专利名称：增强抗原免疫原性以及天然和获得性免疫的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及应用从灵芝(Ga"0(ie/7wa /wcWw附，G /wc/(iw附或G 中分离的一种真菌免疫调节蛋白(flingal immunomodulatory protein, FIP) LZ-8 (或FIP-gts)促进树突状细胞(DCs)成熟的用途。本发明还涉及利 用LZ-8诱导DCs促炎性细胞因子和趋化因子的生成。本发明更涉及利用 LZ-8作为辅助剂促进DCs诱导的T细胞增殖。
背景技术：
树突状细胞(DCs)是专职的抗原提呈细胞(antigen-presenting cell), 作为连接天然和获得性免疫的桥梁(Steinman， R. M. Nat Med 2007;13:1155-1159.)。 DCs是异源性的，但其所有的亚群具有固有的协同 免疫调节功能(Wu， L. et al, Immunity 2007; 26:741-750; Iwasaki, A. Ann Rev Immunol 2007; 25:381-418.)。当暴露于特定的抗原或环境时，它们能 够引导天然T细胞朝向免疫原性或免疫耐受性的方向(Abbas, A.K. et al., Nat Immunol 2005; 6:227-228.)。当通过炎性介质或微生物致病体刺激时， DCs在迁移到淋巴的过程中变成熟，这显著地增强了 DCs激活抗原专一 性T细胞(antigen-specific T cells)的能力(Reis e Sousa， C Nat Rev Immunol 2006;6:476-483.)。 Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)在天然识别病 原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)禾口启动 DCs免疫应答中发挥着主要作用(Lee, M.S. et al, Ann Rev Biochem 2007; 76:13.1-13.34.)。 一旦TLR刺激，成熟DCs中II类MHC和协同刺激分子， 尤其是CD40、 CD80和CD86的表达就被上调。所有这些分子对启动T 细胞都是重要的(Kawai, T. et al, Semin Immunol 2007; 19:24-32.)。因DCs 在免疫应答中的关键调节作用，目前正在开发DCs来治疗癌症、变态反应和病毒感染，并作为有效新疫苗的辅助剂来预防或治疗癌症和感染性疾病
(Banchereau， J. et al， Nat Rev Immunol 2005; 5:296-306.; Steinman， R. M. et al， Nature 2007; 449:419-426.)。促进DC激活的物质能够潜在应用于免疫 疗法和疫苗接种。
从非褶菌目(々7/^//0/ /zora/^)、多数被称为多孔菌中已经分离出大量 有生物活性的天然物质。多孔菌是属于担子菌亚门(; /^/ww5awfew^coto) (担子菌)的一大类陆生真菌，它们与子囊菌门(^scom^oto)的一些种 一起形成了药理活性物质的主要来源(Zjawiony, J. K. et al， J Nat Prod 2004; 67:300-310.).灵芝(Gaw6^r應/腦'(i訓(Leyss. ex Fr.) Karst. (Ling-Zhi or Reishi))是一种有名的药用真菌，属于多孔菌科、菌褶少的担子菌类真菌。 在亚洲，这些菇类的医药性质，包括许多促进健康和治疗的效用，已被认 知有多个世纪。已经积累了许多关于灵芝(G/M"V/Wm)在治疗多种疾病， 比如肿瘤、癌转移、高血压、肝炎、胃炎、关节炎、支气管炎、哮喘、厌 食和免疫紊乱中的医药用途的证据(Lin, Z., Acta Pharmacol Sin 2004; 25:1387-1395; Lin, Z.J Pharmacol Sci 2005; 99:144-153.)。近来，研究人员 已经研究了从子实体、纯培养菌体和培养滤液(培养液)中提取或纯化的 生物活性组分的生物学作用(Shiao, M.S., The Chem Record 2003; 3:172-180.)。然而，灵芝的医药用途仍需要通过更另人信服的证据来支持。
