专利名称：一种兼具光敏性和温敏性的纳米水凝胶药物载体材料的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种水凝胶，尤其是涉及一种兼具光敏性和温敏性的纳米水凝胶药物载体材料。
背景技术：
聚异丙基丙烯酰胺(pNIPAAm)作为一类温敏型高分子智能水凝胶材料，近年来备受研 究者们的关注([l] Leda Klouda， and Antonios G. Mikos. Thermoresponsive hydrogels in ■biomedical applications. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 2008 (68):34-45)。其温敏特性是由于pNIPAAm分子内具有一定比例的疏水和亲水基团，它们与水 分子在分子内、分子间会产生相互作用的结果。当环境温度低于其临界相变温度(LCST， 32 °C)时，pNIPAAm上酰胺基团与水分子间氢键相互作用，导致pNTPAAm分子链周围的水分了 形成一种由氢键连接的、有序化程度较高的溶剂化层.并使pNIPAAm分子表现出伸展的线团 结构，此时pNIPAAm水凝胶呈溶胀状态；当环境温度高于其LCST时，pNIPAAm分子内及分 子间疏水相互作用加强，形成疏水层，水分子从溶剂化层排出，此时pNIPAAm分子由疏松的 线团结构变为紧密的胶粒状结构，即pNIPAAm水凝胶呈收縮状态。而pNIPAAm的LCST值可 通过加入疏水或亲水的单体得以降低或增加。如将pNIPAAm与亲水的丙烯酸或丙烯酰胺单体 共聚，可以升高其LCST至接近人体温度(37。C )或更高([1] Leda Klouda， and Antonios G. Mikos. Thermoresponsive hydrogels in biomedical applications. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 2008 (68):34-45)。因其独特的温度敏感性能，pNIPAAm水凝胶可应用于牛 物医学领域，包括温敏性药物控制释放体系([2] Chien-Chi Lin a， and Andrew T. Metters. Hydrogels in controlled release formulations: Network design and mathematical modeling. Advanced Drug Delivery Reviews. 2006(58):1379画1408; [3] Dirk Schmaljohann. Thermo- and pH-responsive polymers in drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 2006 (58):1655-1670; [4] Prashant K. Jain， Ivan H. El-Sayed， and Mostafa A. El-sayed. Au nanoparticles target cancer. Nanotoday. 2007(2)1:18-28)、细胞培养基和温敏性分离膜等([5] Pei Li, Ai Mei Zhu， Qing Lin Liu, and Qiu Gen Zhang. Fe3O4/poly(N-Isopropylacrylamide)/Chitosan Composite Microspheres with Multiresponsive Properties. Ind. Eng. Chem. Res. 2008(47): 7700-7706; [6] N. Shamim, L.Hong, K. Hidajat, M.S. Uddin. Thermosensitive polymer (N- isopropylacrylamide) coated nanomagnetic particles: Preparation and characterization. