专利名称：：血管紧张素Ⅱ的1型受体拮抗剂在抗肿瘤中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及医药领域，更具体的涉及沙坦类药物在抗肿瘤方面的应用。《承汉不据WHO统计，在全世界50多亿人口中平均每年死于恶性肿瘤者达690万人新发病例为870万例，且数字还在逐年增加。国内情况也基本如此，近20年间恶性肿瘤在死因中构成比己由12.6%升至17.9%。因此，各国政府、研究机构及制药公司长期以来一直对肿瘤研究和抗肿瘤药物予以高度重视，在抗肿瘤药物的研究上，目前已取得重大进展。肿瘤的化学治疗是应用一种或数种化学药物，通过口服或注射达到治疗肿瘤的方法。化疗同手术治疗和放疗相比，它不仅仅杀死局部的癌细胞，而且杀伤全身的转移病灶，但化疗并不是万能的，其本身的巨大毒性使疗效受到了极大的限制。化疗会杀伤骨髓中的白细胞，引起白细胞减少，导致患者易患感染性疾病，化疗药也会影响骨髓造血细胞和产生血小板的能力，使患者碰到很轻微的损伤，也会造成出血或内出血，另外，化疗引起的继发性肿瘤可能会在许多年以后出现。目前，为了提高抗肿瘤药物的疗效，在实际应用时大多采用联合用药。近年来研究发现，在人体胰腺、卵巢、前列腺、乳腺等组织中均存在局部独立的肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAS)，血管紧张素II是RAS中最具生物活性的因子，其对肿瘤增殖与生长的作用越来越引起人们的关注。血管生成是肿瘤生长和转移过程中的必需环节，而血管紧张素II及其受体参与并影响肿瘤生长、血管生成过程。血管紧张素II受体，主要是AT,亚型在肿瘤细胞、内皮细胞上可见表达且在许多肿瘤组织中高表达。血管紧张素II及其受体在调控细胞增殖、炎症反应和肿瘤血管形成等方面显示出了不可忽视的作用，为肿瘤治疗开辟了新的药物靶点。"沙坦"类药物即血管紧张素II受体拮抗剂(angiotensinIIrec印torblocker,ARB)类抗高血压药物，问世10余年来，因其独特的疗效和安全性得以迅速发展。沙坦类药物是一种血管紧张素II(ATII)的多肽类似物，可以通过与血管紧张素II受体1(AT,)型结合阻断血管紧张素II效应。除了有效的降血压功效外，实验证明，沙坦类药物可以抑制肿瘤细胞的生长、迁移和血管形成，降低VEGF等细胞因子的分泌并促进肿瘤细胞的凋亡。血管紧张素II的1型受体拮抗剂作为抗高血压药己广泛应用于临床，实验表明其用于肿瘤治疗也具有一定的疗效，因此，血管紧张素n的i型受体拮抗剂作为一种新型的抗肿瘤药物应用于临床，前景十分可喜。魏晓萍、惠起源等在《血管紧张素II及受体与肿瘤关系的研究进展》(临床荟萃，2008年23巻11期，831-832)中发表了氯沙坦可抑制神经胶质瘤细胞的生长、替米沙坦抑制食管鳞癌细胞生长、缬沙坦可抑制宫颈鳞癌细胞生长、坎地沙坦可治疗前列腺癌、卵巢癌、恶性黑色素瘤，故氯沙坦用于治疗神经胶质瘤；替米沙坦用于治疗食管鳞癌；坎地沙坦用于治疗前列腺癌、卵巢癌不在本专利保护范围之内。YoshifumiFujimoto在《AngiotensinIITypelReceptorExpressioninhumanPancreaticCancerandGrowthInhibitionbyAngiotensinIITypelReceptorAntagonist》(FEBSLetters2001，495，197-200)中发表了用氯沙坦抑制胰腺癌细胞生长，故氯沙坦用于治疗胰腺癌不在本专利保护范围之内。AkiraMiyajima，Takeokosaka在《AngiotensinIITypelAntagonistPreventsPulmonaryMetastasisofMurineRenalCancerbyInhibitingTumorAngiogenesis》(CancerResearch2002，62,4176-4179)中提出坎地沙坦可治疗肾细胞癌，故坎地沙坦用于治疗肾细胞癌不在本专利保护范围之内。TakayasuSuganu腿，KazuhikoIno在《FunctionalExpressionoftheAngiotensinllTypelReceptorinhumanOvariancarcinomaCellsanditsBlockadeTherapyResultinginSuppressionofTumorInvasion,Angiogensis，andPeritonealDissemination》(ClinCancerRes2005，11，7，2686-2694)中发表了坎地沙坦可抑制卵巢癌细胞的转移与血管生长，故坎地沙坦用于治疗卵巢癌不在本专利保护范围之内。