从灵芝的担子果和菌丝体中分离出的药用活性化合物包括多糖、三蔽 类化合物、蛋白质、凝集素、甾醇、生物碱、核苷酸、内酯和脂肪酸(Zhou, X. et al， Phytochemistry 2006; 67:1985-2001.)。许多研究已经表明多糖是灵 芝的主要活性成分(Hsu，H.Y.etal， J Immunol 2004; 173:5989-5999.)。此 外， 一些研究已经证实灵芝中的天然三萜类化合物具有抗炎、抗肝炎和抗 癌活性(Wang, G. et al, Int Immunopharmacol 2007; 7:864-870.)。在灵芝的 研究中，与多糖和三萜类化合物相比，没有多少研究着重于蛋白功能的研 究(Jeurink, P. V. et al， Int Immunopharmacol 2008; 8:1124-1133.)。已从灵芝 菌丝体中分离出一种分子量为12.4kDa、命名为LZ-8的免疫调节蛋白 (Kino， K. et al， J Biol Chem 1989; 264:472-478.)。从另一个种松杉灵芝(G 中也分离到了该蛋白，命名为FIP-gts(Lin，W.H. etal,JBiolChem1997; 272:20044-20048.)。 一些研究已经表明LZ-8对自身免疫性和移植具 有免疫调节作用，并且LZ-8作为促细胞分裂剂来激活T细胞(Hsu， H.Y. et al.， J Cell Physiol 2008; 215:15-26.)。由于DCs在免疫系统中起着重要的作 用，因此灵芝对DCs的作用己被研究过，但也仅限多糖被鉴定过(Lin，Y. L. et al, Mol Pharmacol 2006; 70:637-644.)。因此，还没有报道揭示LZ-8 蛋白对DCs的作用。
图1表示骨髓源性树突状细胞(BMDCs)在LZ-8刺激后细胞因子和 趋化因子的生成。(A)剂量响应曲线。BMDCs用不同剂量的LZ-8培养6 小时，最后在布雷菲德菌素A的存在下培养4小时。通过流式细胞仪测定 生成的TNFa的CDllc+细胞的百分含量。(B和C) BMDCs用不同剂量的 LZ-8培养24小时(6小时用于TNFa)，收集上清液，用ELISA法测定(B) TNFa、 IL-la、 IL-ip、 IL-2、 IL画6和IL-12, (C) MCP-1、 MIP画la、 MIP-ip 和RANTES。误差线表示三份样品的士SD。所有的数据表示三次独立的实 验。
图2表示LZ-8蛋白诱导的BMDC活性并非由污染所造成。BMDCs 用LPS(20ng/ml)或LZ-8(5吗/ml)培养6小时，最后在布雷菲德菌素A的存 在下培养4小时。通过流式细胞仪测定生成TNFa的CDllc+细胞的百分 含量，并示于区域标记上方。(A)检验LPS、 LZ-8和背景对照组。(B) 在将LPS和LZ-8加入BMDCs之前，用多粘菌素(polymyxin) B(5|ag/ml， Sigma-Aldrich)处理30分钟。(C)处理之前用蛋白酶K处理LZ國8和LPS 1 小时。(D)处理前将LZ-8和LPS煮沸20和50分钟。数据表示三次独立 的实验。
