专利名称：水凝胶的制作方法
技术领域：
本发明涉及包含多糖类和无机盐水溶液的凝胶，所述多糖类在侧链具有羧基的多 糖类的羧基上结合有两亲性侧链。由于该凝胶的流动性和粘弹性优异而被用于医疗材料寸。
背景技术：
已知通过向多糖类的侧链中导入各种官能团来改良其理化性质或形状，有时改善 多糖类自身的理化性质或多糖水溶液的流动性、形成水凝胶等，迄今为止有人报道了各种 多糖类衍生物或其改性方法。其中有一种在侧链具有羧基的多糖类上结合有磷脂的多糖 类。日本特开2006-296916号公报中记载了包含透明质酸与磷脂酰乙醇胺的反应产 物的防粘连材料(癒着防止剤)。此外，W02007/015579号说明书中记载了包含羧甲基纤维 素与磷脂酰乙醇胺的反应产物的防粘连材料。但是，上述文献中均未记载、也没有暗示有关本说明书中公开的水凝胶。已知有通过无机离子类进行凝胶化的多糖类，但只知道象海藻酸钠或果胶水溶液 那样，通过二价离子的钙离子进行凝胶化的多糖类。的确，通过钙离子进行凝胶化的多糖 类，其凝胶形成能力优异，但由于钙离子是掌管神经传递的因子、并具有激活凝血因子等多 种生理作用，因此在作为医疗用凝胶的应用上受限。相对于此，通过钠离子这样的一价阳离子进行凝胶化的多糖类还无人知晓。
发明内容
发明所要解决的课题本发明所要解决的课题是提供一种不使用钙离子、具有适于在体内使用的复合 弹性模量、且安全性和操作性优异的水凝胶。解决课题的方法本发明的发明人等基于上述目的进行了深入研究，结果发现当为特定的多糖类 衍生物时，不必使用钙离子即可进行凝胶化，从而完成了本发明。S卩，本发明涉及含有多糖类(以下也称作“成分1”)、钙离子以外的无机离子类(以 下也称作“成分2”)和水的水凝胶，所述多糖类在侧链具有羧基的多糖类的羧基上结合有 两亲性侧链。本发明还涉及水凝胶制备用试剂盒，该试剂盒由成分1的水溶液和成分2的水溶 液这两种溶液构成。本发明还涉及水凝胶的制备方法，该制备方法包括混合成分1的水溶液和成分2 的水溶液的步骤。本发明还涉及水凝胶的制备方法，该制备方法包括将成分1溶解于成分2的水溶 液中的步骤。
发明效果本发明的水凝胶是高粘弹性的凝胶，例如被用作使用注射器等可以注入的可注射 凝胶等，优选用作医用材料。本发明的水凝胶不必使用钙离子即被凝胶化，因此适合在体内 使用。
具体实施例方式本发明的水凝胶中的成分1是在侧链具有羧基的多糖类的羧基上结合有两亲性 侧链的多糖类。这里，侧链具有羧基的多糖类的例子有海藻酸、透明质酸、果胶等主链中具有具 羧基的单糖类的多糖类；羧甲基纤维素、羧甲基壳多糖、羧甲基普鲁兰、羧甲基葡聚糖、羧甲 基淀粉、羧乙基纤维素、羧甲基壳聚糖等羧基烷基化的多糖类；N-琥珀酰壳聚糖等多糖类 与环状羧酸酐的反应物，所述N-琥珀酰壳聚糖是壳聚糖与琥珀酸酐反应得到的。这些多糖 类的羧基可以和钠、钾、锂等碱金属类形成盐。当为羧基烷基化多糖类时，对羧基烷基的取代度或取代位置没有特别限定，但优 选取代度为0. 6 1. 0、取代位置为C-6位的伯羟基被取代的衍生物。对多糖类的分子量没有特别限定，以重均分子量计，优选1万 200万，更优选2 万 150万，进一步优选为3万 100万。这些多糖类中，从与无机盐、特别是钠盐混合时容易进行凝胶化的角度考虑，优选 使用羧甲基纤维素或透明质酸。作为与羧基结合的两亲性侧链，只要是具有亲水性官能团和疏水性官能团这两者 的官能团即可，没有特别限定，优选的例子有具有作为一种磷脂的磷脂酰乙醇胺的结构的 侧链。特别优选多糖类的羧基与磷脂酰乙醇胺的伯氨基通过酰胺键直接结合的侧链。