专利名称：一种表面具有纳米盲孔结构的骨科内植物及其应用的制作方法
一种表面具有纳米盲孔结构的骨科内植物及其应用
技术领域：
本发明涉及医学材料技术领域，具体地说，是关于一种表面具有纳米盲孔结构的 骨科内植物及其应用。
背景技术：
从生物力学的角度考虑，骨科内植物材料的优化选择已经相当成熟，如医用钛及 钛合金、不锈钢、生物陶瓷等；而在预防假体术后松动方面，针对内植物表面的各种优化研 究还在进行中，如各种改变内植物表面粗糙度、羟基磷灰石涂层、生物玻璃涂层、各种活性 高分子材料等方法。但是，人们在钛内植物表面改性以促进骨整合预防松动方面做的工作 大部分集中于在其表面制备具有生物活性的涂层，但因其与基体的结合弱而脱落导致涂层 失败。表面纳米化作为表面强化的一个手段，即利用各种物理或化学方法将材料的表层晶 粒细化至纳米量级，制备出一定厚度的具有纳米晶粒结构的表层，但是基体仍然保持原有 的粗晶状态，今年来诸多关于利用纳米化的钛表面促进成骨细胞黏附增殖的报道。材料经 表面纳米化处理后，表面晶粒细化，原子活性提高，扩散系数增大，表面的硬度、强度、耐磨 性、疲劳强度等性能均得到很大的提高，另外，骨组织本身也是纳米结构(无机矿物质颗粒 < IOOnm)，而且骨组织细胞外基质蛋白也同样达到纳米尺寸，因此，研究新一代纳米结构植 入材料，增强C3H10T1/2细胞与纳米材料相互作用，有效促进骨整合，促进内植物的长期稳 定。目前关于纳米纤维、纳米陶瓷、纳米聚合物和纳米复合物等的生物学效应已有研究。骨科内植物手术感染的发病取决于细菌黏附于材料表面及形成生物膜的能力，为 预防此类疾病近年来许多研究致力于研发新型内植物表面抗感染涂层，通过其改变内植物 表面性状以减少或避免细菌粘附或利用涂层释放杀菌成分降低感染形成的风险。抗细菌粘 附涂层的效应取决于其在植入物表面的牢固性及持久性，但是这些涂层大多是将理化性质 差异很大的抗菌药物交联到金属表面，因“内植物_涂层和涂层_骨界面”不同的弹性模量 引起涂层的分离，就像“筷子上挂米汤那样”，其稳定性及缓释效果往往达不到临床需要而 只能停留在实验阶段。Tan等报道钛纳米结构表面(56士32nm)有利于Sao-2细胞黏附增殖及成骨分化， 有望解决骨科假体松动的问题；Bauer等研究孔径为15、20、30、50、70及IOOnm的钛纳米管 超疏水性修饰后更有利于兔骨髓基质干细胞在其表面黏附增殖分化；Brammer等研究孔径 在30-100nm范围的钛纳米管对小鼠CSHlOTlA细胞(MC3T3-E1)黏附增殖及分化的影响， 其结果表明30nm以下的小孔径有利于C3H10T1/2细胞黏附增殖，而较大孔径70-100nm的 纳米管表面细胞增殖数量小，但成骨分化如碱性磷酸酶的水平却更高；Popat等研究将抗 生素_庆大霉素载入到钛纳米管中，体外实验观察其可有效抑制表皮葡萄球菌黏附和促进 MC3T3-E1黏附增殖与分化。总之，现有技术有不同尺寸孔径的钛纳米管超疏水性修饰后更 有利于兔骨髓基质干细胞在其表面黏附增殖分化，或者是将抗生素_庆大霉素载入到钛纳 米管中，体外实验观察其可有效抑制表皮葡萄球菌黏附和促进MC3T3-E1黏附增殖与分化。 但是关于纳米盲孔本身对细胞黏附增殖分化和细菌黏附增殖与形成生物膜的影响的研究未见报道。