图3表示LZ-8对BMDC成熟的促进。(A)用LZ-8(5pg/ml)(黑线) 处理或不处理(暗灰线)BMDCs 16小时。浅灰线表示用同类型匹配的对 照抗体染色。用流式细胞仪测定DC的成熟。将细胞用对I-Ab、 CD86、 CD80、 CD40、 CD54和CD119特异的单克隆抗体染色。(B)用 LZ-8(5pg/ml)、对照溶液(LZ-8溶液的背景)和LPS(20 ng/ml)对BMDCs培养或不处理16小时。通过在4。C (背景，灰线)和37。C (黑线)下右 旋糖苷-FITC的摄取来测定DCs的胞吞作用。区域标记上方表示 DeXtran-FITC+细胞的百分比。所示数据为在CDllc+细胞上的筛选。所有
数据表示三次独立的实验。
图4表示LZ-8处理的BMDCs对T细胞的激活。(A)从OT-I/OT-II 小鼠中分离出CD8+/CD4+ T细胞，并与LZ-8 (5 pg/ml)-和LPS (20 ng/ml)-激活的BMDCs以DC:T细胞数为2:l、在OVA257.264/OVA323-339肽(1 |Lig/ml)
的存在下一起培养72小时。在左面，通过[SH]胸腺嘧啶核苷的结合测定T 细胞的增殖。在右面，通过ELISA法测定IFN-y的生成。(B)经足垫注 射仅混有IFA或混有IFA + LZ-8 (10jig)的0￥八323-339肽(10吗)对C57BL/6 小鼠进行免疫。IO天后收集排出的淋巴结细胞，在96孔板中用不同浓度 的0￥^23.339肽培养3天。通过[3印胸腺嘧啶核苷的结合测定T细胞的增 殖。误差线表示三份样本士 SD。所有数据表示三次独立的实验。
图5表示通过LZ-8对BMDCs的刺激而诱导的MAPKs和NF-kB激 活。收获BMDCs、使其饥饿、用LZ-8(10 jag/ml)处理，然后在有效的时间 点将其溶解。将样品分离在SDS-PAGE凝胶上，转移到硝酸纤维素薄膜， 然后用蛋白印迹法(westernblotting)分析。分别用抗-磷酸化特异抗体和 抗-蛋白抗体检测磷酸化和未磷酸化的JNK、 ERK和p38MAPK蛋白。用 抗-IkB抗体测定IkB的降解。所示数据表示三次独立的实验。
图6表示LZ-8对巨噬细胞的激活。将RAW264.7细胞用LZ-8(5pg/ml) 和LPS(100ng/ml)培养16小时。收集上清液，用ELISA法测定TNFa的
生成。所示数据表示两次独立的实验。
图7表示LZ-8对人单核细胞源性树突状细胞(monocyte-derived DCs， MoDCs)的激活。将未成熟的MoDCs用LPS(lug/ml)、 poly(I:C) (pIC, 25 ug/ml)或各种浓度的LZ-8处理48小时。(A)将细胞用CD80、 CD86 (Immunotech)和CD83 (BD PharMingen)的抗体染色，然后用流式细胞仪分 析。数据表示三次独立的实验。(B)收集培养上清液，用人CBA(cytometric bead array)试剂盒分析细胞因子的生成。误差线表示三次独立实验的标准
7差。
发明内容
本发明提供了 一种LZ-8蛋白或LZ-8处理的树突状细胞通过激活树突 状细胞(dendritic cells, DCs)和巨噬细胞来增强天然和获得性免疫的用 途。本发明还提供了一种LZ-8蛋白融合抗原(LZ-8 protein-fUsed antigen) 在增强抗原的免疫原性的用途。
本发明另提供一个组合物，其包含LZ-8蛋白处理的树突状细胞。
具体实施例方式
DCs在启动和调节免疫应答中扮演着重要角色，并作为连接天然和获 得性免疫的桥梁。成熟的DCs能够吸引、干扰和激活天然T细胞从而启 动初级免疫应答。DCs还能够直接激活NK细胞，并能在遭遇病毒病原体 时生成大量的干扰素。本发明提供了一种LZ-8蛋白或LZ-8处理的树突状 细胞通过激活DCs和巨噬细胞增强天然和获得性免疫的用途。通过给予 LZ-8蛋白，DCs被激活并产生细胞因子和趋化因子。
之前的研究已经证实了LZ-8的免疫调节活性。然而，还不清楚LZ-8 蛋白是否对DCs发挥了任何作用。本发明揭示了 LZ-8蛋白可以激活DCs 和巨噬细胞。因此，在本发明中，介绍了通过给予LZ-8增强天然和获得 性免疫。
