新型肽、其制备方法及其用途的制作方法

专利名称：新型肽、其制备方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及新型肽，特别是寡肽，而且它还涉及一种用于生产此类肽的方法及此类肽在生产药物中的用途。
背景技术：
补体系统是人和动物生物体的先天性免疫的最重要的组分之一。一般地作为免疫系统，补体系统能够识别、标记并除去侵入的病原体和改变的宿主结构(例如，凋亡细胞)。作为先天性免疫系统的一部分，补体系统形成针对病原性微生物的第一道生物体防线之一，但是它还在数个点处与适应性(获得性)免疫系统连接，可以说在先前性与适应性免疫机制间形成桥(Walport 2001a ；ffalport 2001b ；Morgan 2005)。补体系统是一种由约30种蛋白质组分组成的网络，所述组分可以以可溶性形式，而且还以附接于细胞表面的受体和调控剂(例如，抑制剂)形式存在于血浆中。该系统的主要组分是丝氨酸蛋白酶酶原，其以严格确定的次序以级联样方式彼此激活。激活的激酶的某些底物是含有硫酯键的蛋白质(补体系统中的补体C4和C3)。在激活的蛋白酶切割这些底物时，反应性硫酯基团被暴露于分子表面上，并且因此其能够将切割的分子附接于受攻击细胞的表面。由于这点，将此类细胞标记，从而它们可以被免疫系统识别。补体系统的生物学功能是极多样且复杂的，并且到目前为止，它们尚未在每个细节上得到探索。最重要的功能之一是直接的细胞毒性活性，其是通过自补体系统的末端组分形成的膜攻击复合物(MAC)触发的。MAP刺穿被视为外来的细胞的膜，这导致溶解，并且由此破坏此类细胞。补体系统的另一个重要的功能是调理作用，此时沉积于细胞表面上的活性补体组分(例如Clq、MBL、C4b、C3b)促进白细胞(例如，巨噬细胞)的吞噬。这些白细胞吞没要破坏的细胞。此外，补体系统的炎症启动作用也是有突出重要性的。补体激活期间释放的切割产物经由其对白细胞的趋化刺激效应而启动炎性过程(Mollnes2002)。补体系统的组分以无活性(酶原)形式存在于血浆中，直至合适的信号(例如，夕卜来细胞，即病原体的侵入)触发补体级联的激活。从维持免疫稳态方面看，补体系统的正常活性是重要的。其异常的活性不足及其不受控制的活性过度都可以导致严重疾病的形成或者导致已经存在的疾病的加重(Szebeni2004)。补体系统可以经由三种不同途径激活经典途径、凝集素途径和旁路途径。在经典途径的第一步中，Cl复合物结合作为识别为外来的生物学结构的激活物的表面。Cl复合物是一种由识别蛋白分子(Clq)和与其结合的丝氨酸蛋白酶(Clr，Cls)组成的超分子复合物(Arlaud 2002)。首先，Clq分子结合免疫复合物、凋亡细胞、C-反应蛋白及其它激活物结构。由于Clq分子与激活物的结合，存在于Cl复合物中的丝氨酸蛋白酶酶原逐渐被激活。在四聚体Cls-Clr-Clr-Cls中，首先Clr酶原自身激活，然后活性Clr分子切割并激活Cls分子。活性Cls切割补体系统的C4和C2组分，该切割产物是C3-转化酶酶复合物(C4bC2a)的前体。C3-转化酶分开C3组分，并转化为C5-转化酶(C4bC2aC3b)。C5-转化酶切割C5，、之后补体系统的激活以所有三种途径特征性的末期阶段(MAC的形成)告终。补体系统的不同途径，即凝集素途径的激活与经典途径的激活非常相似(Fujita2004)。然而，在此情况中，牵涉数种不同类型的识别分子MBL( “甘露糖结合凝集素”)和纤维胶凝蛋白(ficolin)(H、L和M型)。这些分子结合微生物表面上的碳水化合物结构。识别分子的结合继之以MASP-2( “MBL相关丝氨酸蛋白酶”-2)酶原的自身激活。激活的MASP-2切割C4和C2组分，这导致形成已经在经典途径的过程中描述的C3-转化酶酶复合物，并且从这点看，该过程如上文所描述的那样继续。 旁路途径以对C3组分的切割及其锚定于识别为外来的生物学结构的表面开始(Harboe 2008)。若切割过程中产生的C3b组分结合微生物的细胞膜，则同时它还结合称作因子B(C3bB)的丝氨酸蛋白酶酶原形式，其被以活性形式存在于血液中的因子D通过切割激活。以此方式产生的C3bBb复合物是旁路途径的C3-转化酶，其在与别的C3b分子完成后转化成C5转化酶。旁路途径也可以通过对C3组分(C3w)的缓慢水解独立地自发性触发，但是若经典途径或凝集素途径到达C3切割点，则旁路途径显著放大其效应。在上述途径中，我们极为详细地描述了凝集素途径，其最近已经被发现并且已经得到最少表征，而且其从本发明的方面看是最重要的。数种不同类型的蛋白酶和非催化性蛋白质结合以数种不同形式存在的识别分子(不同程度聚合的MBL和纤维胶凝蛋白)。MASP-2甚至本身能够启动补体级联(Ambrus 2003 ；Gal 2005)，但是这后一种酶以比MASP-I小的量(O. 5μ g/ml)存在。尚未完全探索以较高量(7 μ g/ml)存在的MASP-1蛋白酶的生理学功能。虽然MASP-I独自不能启动补体级联(其仅能切割C2，而非C4)，但是其活性可以在数个点补充MASP-2的活性，因此活性MASP-I可能是放大和完成凝集素途径的效应必需的。数个迹象指示在某种程度上，MASP-I是一种与凝血酶相似的蛋白酶，在血液中的两种主要蛋白水解级联系统补体系统和血液凝固系统间形成桥(Hajela 2002 ；Krarup 2008)。MASP-I和MASP-2两者的基因都具有可变剪接产物。MApl9(sMAP)蛋白是自MASP-2基因生成的，其含有MASP-2的前两个域(CUB1-EGF)。MASP-3mRNA自MASP-I基因转录。MASP-3的前5个域与MASP-I的域相同，但是它们在其丝氨酸蛋白酶域上有所不同。MASP-3对合成的底物具有低的蛋白水解活性，并且其天然底物是未知的。与其它早期蛋白酶不一样，它不与Cl-抑制剂分子形成复合物。可能地，MAp 19和MASP-3两者的存在对抗凝集素途径的激活，因为这些无蛋白水解活性的蛋白质与活性MASP-2和MASP-I酶竞争识别分子上的结合位点。如上文已经提及的，人或动物生物体中的补体系统的异常运行可以导致形成疾病。补体系统的不受控制的激活可以导致损害自身组织，并且形成炎性或自身免疫性状况(Beinrohr 2008)。这些状况之一是缺血-再灌注(下文为IR)损伤，其在组织的氧供应出于任何原因(例如，血管阻塞)而暂时受到限制或中断(缺血)时发生，并且在血液循环恢复(再灌注)后，开始细胞破坏。在再灌注期间，补体系统将缺血性细胞识别为改变的自身细胞，并且开始炎性反应以将它们除去。部分地，此现象是造成心脏梗死和中风后发生的组织损伤的原因，并且它还可以在冠状动脉旁路手术和器官移植期间引起并发症(Markiewski 2007)。凝集素途径可能在IR损伤的形成中发挥作用。出于此原因，对凝集素途径的有意抑制可以降低IR损伤的程度和后果。凝集素途径在类风湿性关节炎(下文为RA)的病例中也可以被激活，因为MBL结合在RA期间在关节中积累的具有改变的糖基化的抗体形式IgG-GO。补体系统的不受控制的活性在不同神经变性性疾病(例如阿耳茨海默氏、亨廷顿氏和帕金森病、多发性硬化(Sclerosis Multiplex))的形成和维持中也发挥作用，并且它也是年龄相关的黄斑变性(AMD)的发病机制中的主要因素之一(Bora 2008)。后一种临床现象占发达工业国家的年龄相关失明的所有病例的一半。补体系统还可以与自身免疫性肾炎形式之一(肾小球肾炎)及与另一种自身免疫性疾病，即SLE(系统性红斑狼疮)有关。若补体系统在第一步期间受到抑制，则对某些激活途径的有效且选择性抑制在不触发全身免疫抑制的前提下变为可能。通过抑制MASP-I和MASP-2酶，可以选择性阻断凝集素途径(例如，在上文所提及的疾病的情况中)，并且通过这点，让负责消除免疫复合物的经典途径不受影响，即发挥功能。Clr、Cls、MASP-l、MASP-2和MASP-3酶形成具有相同域结构的酶家族(Gcil 2007)。负责蛋白水解活性的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶(SP)域前面有5个非催化域。形成分子的N端部分的三个域CUB1-EGF-CUB2(CUB = Clr/Cls，海胆Uegf和骨形态发生蛋白-I ；EGF =表皮生长因子)负责分子的二聚化(同时在MASP-I和MASP-2的情况中)及负责与分子的相互作用，例如结合识别分子。分子的C端CCP1-CCP2-SP片段(CCP =补体控制蛋白)就其催化特性而言等同于整个分子。补体蛋白酶的特征性特征之一在于它们具有非常窄的底物特异性，它们能够切割仅几种蛋白质底物的定义明确的肽键。CCP模块和SP域两者都造成此细微调整的特异性。SP域含有丝氨酸蛋白酶的活性中心特征、底物结合袋和氧阴离子穴(oxyanionhole)。8个表面环区(其构象在不同蛋白酶中完全不同)在确定亚位点特异性方面发挥决定性作用。一方面，CCP模块稳定催化区的结构，而另一方面，它们含有大的蛋白质底物的结合位点。虽然一般用于抑制胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的小分子化合物(例如苄脒、NPGB、FUT-175)也抑制补体蛋白酶的活性(Schwertz 2008)，但是此抑制不是足够选择性的，它还延伸到使血浆中的其它丝氨酸蛋白酶，例如血液凝固酶、激肽释放酶失活。补体系统的唯一已知的天然抑制剂，即在血液中循环且属于丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(serpin)家族的Cl抑制剂蛋白也以相对较宽的特异性为特征。依照现有技术，不知道可以有效且选择性抑制凝集素途径的化合物或天然抑制剂蛋白质。发明概述对补体系统(包括凝集素途径)的抑制可以是一种在对抗由于补体系统的异常活性而发生的人和动物疾病中的有效工具。然而，目前不可获得如下的化合物，通过使用该化合物，可以以期望的程度抑制补体系统，主要为凝集素途径以抗击此类疾病。如已经在上文详细解释的，可以通过抑制MASP-I和MASP-2酶来选择性抑制凝集素途径。