发明内容本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种表面具有纳米盲孔结构的骨科 内植物。本发明的再一的目的是，提供了表面具有纳米盲孔结构的骨科内植物的用途。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是一种表面具有纳米盲孔结构的骨科内植物，所述的骨科内植物表面具有纳米盲孔 结构，所述的骨科内植物最上面是纳米盲孔层，中间是Ti02阻挡层，最下面是Ti基底层。为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是表面具有纳米盲孔结构的骨科内植物在制备治疗重建骨关节结构和功能或固定 骨折或促进骨整合或防止感染和松动疾病骨材料中的应用。本发明利用表面阳极化法及改进的电化学方法，将钛片(Ti)制作成纳米盲孔钛 片(NTi)。体外细胞学实验在Ti与NTi表面种植具备多向分化潜能的小鼠C3H10T1/2成 纤维细胞系，ld，2d及3d后用DAPI染色计数表面细胞黏附数量，扫描电镜(SEM)观察细胞 生长状况；14d后碱性磷酸酶染色表征细胞成骨分化情况。体外抑菌实验在Ti与NTi表 面种植国际标准表皮葡萄球菌的菌株ATCC 35984，对活细菌进行染色后荧光显微镜观察细 菌的黏附生长及生物膜形成情况。本发明优点在于利用纳米化技术在骨科内植物表面制作纳米盲孔结构，具有纳 米盲孔结构骨科内植物对C3H10T1/2细胞的黏附增殖与分化具有促进作用；同时，该表面 还对生物膜阳性的表皮葡萄球菌ATCC 35984有明显抑制作用，表现出一定的抗菌作用。综 上，表面具有纳米盲孔结构的骨科内植物可提高骨科金属内植物材料表面骨整合及抗菌性 能。
附图1 为纳米盲孔阵列的表面，侧面和底部SEM图片，其中(a)纳米盲孔阵列的 表面形貌，(b)表面形貌高倍放大图，(c)纳米盲孔的截面图，(d)纳米盲孔的底部形貌。附图2 材料表面细胞核的DAPI染色显示(X200)随着时间延长，两种表面的细 胞数量都在增加，Id后NTi表面(b)显著高于Ti表面细胞数量(a)，且可见正处于分裂期 的双核细胞；2d后NTi表面(d)显著高于Ti表面细胞数量(c)，且两组都可见正处于分裂 期的双核细胞；3d后NTi表面(f)仍然高于Ti表面细胞数量(e)。附图3 材料表面细胞核数量随着时间延长，两种Ti与NTi表面的细胞数量都在 增加；且于ld，2d及3d后NTi表面显著高于Ti表面细胞数量，ρ < 0. OOl0附图4 :C3H10Tl/2细胞在两种材料表面黏附增殖的情况6h后Ti表面细胞仍呈 近圆球形(a)，而在NTi表面的细胞已经伸展开来(b) ；3d后Ti表面细胞也呈铺展生长(c)， 但其密度显著低于NTi表面(d) ；6h后的高倍观察见纳米盲孔表面的细胞分泌颗粒很多生 长旺盛(f)，而Ti表面细胞无此现象(e)。附图5:共培养14d后Ti (a)和NTi (b)表面ALP染色，见成骨分化的细胞胞质内 有阳性颗粒(X100)。
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附图6 培养Id后ATCC 35984在Ti (a)与NTi (b)表面细菌生物膜生长情况 (X200)。(活菌染色为绿色，死菌染色为红色)。附图7 扫描电子显微镜观察普通钛板表面(a)和纳米微盲孔钛板表面(b)细菌 生物膜形成的情况。
具体实施方式下面结合附图对本发明提供的谱增益的具体实施方式