LZ-8蛋白通过促进DCs激活和成熟来调节获得性免疫。因为促炎因 子的生成是DC激活的主要证据，所以检测了 LZ-8在骨髓源性DC (BMDCs)中TNF的诱导。用LZ-8处理BMDCs后，生成的TNF与剂 量的关系表明LZ-8能够激活DCs (图1A)。除TNF之外，细胞内的IL-6 和IL-12p40也是可检测的。LZ-8处理后对其他细胞因子也进行了检测。 如图IB所示，LZ-8处理的BMDCs显著地分泌TNFa、 IL-la、 IL-ip、 IL-2、 IL-6和IL-12。趋化因子比如单核细胞趋化蛋白Kmonocyte chemoattractant protein 1， MCP-1)、巨噬细胞炎性蛋白la (macrophage inflammatory protein la， MIP-la)、巨噬细胞炎性蛋白l卩(macrophage inflammatory protein-l卩，MIP-ip)的生成、以及激活后的调制、正常T细胞的表达和分泌 (RANTES)，也通过LZ-8刺激的BMDCs发生(图1C)。本发明中的LZ國8 蛋白激活了 DCs从而分泌细胞因子和趋化因子，并增强了获得性免疫应答。
DCs的成熟是其调节功能的一个关键步骤。检测了 LZ-8刺激后 BMDCs的成熟状态。LZ-8通过上调II类MHC、 CD40、 CD54 (ICAM-1)、 CD80、 CD86的表达，以及下调CD119 (IFN-y受体)的表达，促进了 BMDC 的成熟(图3A)。 DC的激活还伴有大分子胞吞作用的降低。LZ-8的处理 降低了 BMDC对FITC-标记的右旋糖苷的摄取(图3B)。这些结果证明本 发明中的LZ-8能够激活DCs并促进DC成熟。
本发明证明了LZ-8刺激的BMDCs在体内体外均能诱导抗原特异性T 细胞的激活，同时也支持LZ-8能相对增强DC成熟的结果。诱导抗原特 异性T细胞的激活是成熟DCs的主要功能。LZ-8激活的BMDCs促进了 T 细胞增殖(图4A，上面)。被以LZ-8刺激的BMDCs激活所有T细胞， 在其刺激下生成更多的IFN-y (图4A，下面)。本发明还表明，在亚单位 免疫模型中，从LZ-8免疫小鼠中分离的T细胞，其在通过LZ-8的处理下， 其增殖活性增强(图4B)。因此，基于这种发现，本发明进一步提供了用 于增强抗原免疫原性的用途，包括给予受试者LZ-8蛋白融合抗原。本文 使用的LZ-8蛋白作为辅助剂增强受试者的免疫应答。在优选实施例中， LZ-8蛋白融合抗原经注射给予。
为了理解生物机制，本发明还提供了涉及LZ-8对BMDC激活的路径。 促分裂原活化蛋白^敫酶(mitogen-activated protein kinase, MAPKs)信号 传输路径和NF-kB路径被证实涉及DCs的激活和成熟。LZ-8蛋白诱导 MAPKs的激活(图5)。 MAPKs信号传输路径包括细胞外信号调节激酶 (extracellular signal-regulated kinases, ERK ) 、 JUN N画4瑞激酶(JUN N-terminal kinases, JNK)和应激活化蛋白激酶2A ( stress-activated protein kinase 2A) (p38)。
本发明的用途不仅是通过促进DCs的激活和成熟增强天然和获得性免疫，而且还通过诱导巨噬细胞的激活增强天然免疫。将巨噬细胞
RAW264.7 (RAW)细胞用LZ-8和LPS培养，用ELISA法测定TNF 的生 成。如图所示，LZ-8促进了RAW细胞中TNF的分泌。结果表明LZ-8 能够激活巨噬细胞并增强天然免疫。
本发明已经证实了LZ-8对小鼠DCs的影响。此外，由于人DCs与小 鼠DCs相比表现出一些不同的特征，所以还用LZ-8来处理人单核细胞源 性DCs (MoDCs)，并观察细胞集落。本发明表明LZ-8增强了LZ-8处理 过的MoDCs中CD80、 CD83和CD86的表达(图7A)。通过LZ-8的刺