出于此原因，我们旨在开发能够通过抑制MASP-I和/或MASP-2酶来选择性抑制补体系统的凝集素途径的化合物。令人惊讶地，我们发现了适合于上述目的的依照通式⑴的以下肽
GX1CSX2SX3PPX4CX5PD (I)其中X1 是 Y、Μ、W、I、V、A，且X2 是 R、K，且父3是丫、卩、1、] ^、0、!1，且X4 是 V、I、H，且X5 是 I、V、Y、F、W。依照上文，本发明涉及依照通式(I)的肽、其盐、酯和药学可接受前药。特别优选地，本发明涉及具有下列序列的肽和具有序列GICSRSLPPICIH)(SEQ IDNO 3)的肽的环形型式及其盐或酯GYCSRSYPPVCIPD(SEQ ID NO 2)，GICSRSLPPICIPD(SEQ ID NO 3)，GVCSRSLPPICWPD(SEQ ID NO 4),GMCSRSYPPVCIPD(SEQ ID NO 5)，GYCSRSIPPVCIPD(SEQ ID NO 6)，GWCSRSYPPVCIPD(SEQ ID NO 7)。最优选地，本发明涉及具有序列GYCSRSYPPVCiro (SEQ ID NO 2)和GICSRSLPPICIPD(SEQ ID NO 3)的肽、其盐和酯。此外，本发明还涉及药物制剂，其含有至少一种依照通式(I)的肽、其盐、酯或前药和至少一种别的添加剂。优选地，此添加剂是确保受控活性剂释放的基质。本发明特别涉及药物制剂，其含有至少一种具有下列序列的肽、具有序列GICSRSLPPICIPD(SEQ ID NO 3)的肽的环形型式、和/或其药学可接受盐和酯GYCSRSYPPVCIPD(SEQ ID NO 2)，GICSRSLPPICIPD(SEQ ID NO 3)，GVCSRSLPPICWPD(SEQ ID NO 4),GMCSRSYPPVCIPD(SEQ ID NO 5)，GYCSRSIPPVCIPD(SEQ ID NO 6)，GWCSRSYPPVCIPD(SEQ ID NO 7)。特别优选地，依照本发明的药物制剂含有具有序列GYCSRSYPPVCiro和GICSRSLPPICIPD的肽和/或其药学可接受盐和/或酯。本发明还涉及含有至少一种依照通式(I)的肽、其盐或酯的试剂盒。本发明还涉及潜在地抑制MASP酶的化合物的筛选方法，在所述方法过程中，将依照本发明的经标记的肽添加到含有MASP的溶液，然后，对其添加含有一种或多种要测试的化合物的溶液，并测量释放的标记肽的量。在这方面，优选地，MASP酶是MASP-I或MASP-2 酶。本发明还涉及依照通式(I)的肽及其药学可接受盐或酯在生产适合于治愈可以通过抑制补体系统治愈的疾病的药物制剂中的用途。依照这点，优选地，疾病可以选自下组炎性和自身免疫性疾病，特别优选地缺血-再灌注损伤、类风湿性关节炎、神经变性性疾病、年龄相关黄斑变性、肾小球肾炎、系统性红斑狼疮、和补体激活相关的假-变态反应。
本发明还涉及分离MASP酶的方法，在该方法的过程中，使具有一种或多种固定的依照通式(I)的肽的载体与含有MASP酶的溶液接触，并将制备物清洗。在这方面，优选地，MASP 酶是 MASP-I 或 MASP-2 酶。依照本发明的一些上述肽抑制MASP-I和MASP-2酶两者，其它肽仅抑制MASP-2酶而非MASP-I酶。然而，依照本发明的这些肽仅在非常高的浓度中才抑制与MASP酶紧密相关的凝血酶，而且一般它们也仅略抑制胰蛋白酶。附图
简述在图中图I显示了曬菌体展示方法的图示；图2显示了在琼脂糖凝胶上实施的实施例I. I. 3. 2中所描述的消化结果的检查(第I道指经消化的pMal_p2X IacIq基因，而第2道指经消化的pBlueKS_NheI_Nsi载体)；图3显示了测试的结果，在所述测试过程中，检查用于实施例I. I. 4. 3中所描述的连接和转化的载体和插入物以检查浓度；图4显示了在实施例2. 2. 2中所描述的连接测试方面制备的凝胶照片；图5显示了获得的序列的序列标志图(sequence logo diagram),其中图5. a显示了涉及选自MASP-2且对MASP-2特异的序列的序列图；图5. b显示了涉及选自MASP-2，而且还识别MASP-1的序列的序列图；及图5. c显示了涉及选自MASP-I，而且还识别MASP-2的序列的序列图。图6显示了依照本发明的肽对血液凝固的影响的剂量相关测试结果，其中图6. a显示了用于测量凝血酶时间的实验，在该实验的过程中，通过将凝血酶添加至血浆触发血浆凝固(血纤蛋白形成)；图6. b显示了用于测量凝血酶原时间的实验，在该实验的过程中，通过将组织因子添加至血浆触发血浆凝固(血纤蛋白形成)；及图6. c显示了用于测量激活的促凝血酶原激酶时间的实验，其模仿血液凝固的所谓的“接触激活”或“固有”途径；图7显示了依照本发明的肽对三种补体激活途径的影响，其中图7. a显示了选择性“S”肽的影响，而图7. b显示了非选择性“NS”肽的影响。发明详述本发明涉及选择性抑制MASP-I和MASP-2 (或仅MASP-2)酶的肽和肽衍生物。本发明还涉及氨基酸序列，其与所描述的序列顺序相似，并且其生物学活性在与所描述的序列比较时也是类似的。本领域技术人员发现明显的是，可以在不改变所讨论的肽的生物学功能的前提下实施某些侧变化修饰或氨基酸替换。此类修饰可以基于氨基酸侧链的相对相似性，例、如基于大小、电荷、疏水性、亲水性等的相似性。此类变化的目的可以是提高针对酶促分解的肽稳定性或者改善某些药动学参数。本发明的保护范围还包括肽，其中整合确保可检测性的组件(例如，荧光基团、放射性原子等)。此外，本发明的保护范围还包括肽，其在其N端、C端、或这两端含有几个其它氨基酸，只要这些其它氨基酸对初始序列的生物学活性没有显著的影响。位于末端的此类其它氨基酸的目的可以是便于固定，确保与其它试剂连接的可能性，影响溶解度、吸附和其它特征。我们使用IUPAC推荐 来标记给定序列中的氨基酸侧链(Nomenclature ofa -Amino Acids, Recommendations,1974-Biochemistry,14(2),1975)。本发明还涉及依照本发明的依照通式⑴的肽的药学可接受盐。通过这点，我们意图在与人或动物组织接触期间不导致不必要的毒性程度、刺激、变应性症状或相似现象的盐。作为酸加成盐的非限制性例子，提及下列各项乙酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、丁酸盐、二葡萄糖酸盐、半硫酸盐、延胡索酸盐、氢氯酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、乳酸盐(Iactare)、马来酸盐、甲烷磺酸盐、草酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐。作为碱加成盐的非限制性例子，提及基于下列各项的盐；碱金属和碱土金属(锂、钾、钠、I丐、镁、铝)、季铵盐、胺阳离子(甲胺、乙胺、二乙胺等等)。就本发明而言，前药是在体内转化成依照本发明的肽的化合物。例如，转化可以在酶促水解过程中在血液中发生。依照本发明的肽可以在药物制剂中使用，其中需要一种或多种添加剂以达到合适的生物学效应。此类制剂可以是与例如本领域技术人员普遍已知的确保受控活性剂释放的基质组合的药物制剂。一般地，确保受控活性剂释放的基质是聚合物，其在进入合适的组织(例如血浆)时例如在酶促或酸-碱水解过程中分解(例如，聚交酯、聚乙交酯)。在依照本发明的药物制剂中，还可以使用现有技术中已知的其它添加剂，诸如稀释剂、填充剂、PH调节剂、促进溶解的物质、颜色添加剂、抗氧化剂、防腐剂、等张剂等。这些添加剂是现有技术中已知的。