作详细说明。实施例1一，材料与方法(一 )实验材料及仪器材料医用钛片(直径5mm，厚度1mm，上海浦卫医疗器械厂)，DAPI (4，6_联 脒-2-苯基吲哚)，碱性磷酸酶定性染色盒(上海仁宝医用试剂研究有限公司)，四环素粉 (华美生物工程公司)，DMEM培养基(美国GIBCO公司)，胰蛋白酶(美国SIGMA公司)，胎 牛血清(美国HYCLON公司)，大豆蛋白胰蛋白胨培养基(Trypticase Soy Broth，TSB，英国 OXOID公司)，其他试剂均为市售分析纯试剂。仪器超净工作台(BIO-HAZARD，VCM-420,中国台湾)，电子分析天平(METTLER TOLEDO, AB204-E，瑞士 )，电磁搅拌器(STUART，SM24，英国)，低温离心机(UNIVERSAL，32R， HETTICH，德国)酶联免疫检测仪(MULTISKAN, ASCENT, VI. 22，美国)，荧光光学显微镜 (OLYMPUS, BH-2,日本)，扫描电子显微镜(SEM，JEOL, JSM-6260LV, Japan)，激光共聚焦显微 镜(CLSM, LeicaTCSS02, Germany)。(二)钛表面纳米化采用商业纯钛(纯度99.5%，元素成分见表1)作为阳极氧化的基体。纯钛片 (0 5mmXlmm)先在丙酮中采用超声波进行清洗以除去表面油污，在用#200，#600，#800， #1000，#1500的砂纸进行打磨。然后在而03和冊作(而03) V(HF)=I 1)的溶液中进行 化学抛光60秒，再用去离子水清洗。采用直流电源进行阳极氧化试验。电解液为0.6vol% 的HF水溶液，以纯钛基体为氧化阳极，不锈钢为氧化的阴极。阳极氧化电压维持在20V，氧 化时间为50分钟。整个阳极氧化过程在室温25°C左右进行。氧化后的样品采用去离子水 清洗，并用吹风机吹干。阳极氧化后的膜层的表面，截面以及底部形貌均采用场发射扫描电 子显微镜(FE-SEM, FEI SIRION 200)进行表征。表1商业纯钛的元素成分
Contents of impurities (<wt%) Substrates Type _~Fe OCNHTi
TA1 0.20 0.18 0.08 0.03 0.015Remains(三)准备实验用细胞株与菌株实验用细胞具备多向分化潜能的小鼠C3H10T1/2成纤维细胞系由中国科学院生 命科学研究院细胞资源中心提供，将该细胞用10%胎牛血清的DMEM培养基按1乂104个/ ml的密度共IOml接种在IOcm的培养皿放培养箱中培养，37°C，5% C02。三天后，待皿底细
5胞汇合后，用0. 25%胰酶消化，用10%胎牛血清的DMEM培养基中止并制备1 X IO4个/ml细 胞密度的细胞悬液备用。实验菌株国际标准菌株ATCC35984是一种生物膜阳性的表皮葡萄球菌，购于复 旦大学上海医学院分子病毒学实验室。取低温保存的菌种用TSB琼脂平板划线后37静态 培养24h后调取单克隆菌落，无菌玻璃管加2. 5mlTSB液体培养基放入摇床IOOrpm扩增8h 后的细菌悬液离心(8000gX5min)后，去上清后用0. 85%盐水小心洗去残留的上清后再次 离心(8000gX5min)，去上清得细菌备用。(四)钛纳米盲孔表面对细胞黏附增殖的影响Ti与NTi消毒后放入12孔板孔底，每孔加1. 5ml的上述细胞悬液，细胞密度为 1 X IO4个/ml，重复3孔，放入37°C，5% CO2培养箱，分别于1，2，3d每组各取出DAPI染色 荧光显微镜计数表面细胞数量；并于6h，Id, 3d取出放入2. 5%戊二醛4°C固定送检SEM观 察细胞生长状况。DAPI的中文名称是4，6-联脒_2_苯基吲哚，是一种常用的荧光染料，可穿透细胞 膜与核中的双链DNA结合而发挥标记的作用，可以产生比自身强20多倍的荧光，按照其说 明书储存液用ddH20配成lmg/ml的浓度，工作液用ddH20稀释为10ug/ml，4°C避光保存。