发明内容本发明的目的就是提供新的治疗方法，它们可有效的抑制肿瘤细胞的生长、迁移、浸润，一定程度上可以治疗肿瘤疾病。在本发明的第一方面，提供了血管紧张素II的l型受体拮抗剂的用途，其特征在于，用于治疗肿瘤疾病，方法包括以下(a)确定患者为阳性肿瘤；(b)当确定患者为阳性肿瘤时，对患者进行血管紧张素II1型受体拮抗剂的治疗；(c)对于接受治疗的患者，血管紧张素II的1型受体拮抗剂可以帮助减少肿瘤生长、迁移和浸润，抑制肿瘤血管的生成。在另一优选例中，所述的肿瘤为原位癌与继发癌。在另一优选例中，所述的肿瘤包括胃癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌、膀胱癌、肝癌、肾癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌等。在另一优选例中，患者为阳性肿瘤是通过患者的组织样本经化验确定的。在另一优选例中，只有当患者确定为肿瘤病人时才可以用血管紧张素II的1型受体拮抗剂进行治疗。在另一优选例中，所述的血管紧张素II的1型受体拮抗剂为以下药物中的一种氯沙坦钾(losartanpotassium)、结砂坦(valsartan)、厄贝沙坦(irbesartan)、甲磺酸依普罗沙坦(eprosartanmesylate)、坎地沙坦(candesartancilexetil)、替米沙坦(telmisartan)、奥美沙坦酯(olmesartanmedoxomil)等药物及其盐类、前药物以及有活性的代谢物。在另一优选例中，所述的血管紧张素II的1型受体拮抗剂适合以片剂或胶囊的剂量单位形式给予。在另一优选例中，所述药物的每日给药剂量在0.01100mg/kg范围内。在本发明的第二方面，提供了血管紧张素II的1型受体拮抗剂的用途，其特征在于，用于治疗多种肿瘤疾病。具体实施例方式本发明人经过深入而广泛的研究，筛选了大量的化合物，发现血管紧张素II的1型受体拮抗剂适合用于治疗肿瘤疾病。沙坦类药物，又叫做血管紧张素n受体拮抗剂，是一类新型的降价药，可以有效的抑制肿瘤生长和血管的形成，该类药物口服吸收快，2小时内达到峰值，在体内无蓄积，因此适合作为治疗肿瘤疾病的药物，在此基础上完成了本发明。血管紧张素n的i型受体拮抗剂适合于本发明的化合物是血管紧张素ii的i型受体拮抗剂，即沙坦类药物。王京丽、贾秀虹在《国际药学研究杂志》(2007，Vol34，6期)上发表了沙坦类药物的作用机制、药代动力学、临床应用及不良反应；邱丽萍在《中国老年学报》(2008，28，414-416)上发表了沙坦类药物在心血管疾病中的应用；魏晓萍、惠起源等在《临床荼萃》(2008,Vo123,11期)上发表了血管紧张素II及受体信号转导通路以及与肿瘤生长的关系；刘玉琴在《基础医学与临床》(2004，Vo124，3期)上发表了肿瘤血管形成的机理以及一些作用因子。在此全部公开作为参考。治疗机理本发明涉及用血管紧张素n的i型受体拮抗剂，及沙坦类药物治疗恶性肿瘤。沙坦类药物能有效的抑制肿瘤血管的形成，减少肿瘤细胞的生长、迁移和浸润，从而对多种肿瘤疾病起到治疗作用。肾素-血管紧张素系统(RAS)包括血管紧张素原、血管紧张素肽原酶、AngI、血管紧张素转化酶(ACE)、AngII和AngII受体等。近年来的一些研究揭示RAS局部表达于一些成分不同的癌细胞和组织中，这其中包括脑肿瘤、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌和子宫颈癌等。因此AngII及其受体在肿瘤发生发展中起着重要的作用，而沙坦类药物可以通过阻断血管紧张素II的1型受体而抑制肿瘤生长和血管生成。