优选地，可以经由胃肠外(静脉内、肌肉内、皮下等)施用使依照本发明的药物制剂进入生物体中。考虑到这点，优选地，药物组合物可以是水或非水溶液、分散体、悬浮液、乳剂、或固体(例如粉状)制剂，其可以在使用前直接转化成上述流体之一。在此类流体中，合适的媒介物、载体、稀释剂或溶剂可以是例如水、乙醇、不同多元醇(例如，甘油、丙二醇、聚乙二醇和相似的物质)、羧甲基纤维素、不同(植物)油、有机酯、和所有这些物质的混合物。依照本发明的药物制剂的优选配制剂包括片剂、粉剂、颗粒剂、栓剂、注射剂、糖浆剂等。所施用的剂量取决于给定疾病的类型、患者的性别、年龄、重量，而且取决于疾病的严重性。在口服施用的情况中，优选的日剂量可以例如在O.Olmg和Ig间变化，在胃肠外施用(例如静脉内施用的制剂)的情况中，就活性剂而言，优选的日剂量可以例如在0. OOlmg 和 IOOmg 间变化。此外，药物制剂也可以在现有技术中已知的脂质体或微囊剂中使用。也可以通过现有技术的基因疗法手段使依照本发明的肽进入靶生物体中。若为了达到期望的医学效果，需要选择性抑制MASP-I或MASP-2的活性剂，则应当优选地自依照本发明的依照通式(I)的肽选择选择性抑制肽。例如，选择性抑制MASP-2酶的依照本发明的肽可以是具有序列GYCSRSYPPVCiro (SEQ ID NO 2)的肽，而选择性抑制MASP-I酶的依照本发明的肽可以是具有序列GICSRSLPPICIH)(SEQ ID NO 3)的肽。为了达到某些治疗目的，可以优选地使用抑制MASP-I和MASP-2两者的肽，诸如具有序列GICSRSLPPICIPD (SEQ ID NO 3)的依照本发明的环肽。优选地，依照本发明的肽可以在不同试剂盒中使用，所述试剂盒可以用于测量或定位不同MASP酶(以对任一种MASP酶，或者同时对MASP-I和MASP-2酶两者特异性的方式)。此类用途可以延伸到竞争性和非竞争性测试、放射性免疫测定法、生物发光和化学发光测试、荧光测量测试、酶联测定法(例如ELISA)、免疫细胞化学测定法等。
依照本发明，试剂盒是特别优选的，其适合于例如在竞争性结合测定法中检查潜在的MASP酶抑制剂。借助于此类试剂盒，可以测量潜在的抑制剂的它可以多大程度自MASP酶置换依照本发明的肽的能力。为了检测它，依照本发明的肽需要以某种方式标记(例如，掺入荧光基团或放射性原子)。依照本发明的试剂盒还可以含有制备溶液和试剂需要的其它溶液、工具和起始物质和使用说明。还可以使用依照通式(I)的依照本发明的化合物(肽)来筛选潜在地抑制MASP酶的化合物。在此类筛选方法过程中，依照通式⑴的肽以经标记的(荧光、放射性等)形式使用以确保在后来的可检测性。将含有此类肽的制备物添加至含有MASP酶的溶液，在此过程中，肽结合MASP酶。在合适的温育期后，将含有要测试的化合物的溶液添加至制备物，其继之以再温育期。化合物对MASP酶的结合(若测试的化合物在与肽相同的位点，或者在别的地方，但是其结合以某种方式改变MASP酶的构象，使得其丧失其结合肽的能力，部分或完全结合酶的表面)以其抑制能力的程度自MASP分子置换经标记的肽。可以使用适合于检测对肽分子使用的(荧光或放射性)标记的任何方法来测定置换肽的浓度。可以以本领域技术人员已知的方式优化温育期、清洗条件、检测方法和其它参数。依照本发明的筛选方法也可以在高通量筛选(HTS)方法中使用。依照本发明的肽首先可以在疾病的医学治疗中使用，在该情况中，抑制补体系统的运行具有优选的效果。因此，本发明还涉及肽在生产用于治疗此类疾病的药物中的用途。如已经在上文详细解释的，此类疾病首先是某些炎性和自身免疫性疾病，特别是下列疾病缺血-再灌注损伤、类风湿性关节炎、神经变性性疾病(例如阿耳茨海默氏、亨廷顿氏和帕金森病、多发性硬化)、年龄相关的黄斑变性、肾小球肾炎、系统性红斑狼疮。还可以使用依照本发明的化合物来分离MASP蛋白，其通过将肽固定，并使以此方式生成的制备物与推测含有MASP酶的溶液接触来进行。若此溶液确实含有MASP酶，则它会经由固定的肽锚定。此方法可以适合于分析和制备目的两者。若给定肽在MASP酶上的结合几何学是未知的，则在此方法期间，应当使用自几个方向锚定的肽或甚至数种肽来确保合适的连接。含有MASP酶的溶液可以是纯的蛋白质溶液、纯化至不同程度的提取物、组织制备物等。噬菌体展示使用噬菌体展示方法来开发依照本发明的肽。噬菌体展示适合于实现定向体外进化，可以在图I中看到现有技术方法(Smith1985)的主要步骤。在此方法的过程中，牵涉进化的蛋白质的基因与噬菌体包膜蛋白基因连接。因此，在创建噬菌体时，生成融合蛋白，其被掺入噬菌体表面中。噬菌体颗粒在内部携带外来蛋白质的基因，而在其表面上，其展现出外来蛋白质。蛋白质及其基因经由噬菌体物理连接。对于定向蛋白质进化，我们改变其编码基因的密码子，这由我们小心地决定。可以基于合成寡核苷酸的混合物使用组合诱变同时改变许多密码子。同时确定突变位置和每个位置的变异性。在创建含有几十亿个变体的DNA文库，并使其进入细菌中后，创建噬菌体蛋白质文库。每个噬菌体仅展示一类蛋白质变体，并且仅携带此变体的基因。个别变体可以使用亲和层析和类似的方法来彼此分开，这基于其结合研究人员选择的给定靶分子(并且一般与表面连接)的能力进行。同时，与简单的蛋白质亲和层析相反，以此方式选择的噬菌体蛋白质变体具有两种重要的特征性特征。一方面，它们能够增殖，另一方面，它们携带包装在噬菌体颗粒中的编码基因。在进化期间，代替检查个别突变体，实际上同时实施几十亿个实验。将结合变体增殖，并且在数轮选择-增殖循环后，获得功能性变体中富集的群体。自此群体，在功能性测试中检查个别克隆，期间蛋白质仍在噬菌体上展示。通过对物理连接的基因测序来鉴定测试期间发现为合适的噬菌体蛋白质变体。除个别测量外，经由对数量大得适当的经功能选择的克隆的序列分析，还揭示了什么氨基酸序列能够履行功能。因此，制备基于真实实验的数据库，其使得有可能制作序列-功能函数。以此为基础发现为最好的变体也以独立的蛋白质生成，并且这些在更精确的其它测试中检查。创建文库SFTI (向日葵胰蛋白酶抑制剂)分子具有胰蛋白酶抑制活性，并且是一种具有以下序列的14个氨基酸的肽GRCTKSIPPICFPD(SEQ ID NO I)。在自然界中，即在向日葵植物中，其以环形形式产生，因此在这里标记为N端的甘氨酸和标记为C端的天冬酰胺酸通过肽键连接。两个半胱氨酸彼此形成二硫桥。体外测试已经证明若二硫桥是完整的，则上述线性形式也是一种有力的胰蛋白酶抑制剂(KorSinCzky，2001)。SFTI分子的另一种空间特征在于在结构上，其实际上与显著较大的Bowman-Birk抑制剂中与酶相互作用的分子部分相同(Luckett 1999 ；Korsinczky, 2001 ；Mulvenna 2005)。Bowman-Birk 抑制剂中保守的且与SFTI分子相同的部分加下划线GR￡IKSI￡￡I￡FPD。除了一个(第4位中的苏氨酸)之外，在创建文库时保留所有加下划线的部分。在设计文库时，使用以下随机化的方案G0￡0(R/K)00E￡0￡0尸/X加下划线的仍然
是出于结构原因而保持不变的位置。在位置“O”中，容许所有20种天然氨基酸，而在位置Pl中，仅容许用方案(R/K)标记的两种碱性氨基酸。斜体部分不变，因为基于我们的第一项期望，我们推测它们不与蛋白酶接触。为了能够在噬菌体展示期间选择高亲和力结合分子，至关重要的是展示的结合分子应当以每个噬菌体低拷贝数，理想地以一个单拷贝(单价噬菌体展示)呈现。通过这点，可以避免源自同时结合数个锚定的靶分子的表观高亲和力结合(亲合力)。为了这点，表达与胰凝乳蛋白酶抑制剂分子融合的上文所描述的SFTI文库，关于所述胰凝乳蛋白酶抑制剂分子，已经表明在与噬菌体蛋白P8连接表达时，它以每个噬菌体一个单拷贝出现(Szenthe 2007)。这是沙漠幢胰凝乳蛋白酶抑制剂(Schistocerca GregariaChymotrypsin Inhibitor, SGCI) (Malik, 1999),关于该抑制剂,我们在初步实验中表明它不抑制MASP酶，而且它甚至不结合这些酶。在SFTI文库的给定组件与SGCI分子间，我们还使用标签与文库的给定组件间的合适的距离保持肽连接来插入通过单克隆抗体可识别的线性表位标签。这是所谓的“Flag、标签”，其满足两个目的。这些之一是能够容易地表明噬菌体表面上的文库展示。另一个目的是在对由于对照选择(其使用针对标签的抗体进行)而获得的克隆测序后找出什么序列的克隆在缺乏特定靶酶，即MASPl和MASP2的情况中获得。因此，在与对抗体选择的这组比较对酶进行的选择的结果时，可以揭示典型的位置依赖性氨基酸偏爱，其实际上可以归因于对酶的结合，并且不是一些其它效应(例如，更有效的生成)的结果。