上 述接种细胞后的Ti与NTi从培养基中取出后用PBS轻轻洗涤2次以去除未黏附的细胞，放 进95%酒精固定lOmin，DAPI工作液染色15min，PBS冲洗6次，荧光显微镜观察。(五)钛纳米盲孔表面对C3H10T1/2细胞成骨分化的影响Ti与NTi消毒后放入12孔板孔底，每孔加1. 5ml的上述细胞悬液，细胞密度为 1 X IO4个/ml，重复3孔，放入37°C，5 % CO2培养箱，24h后更换1. 5mlDMEM成骨诱导培养 基，每3d换液。培养14d后碱性磷酸酶染色观察表面细胞分化，按照碱性磷酸酶染色试剂盒操 作(1)用二甲基甲酰胺溶解底物后，倒入缓冲液中，注意需将安瓿内全部底物溶解；(2)再 加入固紫B混勻；(3) Ti与NTi取出PBS轻轻洗涤3次后放入固定液4°C 30s ； (4)取出Ti 与NTi，ddH20冲洗，空气晾干；(5)加工作液于培养皿浸Ti与NTi，置37°C水浴箱45min ； (6)取出，荧光显微镜拍照。(7)拍照后密封，放入4°C冰箱保存。(六)钛纳米盲孔表面对细菌黏附增殖及形成生物膜的影响L7012 live/dead baclight viability kit 含有两种荧光染液 SYST09 和 PI，前 者使活细菌发出绿色荧光，而后者使死细菌发出红色荧光，从而可以在镜下区分活细菌和 死细菌。按说明书的比例SYT09 PI ddH20=l. 5ul 1. 5ul Iml将三种试剂加入 同一离心管，振荡混勻备用，每一标本用染液200ul，以上操作均在避光条件下进行。Ti与 NTi消毒后放入12孔板孔底，每孔加1. 5ml上述细菌悬液，密度为1 X IO5个/ml，放入培养 箱有氧37°C培养24h，弃培养液，PBS轻轻洗涤3次，在各标本表面滴加200ul上述配制好 的染液，铝箔包裹避光室温孵育15min后，标本至于正置荧光显微镜下观察。(七)扫描电镜观察纳米微盲孔表面对表皮葡萄球菌生物膜形成的影响Ti与NTi消毒后放入12孔板孔底，每孔加1. 5ml上述细菌悬液，密度为1 X IO5个 /ml，放入培养箱有氧37°C培养24h，弃培养液，PBS轻轻洗涤3次，将各组钛板用2. 5%戊 二醛初始固定，4°C，2h。PBS漂洗lh，放入0. 锇酸固定lh，梯度酒精脱水(30%，50%， 70%，80%，90%，95%及100% )各lOmin。临界点干燥，喷金。在扫描电子显微镜(JE0LJSM-6360LV,日本)下观察并拍照。二，结果(一 )钛纳米盲孔表面图1为采用阳极氧化的方法在纯钛基体上制备出的Ti02纳米盲孔阵列。图1 (a和 b)所示纳米盲孔阵列均勻排列，每个纳米盲孔的形状不是规则的圆形，而是呈现不规则的 圆形，纳米盲孔内孔径约为80nm，管壁约为20nm。纳米盲孔的长度约为200nm(见图1 (c))。 纳米盲孔的底部是封闭的，在纳米盲孔与钛基体之间，呈现一个个不规则的圆形，与管口处 的形状是相对应的(见图1(d))。由此可得出该纳米盲孔阵列膜层可分为三层，最上面是纳 米盲孔层，中间是Ti02阻挡层，最后是Ti基底层。( 二)钛纳米盲孔表面细胞的黏附增殖Ti与NTi表面黏附增殖实验所示，随时间的延长，两种表面上黏附的细胞数量均 明显增加(P < 0. 001)，Ti与NTi表面种植细胞共培养1，2，3d后，经DAPI染色荧光显微镜 观察，NTi表面细胞的黏附增殖较Ti显著高(ρ <0.001)，见图2及图3。