磷脂酰乙醇胺的具体的化合物有二月桂酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰乙 醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二(二十烷酰)磷脂酰乙醇胺(dia rachidoylphosphatidylethanolamine)、二 (二十二；^酉先) 粦月旨酉先乙酉享月安(dibehenoylpho sphatidylethanolamine)、月桂酉先油酉先磷月旨酉先乙醇胺(laurooleoylphosphatidylethanola mine)、肉豆蔻酰油酰磷脂酰乙醇胺(myristoleoylphosphatidylethanolamine)、棕榈酰油 酰磷脂酰乙醇胺(palmitoleoylphosphatidylethanolamine)、二油酰磷脂酰乙醇胺、二亚 油酰磷脂酰乙醇胺(dilinoleoylphosphatidylethanolamine)、二亚麻酰磷脂酰乙醇胺(d i 1 ino 1 enoyIphosphatidy 1 ethano 1 amine)、二花生四烯酰磷脂酰乙醇胺(diarachidonoylp hosphatidylethanolamine)、二 docosahexaenoyl 粦月旨酉先乙酉享月安(didocosahexaenoyIphos phatidylethanolamine)，其中优选使用二油酰磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine dioleoyl)。作为另一优选的两亲性侧链，可以列举直链状的、下述结构式的侧链。(结构式)多糖类-C0-NH-X-C0-Y-Z其中，CO来自多糖类的羧基；X表示碳原子数为1 10的二价烃基；Y表示两末端具有氧原子的二价聚氧化烯烃类；Z表示碳原子数为1 M的烃基或-CO-R1 (R1表示碳原子数为1 23的烃基)。
式中的X表示碳原子数为1 10的二价烃基，具体可以列举亚甲基、亚乙基、正 亚丙基、异亚丙基、正亚丁基、异亚丁基等。优选为亚甲基，此时，由于与羰基和氨基相邻，所 以形成使用了甘氨酸的键单元(bonding unit)。Y表示两末端具有氧原子的二价聚氧化烯烃类。二价聚氧化烯烃类具体是 指以聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇等形式例示的聚亚烷基醚类。两末端具有氧原子 是指参与聚亚烷基醚的两末端的羟基与所相邻的官能团结合的结构。具体可以列举 以-(O-CH2-CH2 (CH3) -) n-0-表示的 1，2-聚丙二醇类、以-(O-CH2-CH2-CH2-) n_0_ 表示的 1， 3-聚丙二醇类、以-(O-CH2-CH2-)n-0-表示的聚乙二醇类等。此外，可以是上述聚乙二醇与 聚丙二醇的共聚物、例如以PEO-PPO等表示的共聚物。这里，η表示重复单元数。其中，优选以聚乙二醇作为主要重复单元的结构，具体是指含有80% (摩尔)以 上、更优选90% (摩尔)以上的聚乙二醇单元的结构。重复单元数η优选为2 100之间， 进一步优选为3 70。Z表示碳原子数为1 M的烃基或-CO-R1 (R1表示碳原子数为1 23的烃基)。作为Z的碳原子数为1 M的烃基，具体可以例示甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、 己基、辛基、壬基、月桂基和硬脂基等直链状烷基；环己基、环戊基、环己基壬基、胆留醇基等 具环状结构的烷基；油烯基等不饱和烷基；苯基、萘基、苄基等芳族烃基。其中优选硬脂基、 油烯基等。R1表示碳原子数为1 23的烃基。作为R1的具体例子，可以例示甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、辛基、壬基、 十七烷基、十七碳烯基、月桂基、硬脂基等直链状烷基；环己基、环戊基、环己基壬基、胆甾 醇基等具环状结构的烷基；油烯基等不饱和烷基；苯基、萘基、苄基等芳族烃基。其中优选 十七烧基、十七碳烯基等。R1为脂肪族烷基时，-CO-R1成为来自脂肪酸的酰基。