，如外周感受器的活动，中枢活动的活动以及运动反应。诱发电位记录的有效性、简便性、 高信息值，均使其成为最重要的电生理学方法。本发明所述的诱发电位包括听觉诱发电位和体表感觉诱发电位。所述的诱发电位(EPs)其产生的生理基础，主要有下述三类电活动。(1)皮层Eps， 大部分是一组神经元群产生的兴奋性和抑制性突触后电位(EPSP和IPSP)在时间和空间上 的综合，该综合电位穿透皮层表面、各种间质、颅骨和头皮，而产生表面电极可记录到的电 场。(2)皮层下Eps，由各组皮层下中继核团的神经元群产生的突触后电位(PSP)，与其传 导通路的动作电位(AP)综合而成。(3)感觉神经或运动神经所记录到的电位，主要是复合 AP,由去极化波沿这类神经纤维膜传导而产生。AEPs的I、III、V波分别源自听神经、桥脑上橄榄核及中脑下丘的电活动，I"III> I-V, III-V波间期(IPL)则代表了上述相应路段的中枢传导时间，SEP的附3_20也反映中
4枢传导。当中枢神经系统或听神经病变时，可出现某电位PL、IPL的延长。本发明经诱发电位记录技术检测，结果显示模型组大鼠体表感觉诱发电位以及 听觉诱发电位I波、III波与V波潜伏期(PL)与正常组比较，潜伏期均有明显延长，组间比 较差异有显著性(P < 0. 01)，说明模型动物的中枢神经系统出现异常。本发明方法通过对四氯化碳(CCL4)高脂低蛋白复合因素造成的实验性大鼠肝硬 化模型进行学习、记忆测试——Morris水迷津法和神经系统、大脑功能的诱发电位测试， 监测其学习、记忆和空间认知的障碍和神经电生理测试异常并与正常动物比较有统计学意 义，建立了较为理想的SHE动物模型。建立的实验动物模型为研究与诊治亚临床肝性脑病 提供了平台，具有较大的临床现实意义及价值。
具体实施例方式实施例11)建立四氯化碳(CCL4)高脂低蛋白复合因素造成实验性大鼠肝硬化的经典动物 模型试剂四氯化碳(CCL4，长海长江化工厂生产，批号201126，规格分析纯)； 橄榄油(Olive oil，上海双喜香料助剂厂生产，批号201022，规格化学纯)；胆固醇 (Cholesterol，上海伯奥生物科技有限公司出品，批号201220，规格分析纯)。配制试剂与饲料CCL4溶液将CCL4溶于橄榄油配制40% CCL4橄榄油溶液；高脂玉米粉饲料79. 5%玉米粉+20%猪油+0. 5%胆固醇。实验动物SD雄性大鼠60只，SPF级，体重220士 14g (购自中科院上海实验动物中 心)。造模随机取9只大鼠为正常组，其余大鼠进行造模，首次以40% CCL4O. 5ml/100g 体重，以后以40% CCL4橄榄油溶液0. 3ml/100g皮下注射，每周两次，以高脂玉米粉饲料饲 养。正常组以普通饲料喂养，生理盐水皮下注射，剂量与次数同造模。2)以动物学习、记忆实验方法Morris水迷津法观察并记录动物入水后搜索目标 所需的时间(潜伏期)、采用的策略和它们的游泳轨迹，分析大鼠的学习、记忆和空间认知 等能力。以上二组分别于造模前、造模后第六周以及第六周后每二周进行Morris水迷津 测试，测定其潜伏期，直至对照组与模型组潜伏期出现异常且有统计学意义。结果显示，SHE 模型大鼠Morris水迷津潜伏期成绩造模前两组潜伏期比较无显著意义(P > 0. 05)，具有可比性；第6周及第8周，两 组潜伏期组间比较差异无显著性(P > 0. 05)，至第10周模型组与正常组比较，潜伏期明显 延长，组间比较有显著意义(P < 0. 05)。造模前、第6周、第8周以及第10周正常组的潜伏 期，各时段虽有较小波动，但无明显差异；而模型组的潜伏期，随着造模时间的延长，潜伏期 亦逐渐延长。表1是Morris水迷津潜伏期的变化(i ±s)。表 1
权利要求
一种建立亚临床肝性脑病的实验模型的方法，其特征是包括如下步骤1)建立四氯化碳高脂低蛋白复合因素造成实验性大鼠肝硬化的动物模型及对照组动物模型；2)以动物学习、记忆实验方法观察并记录实验动物入水后的潜伏期、采用的策略和它们的游泳轨迹，分析实验动物的学习、记忆和空间认知能力；3)对所造模型进行神经电生理测试，检测其神经系统和大脑功能的变化，建立亚临床肝性脑病实验模型。
2.按权利要求1的方法，其特征是，所述步骤2)的动物学习、记忆实验方法是Morris 水迷津法。
3.按权利要求1或2的方法，其特征是，所述步骤2)的实验动物入水后的潜伏期是实 验动物入水后搜索目标所需的时间。
4.按权利要求1的方法，其特征是，所述步骤3)的神经电生理测试是在对照组与模型 组潜伏期出现异常且有统计学意义时进行。
5.按权利要求1或4的方法，其特征是，所述步骤3)的神经电生理测试采用诱发电位 记录技术。
6.按权利要求5的方法，其特征是，所述的诱发电位包括听觉诱发电位和体表感觉诱 发电位。
7.按权利要求1或5的方法，其特征是步骤3)的神经电生理测试中，直至诱发电位出 现异常，且与对照组比较有统计学意义时，为亚临床肝性脑病的实验模型建立成功。
全文摘要
本发明属生物医学领域，具体涉及一种建立亚临床肝性脑病的实验动物模型的方法。本发明方法通过对四氯化碳高脂低蛋白复合因素造成的实验性大鼠肝硬化模型进行学习、记忆测试和神经系统、大脑功能的诱发电位测试，监测其学习、记忆和空间认知的障碍和神经电生理测试异常并与正常对照组比较有统计学意义，建立了较为理想的SHE动物模型。建立的实验动物模型为研究与诊治亚临床肝性脑病提供了平台，具有较大的临床现实意义及价值。
文档编号A61B5/04GK101961489SQ20091005519
公开日2011年2月2日 申请日期2009年7月22日 优先权日2009年7月22日
发明者刘龙民, 朱喜英, 梁贤栋, 殷佩浩, 王灵台, 虞胜, 陈建杰, 高月球 申请人:上海中医药大学附属普陀医院