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2007 (55): 51-58)。但单纯的pNIPAAm水凝胶功能单一，限制了其进一步的应用。目前的研究 热点集中在将pNIPAAm水凝胶与其他功能材料复合，以扩展pNIPAAm水凝胶的应用范围。文 献中就有大量报道将pNIPAAm微球与具有磁性的Fe304及Fe203 ([7] Jorge Rubio-Retama, Nikolaos E. Zafeiropoulos, Caterina Serafmelli, Rosana Rojas-Reyna, Brigitte Voit， E. Lopez Cabarcos, and Manfred Stamm. Synthesis and Characterization of Thermosensitive PNPIAM Microgels Covered with Superparamagnetip"y-Fe203 Nanoparticles. Langmuir. 2007, 23:10280; [8] Matthias Karg, Isabel Pastoriza-Santos， Jorge P_rez-Juste， Thomas Hellweg， and Luis M. Liz-Marzn. Nanorod-Coated PNIPAm Microgels:Thermoresponsive Optical Properties. Small, 2007， (3)7:1222-1229; [9] Katherine C. Grabar, R. Griffith Freeman, Michael B. Hommer & Michael J. Natan. Preparation and Characterization of Au Colloid Monolayers. Analytical chemistry. 1995， 67(4):735-743)，具有光敏性的金纳米颗粒等进行复合的先例，获得了具有多功能响应的纳米 复合材料，可潜在应用于生物传感和药物递送等领域([10] Jun Gao and Barbara J. Frisken. Influence of Reaction Conditions on the Synthesis of Sdf-Cross-Linked N-Isopropylacrylamide Microgels. Langmuir. 2003, 19:5217-5222)。 发明内容本发明的目的是提供一种兼具光敏性和温敏性的纳米水凝胶药物载体材料与制备方法。 本发明所述一种兼具光敏性和温敏性的纳米水凝胶药物载休材料具有核-壳结构，所述核为纳米金核，所述壳为聚异丙基丙烯酰胺(pNIPAAm)壳，所述一种兼具光敏性和温敏性的纳米水凝胶药物载体材料的结构式为p(NIPAAm)其中，n为异丙基丙烯酰胺聚合分子数，m为参与反应的交 剂分子数c红外光谱表征显示兼具光敏性和温敏性的纳米水凝胶药物载体材料在3300 3400 cm—1、 2970 cm-1 、 2930 cm-1、 2880 cm-1 、 1650cm扁1、 1540 cm-1 、 1460 cm扁1、 13卯cm4和1370 cm-1 具有吸收，其中3300 3400 cm—i是N-H的伸缩振动吸收峰，2880 cm1、 2930 cm"和2970 cm—1是C-H的伸缩振动吸收峰，1650和1540 cm—1是酰胺I (酰胺基团上C=0的伸缩振动) 及酰胺II (酰胺基团上NH2弯曲振动)的特征吸收峰；1460cm"是-CH3的不对称弯曲振动吸 收峰，1390 cm"和1370cm"是异丙基上双甲基的对称变形振动耦合分裂而形成的双峰。
紫外可见光光谱显示该复合纳米水凝胶的水溶液在 530 nm处有吸收峰。
示差扫描量热图谱显示Au/pNIPAAm复合纳米水凝胶的水溶液在30 5(TC某一特定温度 有相转变现象发生，说明该复合纳米水凝胶在该温度下响应。
示差扫描量热图谱显示兼具光敏性和温敏性的纳米水凝胶药物载体材料在30 5(TC有相 转变现象发生，说明兼具光敏性和温敏性的纳米水凝胶药物载体材料在该温度下响应。
所述纳米金可为10 50 nm的纳米金颗粒。