激诱导了 MoDCs中细胞因子的生成(图7B)。细胞因子包括TNFa、IFN-Y、 IL-2和IL-6。数据证实了 LZ-8能够激活人DCs,这与在小鼠DCs上的作 用一致。因此，本发明还提供了LZ-8在哺乳动物(比如人)中以DC做免疫
治疗上的应用。
本发明的LZ-8蛋白分离自灵芝，或者通过重组蛋白技术在宿主细胞 中制得。宿主细胞可以是酵母或细菌系统。
所述的宿主细胞是酿酒酵母"acc/zaraw少cas ce^WWae)、毕赤酵母 (P油'a戸ton、)、汉逊酵母(//薩謂/" po/，o—")、产阮假丝酵母 (Om^fo W/fc)、波氏假丝酵母(Ca"fife/a 6w'Am7)、麦芽糖假丝酵母 (C朋AWa ma/tosa)、乳酸克鲁维斯酵母(K/i(yveramyc" /octo)、耶罗维 亚酵母(！2wTovWa酵母菌(5b/2丽w7/o呼cas oc"We齒/^)、粟 酒裂殖酵母(6b/^zoMcc譜w戸s/ ow6e)、球拟酵母(7brM/op^)、爿削/a "(iew/w/vonms1或曲霉菌(Ape^g7'〃MS) ". wV/w/<ms, vlA j. )、瑞氏木霉(7Hc。(ienwa rease/)。
本发明中的LZ-8还能在体外激活人MoDCs。因此，本发明提供了一 种LZ-8体外促进BMDC成熟和功能的用途，以及LZ-8处理的树突状细 胞促进BMDC成熟和功能。本发明能够应用于用于肿瘤治疗和感染性疾 病的基于DC的疫苗。
因此，本发明进一步结合树突状细胞疫苗的应用，可应用于癌症的治疗。本发明另提供一个组合物，其包含LZ-8蛋白处理的树突状细胞，此
组合物可促进T细胞的增生与活化。
下面的实施例并非用来限制本发明，而仅用来表示本发明的几个方面 和特点。
材料和方法
小鼠和DC培养
如前所述(Chu, C. L.， and C. A. Lowell, J Immunol 2005; 175:2880-2889.)，从C57BL/6小鼠(国家实验动物中心(National Laboratory Animal Center),台北，台湾)分离的骨髓中制备小鼠DCs。 OT-I禾fl OT-II TCR转基因小鼠由Clifford Lowell博士 (UCSF, CA)提供。所有的动物根 据实验动物管理及使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)核准的协议词养在NHRI (台湾)的栅栏设施中。
重组LZ-8的制备
在酿酒酵母(S. cwev&'a)中克隆和表达灵芝的LZ-8。然后将表达LZ-8 的细胞(或空载体作为对照)离心，并经过细胞破碎仪。离心溶菌产物， 并将上清液通过0.2|im的真空过滤器和分子筛，获得10kDa和100kDa之 间的蛋白。进一步利用具有Superdex75柱(GEHealthcare)的快速蛋白液相 色谱(Fast protein liquid chromatography, FPLC)纯化滤液。经FPLC测 定纯度为98%。
人MoDCs的制备
如前所述(Chu，C.L.etal.E J Immunol 2008; 38:166-173.)，从外周血 单核细胞(PBMCs)中生成MoDCs。简言之，用Ficoll-Paque通过密度梯 度离心法富集PBMCs，并在AIM-V培养基(Invitrogen公司)中37。C培 养2小时，然后将粘附的细胞培养在含2%加热灭活的自体同源血浆、1000 U/mL人IL-4 (Strathmann Biotec AG)和500 U/mL粒细胞巨噬细胞集落 朿U激因子(granulocyte- macrophage-colony-stimulating factor) (Leukomax;
实施例Novartis International AG，瑞士巴塞尔)的X-VIV015培养基中。第7天收 集松散粘附或漂浮的细胞作为未成熟的DCs。