给药和剂量沙坦类药物的给药方式是口服给药，剂量为不大于正常的治疗高血压的给药剂量。可治疗的肿瘤疾病本发明提供了一种血管紧张素II的1型受体拮抗剂治疗肿瘤的方法。包括(a)确定患者为阳性肿瘤；(b)当确定患者为阳性肿瘤时，对患者进行血管紧张素II1型受体拮抗剂的治疗;(c)对于接受治疗的患者，血管紧张素II的1型受体拮抗剂可以帮助减少肿瘤生长、迁移和浸润和肿瘤血管的生成。因为在本发明的治疗方法中，通过口服血管紧张素n的i型受体拮抗剂，可以有效抑制肿瘤生长、迁移浸润，并抑制肿瘤血管的形成。因此本发明可用于治疗多种肿瘤。代表性肿瘤包括(但并不限于)胃癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌、膀胱癌、肝癌、肾癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌等等。治疗的评价血管紧张素II的1型受体拮抗剂治疗的效果在体外上可用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法观察各种沙坦类药物对肿瘤细胞增殖的抑制作用，也可以通过流式细胞仪观察细胞所处的时期。在体内可通过动物模型观测肿瘤大小情况。下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例l:治疗剂的制备本发明中所用治疗剂为市售各种沙坦类药物，溶于磷酸盐缓冲液(PBS),4'C冰箱保存，用时以培养液稀释成不同浓度的工作液。氯沙坦片剂，杭州默东制药有限公司生产，国药准字:X20000371,批号01067;缬沙坦:胶囊，丽珠集团丽珠制药厂生产，国药准字:H19991146;厄贝沙坦胶囊，广东合鑫医药有限公司生产，国药准字X20000546;依普罗沙坦片剂，杭州科本药业有限公司生产；坎地沙坦片剂，杭州科本药业有限公司生产；替米沙坦片剂，浙江金立源药业有限公司，国药准字H20041252;奥美沙坦片剂，杭州科本药业有限公司生产。实施例2:1.血管紧张素II1型受体拮抗剂对人肝癌H印G2细胞体外生长的抑制作用受试细胞人肝癌H印G2细胞受试药物氯沙坦、缬沙坦、厄贝沙坦、依普罗沙坦、坎地沙坦、替米沙坦、奥美沙坦实验过程将处于对数生长期的细胞用胰酶消化后，用RPMI1460全培养基调整细胞浓度为5X107L，于96孔板每孔接种人肝癌H印G2细胞lOOliL(5X103)，于37。C、5%0)2饱和湿度下培养过夜。次日每孔分别加入500ymol/L氯沙坦100yL,500umol/L缬沙坦100uL,500ymol/L厄贝沙坦100uL,500umol/L依普罗沙坦100uL，500umol/L坎地沙坦100uL，500ymol/L替米沙坦100uL，500ixmol/L奥美沙坦100uL，以不含药物为对照组，以25mg/L顺铂溶液(DDP)设为阳性对照组，每组设4个复孔，培养24、48、72h，中止前4-6h弃悬液，每孔加MTT溶液20nL，培养4-6h，每孔加二甲基亚砜(DMSO)溶液150yL，混匀后静置20min,酶联免疫检测仪测各孔在570nm处的吸光度值(A57。)，试验重复3次。分别计算抑制率。肿瘤抑制率%=^^100°/。式中，T:给药组平均A值；C:对照组平均A值结果见表1，发现七种沙坦类药物均表现出一定的抗肿瘤活性。表1七种沙坦药物对人肝癌H印G2细胞的抑制效果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2.血管紧张素H1型受体拮抗剂对人胃癌MKN-28细胞体内的抑制作用受试细胞人胃癌MKN-28细胞受试药物氯沙坦、缬沙坦、厄贝沙坦、依普罗沙坦、坎地沙坦、替米沙坦、奥美沙坦实验过程无菌条件下于小鼠右前肢腋侧皮下接种胃癌MKN-28细胞，待肿瘤长至直径4-6mm时，选取生长良好、无溃疡具半球状单一肿瘤的小鼠，按同窝同性别随机分组，每组8只，小鼠分别给予氯沙坦、缬沙坦、厄贝沙坦、依普罗沙坦、坎地沙坦、替米沙坦、奥美沙坦5mg/kg灌胃，以生理盐水作为空白对照，每天一次，共30天，喂药后开始每天观察小鼠饮食、活动、大小便以及肿瘤生长等情况。