所述纳米水凝胶药物载体材料的粒径大小及临界相变温度可控，并且具有良好的生物相 容性，其中壳结构的聚异丙基丙烯酰胺水凝胶可储存药物，而核结构的纳米金可吸收可见光 ( 520 nrn)，并将吸收的光能转换成热能，从而引起所述纳米水凝胶药物载体材料的环境温 度升高，当环境温度达到聚异丙基丙烯酰胺的LCST以上时，具有温敏件的聚异丙基丙烯酰 胺可释放其储存的药物。
所述兼具光敏性和温敏性的纳米水凝胶药物载体材料的制备方法包括以下步骤
1) 将纳米金颗粒分散于水溶液中，得分散液，向分散液中加入丙烯酰胺，使得纳米金终 浓度为1X10" 5X10'2个/mL，丙烯酰胺终浓度为6 100|_imol/mL，即可得悬浮液A;
2) 将悬浮液A静置，离心后收集沉淀，并将沉淀重新分散于去离子水中，得悬浮液B;
3) 向悬浮液B中加入异丙基丙烯酰胺、N，N'-亚甲基双丙烯酰胺、十二垸基硫酸钠和水 溶性药物，即得到悬浮液C;
4) 将悬浮液C搅拌，然后向悬浮液C中加入过硫酸铵，反应，得悬浮液D;
5) 将悬浮液D离心后，收集沉淀，即可得兼具光敏性和温敏性的纳米水凝胶药物载体 材料。
在步骤l)中，所述纳米金颗粒的合成方法可根据不同柠檬酸三钠水溶液用量，还原O.Ol %氯金酸水溶液，得到特定粒径的纳米金溶液。柠檬酸三钠用量与纳米金颗粒直径的关系如 表1所示。表10.01 Q/。氯金酸(mL)P/o柠檬酸三钠(mL)直径(nm)1005.015.38 ± 1.421001.052.06 ± 0.91在步骤2)中，所述静置的温度最好为20 3(TC,静置的时间最好为8 12h。在步骤3)中，所述异丙基丙烯酰胺终浓度最好为0.01 1.2mmol/mL，异丙基丙烯酰胺 与丙烯酰胺、N,N'-亚甲基双丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠和水溶性药物的摩尔比最好分别为 10/1 1/1、 4000/1 3/1、 60/1 1/2和0 5/3。在步骤4)中，所述搅拌最好在50 80 'C下恒温搅拌0.5~2h，所述向悬浮液C中加入 过硫酸铵，最好使过硫酸铵与异丙基丙烯酰胺的摩尔比例为1/400 2/1,所述反应最好是在 50 8(TC下恒温反应4 24h。制备所述兼具光敏性和温敏性的纳米水凝胶药物载体材料的反应机理如下<formula>formula see original document page 7</formula>本发明所制备的所述兼具光敏性和温敏性的纳米水凝胶药物载体材料的粒径与LCST可 调控，且生物相容性好。当环境温度大于pNIPAAm的LCST时，或者在波长为500 600 nm 的激光照射下，Au/pNIPAAm复合纳米水凝胶可释放被包裹的药物，实现药物的控制释放。所述Au7pNIPAAm复合纳米水凝胶材料可作为水溶性药物的载体，当用波长为500 600 nm的激光对其进行照射，环境温度高于该复合纳米水凝胶的LCST时，药物释放，可实现环 境温度对药物的控制释放。
图1为实施例1制备的兼具光敏性和温敏性的纳米水凝胶药物载体材料的透射电镜照片。在图1中，标尺为50nm。
图2为实施例1制备的兼具光敏性和温敏性的纳米水凝胶药物载体材料的红外图谱。其 横坐标为波数WavenumberCcm-1)，纵坐标为红外光透过率Transmittance(%);上曲线为 p(NIPAm-Aam)，下曲线为p(NIPAm-Aam)/Au，从左至右谱峰相应为NH， CH， CONH， CH3。
图3为实施例1制备的兼具光敏性和温敏性的纳米水凝胶药物载体材料的紫外-分光光度 计表征。其横坐标为波长Wavelength/nm，纵坐标为强度Intensity;上曲线为Au/p (NIPAm-Aam)，下曲线为AuNPs;峰值为530nm。
图4为实施例1,3制备的兼具光敏性和温敏性的纳米水凝胶药物载体材料的差示扫描量 热分析图谱。其横坐标为温度Temperature(X:)，纵坐标为能量变化；曲线a为32.68t:，曲线 b为35.08°C。
图5为实施例5制备的兼具光敏性和温敏性的纳米水凝胶药物载体材料的细胞毒性MTT 图。其横坐标是纳米粒子的浓度(ng/mL)，纵坐标是细胞存活率(％)。