实施例在下文，本发明基于实施例更为详细地进行描述，然而，所述实施例不应视为限制本发明的实施例。经由实施例，显示了形成噬菌粒系统(实施例I)、制备文库(实施例2)、噬菌体选择(实施例3)的可能的方法和结果(实施例4)。在实施例5中，描述了肽合成和关联的分析测试。实施例I :开发噬菌粒系统I. I.开发噬菌粒载体在第一步中，从商业销售可获得的载体开始，我们开发出我们自身的噬菌粒载体。对此，我们必须创建新的限制性内切核酸酶切割位点，其使用Kunkel诱变(Kunkel，1991)实现。I. I. I.制备含有尿嘧啶的单链Kunkel模板I. I. I. I.转化O. 5 μ I pBluescript II KS (-)卩遼菌粒(Stratagene,产品目录编号212208-51. I μ g/μ l，2961bp)8μ I KCM 溶液[O. 5Μ KCl ；0. 15Μ CaCl2 ；0. 25Μ MgCl ]31. 5μ I USP 蒸馏水40 μ I CJ236K12大肠杆菌感受态细胞将转化体在冰上温育20分钟，然后于室温温育10分钟。我们添加其体积10倍量的LB培养基(800 μ I)，然后将其于37°C以200rpm摇动30分钟。然后，将100 μ I量于37°C在LB-氨苄青霉素平板[LB ；100 μ g/ml氨苄青霉素]上培养过夜。I. I. I. 2.感染次日，将菌落在2ml培养基[LB ; 100 μ g/ml氨苄青霉素，30 μ g/ml氯霉素]中接种，并将其于37°C温育过夜，以200rpm摇动。然后，将2μ I培养过夜的培养物接种到2ml与上文相同组成的培养基中，并且将其于37°C培养6小时，以200rpm摇动。然后，将其用30 μ I Μ13Κ07辅助噬菌体(ΝΕΒ，产品目录编号N0315S)感染，然后，将其于37°C培育40分钟，以200rpm摇动。将整个起始培养物转移到30ml [2YT，100 μ g/ml氨苄青霉素、30 μ g/ml氯霉素]培养基中。通过在以200rpm摇动的情况中将过夜培养物于37°C培养16-18小时生成噬菌体。次日早晨，将培养物于4°C以8，000离心10分钟。将上清液转移到清洁的管，并且在添加其体积1/5量(6ml)的溶液[2. 5M NaCl ；20% PEG-8000]，并将其于室温温育20 分钟后，自溶液沉淀噬菌体。将沉淀物以10，OOOrpm于4°C离心20分钟，移去上清液。将沉淀物在800 μ I PBS缓冲液中溶解。使用Qiapr印旋转Μ13试剂盒(Qiagen，产品目录编号27704)依照附于试剂盒的方案自噬菌体获得单链质粒，用100 μ I 10倍洗脱的EB缓冲液将其从柱洗脱。于260nm(ssDNS 0D260nm = I = 33ng/ μ I)以35倍稀释检查产物的浓度。由于上述方法获得的含尿嘧啶的单链PKS-噬菌粒载体的浓度是407 μ g/ml。I. I. 2.使用Kunkel诱变来引入切割位点Nsi和NheII. I. 2. I.寡聚物的磷酸化
突变引物Blue_NheI_in_779(36mer, SEQ ID NO 8)5， _cgcaattaaccctcagctagcggaacaaaagctggg_3，Blue_NsiI_in_1089(36mer, SEQ ID NO 9)5’ -ccgcctttgagtgagatgcatccgctcgccgcagcc-3>· 2 μ I IOx 浓缩的 TM 缓冲液
· 2μ I IOmM ATP· I μ I IOOmM DTT· I μ I T4 多核苷酸激酶(Fermentas, IOu/ μ I)· 36ng Blue_NheI 引物(4 μ I) /36ng Blue_Nsi 引物(3. 5 μ I)· 10 μ I USP 蒸馏水 /10. 5 μ I USP 蒸馏水分别用两种引物进行的两个磷酸化反应加起来为体积20 μ 1，并于37°C温育45分钟。I. I. 2. 2.寡核苷酸的杂交模板设置引物的比例，从而摩尔比例是25μ I体积中的I : 3。· 2. 5 μ I 单链 Kunkel 模板(I μ g)· 2 μ I 磷酸化的 Blue_NheI_ 引物· 2 μ I 磷酸化的 Blue_Nsi_ 引物· 2. 5 μ I IOx浓缩的TM缓冲液· 16 μ I USP 蒸馏水将反应混合物在90°C水浴中加热I分钟，然后将其立即转移到50°C恒温器中，再持续3分钟。然后将其离心较短的时间，并在冰中放置。I. I. 2. 3.双链产物的制备、纯化、消化在寡核苷酸杂交后，通过第二次DNA合成，体外生成双链产物，其中一条链含有尿嘧啶，它是初始Kunkel模板，但是携带突变并通过延长引物创建的另一条链不含尿嘧啶。· I μ I IOmM ATP· I μ I 25mM dNTP· I. 5μ I IOOmM DTT· O. 6μ I Τ4 连接酶(ΝΕΒ，400ιι/μ I)· O. 3 μ I Τ7 聚合酶(Fermentas, IOu/ μ I)将反应混合物于14°C温育过夜。将全部混合物在1%琼脂糖凝胶上运行，分离，并用Qiaquick凝胶提取试剂盒(Qiagen，产品目录编号28704)依照方案纯化。将产物在30 μ I EB缓冲液中洗脱，并依照上文提及的方案转化到大肠杆菌(E. coli)XLlBlue感受态细胞中。这些细胞分解含有尿嘧啶的链，从而在3ml培养物中培养的细菌中，主要存在着如下的克隆，其中经由不含尿嘧啶的突变链的复制来增殖载体。在50μ1 EB缓冲液中使用Mini Plus质粒DNA提取系统(Viogen，产品目录编号GF2001)试剂盒来分离双链载体。对于遗传操作的下一步，在25 μ I中在新进入的切割位点处消化产物。· 20 μ I载体微量制备物· 2. 5 μ I IOx 浓缩的 Y Tango 缓冲液(Fermentas)· I. 25 μ I USP 蒸馏水· O.50 μ I NheI(Fermentas,10u/ml)
· O. 75 μ I Nsi (Promega, 10u/ml)于37°C发生消化过夜。使用电泳在2%琼脂糖凝胶上检查产物，然后，在使用上文提及的方法自凝胶分离经消化的质粒后，将其用试剂盒纯化。以此方式获得的载体的名称是pBlueKS_NheI_Nsi。I. I. 3 添加 IacIq 基因I. I. 3. IPCR使用PCR 自 pMal_p2X 载体(NEB，产品目录编号 N8077S，200 μ g/ml)分离 IacIq 基因和麦芽糖结合蛋白(MBP)信号序列。引物pMal_lac_ 正向(SEQ ID NO 10)5， -gtcagtatgcatccgacaccatcgaatggtg-3，pMal_NheI_rev(SEQ ID NO 11)5， -gtcagtgctagcgccgaggcggaaaacatcatcg-3，· 5 μ I IOx浓缩的Pfu缓冲液· 0. 4 μ I 25mM dNTP· 10 μ I 25mM MgSO4· O. 5 μ I pMal_p2X 模板· O. 5 μ I 5 μ M pMal_lac_forward 引物· O. 5 μ I 5 μ M pMal Nhel_rev 引物· I μ I Pfu 聚合酶(Fermentas, 2, 5Wu/ μ I)· 36. 5 μ I USP 蒸馏水PCR期间使用的程序95 °C 180 秒95 °C 45 秒65 0C 45 秒72 0C 240 秒72 0C 480 秒将步骤2-4重复20次。I. I. 3. 2 消化使用GenElute PCR清除试剂盒(Sigma，产品目录编号NA1020)依照说明来纯化产物，然后用限制酶将其于37°C消化过夜以生成连接需要的可用粘性末端。· 20 μ I PCR 产物(IacIq 基因)
· 2· 5 μ I IOx 浓缩的 Y Tango 缓冲液(Fermentas)· I μ I Nsi 酶(=AvaIII, Fermentas, IOu/ μ I)· O. 5 μ I NheI 酶用如上述的试剂盒纯化经消化的PCR产物，然后与预先制备、消化并纯化的噬菌粒载体一起，将其在1%琼脂糖凝胶上检查。图2中显示了结果，其中第I道对应于经消化的pMal_p2X IacIq基因，而第2道对应于经消化的pBlueKS_NheI_Nsi载体。
