专利名称：包括通过调节先天免疫治疗和预防感染在内的治疗和预防免疫相关疾病的新型肽的制作方法
技术领域：
0002本发明涉及用于预防和治疗免疫相关疾病，包括通过调节先天 免疫治疗和预防感染的肽。 一方面，本发明涉及组合物及其调节先天 免疫的用途。另一方面，本发明提供了新型肽及其有效减少二肽基肽 酶IV (DPPIV)活性的用途。
背景技术：
随着抗菌药耐药性的日益严重以及新传染病的出现，存在着对
新型治疗性化合物的持续需求。作用于宿主而非致病菌的治疗是理想 的，因为其不促使致病菌产生耐药性。尤其是经先天免疫系统作用于 宿主的药物提供了一种有前景的治疗来源。先天免疫系统提供了一系列的保护机制，包括上皮屏障功能， 以及细胞因子和趋化因子的分泌。到目前为止，根据保守N端半胱氨 酸基序C、 CC、 CXC和CX3C(其中X是一个非保守的氨基酸残基) 的数量，趋化因子被分为四个家族。已知CXC趋化因子对带有 CXCR3受体的细胞，包括单核细胞，活化T细胞(Thl)和NK细 胞，有趋化效应。原代人类呼吸道上皮细胞和细胞系16-HBE组成型表 达CXCR3受体及其配体，IP-IO、 I-TAC和MIG (Kelsen d a/., The chemokine receptor CXCR3 and its splice variant are expressed in human airway epithelial cells(趋化因子受体CXCR3及其剪切变体在人呼吸道上
皮细胞中表达)，爿肌J P/j>wW.丄柳g CW/ Mo/. P/z>w'o/.， 287:L584, 2004)。此外，CXCR3配体诱导16-HBE细胞内的趋化反应和肌动蛋白 重组(Kelsen a/., The chemokine receptor CXCR3 and its splice variant are expressed in human airway epithelial cells(趋叶匕因子受体CXCR3及其 剪切变体在人呼吸道上皮细胞中表达)，J肌J P/7>w'o/.Ce〃 Mo/, /^>w'oZ.,287:L584, 2004)。
0009此外II型跨膜丝氨酸蛋白酶二肽酰肽酶IV (DPPIV)又称为 CD26或腺苷脱氨酶结合蛋白，是一个调节各种生理过程，包括免疫功 能的重要调节子。CD26/DPPIV是一个110 kD的细胞表面糖蛋白，主 要在成熟胸腺细胞、活化的T细胞、B细胞、NK细胞，巨噬细胞和上 皮细胞上表达。它至少有两种功能，信号传导功能和蛋白水解功能 (Morimoto C, Schlossman SF. The structure and function of CD26 in the T-cell immune response(T细胞免疫反应中CD26的结构和功能).Immunol. Review, 1998， 161 : 55-70.)。它的一个细胞作用涉及从趋化因子N端裂 解二肽来调节趋化因子活性。趋化因子氨基末端的调节不仅对与其受 体的结合以及下列反应，而且对改变经处理的趋化因子的受体特异 性，都是非常重要的。DPPIV活性已与许多免疫相关疾病相关联。
发明概述
OOIO]本发明人已发现，具有表1所列和所述肽之一的氨基酸序列的
肽，或其类似物，衍生物，或变体，能增强宿主的先天免疫。 一方 面，本发明的免疫调节肽表现出提高受感染宿主存活能力时，被发现
缺乏抗菌活性。另一方面，本发明提供了调节DPPIV活性的肽。 一方 面本发明提供了降低DPPIV活性的肽。但另一方面，本发明提供了可 用于诊断，治疗或预防如与DPPIV活性和/或先天免疫相关的免疫系统 疾病的肽。另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包括一种具有或 包含表1氨基酸序列的分离肽，或其类似物、衍生物、或变体(包括 药学上可接受的盐，加成盐，或上述任何物质的酯，或多晶型)，以 及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。另一方面，本发明提供了一种通过将具有或包含表1氨基酸序 列的肽，或其类似物、衍生物、或变体或明显化学等同物施用于受试 者，来治疗和/或预防受试者感染(例如微生物感染)的方法。举例来 说，受试者可能受到感染，或有感染的风险。在一个实施方案中，所 述肽调节受试者的先天免疫，从而治疗和/或预防受试者感染。本发明 还提供了 一种方法，其用于鉴别可用本发明的肽治疗的微生物感染。
另一方面，本发明提供了一种治疗或预防DDPIV相关疾病的方法。
本发明的方法可治疗和/或预防的代表性感染，包括