至第32天实验结束，小鼠称重后以颈椎脱臼法处死，剪开皮肤，取下完整肿瘤，称重，并与对照组比较抑制率。肿瘤抑制率%=￡^><100%式中，T:给药组平均瘤重；C:对照组平均瘤重实验结果见表2,七种沙坦类药物对肿瘤具有一定的抑制作用表2七种沙坦类药物对人胃癌MKN-28细胞的抑制效果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>3.血管紧张素ni型受体拮抗剂对人胰腺癌Pane-1细胞的抑制作用受试细胞人胰腺癌Panc-l细胞受试药物氯沙坦、缬沙坦、厄贝沙坦、依普罗沙坦、坎地沙坦、替米沙坦、奥美沙坦实验过程将处于对数生长期的细胞用胰酶消化后，用RPMI1460全培养基调整细胞浓度为5X107L，于96孔板每孔接种Pane-1细胞lOOnL(5X103)，于37'C、5%(:02饱和湿度下培养过夜。次日每孔分别加入500ymol/L氯沙坦100uL，500ixmol/L缬沙坦100uL，500umol/L厄贝沙坦100wL，500umol/L依普罗沙坦100uL，500umol/L坎地沙坦100uL，500umol/L替米沙坦100nL,500umol/L奥美沙坦lOOnL，以不含药物为对照组，以25rag/L顺铂溶液(DDP)设为阳性对照组，每组设4个复孔，培养24、48、72h，中止前4-6h弃悬液，每孔加MTT溶液20yL，培养4-6h,每孔加二甲基亚砜(DMSO)溶液150uL，混匀后静置20min，酶联免疫检测仪测各孔在570咖处的吸光度值(A57。)，试验重复3次。分别计算抑制率。肿瘤抑制率^早x100^式中，T:给药组平均A值；C:对照组平均A值结果见表3，发现七种沙坦类药物均表现出一定的抗肿瘤活性。表3七种沙坦药物对人胰腺癌Pane-1细胞抑制率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>4.血管紧张素ii1型受体拮抗剂对人结肠癌sw480细胞的抑制作用受试细胞人结肠癌sw480细胞受试药物氯沙坦、缬沙坦、厄贝沙坦、依普罗沙坦、坎地沙坦、替米沙坦、奥美沙坦实验过程将处于对数生长期的细胞用胰酶消化后，用rpmi1460全培养基调整细胞浓度为5X107l，于96孔板每孔接种人结肠癌sw480细胞100ul(5x103)，于37°c、5%0)2饱和湿度下培养过夜。次日每孔分别加入500wmol/L氯沙坦100uL,500umol/L缬沙坦100uL，500uraol/L厄贝沙坦100uL，500ymol/L依普罗沙坦100uL，500umol/L坎地沙坦100yL，500iimol/L替米沙坦100uL，500umol/L奥美沙坦100yL，不含药物的为对照组，以25mg/L顺铂溶液(DDP)设为阳性对照组，每组设4个复孔，培养24、48、72h,中止前4-6h弃悬液，每孔加MTT溶液20pL，培养4-6h,每孔加二甲基亚砜(DMS0)溶液150yL，混匀后静置20min,酶联免疫检测仪测各孔在570nm处的吸光度值(A57。)，试验重复3次。分别计算抑制率。肿瘤抑制率%-^><10()%式中，T:给药组平均A值；C:对照组平均A值结果见表4，发现七种沙坦类药物对人结肠癌sw480细胞均表现出一定的抑制作用。表4七种沙坦药物对人结肠癌sw480细胞抑制率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>5.血管紧张素II1型受体拮抗剂对人肺癌A549细胞的抑制作用受试细胞人肺癌A549细胞受试药物氯沙坦、缬沙坦、厄贝沙坦、依普罗沙坦、坎地沙坦、替米沙坦、奥美沙坦实验过程用500ymol/L浓度的氯沙坦、缬沙坦、厄贝沙坦、依普罗沙坦、坎地沙坦、替米沙坦、奥美沙坦分别处理人肺癌A549细胞48h，以等量完全培养基为空白对照，利用流式细胞仪进行细胞周期分析，结果表5显示人肺癌A549细胞在G。/d期所占百分比明显增加，而S和G2/M期的细胞所占百分比减少，说明细胞被阻滞在G。/G,期，细胞增殖被抑制。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>6.