统计学分析
利用二样本等方差二尾分布Student's t-检验，测定LZ-8处理组与对 照组相比对细胞因子和趋化因子的生成以及T细胞增殖的显著性影响。误 差线表示三样本的平均值士标准差(mean ±SD)。 p值小于0.05被认为具 有显著性差异。
实施例l
LZ-8刺激BMDCs生成细胞因子和趋化因子
为了测定LZ-8的作用，检测了 BMDCs中TNF 的诱导。LZ-8处理 后BMDCs的TNFoi生成与剂量相关(图1A)表明LZ-8能够潜在地激活 DCs。除了TNFa夕卜，细胞内的IL-6禾口 IL-12 p40也是可检测的(数据未 示)。我们利用ELISA法定量检测了由LZ-8处理过的BMDCs分泌的细胞 因子。如图IB所示，LZ-8处理过的BMDCs显著分泌TNFa、IL-la、IL-l卩、 IL-2、 IL-6和IL-12。我们还检测了趋化因子的生成，LZ-8剌激的BMDCs 生成MCP-1、 MIP-la、 MIP-1卩和RANTES (图IC)。
实施例2
由无污染的LZ-8蛋白激活BMDCs
本文使用的LZ-8蛋白来自酵母表达的重组蛋白。为了排除在LZ-8制 备过程中酵母成分污染的可能性，从表达空载体的酵母中制备背景溶液作 为对照。如图2A所示，对照溶液对BMDCs TNFa的生成没有影响，排除 了污染的影响。此外，多粘菌素B (PolymyxinB)未显著地抑制LZ-8的 活性，表明DC的激活不是因为内毒素的污染(图2B)。
此外，在LZ-8蛋白处理BMDCs之前，通过用蛋白酶K对其进行37 °C下1小时或100°C下加热25和50分钟使其失活。如图2C和2D所示， 用蛋白酶K消化和加热灭活的LZ-8丧失了刺激BMDCs的能力，提示该 活性源自LZ-8蛋白本身。这些数据证明LZ-8对DCs的刺激活性不是由酵母成分的污染引起的。
实施例3
LZ-8促进BMDC成熟
通过流式细胞仪检测了 LZ-8刺激后BMDCs的成熟状态。将培养6 天的BMDCs用LZ-8(5ng/ml)处理16小时。然后，将细胞用抗-CD16/CD32 单克隆抗体(mAb) 2.4G2(BDPharmingen)阻断，用针对CDllc、 CD40、 CD54、 CD80、 CD86、 CD119和I-Ab (Biolegend)的mAbs染色，并用流式 细胞仪分析。如图3A所示，LZ-8上调II类MHC、 CD40、 CD54 (ICAM-1)、 CD80和CD86的表达，并下调CD119 (IFN- 受体)的表达。
此外，已知DC的激活伴有大分子胞吞作用的降低。因此，还检测了 BMDCs的胞吞作用。将未处理过的或处理过的BMDCs用200pg/ml Dextran-FITC (M.W.~77 kD, Sigma-Aldrich)在4°C或37°C下培养1小时。 用冷PBS洗涤细胞，用抗-CDllc单克隆抗体对其染色，然后通过流式细 胞仪分析。如图3B所示，LZ-8的处理减少了 BMDCs对FITC-标记的右 旋糖苷的摄取。 一致的结果是，对照溶液未改变BMDCs的胞吞作用。这 些结果证明LZ-8能够激活DCs并促进DC成熟。
实施例4
LZ-8处理的DCs诱导T细胞的激活
诱导抗原特异性T细胞的激活是成熟DCs的主要功能。从OT-I或 OT-IITCR转基因小鼠中分离T细胞，将细胞与LZ-8-处理过的OVA257.264 (OVAw)-或OVA257.264 (OVAp2)-加BMDCs —起培养72小时。然后，通过[3^ 胸腺嘧啶核苷的结合测定T细胞的增殖。过程如下。如前所述测定BMDCs 的抗原提呈。简言之，通过使用EasySep阳性选择试剂盒(EasySep Positive Selection Kit) (StemCell Technology)纯化BMDCs，将细胞接种于96孔 平底板(Costar Coming),并加入lpg/ml含或不含LZ-8的OVAPi或OVAp2， 培养3小时。用EasySep阳性选择试剂盒从OT-I或OT-II TCR转基因小鼠 中分离出T细胞，并以DC/T细胞数=1/2，将T细胞加入到DC培养液 中。将细胞培养72小时，通过[3印胸腺嘧啶核苷的结合测定T细胞的增殖。如图4A所示(上面)，LZ-8激活的BMDCs在体外促发了比对照细 胞更多的T细胞增殖。此外，被以LZ-8刺激的BMDCs激活的所有T细 胞，其生成了比对照组细胞更多的IFN-Y (图4A，下面)。