细菌感染(例如革兰氏阳性或革兰氏阴性菌)，真菌感染，寄生虫感 染和病毒感染。在本发明的一个实施方案中，这种感染是细菌感染 (如大肠杆菌(￡. co//)、肺炎克雷伯氏菌(幻eZwW/a ; "e"wom'ae)、绿脓 杆菌(尸化M(iomo"as aewg〖wwa)、 沙门氏杆菌(Sa/wo"e/Za s; p.)、金黄色 葡萄球菌(5to; /^/ococaw awews)、链球菌(5^e/ fococci^ s/7/ .)、或抗万 古霉素肠球菌感染)。在另一实施方案中，所述感染是真菌感染(例 如霉、酵母、或更高级的真菌感染)。在另一实施方案中，所述感染 是寄生性感染(例如单细胞或多细胞寄生虫感染，包括贾第鞭毛虫 (G/ara^3f <^(%/6""//力、小3求隐孑包子虫(Ojptoy/7oW(i/ww /wrvww)、 圓孑包子 ^求虫(Cyc/(w/ on3 cqyetowe"J7'力禾口弓形虫(Tbxop/oswa go"c ") ) 。 4旦在另 一实施方案中，所述感染是病毒性感染(例如爱滋病、禽流感、水 痘、感冒疮、伤风感冒、肠胃炎、腺发烧、流感、麻疹、腮腺炎、咽
炎、肺炎、风疹、非典型性肺炎、下或上呼吸道感染相关病毒(例如 呼吸道合胞病毒))。
0018按照本发明的方法，具有或包含表1氨基酸序列的肽，或其类 似物、衍生物、或变体可以直接(即把肽本身施用于受试者)或间接 (例如以允许该肽在受试者内表达的方式把编码该肽的核酸序列施用于 受试者)施用于受试者。本发明的肽(或编码该肽的核酸)可以口 服，胃肠外(例如皮内，肌注，腹腔注射，静脉注射或皮下注射)， 透皮，滴鼻，肺部(例如气管内给药)和/或由渗透泵施用于受试者。
根据本发明方法，可检测受试者诊断样品的标记物表达，用所 知领域容易确定的技术(如免疫技术，杂交分析，荧光成像技术，和/ 或放射性检测)，以及本文公开的任何检测方法(如免疫沉定反应， 蛋白质印迹分析等)，可以检测诊断样本中标记物表达。例如可以用 与炎症标记物起反应的物质检验受试者诊断样本的标记物表达。本文 所用的"起反应的，，是指该物质对标记物有亲和力，能键合于标记物， 或直接作用于标记物。本文进一步使用的"物质"包括蛋白质，多肽， 肽，核酸(包括DNA或RNA),抗体，Fab片段，片段，分子，化合 物，抗生素，药物及其任意组合。优选得，依据本文所述的技术，本 发明的物质用可^r测的标记物或标签标记。在本发明的 一 实施方案 中，与该标记物反应的物质是一种抗体。或者，通过对提取自受试者诊断样品的核酸进行杂交分析，以 检验受试者诊断样品的标记物表达。依据本发明的这种方法，可用 mRNA的Northern印迹分析进行杂交分析，也可用与编码标记物的核 酸杂交的一个或多个核酸进行DNA的Southern印迹分析。核酸4笨针可 以用本领域技术人员已知的多种技术来制备，包括但不限于下述技 术标记物核酸的限制性内切酶消化；4吏用如Applied Biosystems Model 392 DNA/RNA合成仪的商业上可购买的寡聚核苷酸合成仪自动 合成寡核苦酸，该寡核苷酸具有与标记物核酸的核苷酸序列的选定部 分对应的序列。在本发明的方法中，检测标记物表达后，可以进行测量或量化 受试者诊断样品中标记物表达程度的检测。这样的检测方法为本领域 技术人员所熟知，可以包括免疫组织化学/免疫细胞化学，流式细胞术
分析，质谱分析，蛋白质印迹分析，或ELISA法以计量标记物蛋白数 量。例如用免疫组织化学方法，可以把组织切片(石蜡包埋)置于载 玻片上，然后与标记物抗体一起孵育。载玻片可随后与二抗(针对一 抗而言)一起孵育，该二抗用染料或其它量热体系(比如荧光染料， 放射活化剂，或具有高电子扫描能力的物质)标记，以使切片中的标 记物显像。
0121本发明在下列实施例中描述，其阐述有助于理解本发明，并且 实施例
实施例1-肽的合成
001221表l中的肽用固相肽合成4支术合成
00123相对于lmmole所需的肽，所有所需Fmoc-保护的氨基酸以3 倍摩尔过量称量。然后将氨基酸溶于二甲基甲酰胺(DMF, 7.5ml)中 制成3mMo1的溶液。根据树脂的取代度，称取适量Rink amide MBHA 树脂。然后将该树脂转移到自动合成仪的反应容器里，用二氯甲烷 (DCM)预泡15分钟。由于这些肽的亲水性，无法使用乙醚分离。因此需要用氯仿提 取。蒸除TFA，将肽残余物溶于10%乙酸(15ml)。溶液用氯仿 (30ml)洗涤两次，以便将乙酸肽溶液的中的杂质和清除剂除去。然后 将肽的水溶液在-8()GC冷冻并冻干，得到可用HPLC纯化的肽冻干粉。
Eguchi K， Ueki Y， Shimomura C， Otsubo T, Nakao H, Migita K, Kawakami A, Matsunaga M, Tezuka H， Ishikawa N, et al. Increment in the Tal+ cells in the peripheral blood and thyroid tissue of patients with Graves' disease(格雷 夫斯病患者的外周血和曱状腺组织中Tal +细胞的增加).《/ /www"o/. 79卵Jww ",."2(7":W33-40.