其优选的具体例子有月桂酰 基、棕榈酰基、硬脂酰基、油酰基等。R1为芳族基团时，-CO-R1成为来自芳族脂肪酸的酰基， 作为其具体例子，可以例示苯甲酰基、萘酰基等。其中优选硬脂酰基、油酰基。以-NH-X-CO-Y-Z表示的两亲性侧链的优选例子有以下侧链。-NH-CH2-CO- (OCH2CH2) ^O-C18H37> -NH-CH2CH2-CO- (OCH2CH2) 7-0-C18H37 等亲水部分具 有聚乙二醇基、疏水部分具有烷基的侧链化合物组；-NH-CH2-CO- (OCH2CH2) ^O-C18H35>-NH-CH2-CO- (OCH2CH2) 20-0-C18H35 等亲水部分具有 聚乙二醇基、疏水部分具有链烯基的侧链化合物组； -NH-CH2-CO- (OCH2CH2) 20-0-C0-C17H35等亲水部分具有聚乙二醇基、疏水部分具有 直链状脂肪酸酯的侧链化合物组；-NH-CH2-CO- (OCH2CH2) 7_0_胆留醇基等亲水部分具有聚乙二醇基、疏水部分具有 胆甾醇基的侧链化合物组。关于多糖类的羧基与两亲性侧链的结合，可以使用例如碳化二亚胺类等缩合剂使 两者结合。碳化二亚胺类的例子有1-乙基-3-( 二甲基氨基丙基)碳化二亚胺或其盐酸 盐、二异丙基碳化二亚胺、二环己基碳化二亚胺或N-羟基-5-降莰烷-2，3- 二甲酰亚胺等。 其中优选使用1-乙基-3-( 二甲基氨基丙基)碳化二亚胺的盐酸盐。为了激活多糖类的羧基，优选使用羧基活化剂。羧基活化剂的例子有N-羟基琥珀酰亚胺、对硝基苯酚、N-羟基苯并三唑、N-羟基哌啶、N-羟基琥珀酰胺、2，4，5-三氯苯酚、 N，N-二甲基氨基吡啶等。其中优选N-羟基苯并三唑。反应溶剂可以只是水，也可以混合与水相溶的有机溶剂，还可以通过使用与水不 相溶的有机溶剂的两层系统的反应来进行。与水相溶的有机溶剂的例子有甲醇、乙醇等醇 类或四氢呋喃、二噁烷等环状醚类；聚氧乙烯化合物等醚类；二甲基甲酰胺或二甲基乙酰胺 等酰胺类；吡啶或哌啶等胺类；二甲基亚砜等二烷基砜类；丙酮等酮类。优选在混合有水和 与水相溶的有机溶剂的均相反应系统中进行羧甲基纤维素与磷脂的反应。作为与水相溶的 有机溶剂，优选四氢呋喃。使用碳化二亚胺的反应的温度优选为0 60°C。为了抑制副产物，更优选在0 10°C下进行反应。反应环境优选弱酸性环境，进一步优选为pH6 7。当两亲性侧链为磷脂时，其取代度优选为0. 3 2. 0% (摩尔)/糖残基。若取代 度低于该值，则无法得到作为凝胶的充分的粘弹性；若取代度高于该值，则容易形成不溶于 水的硬凝胶。取代度更优选0.6 1.9% (摩尔)/糖残基，进一步优选为0.7 1.7% (摩 尔)/糖残基。不过，所述的优选取代度可以根据使用的多糖类的种类或分子量、羧基的取代度 或取代位置、两亲性侧链的种类、钙离子以外的无机离子类的组成或浓度、水凝胶的最终浓 度等而变动。但是，有若取代度过高则容易形成不溶性的硬凝胶这种想法的本领域技术人 员可以参考后述实施例中的具体例子，通过试行，可以容易地确定个别条件下的取代度的 优选范围。制备成分1的水溶液时，相对于100重量份水，优选含有0. 1 3. 0重量份、更优 选0. 3 2. 0重量份、进一步优选0. 5 1. 0重量份的成分1。成分1中有时会混入的成分有用于合成的缩合剂类、缩合剂经过规定的化学反 应而生成的脲等副产物类、羧基活化剂、未反应的胺类、在反应的各阶段有可能混入的杂 质、用于调节PH的离子类等，这些成分优选被限制在某一程度的含量以下的低水平，所述 某一程度是指凝胶被放入体内时所有化合物均未被识别成异物反应的程度。不过，混有这 些成分的溶液也包含在本发明的范围内。制备成分1的水溶液时，根据需要，所述水溶液中可以含有其他多糖类或水溶性 的高分子类、单糖或寡糖类、氨基酸类等。根据需要，可以进一步含有具生理活性的低分子 药物或肽类、蛋白类。