还进一步进行了体内T细胞激活的检测。为了测定体内LZ-8对T细 胞激活的诱导，采用亚单位疫苗模型来评价LZ-8对T细胞启动的影响。 为了进行检验，用10 pg仅混有不完全佐齐y( incomplete Freund，s Adjuvant, IFA) (Sigma-Aldrich)或混有IFA + LZ-8 (lOjag)的OVAp2经足垫注射对 C57BL/6小鼠进行免疫。10天后从免疫的小鼠中分离排出的淋巴结细胞， 并将细胞用OVAp2培养3天。通过[3司胸腺嘧啶核苷的结合测定T细胞的 增殖。结果显示从LZ-8免疫的小鼠中分离的细胞比对照小鼠的细胞在应 答OVAp2时表现出更多的增殖(图4B)。这些数据揭示LZ-8刺激的BMDCs 在体内和体外均能诱导抗原特异性T细胞的激活，并且也支持LZ-8对DC 成熟有相对增强作用的结论。
通过LZ-8对BMDCs的刺激诱导的MAPKs和NF-kB的激活
为了探讨LZ-8诱导细胞激活的分子机制，检测了 LZ-8处理过的 BMDCs中MAPKs和NF-kB的激活。用LZ-8处理BMDCs,并通过蛋白 质印迹法分析了 JNK、 ERK和p38MAPK的失活和激活形式。过程如下。 收获BMDCs、使其饥饿3小时，然后用LZ-8处理(10 ng/ml)。将细胞 溶解、煮沸、在SDS-PAGE凝胶上分离，然后转移到ImmunobilonNC薄 膜(Millipore)。阻断后，将印迹用针对p38MAPK(Thrl80/Tyr182)、 ERK (Thr202/Tyr204)和JNK (Thrl83/Tyr185) (Cell Signaling Technology)的抗磷 酸特异性抗体或抗-p38 MAPK (Millipore) 、 ERK (BD Transduction Laboratories)、 JNK和IkB (Santa Cruz Biotechnology)抗体培养，接着用 HRP-共轭的二次抗体培养(Chemicon)。使用ECL检测试剂(Pierce)检 测免疫反应性。
结果显示LZ-8诱导了这些MAPKs的激活(图5)。此外，LZ-8还诱 导了 IkB的降解，提示该蛋白能够激活NF-icB路径。这些结果提示LZ-8通过激活MAPKs和NF-kB路径促进DC的成熟和发挥作用。 实施例6
LZ-8对巨噬细胞的激活
将RAW264.7细胞系培养在含10。/。胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、 2 mM谷氨酸盐、1%非必需氨基酸和1 mM丙酮酸钠的RPMI中。将细胞 置37。C 、 5% C02的湿润培养箱中。为了激活，将细胞用LZ-8 (5 mg/ml) 或LPS (100 ng/ml)处理16小时，收集上清液。用ELISA法测定TNFa的 生成。如图6所示，LZ-8促进了 RAW细胞中TNFa的分泌。这些结果表 明LZ-8能够激活巨噬细胞并增强天然免疫。
实施例7
LZ-8对人MoDCs的激活
为了探讨LZ-8对人DCs的影响，用LZ-8对人单核源性DCs(MoDCs) 进行处理，在培养物中表现出细胞集落(数据未示出)。然后通过流式细 胞仪检测LZ-8处理的MoDCs的成熟状态。将细胞用CD80、 CD86 (Immunotech)和CD83 (BD PharMingen)的抗体染色，然后通过流式细胞仪 分析。如图7A所示，LZ-8诱导了 MoDCs中CD80、 CD83和CD86的表 达。这些结果与在小鼠BMDCs中的一致。