图6为实施例6中制备的载有罗丹明B的兼具光敏性和温敏性的纳米水凝胶药物载体材 料在不同温度下罗丹明B的释放曲线图。其横坐标为温度Temperture(。C)，纵坐标为罗丹明B 释放百分比Drugrelease content(%)。
图7为实施例7中制备的载有5-氟尿嘧啶的兼具光敏性和温敏性的纳米水凝胶药物载体 材料在515nm、强度为400 mW/cm2的连续激光连续激光器照射下，5-氟尿嘧啶的释放曲线图。 其横坐标为时间Time(min)'纵坐标为5-氟尿嘧啶释放百分比Release effciency(%)。
具体实施例方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明。 实施例1
将2.5 x 1012个/mL纳米金颗粒(粒径为~50 nm)超声分散于30 mL去离子水中，向该 分散液中加入0.211 mmol丙烯酰胺，然后在25 °C卜'静置12h。离心清洗(l画rpm， 20 min， 25°C) 3次后，将收集到的沉淀重新分散于5mL去离子水中。在上述悬浮液中分别加入1.77 mmol异丙基丙烯酰胺，12.97 pmolN,N，-亚甲基双丙烯酰胺，86.69 pmol十二垸基硫酸钠和 10 mL去离子水，于7(TC下恒温搅拌1 h后加入109.6 pmol过硫酸铵，再于70'C下反应4 h。 反应结束后，将悬浮液离心清洗(11000rpm， 20min， 25°C) 3次，除去未反应的单体，收集 沉淀，即可得到如图1所示的粒径为90.47 ± 0.30 nm的Au/pNIPAAm复合纳米水凝胶材料。 将Au/pNIPAAm复合纳米水凝胶冻干后以红外图谱进行表征，如图2所示，该复合纳米水凝 胶出现pNIPAAm的典型谱带。将Au/pNIPAAm复合纳米水凝胶重新分散于去离子水中以紫外-分光光度计进行表征，如图3所示，该复合纳米水凝胶的水溶液在530 nm有吸收。以差 示扫描量热分析，如图4(a)所示，Au/pNIPAAm复合纳米水凝胶的LCST为32.7°C 。 实施例2将1.3 x 1012个/mL纳米金颗粒(粒径为~15 nm)超声分散于10 mL去离子水中，向该 分散液中加入0.211 mmol丙烯酰胺，然后在25。C下静置12h。离心清洗(12000 rpm， 15 min， 20°C ) 3次后，将收集到的沉淀分散于5 mL去离子水中。在上述悬浮液中分别加入1.77 mmol 异丙基丙烯酰胺，6.486 nmolN,N，-亚甲基双丙烯酰胺，86.69 nmol十二烷基硫酸钠和10mL 去离子水，于70 'C下恒温搅拌lh后加入131.5 )nmol过硫酸铵，再于70 'C下反应4h。反 应结朿后，将悬浮液离心清洗(9,500 12000 rpm， 15 min， 25°C) 3次，除去未反应的单体， 收集沉淀，即可得到粒径为66.28 ± 2.34nm的Au/pNIPAAm复合纳米水凝胶材料。 实施例3将8.2 x 101G个/mL纳米金颗粒(粒径为~50 nm)超声分散于30 mL去离子水中，向该 分散液中加入0.211 mmol丙烯酰胺，然后在25"C下静置12h。离心清洗(9,500 rpm， 15 25 min， 25 °C )3次后，将收集到的沉淀分散于5 mL去离子水中。在上述悬浮液中分别加入1.77 mmol 异丙基丙烯酰胺，6.486 pmolN，N，-亚甲基双丙烯酰胺，86.69 pmol十二烷基硫酸钠和10mL 去离子水，于70 'C下恒温搅拌lh后加入131.5 nmol过硫酸铵，再于7(TC下反应4h。反应 结束后，将悬浮液离心清洗(9，500rpm， 25min， 25°C) 3次，除去未反应的单体，收集沉淀， 即可得到粒径为103.83 ± 1.69 nm的Au/pNIPAAm复合纳米水凝胶材料。 实施例4将8.2 x 101Q个/mL纳米金颗粒(粒径为~50 nm)超声分散丁 30 mL去离子水中，向该 分散液中加入1.04mmol丙烯酰胺，然后在25。C下静置12h。离心清洗(1000rpm， 20 min, 25°C ) 3次后，将收集到的沉淀分散于5 mL去离子水中。