I. I. 3. 3.连接2 μ I 经消化的 pBlueKS_NheI_Nsi 载体6 μ I 经消化的 pMal_p2X IacIq 基因I μ I IOx浓缩的Τ4连接酶缓冲液I μ I Τ4 连接酶(Fermentas, I 个 Weiss u/ μ I)将连接于室温实现2小时。然后，将连接的产物转化到40 μ I感受态大肠杆菌XLlBlue细胞中，如上文所提及的。将100 μ I经转化的产物[LB ; 100 μ g/ml氨苄青霉素]在琼脂板上涂布，并于37°C温育过夜。自形成的菌落接种微量制备培养物，并使用Viogen试剂盒来分离质粒。用限制性消化来检查连接，于37°C持续I小时。对于EcoRI酶，仅存在着一个在添加的IacIq基因内部的切割位点。·3. 5μ1微量制备产物· I μ I IOx EcoRI 缓冲液· O.26 μ I EcoRI 酶(Fermentas,IOu/μ I)· 5. 24 μ I USP 蒸馏水基于1%琼脂糖凝胶，可以看到发生消化，即连接是成功的。新的噬菌粒载体的名称是pBlueKS NheI_Nsi_lacIq。I. 1.4.进入表位标签和SGCI部分I. 1.4. 1.PCR用作表位的Flag标签的氨基酸序列是DYKDDDDK(SEQ ID NO 12)。将SGCI部分与包膜蛋白P8融合，并将表位标签与SGCI的N端融合。如已经如上文所提及的，SGCI的存在确保单价表达，从而一个噬菌体会在其表面上展示最多I个文库成员肽。引物pGP8-Tag-NheI(SEQ ID NO 13)5， -gtcagtgctagcatcggattataaagacgatgac-3>P8-XbaI-rev(SEQ ID NO 14)5’ -gtcagttctagattattagcttgctttcgaggtg-3>· 5 μ I IOx浓缩的Pfu缓冲液· 8 μ I 25mM MgSO4· O. 4 μ I 25mM dNTP· 2 μ I模板pGP8-Tag_SGCI载体(较早的构建体)· O. 5 μ I 5 μ M pGP8_Tag_NheI 引物· 0. 5 μ I 5 μ M P8_XbaI_rev 引物· I μ I Pfu 聚合酶(Ferm entas, 2, 5u/μ I)
· 36. 2 μ I USP 蒸馏水PCR期间使用的程序95 0C 180 秒95 0C 45 秒60 0C 45 秒72 0C 60 秒72 0C 480 秒将步骤2-4重复25次。使用Sigma GenElute PCR清除试剂盒依照方案纯化PCR产物。I. I. 4. 2.限制性消化用限制酶将PBlueKS_NheI_Nsi_lacIq载体于37°C消化2小时，以能够连接Flag标签-SGCI部分。· 2. 5 μ I pBlueKS_NheI_Nsi_lacIq 微量制备物· 3. 5 μ I IOx 浓缩的 Tango 缓冲液· I. 5 μ I XbaI (Fermentas, IOu/ μ I)· I.5 μ I NheI(Fermentas,IOu/μ I)· 3. 5 μ I USP 蒸馏水将产物自I %琼脂糖凝胶分离，用Viogen凝胶-M试剂盒纯化，并在45 μ I水中洗脱。然后，用碱性磷酸酶将产物于37°C处理45分钟。·自凝胶分离的43 μ I经消化的pBlueKS_NheI_Nsi_lacIq载体· I μ I 奸喊性憐酸酶(SAP, Fermentas, Iu/ μ I)· 5 μ I IOx浓缩的SAP缓冲液于65°C使磷酸酶热失活15分钟。I. I. 4. 3.连接和转化在制备反应混合物前，将载体和插入物在I. 8%琼脂糖凝胶上运行以检查浓度。图3中显示了结果。在图中，个别泳道具有下列意义I. 6 μ I Ikb DNA 梯(Fermentas)；2. Flag 标签 _SGCI_p8PCR 产物；及3.经消化的、纯化的 pBlueKS_NheI_Nsi_lacIq 载体。对于连接，将反应混合物和对照产物于室温温育90分钟。· 2 μ I pBlueKS_NheI_Nsi_lacIq 载体
· 7 μ I Flag 标签 _SGCI_p8PCR 产物· I μ I IOx浓缩的Τ4连接酶缓冲液
· I μ I T4 连接酶(Fermentas, I 个 Wu/ μ I)如上文所提及，将连接的产物转化到感受态大肠杆菌XLl Blue细胞中，涂布，并于37 °C培养过夜。用个别细菌菌落接种10个等分试样的培养基(各3ml)后，制备培养过夜的液体培养物，并自其分离双链质粒。通过XbaI和NheI酶生成的粘性末端也彼此相容，因此从10个克隆，通过DNA测序分离如下的克隆，在该克隆的情况中以合适的取向实现整合，并且使用Big Dye终止物v3. I循环测序试剂盒(Applied Biosystems ;产品目录编号4336917)系统来进行PCR反应。通过BIOMI Kft. (G6d6ll6)运行测序。在10份检查的样品中，找到2个良好的整合物。新载体的名称是pKS-Tag-SGCI-p8。I. I. 5.整合 Ser-Gly 衔接头对于单价表达,仓Il建功能性单元的下列序列文库成员-Ser/Gly/接头-Flag标签-SGCI-p8。对此，用NheI和XhoI酶打开pKS_Tag-SGCI-p8载体，由于此步骤，省略初始的Flag标签。然后，将载体连接到含有Gly-Ser接头(GGSGGSGG，SEQ ID NO 15)和Flag标签的衔接头，其提供有合适的NheI和XhoI粘性末端。为了检查连接，在Flag标签内部创建BamHI切割位点。此酶在两个位点处分开适当连接的载体，创建的产物长159个碱基对，其可以使用琼脂糖凝胶电泳来检测。
20 ill pKS-Tag-SGCI-p8 载体微量制备物 3 U I IOx Y Tango 缓冲液 2 U I XhoI(Fermentas,IOu/U I)*5111 USP 蒸馏水将载体于37°C消化2小时，然后在0. 8%琼脂糖凝胶上，对其检查消化是否完成，因为给定的条件对于XhoI不是理想的。然后，对其添加Iul NheI酶，并且将其于37°C温育I小时。用Viogen凝胶-M试剂盒自琼脂糖凝胶分离产物。将含有接头和Flag标签的衔接头退火到经消化的载体。衔接头Ser_Gly_ 正向(SEQ ID NO 16)5，-ctagctggcgggtcgggtggatccggtggcgattataaagacgatgatgacaaac-3，Ser_Gly_ 反向(SEQ ID NO 17)5，-tcgagtttgtcatcatcgtctttataatcgccaccggatccacccgacccgccag-3， 15 ill 经消化的 pKS-Tag-SGCI_p8 载体 2. 8 U I I. 3ng/ U I Ser_Gly_ 正向引物 I. 7ml 2. 2ng/ U I Ser-Gly_ 反向引物将反应混合物于90°C温育I分钟，然后于50°C温育3分钟，离心较短的时间，并在冰上放置。对于连接，对其添加下列各项-2. 2 U I IOx浓缩的T4连接酶缓冲液 I u I T4 连接酶(Fermentas, I 个 Weiss u/ U I)将连接于16°C实施过夜。如上文所描述的，转化感受态大肠杆菌XLlBlue细胞，然后将经转化的产物[LB ；100mg/ml]在平板上涂布。自菌落将起始物接种过夜，并且凭借、Viogen Mini-M试剂盒,依照指令纯化微量制备质粒。使用Big Dye终止物v3. I循环测序试剂盒用DNA测序来检查获得的样品，通过BIOMI Kft. (Godollo,Hungary)运行PCR产物。在下文中，基于以此方式制备的噬菌粒创建文库，其名称是pKS-SG-Tag-SGCI-p8。实施例2 :制备噬菌体文库用测序检查的pKS-SG-Tag-SGCI_p8载体充当用于创建DNA文库的模板，其借助于简并文库寡聚物和载体特异性寡聚物作为引物使用聚合酶链式反应(PCR)来创建。将以此方式创建的PCR产物在pKS-SG-Tag-SGCI-p8载体中整合。2. I. PCR
2. I. I.文库寡聚物如已经在上文所提及的，在设计文库时，使用以下随机化的方案G0￡0(R/K)00PP0C0尸从制备SFTI-文库，使得将6个选定的位置(“0”位置)完全随机化，也就是说，容许出现所有20种氨基酸，在位置Pl处，仅容许精氨酸和赖氨酸(“R/K”位置)。使用涉及简并寡核苷酸的IUPAC密码，文库的寡核苷酸序列如下(SEQ ID NO 19)5，-CC GCC GCC TCG GCG CTA GCA GGT NNK TGT NNK ARA NNKNNK CCTCCG NNK TGT NNK CCG GAT GGC GGG TCG GGT GGA TCCGGT GG-3，编码肽的部分是加下划线的，而随机化的密码子是粗体标记的。2. I. 2 制备 DNA 文库使用PCR来制备文库，其中一种寡聚物携带要整合的文库成员，而另一种寡聚物是通用外部引物。将全部反应混合物(其总计300iU)分入6个PCR管中。