此外，还检测了 LZ-8刺激后MoDCs的细胞因子的生成。为了检测细 胞因子的生成，培养24小时后，收集用TLR配体或有效LZ-8培养的MoDC 培养物的上清液。通过使用人流式微球分析(cytometric bead array)试剂 盒(BDPharMingen)检测细胞因子。如图7B所示，检测了 TNFa、 IFN-y、 IL-2和IL-6。令人意想不到的是，当与TLR-激活的细胞相比较时，还发 现LZ-8诱导了 MoDCs的IFN-y和IL-2的生成。这些数据证明LZ-8能激 活人DCs，这与其在小鼠DCs上的作用一致。
虽然已经足够详细地描述和举例说明了本发明，使本领域的技术人员 能够制造和使用它，但是在不脱离本发明的宗旨和范围的情形下，各种替 换、修改和改进是显而易见的。本领域的技术人员很容易理解本发明能够充分实现本发明的目的，并 获得所提到的结果和优点，以及其中固有的优点。生成它们的过程和方法 是优选实施例的代表，是示意性的，并不用来限制本发明的保护范围。本 领域的技术人员容易想到其中的修改以及其他用途。这些修改也包含在本 发明的精神内并受到权利要求范围的限定。
权利要求
1.LZ-8蛋白或LZ-8蛋白处理的树突状细胞通过激活树突状细胞和巨噬细胞增强天然和获得性免疫的用途。
2. 如权利要求l所述的用途，其特征在于，LZ-8蛋白是从灵芝中分离 得到或者通过重组蛋白技术在酵母或细菌系统中制备得到。
3. 如权利要求l所述的用途，其特征在于，激活树突状细胞生成细胞 因子和趋化因子。
4. 如权利要求l所述的用途，其特征在于，激活树突状细胞进一步包 含树突状细胞的成熟。
5. 如权利要求l所述的用途，其特征在于，巨噬细胞生成细胞因子。
6. 如权利要求4所述的用途，其特征在于，树突状细胞的成熟经过促 分裂原活化蛋白激醇路径或NF-kB的激活。
7. 如权利要求4所述的用途，其特征在于，树突状细胞的成熟诱导了 T细胞的激活和增殖。
8. 如权利要求3所述的用途，其特征在于，细胞因子选自由肿瘤坏死 因子-ou白细胞介素-1(3、白细胞介素-6、白细胞介素-10和白细胞介素-12组成的群组。
9. 如权利要求3所述的用途，其特征在于，趋化因子选自由单核细胞 趋化蛋白l、巨噬细胞炎性蛋白la、巨噬细胞炎性蛋白1(3组成的群组，并 且在激活时调节正常T-细胞表达和分泌。
10. 如权利要求6所述的用途，其特征在于，促分裂原活化蛋白激酶路 径选自由JUNN-端激酶、细胞外信号调节激酶和p38组成的群组。
11. 如权利要求7所述的用途，其特征在于，T细胞生成的细胞因子选 自由白细胞介素-2、白细胞介素-4和干扰素-Y组成的群组。
12. 如权利要求l所述的用途，其特征在于，进一步结合树突状细胞疫 苗的应用。
13. —种LZ-8蛋白融合抗原在增强抗原免疫原性中的用途。
14. 如权利要求12所述的用途，其特征在于，LZ-8蛋白融合抗原是通过重组蛋白技术在酵母或细菌系统中制得。
15. 如权利要求12所述的用途，其特征在于，LZ-8蛋白融合抗原用作 免疫辅助剂。
16. 如权利要求13所述的用途，其特征在于，抗原的免疫原性通过 LZ-8在体内诱导的T细胞激活增强。
17. —种组合物，其特征在于，包含LZ-8蛋白处理的树突状细胞。
全文摘要
本发明是关于LZ-8蛋白或以LZ-8蛋白处理的树突状细胞通过激活树突状细胞和巨噬细胞增强天然和获得性免疫的用途；以及一种LZ-8蛋白融合抗原在增强抗原免疫原性中的用途。本发明更提供一种组合物，其内含以LZ-8蛋白处理的树突状细胞，可刺激T细胞的活化。
文档编号A61K39/00GK101584861SQ20091020291
公开日2009年11月25日 申请日期2009年5月18日 优先权日2008年5月16日
发明者朱清良, 陈子智 申请人:益生生技开发股份有限公司