在上述悬浮液中分别加入1.30mmol 异丙基丙烯酰胺，12.97 nmolN，N，-亚甲基双丙烯酰胺，86.69 pmol十二垸基硫酸钠和10mL 去离子水，于7(TC下恒温搅拌1 h后加入109.6 pmol过硫酸铵，再于7(TC下反应4 h。反应 结束后，将悬浮液离心清洗(1000rpm， 20min， 25。C)3次，除去未反应的单体，收集沉淀， 即可得到粒径为88.37± 1.05 nm的Au/pNIPAAm复合纳米水凝胶材料。将Au/pNIPAAm复合 纳米水凝胶重新分散于去离子水中以差示扫描量热分析，如图4(b)所示，该复合纳米水凝胶 LCST为35.1 。C。 实施例5将8.2 x 101G个/mL纳米金颗粒(粒径为 50 nm)超声分散于30 mL去离子水中，然后向该分散液中加入0.211 mmol丙烯酰胺，在25。C下静置12h。离心清洗(11000rpm， 20min， 25 。C )3次后，将收集到的沉淀分散于5 mL去离子水中。在上述悬浮液中分别加入1.77 mmol 异丙基丙烯酰胺，38.92 (amolN,N，-亚甲基双丙烯酰胺，86.69 |amol十二烷基硫酸钠和10mL 去离子水，于70匸下恒温搅拌lh后加入87.64 iamol过硫酸铵，再于70'C下反应4h。反应 结束后，将悬浮液离心清洗(llOOOrpm， 20min， 25 。C) 3次，除去未反应的单体，收集沉 淀，即可得到粒径为74.48± 1.13 nm的Au/pNIPAAm复合纳米水凝胶材料。将该复合纳米水 凝胶重新分散于去离子水中，用0.22 pm的过滤器过滤，即可得到无菌的Au/pNIPAAm复合 纳米水凝胶悬浊液。将该无菌的复合纳米水凝胶材料悬浮于无血清的DMEM培养基中，超声分散，并加入使 其含量分别为100pg/mL， 200pg/mL， 300吗/mL， 400吗/mL和500 pg/mL。按每孑L3.5x105 个细胞的密度，将人子宫颈癌细胞HeLa接种于6孔培养板，培养6h贴壁后，吸去旧培养液， 用PBS洗涤培养板中的细胞两次。每孔加入200 pL上述含有复合纳米水凝胶材料的培养基 悬浮液，然后每孔补加800 pL含血清的DMEM培养基。培养24h后，用MTT法通过酶标 仪测定细胞相对存活率。结果如图5所示，该Au/pNIPAAm复合纳米水凝胶材料具有良好的 细胞相容性。 实施例6将8.2 x 101Q个/mL纳米金颗粒(粒径为~50 nm)超声分散于30 mL去离子水中，向该分 散液中加入0.211 mmol丙烯酰胺，然后在25。C下静置12h。离心清洗(9,500 rpm， 15min， 25°C) 3次后，将收集到的沉淀分散于5 mL去离子水中。在上述悬浮液中分别加入1.77 mmol 异丙基丙烯酰胺，38.92 pmol N,N，-亚甲基双丙烯酰胺，86.69 pmol | 二烷基硫酸钠，2,09 pmol 罗丹明B和10 mL去离子水，于70 。C下恒温搅拌1 h后加入87.64 pmol过硫酸铵，再于70 。C下反应4h。反应结束后，将悬浮液离心清洗(9,500卬m， 15 min， 25 。C) 3次，除去未 反应的单体，收集沉淀重新分散于去离子水中，即可得到载有罗丹明B的Au/pNlPAAm复合 纳米水凝胶悬浊液。将该复合纳米水凝胶悬浊液置于透析袋中，以去离子水作为透析液，分 别在30， 35， 40， 45， 50， 55， 60 'C下透析2天。通过荧光分光光度计测定各透析液中罗 丹明B含量以确定释药量。结果如图6所示，随着温度的升高，罗丹明B释放量增加。 实施例7将8.2 x 101G个/mL纳米金颗粒(粒径为~50 nm)超声分散于30 mL去离了水中，向该 分散液中加入0.211 mmol丙烯酰胺，然后在25 。C下静置12h。离心清洗(13000 rpm， 10min， 25°C ) 3次后，将收集到的沉淀分散于5 mL去离子水中。在上述悬浮液中分别加入1.77 mmol异丙基丙烯酰胺，38.92 nmolN,N，-亚甲基双丙烯酰胺，86.69 (imol十二垸基硫酸钠，7.69 pmol 5-氟尿嘧啶和10 mL去离子水，于70。C下恒温搅拌1 h后加入87.64 pmol过硫酸铵，再于70 。