SEM观察不同时 间点C3H10T1/2细胞在Ti与NTi的生长形态共培养6h后，Ti组表面的细胞呈球形，尚未 铺展开生长，而NTi表面的细胞已经伸展开来，呈扁平状生长；共培养3d后观察，Ti组表面 的细胞也伸展开来，呈扁平状生长，细胞之间尚留有间隙，而NTi表面的细胞增殖旺盛，已 经全部铺满表面且相互接触呈梭形，高倍观察6h后纳米盲孔表面即见细胞突起较多且表 面有很多反映代谢旺盛的分泌颗粒，见图4。据此而知SOnm孔径的钛纳米盲孔表面具有促 进干细胞黏附增殖的特性。(三)钛纳米盲孔表面细胞的成骨分化能力观察大量碱性磷酸酶(ALP)的分泌是干细胞向成骨细胞分化的一个特征，故 C3H10T1/2细胞如果向干细胞分化则具有较强的ALP活性。Ti、NTi表面种植C3H10T1/2细 胞共培养液14d后ALP试剂盒染色后荧光显微镜镜下观察，ALP染色阳性细胞呈红色，如图 5所示，NTi表面ALP染色阳性细胞密度显著高于Ti表面。(四)荧光显微镜观察钛纳米盲孔表面对细菌黏附增殖及形成生物膜的影响经过TSB细菌培养基24h共培养，在Ti与NTi表面的三种细菌都有一定的黏附生 长，经live/dead bacIightTM viability kit荧光染液染色后荧光显微镜观察发现Ti表 面黏附的细菌量较NTi表面显著多；Ti表面黏附的绿色活菌与红色死菌的量比较NTi表面 显著高，且Ti表面细菌多呈团块状分布形成生物膜，而NTi表面的细菌散在分布生物膜形 成受到抑制(见图6)。据此而知SOnm孔径的钛纳米盲孔表面具有抑制细菌的黏附及生物 膜形成的特性。(五)扫描电子显微镜观察钛纳米盲孔表面对细菌生物膜形成的影响为进一步证实钛纳米盲孔表面对细菌形成生物膜的抑制作用，本实验通过扫描电 子显微镜对这一过程进行观察，如图7所示，(a)图见经过24h后，ATCC35984在普通钛板表 面有明显的生物膜形成，致密排列大量的葡萄球菌聚集在一起，形成典型立体突起的蘑菇 状生物膜；而(b)图见经过24h后，ATCC35984在纳米微盲孔钛板表面细菌呈平铺生长，且 有许多表面裸露出来未见细菌生长，没有明显可见的蘑菇状突起的生物膜，表明在改表面， 表皮葡萄球菌的生物膜形成受到抑制。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为 本发明的保护范围。
权利要求
一种表面具有纳米盲孔结构的骨科内植物，其特征在于，所述的骨科内植物表面具有纳米盲孔结构，所述的骨科内植物最上面是纳米盲孔层，中间是TiO2阻挡层，最下面是Ti基底层。
2.根据权利要求1所述的表面具有纳米盲孔结构的骨科内植物在重建骨关节结构和 功能、固定骨折、促进骨整合、防止感染和松动疾病中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种表面具有纳米盲孔结构的骨科内植物，所述的骨科内植物表面具有纳米盲孔结构，所述的骨科内植物最上面是纳米盲孔层，中间是TiO2阻挡层，最下面是Ti基底层。本发明还提供了表面具有纳米盲孔结构的骨科内植物的用途。本发明优点在于利用纳米化技术在骨科内植物表面制作纳米盲孔结构，具有纳米盲孔结构骨科内植物对具有多向分化潜能的小鼠C3H10T1/2成纤维细胞系的黏附增殖与分化具有促进作用；同时，该表面还对生物膜阳性的表皮葡萄球菌ATCC 35984有明显抑制作用，表现出一定的抗菌作用。综上，表面具有纳米盲孔结构的骨科内植物可提高骨科金属内植物材料表面骨整合及抗菌性能。
文档编号A61L27/50GK101934088SQ20091019568
公开日2011年1月5日 申请日期2009年9月15日 优先权日2009年9月15日
发明者何国, 倪嘉桦, 彭兆祥, 汤亭亭 申请人:上海交通大学医学院附属第九人民医院;上海交通大学