Stecca BA, Nardo B， Chieco P， Mazziotti A, Bolondi L， Cavallari A. Aberrant dipeptidyl peptidase IV (DPP IV/CD26) expression in human hepatocellular carcinoma(人肝细胞癌中异常二肽基肽酶IV (DPP IV/CD26)表达)，J/fep"to/. /卯7爿wg,'27f2,B7-45.Hinke SA， Pospisilik JA, Demuth HU, Mannhart S, Kuhn-Wache K, Hoffmann T， Nishimura E, Pederson RA, Mcintosh CH. Dipeptidyl peptidase IV (DPIV/CD26) degradation of glucagon. Characterization of glucagon degradation products and DPIV-resistant analogs(胰高血糖素的二 肽基肽酶IV (DPP IV/CD26)降解。胰高血糖素降解产物和DPIV-抗性类 似物的鉴定)./Ao/CTzew. MMFe6 〃;275问:3S27-W.
Marguet D, Baggio L， Kobayashi T， Bernard AM, Pierres M, Nielsen PF, Ribel XJ, Watanabe T, Drucker DJ, Wagtmann N. Enhanced insulin secretion and improved glucose tolerance in mice lacking CD26(缺乏CD26的小鼠 中增强的胰岛素分泌以及提高的葡萄糖耐受性).尸rac A^/ JcadSd f/S
Nakao H, Eguchi K, Kawakami A, Migita K, Otsubo T, Ueki Y， Shimomura C, Tezuka H， Matsunaga M, Maeda K, et al. Increment of Tal positive cells in peripheral blood frompatients with rheumatoid arthritis(类风湿性关节炎 患者的外周血中Tal阳性细胞的增加).Ji^eww加o/. /9卵^/;/6(7"96>4-/0.
Constantinescu CS, Kamoim M, Dotti M， Farber RE, Galetta SL， Rostami A. A longitudinal study of the T cell activation marker CD26 in chronic progressive multiple sclerosis(慢性进行性多发性石更化症中T细月包活化标 记物CD26的演变的研究).JA^wra/Sc/.J柳;/30(^1:/7S-S2。
权利要求
1.一种分离的肽，其包括表1的氨基酸序列，或其类似物、衍生物或变体。
2. 权利要求1所述的分离的肽，其具有修饰的C-端和/或修饰的N-端。
3. 权利要求2所述的分离的肽，其具有修饰的C-端。
4. 权利要求3所述的分离的肽，其具有酰胺化的C-端。
5. 权利要求1所述的分离的肽，其包括至少一 D型氨基酸取 代修饰的表l氨基酸序列。
6. —种物质，其与权利要求1所述的肽起反应。
7. 权利要求6所述的物质，其为抗体。
8. 权利要求7所述的物质，其为单克隆抗体。
9. 一种分离的核酸分子，其编码权利要求1所述的肽。
10. —种重组核酸构建体，其包括可操作地连接到一种表达载 体上的权利要求9所述的核酸分子。
11. 至少一种宿主细胞，其包括权利要求10所述的重组核酸构建体。
12. —种制备包括表1所列氨基酸序列的肽，或其类似物、衍生 物、或变体的方法，所述方法包括步骤(a) 在允许该肽表达的条件下，培养权利要求11所述的至少一种 宿主细"包；和(b) 从该至少 一种宿主细胞或其培养基回收该肽。