30 ill IOx浓缩的Taq缓冲液 36u I 25mM MgCl2 2. 4u I 25mM dNTP 15 ii I 13 ii M SFTI-文库寡核苷酸.22 ill IOuM pVIII 3，弓 I物 9u I (450ng)pKS-SG_Tag-SGCI-p8 模板 180. 6u I USP 蒸馏水 5 U I Taq 聚合酶(Fermentas, 5u/ U I)程序I. 95°C 60 秒2. 95 °C 30 秒3. 50 °C 30 秒4. 72 °C 60 秒5. 72 °C 120 秒将步骤2-4重复15次。将PCR产物在I. 5%琼脂糖凝胶上检查，然后，将其用ExoI酶消化以除去引物。将其与每管I ill ExoI酶于37°C —起温育45分钟，然后将其于80°C失活。为了增殖同双链体，插入短的聚合循环，引物是一般使用的外部引物。pVIII_3，(SEQ ID NO 18)5’ -gctagttattgctcagcggtggcttgctttcgaggtgaatttc-3>将下列各项添加到每管 2. 5u I 2,5mM dNTP Iii I IOOiiM pVIII_3，引物 0. 8 U I Taq 聚合酶(Fermentas, 5u/ U I)程序与先前PCR的情况中一样，但是仅运行2个循环。
将产物再次在I. 5%琼脂糖凝胶上检查，然后，将其用ExoI酶消化，并在3个柱上将6个PCR管的内容物用Sigma PCR清除试剂盒依照方案纯化。在52 yl/柱的体积中在稀释IOx的EB缓冲液中发生洗脱。2. 2将DNA文库在pKS-SG_Tag-SGCI-p8噬菌粒载体中整合2. 2. I 消化将载体和充当插入物的DNA文库在两步中消化，首先将它们用NheI酶切割。可以不从反应混合物除去DNA文库消化过程中分离的不必要部分，因为它与产物具有几乎完全相同的大小。为了阻止此部分进入载体中，还在消化的第一步中添加SacI酶。在不必要部分的末端附近，它分离出小片段，其可以通过纯化除去，并且保留在那里的较大部分不能与SacI的粘性末端连接。将温育于37°C实施8小时及过夜。
93u I pKS-SG-Tag-SGCI-p8 载体(40 U g) 15 U I IOx Y Tango 缓冲液 4 U I NheI 酶(Fermentas, IOu/ U I) 38u I USP 蒸馏水(V= 150 U I) 35u I DNS-文库 PCR 产物 15 U I IOx Y Tango 缓冲液 4 U I NheI 酶(Fermentas, IOu/ U I) 4 U I SacI 酶(Fermentas,IOu/U I)*38111 USP 蒸馏水(V= 150 ill)在下文中，两次添加产生另一粘性末端的Acc651 ( = KpnI)酶的量。还将Tango缓冲液的浓度加倍。对经消化的pKS-SG-Tag-SGCI_p8 载体 8 U I Acc651(Fermentas,IOu/U I) 19. 8u I IOx 浓缩的 Tango 缓冲液对经消化的DNA-文库 8 U I Acc651(Fermentas,IOu/U I) 11 u I IOx 浓缩的 Y Tango 缓冲液2. 2. 2 连接首先，自凝胶分离这两种经消化的产物。将载体自0. 8%琼脂糖凝胶分离，分入6个袋中，然后使用Viogen凝胶-M试剂盒在6个柱上纯化。将DNA-文库自I. 8%凝胶分离，并在3个柱上纯化(图4)。图中显示的凝胶图像的各道具有下列意义Llul IOObp DNA 梯 2. I ill 纯化的 DNA-文库3. I ill纯化的载体4. 5 U I Ikb DNA 梯使用所有样品进行连接，将它们分入6个管中，并于16°C温育18小时 210ml 纯化的 pKS-SG_Tag-SGCI-p8 载体
IOOml 纯化的 SFTI DNA-文库 2ml T4 连接酶(NEB，400，000ul/ml)*351111 USP 蒸馏水用Qiagen凝胶洗脱试剂盒纯化产物，它不从凝胶分离，仅在柱上纯化。在2x60 U I USP蒸馏水中实施洗脱。2. 3电穿孔、噬菌体文库的增殖 经由电穿孔将文库导入超级感受态细胞。我们的目的是将质粒导入尽可能多的细胞，从而我们的文库含有IO8-IO9个部分。将DNA文库(其位于USP蒸馏水中，因此它不含盐)添加至2x350ml超级感受态细胞。在具有0. 2cm直径的小杯中依照下列方案进行操作2. 5kV、200ohm、25ii F。电穿孔后，将细胞小心地转移到2x25ml SOC培养基中，以IOOrpm于37°C温育30分钟，然后采集样品，自其洗脱序列，并滴到[LB] [LB；100ug/ml氨苄青霉素]和[LB ；10ug/ml四环素]平板上，并将其于37°C培养过夜。在未电穿孔的对照产物和用水电穿孔的对照产物的情况中遵循相同的方法。在采集样品后，用2x 250 u I M13K07辅助噬菌体感染2x 25ml培养物，于37°C以220rpm摇动30分钟，然后接种全部的产物。将2x 250ml [2YT ；100 u g/ml氨苄青霉素；30 u g/ml卡那霉素]培养物在两个2升烧瓶中于37°C以220rpm培养18小时。基于滴定，我们的文库含有I. 2xl09个变体。实施例3 :噬菌体选择在下文的实施例中，我们表明对MASP-I和MASP-2靶酶选择依照上述实施例构建的文库。3. I 靶酶人MASP靶物由丝氨酸蛋白酶(SP)域和两个补体控制蛋白域(CCP-1，-2)组成(Gdl 2007)。这些是重组片段产物，其携带整个分子的催化活性。蛋白质以包含体形式生成，通过复性自所述包含体获得具有生物学活性的构象。通过阴离子和阳离子交换分离实施纯化。在溶液中及还在与ELISA板关联的形式中测试蛋白质的活性。生成详细记载于不同研究中(Ambrus 2003)。选择过程中使用的靶物的数据MASP-1CCP1-CCP2-SP Mw = 45478Da, c 储液=0. 58g/l (下文为 MASP-1).MASP-2CCP1-CCP2-SP Mw = 44017Da, c 储液=0. 45g/l (下文为 MASP-2)抗-Flag标签抗体c储液=4g/l, (Sigma,小鼠中生成的单克隆抗-FLAGM2抗体，产品目录编号F3165)3. 2选择步骤3. 2. I分离噬菌体在第2. 3章中所描述的操作结束时，将噬菌体在2x250ml培养物中生成18小时。在选择的第一步中，将它们分离以能够立即使用文库进行展示。将细胞培养物于4°C以8，OOOrpm离心10分钟。将上清液(其含有噬菌体)倒入清洁的离心管中，并对其添加其体积1/5的沉淀剂[2. 5M NaCl ；20% PEG-8000]。于室温发生沉淀20分钟。然后，将其以10，OOOrpm于4°C再离心15分钟。弃去上清液，将其再离心一段短时间，并吸去剩余的液体。将白色的噬菌体沉淀物在25ml [PBS ；5mg/ml BSA ；0. 05%Tween-20]缓冲液中溶解。为了除去可能的细胞碎片，将其再离心，并将上清液转移到清洁的管中。3. 2. 2.第一次选择循环a)固定将祀分子固定于96孔Nunc Maxisorp ELISA板(产品目录编号442404)上。在固定过程中，MASP-I和-2的浓度是20 ii g/ml，而抗Flag标签抗体的浓度是2 yg/ml。将蛋白质在固定缓冲液[200mM Na2CO3 ；pH 9. 4]中稀释，并将100 U I放进孔中。每种蛋白质优化固定期。在于室温以IlOrev/分钟混合60分钟的情况中温育MASP-1,将抗体温育30分钟，并将MASP-2于4°C温育过夜。在第一次选择循环中，使用每种靶蛋白12个孔。将每第二行保持为空。作为阴性对照，将仅固定缓冲液放进一行中。然后，以与用靶蛋白覆盖的各行相同的方式处理此行。b)封闭除去固定溶液，并将200 U I/孔封闭缓冲液[PBS ；5mg/ml BSA]放到平板 上。将其与室温温育至少I小时，期间将其以150rev/分钟混合。c)清洗使用11清洗缓冲液[PBS ；0. 05% Tween-20]将ELISA板清洗4次。d)选择将如上文所描述的那样分离的文库的噬菌体移液到平板上，每孔中100 ill。将其于室温温育，期间将以IlOrev/分钟混合2. 5小时。e)大肠杆菌XLlBlue培养物在选择期间，将从平板预先使用接种环新鲜挑出的XLI Blue细胞接种到2x30ml [2YT;IOii g/ml四环素]培养基中。后来会用自靶蛋白洗脱的噬菌体感染这些细胞。在感染时，细胞必须处于指数生长期。需要具有OD6tltol约0. 3-0.5的培养物，其通过将其于37°C以220rpm培养2_3小时获得。f)清洗使用3升清洗缓冲液来将ELISA板清洗12次。g)洗脱使用IOOmM HCl溶液以100 U I/孔实施洗脱。应用酸，摇动5分钟，然后将其自每孔逐一吸出。将自个别靶蛋白洗脱的噬菌体在管中收集，其中已经预先放进12x15u I IM Tris-碱缓冲液以快速中和含有噬菌体的酸溶液。将管立即混合，并在冰上放置。h)感染将4. 5ml指数生长期的XLlBlue培养物放进试管中，并且将其用500 U I自靶蛋白洗脱的噬菌体溶液感染。用自MASP-I和MASP-2、自抗体及自阴性对照物质洗脱的噬菌体实施总数4次感染。将培养物于37°C以220rpm温育30分钟。i)滴定自每种感染的培养物采集20-ii I样品，用2YT培养基将其稀释至其体积的10倍，并通过再稀释IOx来制备序列。自每个点，将IOiU [LB ;100ii g/ml氨苄青霉素]滴到平板上，并于37°C培养过夜。j)用辅助噬菌体感染取样后直接将50 U I M13K07辅助噬菌体添加到试管中的每种培养物，并将它们再温育30分钟。k)将所有经感染的培养物转移到3x200ml [2YT ；100 u g/ml氨苄青霉素；30 u g/ml卡那霉素]培养基中，并于37°C温育，期间将其以220rpm混合18小时。对照物质不再进一步处理，它仅是滴定需要的。I)富集次日早晨，检查滴定，并且仅在一次选择循环后，与对照物质相比可以检出大的差别。自抗体洗脱的噬菌体数目比自背景洗脱的噬菌体数目高4个数量级，在MASP的情况中，差别是1-1. 5个数量级。3. 2. 3.第二次选择循环