C下反应4h。反应结束后，将悬浮液离心清洗(13000rpm, 10min， 25°C) 3次，除去未反 应的单体，收集沉淀重新分散于去离子水中，即可得到载有5-氟尿嘧啶的Au/pNIPAAm复合 纳米水凝胶悬浊液。将该复合纳米水凝胶悬浊液置于透析袋中，以去离子水作为透析液，用 波长为515 nm，强度为400 mW/cm2的连续激光进行照射。分别在照射5 min，0 min， 15 min 后取出透析液，通过紫外-可见光分光光度计测定透析液中5-氟尿嘧啶的含量以确定释药量。 结果如图7所示，随着照射激光时间的增加，5-氟尿嘧啶的释放量增加。
权利要求
1.一种兼具光敏性和温敏性的纳米水凝胶药物载体材料，其特征在于具有核-壳结构，所述核为纳米金核，所述壳为聚异丙基丙烯酰胺壳，结构式为其中，n为异丙基丙烯酰胺聚合分子数，m为参与反应的交联剂分子数。
2. 如权利要求1所述的一种兼具光敏性和温敏性的纳米水凝胶药物载体材料，其特征在 于所述纳米金为10 50nrn的纳米金颗粒。
3. 如权利要求1所述的兼具光敏性和温敏性的纳米水凝胶药物载体材料的制备方法，其 特征在于包括以下步骤-1) 将纳米金颗粒分散于水溶液中，得分散液，向分散液中加入丙烯酰胺，使得纳米金终 浓度为1X101G 5X10^个/mL，丙烯酰胺终浓度为6 100|_imol/mL，即可得悬浮液A;2) 将悬浮液A静置，离心后收集沉淀，并将沉淀重新分散于去离子水中，得悬浮液B;3) 向悬浮液B中加入异丙基丙烯酰胺、N，N'-亚甲基双丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠和水 溶性药物，即得到悬浮液C;4) 将悬浮液C搅拌，然后向悬浮液C中加入过硫酸铵，反应，得悬浮液D;5) 将悬浮液D离心后，收集沉淀，即可得兼具光敏性和温敏性的纳米水凝胶药物载体 材料。
4. 如权利要求3所述的兼具光敏性和温敏性的纳米水凝胶药物载体材料的制备方法，其 特征在于在步骤2)中，所述静置的温度为20 3(TC，静置的时间为8 12h。
5. 如权利要求3所述的兼具光敏性和温敏性的纳米水凝胶药物载体材料的制备方法，其 特征在于在歩骤3)中，所述异丙基丙烯酰胺终浓度为0.01 1.2mmol/mL。
6. 如权利要求3所述的兼具光敏性和温敏性的纳米水凝胶药物载体材料的制备方法，其 特征在于在步骤3)中，异丙基丙烯酰胺与丙烯酰胺、N,N'-亚甲基双丙烯酰胺、十二烷基硫 酸钠和水溶性药物的摩尔比分别为10/1 1/1、 4000/1 3/1、 60/1 1/2和0 5/3。
7. 如权利要求3所述的兼具光敏性和温敏性的纳米水凝胶药物载体材料的制备方法，其 特征在于在步骤4)中，所述搅拌是在50 80 。C下恒温搅拌0.5 2h。
8. 如权利要求3所述的兼具光敏性和温敏性的纳米水凝胶药物载体材料的制备方法，其 特征在于在步骤4)中，所述向悬浮液C中加入过硫酸铵，是使过硫酸铵与异丙基丙烯酰胺 的摩尔比例为1/400 2/1。
9. 如权利要求3所述的兼具光敏性和温敏性的纳米水凝胶药物载体材料的制备方法，其 特征在于在步骤4)中，所述反应是在50 80t:下恒温反应4 24h。
全文摘要
一种兼具光敏性和温敏性的纳米水凝胶药物载体材料，涉及一种水凝胶。提供一种兼具光敏性和温敏性的纳米水凝胶药物载体材料与制备方法。具有核-壳结构，核为纳米金核，壳为聚异丙基丙烯酰胺壳。将纳米金颗粒分散于水溶液中，加入丙烯酰胺，得悬浮液A，静置，离心后收集沉淀，并将沉淀重新分散于去离子水中，得悬浮液B，加入异丙基丙烯酰胺、N，N′-亚甲基双丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠和水溶性药物，即得悬浮液C，搅拌，加入过硫酸铵，反应，得悬浮液D，离心后，收集沉淀，即可得兼具光敏性和温敏性的纳米水凝胶药物载体材料。
文档编号A61K47/32GK101664557SQ20091011257
公开日2010年3月10日 申请日期2009年9月23日 优先权日2009年9月23日
发明者磊 任, 雯 刘, 俊 王, 军 王, 赵雪芹 申请人:厦门大学