13. —种药物组合物，其包括权利要求1所述的肽和药学上可 接受的载体、稀释剂或赋形剂。
14. 一种治疗和/或预防受试者感染的方法，其包括将一种包括 表1所列氨基酸序列的肽，或其类似物、衍生物、或变体施用于受试 者。
15. 权利要求14所述的方法，其中所述肽具有SEQIDNO: 1、 3-16、 18-60的氨基酸序列。
16. 权利要求14所述的方法，其中所述肽调节受试者的先天免 疫，从而治疗和/或预防受试者感染。
17. 权利要求14所述的方法，其中所述感染是微生物感染。
18. 权利要求17所述的方法，其中所述感染选自细菌感染、真菌 感染、寄生虫感染和病毒感染。
19. 权利要求18所述的方法，其中所述细菌是革兰氏阳性或革兰 氏阴性菌。
20. 权利要求19所述的方法，其中所述细菌选自大肠杆菌、肺炎 克雷伯氏菌、绿脓杆菌、沙门氏杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌和万 古霉素耐药的肠球菌。
21. 权利要求18所述的方法，其中所述真菌选自霉菌、酵母菌、 和更高级的真菌。
22. 权利要求18所述的方法，其中所述寄生虫是单细胞或多细胞的。
23. 权利要求22所述的方法，其中所述寄生虫选自十二指肠贾第 鞭毛虫、小球隐孢子虫、圆孢子球虫和弓形虫。
24. 权利要求18所述的方法，其中所述病毒与选自以下的疾病相 关爱滋病、禽流感、水痘、感冒疮、伤风感冒、肠胃炎、腺发烧、 流感、下呼吸道感染、麻疹、腮腺炎、咽炎、肺炎、风疹、非典型性 肺炎和上呼吸道感染。
25. 权利要求24所述的方法，其中所述病毒是呼吸道合胞病毒 (RSV)。
26. 权利要求14所述的方法，其中所迷受试者受到感染、或有感 染的风险。
27. 权利要求26所述的方法，其中所述肽是以口服给药、非肠道 给药、透皮给药、鼻内给药、呼吸道给药、或渗透泵方式给药。
28. —种预测受试者是否对微生物感染或免疫相关疾病的治疗有应答的方法，其中所述治疗包括将一种包括表1氨基酸序列的肽， 或其类似物、衍生物、或变体施用于受试者，该方法包括有DPPIV 底物存在，在允许DPPIV与底物反应的条件下，通过将本发明的肽施 用于样本，检测受试者诊断样本的DPPIV活性，其中较之没有肽的对 照组，所述DPPIV活性的减少表明受试者对治疗有应答。
29. —种分离的肽，其包含 一种选自SEQ. ID. NO. 1-60的氨基 酸序列。
30. 权利要求29所述的一种分离的肽，其中所述氨基i^列选自 SEQ.ID.NO. 1、 3-16、 18-60。
31. 权利要求30所述的一种分离的肽，其中所述氨基^f列选自 SEQ. ID.NO.l、 3-16、 18-54。
32. 权利要求29或30的任何一项所述的一种分离的肽，其包括 免疫活性。
33. 权利要求32所述的一种分离的肽，其由最多达10个的氨基 酸组成。
34. 权利要求32或33的任何一项所述的一种分离的肽在治疗 DPPIV相关疾病中的用途。
35. 权利要求32或33的任何一项所述的一种肽在治疗感染或先 天性免疫相关疾病中的用途。
全文摘要
一方面，本发明提供了分离的新型肽，其可用于调节受试者的先天免疫和/或用于治疗免疫相关疾病，包括通过调节先天免疫来预防和治疗感染。本发明还提供了一种与该肽反应的物质，一种包括该肽的药物组合物，一种编码该肽的分离的核酸分子，一种包括该核酸分子的核酸构建体，至少一种包括该重组核酸构建体的宿主细胞，以及一种利用该宿主细胞生产该肽的方法。本发明进一步提供了一种通过将本发明的肽施用于受试者以治疗和/或预防受试者感染的方法，从而调节受试者的先天免疫。此外，本发明提供了一种预测受试者是否对用本发明的肽治疗有应答的方法。
文档编号A61P31/00GK101351554SQ200680045440
公开日2009年1月21日 申请日期2006年10月4日 优先权日2005年10月4日
发明者A·罗策, O·多尼尼, S·W·伦茨 申请人:伊尼梅克斯制药公司