在此循环中，如在第一次选择循环的情况中那样重复相同的步骤，但是在封闭和清洗缓冲液中，使用2mg/ml酪蛋白(Pierce，产品目录编号37528)替换BSA。通过此修饰，可以避免结合BSA的噬菌体的增殖。在此步骤中，每种靶蛋白具有其自身的对照物质(12孔)，并将在先前的循环中洗脱并增殖的噬菌体放置在每种靶蛋白上。
分离持续18小时生成的噬菌体，如上文所描述的，但是结束时，将它们在IOml无菌PBS缓冲液中溶解。于268nm测量噬菌体溶液的浓度，然后将它们用[PBS ；2mg/ml酪蛋白；0. 05% Tween-20]缓冲液稀释，从而它们中的每种具有一致的OD268值0. 5，并且这是它们如何在引入步骤中使用。在第二次选择循环后，用300 u I洗脱的噬菌体感染2. 7ml新鲜的指数生长的XLlBlue细胞。在所有六种情况(3种靶蛋白+3种对照物质)中实施滴定，然后将还用辅助噬菌体感染的培养物转移到30ml [2YT ； 100 u g/ml氨苄青霉素；30ii g/ml卡那霉素]培养基中。在第二次选择循环后，我们获得就抗flag标签抗体而言104倍、就MASP-I而言10倍、就MASP-2而言20倍的富集。3. 2. 4第三次选择循环所有事情以与第二次循环的情况中相同的方式进行，也将酪蛋白在缓冲液中保持。在分离后，将噬菌体在2. 8ml无菌PBS中溶解，并且为了展示，将它们稀释至OD268约0. 5。第三次选择循环后，与对照物质相比，获得巨大的富集数值。差别是在抗flag标签抗体方面的IO5倍和在这两种MASP方面的IO4倍。3. 3.使用噬菌体ELISA测定法来测试个别克隆在此测试中，我们检查何种比例的选定个别克隆能够在它们不展示关于背景的信号的情况中结合靶蛋白。a)感染在MASP-I和MASP-2的情况中，将10 yl来自选择循环2和3的洗脱噬菌体添加到90 u I指数期的XLl Blue培养物。将其于37°C温育30分钟，期间将其以220rpm混合，然后取出20-ii I量，并对其添加180 ill 2YT培养基。将这10倍稀释再重复两次。自每个稀释系列，我们将100 U I在[LB ；100 u g/ml氨苄青霉素]平板上涂布，并将它们于37°C培养过夜。首先洗脱第一次选择循环中自抗flag标签抗体洗脱的噬菌体，并仅在此之后，感染细胞。这点的原因是抗体可以优选得多地固定于ELISA板的表面上，并且洗脱多得多的噬菌体。由于高噬菌体浓度，存在着一个细胞被数个噬菌体感染的风险，这导致混合的、无法理解的序列。b)注射将个别菌落接种到所谓的“单松套”管中，进入500 ill培养基[2YT;100 u g/ml氨苄青霉素；50 ill M13K07辅助噬菌体]中。这些管与96孔ELISA板布置类似地排列，它们个别移动，因此在平板培养箱中，于37°C，在以300rev/分钟混合的情况中，它们适合于生成小体积的培养物。c)固定将MASP-I和MASP-2蛋白以0. Oliig/ill的浓度固定，而将抗flag标签抗体以I U g/ml的浓度固定，体积为100 V- I/孔,如上文结合在Nunc ELISA Maxisorp板上选择所描述的。将每种克隆在其自身的靶蛋白上、在背景上及在抗Flag标签抗体上测试。d)在18小时后，将管在平板离心机中以2，500rpm于4°C离心10分钟，将上清液移液到清洁的管中。在ELISA后，将剩余的上清液于65°C加热2小时，并在此后，可以将它们于-20°C贮存，并可以使用它们来测序。e)封闭自固定的样品除去液体，并将200 U I/孔[PBS ；2mg/ml酪蛋白]封闭缓冲液在每孔中放置。于室温发生温育，持续至少I小时，期间以150rev/分钟混合。f)清洗使用I升清洗缓冲液将平板清洗4次。g)噬菌体应用使用[PBS ；2mg/ml酪蛋白；() 05% Tween-20]缓冲液将如上文所描述的那样生成并分离的噬菌体稀释2倍，并将IOOiU在孔中放置。自相同克隆，将样品移液到总共3个孔中。于室温 实施温育达I小时，期间以IlOrev/分钟混合。h)清洗使用I. 5升清洗缓冲液来将平板清洗6次。i)抗M13抗体将在[PBS ；2mg/ml酪蛋白；0，05 % Tween-20]缓冲液中稀释10，000倍的IOOiIl缀合有HRP的单克隆抗M13抗体(Amersham，产品目录编号27-9421-01)在孔中放置，然后，将其于室温温育30分钟，期间将其以IlOrev/分钟混合。j)清洗用I. 5升清洗缓冲液将平板清洗6次，然后用PBS清洗两次。k)显色将用USP蒸馏水稀释至其量两倍的100 ill I-步Ultra TMB-ELISA底物(Pierce，产品目录编号34028)在每孔中放置，摇动一会，然后通过在每孔中添加50 IMHCl来停止反应。I)读出使用BioTrak II (Amersham)读板光度计于450nm测量吸光度。我们自噬菌体上清液采集样品，在该情况中，背景的强度较低，并且其在它自身的靶蛋白上展示强烈至少3倍的信号，并且制备样品以进行DNA测序。我们使用2iU上清液，并使用Big Dye终止物v3. I循环测序试剂盒(Applied Biosystems ;产品目录编号4336917)系统来进行PCR反应。它通过BIOMI Kft. (G6d6ll6)运行。在解读序列后，证实在MASP-s的情况中，必须自第二次选择循环选择并测试其它克隆，因为在第三次循环中，仅找到几个个别序列，仅富集几种类型。我们的目的是收集尽可能多种多样的大量序列以能够构建关于靶蛋白的氨基酸偏爱的样式。实施例4:结果在此实施例中，我们描述了实施例1-3中所描述的测试的结果，也就是说获得的序列。从自MASP-I洗脱的噬菌体，我们使用ELISA来测试32个克隆，并且最终我们找到9个个别的序列。在MASP-2的情况中，我们自80个ELISA点获得21个个别的序列，而在抗Flag标签抗体的情况中，我们自72个测试的克隆获得57个可解读的序列。在解读结果时，我们必须考虑展示-偏爱的效果。用于此的方法是密码子标准化，因为用于构建DNA文库的NNK密码子不确保个别氨基酸的相同频率。另一种更实际的方法是相对于自抗体选择的序列的数据标准化。不是所有理论上有可能的序列类型都可以在噬菌体表面上展示，因为它们中的一些并不导致可实现的构建，或者它们在噬菌体上代表太大的负担。然而，我们自抗体获得实际上已经存在的序列，它们存在于对靶蛋白实施的初始选择步骤，因此，自这些获得对MASP-s特异性的形式。在数据标准化后，我们借助于因特网上易得到的WebLogo (http: //weblogo.berkeley. edu/logo. cgi ；Crooks 2004and Schneider 1990)产生关于序列的序列标志图。我们检查哪些是个别位置中的优选氨基酸及它们多大程度彼此不同，这取决于它们是否自MASP-I或MASP-2衍生。我们还与充当框架的野生型SFTI (其是牛胰蛋白酶的次纳摩尔(subnanomolar)抑制剂)的序列比较我们的数据。在上文所描述的ELISA系统中在用作背景的BSA上、自用作靶物的其自身蛋白质上、及还在其它MASP分子上检查个别克隆以检测可能的交叉反应。基于结果，可以将序列分成三组a)选自MASP-2且对MASP-2特异性的序列；b)选自MASP-2，而且还识别MASP-1的序列；和c)选自MASP-I，而且还识别MASP-2的序列。我们没有发现仅特异性识别MASP-I的任何组。两个非选择性组(b和c)指示非常相似的趋势，不论针对哪个MASP靶物选择它们。在序列标志图的水平轴上，可以看到个别位置的数目，位点Pl对应于第5位。图5中显示序列标志图，其中图的数字(5. a ；5. b和 5. c)涉及以相同次序标记为a)、b)和c)的组的序列标志图。在每个位置中，标志的柱高指示各组件(在我们的情况中为20种不同类型的氨基酸)的出现是如何均匀(even)。这种出现越不均匀，该柱越高。