血管紧张素II1型受体拮抗剂对人肺癌H125细胞的抑制作用受试细胞人肺癌H125细胞受试药物氯沙坦、缬沙坦、厄贝沙坦、依普罗沙坦、坎地沙坦、替米沙坦、奥美沙坦实验过程无菌条件下于小鼠右侧胁腹部近腋下皮下接种人肺癌H125细胞，待肿瘤长至直径约3-4mm时，选取生长良好的小鼠，按同窝同性别随机分组，每组8只，小鼠分别给予氯沙坦、缬沙坦、厄贝沙坦、依普罗沙坦、坎地沙坦、替米沙坦、奥美沙坦5rag/kg灌胃，以生理盐水作为空白对照，每天一次，共30天，喂药后开始每天观察小鼠饮食、活动、大小便以及肿瘤生长等情况。至第32天实验结束，小鼠称重后以颈椎脱臼法处死，剪开皮肤，取下完整肿瘤，称重，并与对照组比较抑制率。肿瘤抑制率%=^1><100%式中，T:给药组平均瘤重；C:对照组平均瘤重实验结果见表6，七种沙坦类药物对人肺癌H125细胞具有一定的抑制作用表6七种沙坦类药物对人肺癌H125细胞的抑制效果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>权利要求1.血管紧张素II的1型受体拮抗剂的用途，其特征在于，用于治疗肿瘤疾病，方法包括以下(a)确定患者为阳性肿瘤；(b)当确定患者为阳性肿瘤时，对患者进行血管紧张素II的1型受体拮抗剂治疗；(c)对于接受治疗的患者，血管紧张素II的1型受体拮抗剂可以帮助减少肿瘤生长、迁移和浸润，抑制肿瘤血管的生成。2.如权利要求l所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤为原位癌与继发癌。3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤包括胃癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌、膀胱癌、肝癌、肾癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌等。4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，患者为阳性肿瘤是通过患者的组织样本经化验确定的。5.如权利要求l所述的用途，其特征在于，只有当患者确定为肿瘤病人时才可以用血管紧张素n的i型受体拮抗剂进行治疗。6.如权利要求i所述的用途，其特征在于，所述的血管紧张素n的i型受体拮抗剂为以下药物中的一种氯沙坦钾(losartanpotassium)、缬沙坦(valsartan)、厄贝沙坦(irbesartan)、甲磺酸依普罗沙坦(eprosartanmesylate)、坎地沙坦(candesartancilexetil)、替米沙坦(telmisartan)、奥美沙坦酯(olmesartanmedoxomil)等药物及其盐类、前药物以及有活性的代谢物。7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的血管紧张素II的1型受体拮抗剂适合以片剂或胶囊的剂量单位形式给予。8.如权利要求l所述的用途，其特征在于，所述药物的每日给药剂量在0.01-100mg/kg范围内。9.血管紧张素II的1型受体拮抗剂的用途，其特征在于，用于治疗多种肿瘤疾病。全文摘要本发明公开了血管紧张素Ⅱ的1型受体拮抗剂用于治疗肿瘤的新用途。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是肾素-血管紧张素系统(RAS)最重要的效应因子，血管紧张素Ⅱ的1型受体在肿瘤细胞的增殖、迁移、浸润和肿瘤血管生成中起重要作用。血管紧张素Ⅱ的1型受体拮抗剂可有效的抑制多种实体肿瘤，如前列腺癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、肾癌等肿瘤细胞的增殖、迁移以及肿瘤血管的生长。文档编号A61K45/00GK101612400SQ20091005517公开日2009年12月30日申请日期2009年7月22日优先权日2009年7月22日发明者丁志楼,达雅静,陈志龙申请人:陈志龙