在完全均匀分布的情况中(所有20种氨基酸以5%的比例出现)，高度是O。最大值属于如下的情况，此时仅出现一类组件(氨基酸)。在柱内，基于出现频率布置个别的氨基酸，最频繁的氨基酸在顶部。标示氨基酸的字母的高度与其在给定位置中的相对出现频率成比例(例如，在50%出现频率的情况中，它是柱高度的一半)。在色图的情况中，一般地，以相同或以相似颜色显示具有相似化学特征的氨基酸，对此，我们在属于本专利说明书的图中使用不同灰色阴影。借助于标志图，我们测定选择性和非选择性组(基于源自选择的克隆名称，其被我们命名为M2-6E和M2-4G肽，及反映其活性的其名称为“S”肽(S代表选择性)或“NS”肽(NS代表非选择性))的共有序列(参见下文)。MASP-2 选择性 M2-6E 克隆(SEQ ID NO 2)“ S ” 肽 GYCSRSYPPVCIPD非选择性M2-4G 克隆(SEQ ID NO 3)“NS” 肽 GICSRSLPPICIPD经由固相肽合成来生成上述肽及其点突变体和环形变体。实施例5中描述了合成和肽分析测试。实施例5 :肽合成和分析5. I.肽制备、复性和质量检查使用标准的Fmoc (N-(9-荷基)甲氧基羰基)方法(Atherton 1989)经由固相肽合成生成肽。在存在1，2_乙二硫醇、苯硫基甲烷、水和酚作为自由基捕获剂的情况中使用TFA(三氟乙酸)方法来实施自载体分离并同时除去保护基。在蒸发溶液直至几乎干燥后，使用冷的二乙酯来沉淀产物。在将沉淀物在水中溶解后，通过冻干除去挥发性组分。对于复性，即在肽中的两个半胱氨酰侧链间创建二硫桥，将冻干的产物在水中溶解，浓度为0. Img/ml。在不断通气外通过混合溶液来实施氧化，通过添加N，N- 二异丙基-乙胺来将pH值于碱性值(8-9)保持。使用反向HPLC和质谱术来测试氧化的完全实现。还使用反相HPLC方法来实施超过95%同质形式的氧化产物的分离。在M2-4G肽的情况中，还生成环形形式，其中在线性型式的N和C端间创建肽键。如下文所描述的那样实施环化。在2-ClTrt(2-氯三苯甲基)树脂上发生肽合成，使用含有1% TFA的DCM(二氯甲烷)溶液自那里分离肽。在此类条件下，侧链保护基保留在肽上。在使用反相HPLC方法纯化分离肽后，使用一定量的DMF( 二甲基甲酰胺)来溶解线性肽，在该情况中，肽的终浓度是0. ImM。然后，对其添加I. I当量的HATU(1-[二(二甲氨基)亚甲基]-1H-1，2，3-三唑[4，5-b]吡啶-3-氧化物六氟磷酸盐)和3.0当量的DIPEA ( 二异丙基乙胺)。于室温混合溶液30分钟后，使用反相HPLC方法和质谱术来测试环化效率。在完成环化后，蒸发样品，并使用制备用反相HPLC方法来纯化肽。
在每种分离的肽的情况中，通过使用质谱术方法实施质量控制。用HPllOO型HPLC-ESI-MS系统用流动注射方法使用IOmM甲酸铵溶液，pH 3. 5发生质谱术分析。将装置设置成下述参数。干燥气体和雾化气体都是氮，干燥气体的流速是101/分钟，其温度是300°C。雾化气体的压力是210kPa，毛细管电压是3500V。在范围为300-2000质量/电荷的阳离子背景中进行总离子流(TIC)层析。用Agilent Chem Station软件评估质量数据。下文表I中显示了所生成的个别抑制剂的名称、序列和质量数据。
权利要求
1.依照通式⑴的肽及其盐、酯和药学可接受的前药，所述通式⑴为Gx1Csx2Sx3PPx4Cx5PD ⑴，其中 X1 是 Y、M、W、I、V、A，且 父2是1 、1(，且 乂3是丫、卩、1、] 、1、￡、0、11，且 X4 是 V、I、H，且 父5是 I、V、Y、F、W。
2.依照权利要求I的肽及其盐和酯，其中所述肽选自具有下列序列的肽和具有序列GICSRSLPPICIPD(SEQ ID NO 3)的环肽GYCSRSYPPVCIPD(SEQ ID NO 2)，GICSRSLPPICIPD(SEQ ID NO 3)，GVCSRSLPPICWPD(SEQ ID NO 4),GMCSRSYPPVCIPD(SEQ ID NO 5)，GYCSRSIPPVCIPD(SEQ ID NO 6)，GWCSRSYPPVCIPD(SEQ ID NO 7)。
3.依照权利要求2的肽及其盐和酯，其中所述肽选自具有下列序列的肽 GYCSRSYPPVCIPD(SEQ ID NO 2)，和GICSRSLPPICIPD(SEQ ID NO 3)。
4.药物制剂，其含有至少一种依照通式(I)的肽和/或含有依照通式(I)的肽的药学可接受的盐、酯或前药和至少一种其它添加剂，所述通式(I)为Gx1Csx2Sx3PPx4Cx5PD(I)，其中 X1 是 Y、M、W、I、V、A，且 父2是1 、1(，且 乂3是丫、卩、1、] 、1、￡、0、11，且 X4 是 V、I、H，且 父5是 I、V、Y、F、W。
5.依照权利要求4的药物制剂，其特征在于至少一种所述添加剂是确保受控活性剂释放的基质。
6.依照权利要求4或5的药物制剂，其特征在于依照通式(I)的肽选自具有下列序列的肽和具有序列GICSRSLPPICIH)(SEQ ID NO 3)的环肽和/或其药学可接受的盐和酯GYCSRSYPPVCIPD(SEQ ID NO 2)，GICSRSLPPICIPD(SEQ ID NO 3)，GVCSRSLPPICWPD(SEQ ID NO 4),GMCSRSYPPVCIPD(SEQ ID NO 5)，GYCSRSIPPVCIPD(SEQ ID NO 6)，GWCSRSYPPVCIPD(SEQ ID NO 7)。
7.依照权利要求6的药物制剂，其特征在于所述肽选自具有下列序列的肽和其药学可接受的盐和酯GYCSRSYPPVCIPD(SEQ ID NO 2)，和GICSRSLPPICIPD(SEQ ID NO 3)。
8.含有一种或多种依照通式⑴的肽和/或其盐或酯的试剂盒，所述通式⑴为Gx1Csx2Sx3PPx4Cx5PD ⑴，其中 X1 是 Y、M、W、I、V、A，且 父2是1 、1(，且 乂3是丫、卩、1、] 、1、￡、0、11，且 X4 是 V、I、H，且 父5是 I、V、Y、F、W。
9.用于筛选潜在地抑制MASP酶的化合物的方法，在所述方法过程中， i)将依照通式(I)的肽和/或其盐、酯添加至含有MASP的溶液，其中所述肽是标记的，所述通式(I)为 Gx1Csx2Sx3PPx4Cx5PD(I),其中 X1 是 Y、M、W、I、V、A，且 父2是1 、1(，且 乂3是丫、卩、1、] 、1、￡、0、11，且 X4 是 V、I、H，且 父5是 I、V、Y、F、W; ii)然后，对其添加含有一种或多种要测试的化合物的溶液； iii)然后，测量释放的标记肽的量。
10.依照权利要求9的方法，其中所述MASP酶选自MASP-I或MASP-2酶。
11.依照通式(I)的肽及其药学可接受的盐或酯在生产适合于治愈可以通过抑制补体系统治愈的疾病的药物制剂中的用途，所述通式⑴为Gx1Csx2Sx3PPx4Cx5To(I),其中 X1 是 Y、M、W、I、V、A，且 父2是1 、1(，且 乂3是丫、卩、1、] 、1、￡、0、11，且 X4 是 V、I、H，且 父5是 I、V、Y、F、W。
12.依照权利要求11的用途，其中所述可以通过抑制补体系统治愈的疾病选自炎性和自身免疫性疾病。
13.依照权利要求11的用途，其中所述可以通过抑制补体系统治愈的疾病选自下组缺血-再灌注损伤、类风湿性关节炎、神经变性疾病、年龄相关的黄斑变性、肾小球肾炎、系统性红斑狼疮。
14.依照权利要求11的用途，其中所述可以通过抑制补体系统治愈的疾病是补体激活相关的假变态反应。
15.用于分离MASP酶的方法，在该方法的过程中， i)将依照通式⑴的肽和/或其盐、酯固定于载体上，所述通式⑴为Gx1Csx2Sx3PPx4Cx5PD ⑴，其中X1 是 Y、M、W、I、V、A，且父2是1 、1(，且 乂3是丫、卩、1、] 、1、￡、0、11，且X4 是 V、I、H，且父5是 I、V、Y、F、W;ii)使以此方式固定的所述肽与含有MASP酶的溶液接触；iii)清洗制备物。
16.依照权利要求15的方法，其中所述MASP酶选自MASP-I或MASP-2。
全文摘要
本发明涉及依照通式(I)GX1CSX2SX3PPX4CX5PD的肽，其中X1是Y、M、W、I、V、A，且X2是R、K，且X3是Y、F、I、M、L、E、D、H，且X4是V、I、H，且X5是I、V、Y、F、W；而且涉及其药学可接受盐、酯和前药。此外，本发明涉及含有它们的药物制剂和试剂盒，而且涉及使用它们进行的筛选和分离方法，及其在药物制剂的生产中的用途。
文档编号C07K7/08GK102639140SQ201080032731
公开日2012年8月15日 申请日期2010年5月25日 优先权日2009年5月25日
发明者G.帕尔, K.A.帕里斯尼, P.加尔, P.扎沃德斯基 申请人:Mta科学与自然研究酶学研究所, 罗兰大学