成分2的无机盐类是含有阳离子成分和阴离子成分这两者的盐，优选含有等摩尔 的阳离子成分和阴离子成分的盐。所述阳离子成分的例子有钠、锂、钾等碱金属类的离子、 铵离子，但是如同磷酸氢钠等那样，有时可以含有质子。其中优选使用具有体内大量存在的 钠离子的盐。对阴离子成分没有特别限定，可以列举氯化物离子或溴化物离子等卤素离子； 磷酸离子、硫酸离子等离子类；乙酸、枸橼酸、草酸等羧酸类的阴离子等。成分2的无机盐类的具体例子有氯化钠、氟化钠、溴化钠、氯化钾、乙酸钠、磷酸 氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠、硫酸钠、枸橼酸钠、草酸钠等碱金属盐类；酒石酸钠、酒石酸钠 钾、碳酸氢钠、碳酸钠、碳酸钾等。这些盐类中，从安全性的角度考虑，优选氯化钠。氯化钠的浓度优选0. 1 10%的范围，更优选0.5 5%，进一步优选为1 3%。以维持细胞的存活为主要目的时，选择离子的种类或量，使其被调整至生理性的 盐浓度。此时，优选使用作为生理性盐类溶液的生理盐水(0. 9% NaCl水溶液)、Ringer溶 液、Locke溶液等的组成或浓度。在成分2的水溶液中，优选进一步含有水溶性高分子类。作为所述的水溶性高分 子类，优选根据与固体的成分1或具粘弹性的成分1的水溶液混合时的混合容易度、或使用 时的方便度，选择适当粘度的高分子类。所述水溶性高分子的具体例子有海藻酸钠、透明质酸钠、果胶、角叉菜胶、淀粉、 糊精、葡聚糖、普鲁兰、肝素、壳聚糖等水溶性多糖类；羧甲基纤维素、羧甲基糊精、羧甲基普 鲁兰、羧乙基纤维素等水溶性多糖类衍生物；明胶、胶原、白蛋白、纤维蛋白原、凝血酶、蚕丝 蛋白等蛋白类；DNA或RNA等核酸类；聚乙二醇及其共聚物、聚乙烯醇或其共聚物、聚烯丙胺 或其共聚物等聚阳离子类，聚丙烯酸钠或其共聚物等聚阴离子类等的合成高分子。其中，作为医疗材料，特别优选使用透明质酸钠、羧甲基纤维素钠、聚乙二醇或其 共聚物。在成分2的水溶液中，根据需要，可以含有其他单糖或寡糖类、氨基酸等。根据需 要，可以进一步含有具生理活性的低分子药物或肽类、蛋白类。作为本发明的水凝胶的优选的复合弹性模量，当两亲性侧链为磷脂时，在水中的 聚合物浓度为1.0% (重量)、温度为37°C的条件下，使用被称为流变仪的动态粘弹性测定 装置以IOrad/秒的角速度进行测定时，复合弹性模量为20 1000N/m2，更优选25 500N/ m2，进一步优选为30 200N/m2。这里，复合弹性模量是指表示弹性体的应力与形变(“f 办)之比的常数。本发明的水凝胶，通过混合两种成分，其粘弹性显著提高，因此可以停留在体内的 特定部位，还可以期待保护伤口或形成脏器间的物理性隔离屏障。本发明的水凝胶，通过用药物将其浸透，可以成为局部性的药物传递系统。将本发明的水凝胶注入体内时，其中任一种成分具有被分解或吸收的特性，可用 于外科手术时使用的注入用凝胶材料或再生医疗的基底材料等。除此之外，本发明的水凝胶还可用于包含医用材料的医疗用途、护发产品或肌肤 保湿剂等日用品用途、化妆品用途等。本发明的水凝胶包含通过注射器可以注入的水凝胶，其可用于低侵袭医疗用途。 特别是可以用作用于再生医疗的细胞的载体；保持、缓释生长因子等的液体因子的载体； 保持、缓释可用作药物的低分子化合物的载体；以及防粘连材料或密封剂等医用材料。并且，本发明的水凝胶还可用于细胞培养载体、微生物的培养载体、齿科用移植物 材料等。可以通过公知的灭菌方法对本发明的水凝胶进行灭菌处理。优选的灭菌方法有 电子束照射或利用环氧乙烷进行的气体灭菌、高压蒸气灭菌。需要说明的是，关于本发明的水凝胶的上述，例如阐述优选的成分1或成分2或者 它们的水溶液，在本发明的试剂盒或本发明方法中也是直接适用的。本发明还包括上述的本发明的凝胶的制备方法。具体而言，涉及水凝胶的制备方 法(制备方法1)，该制备方法包括混合成分1的水溶液和成分2的水溶液的步骤；还涉及水凝胶的制备方法(制备方法幻，该制备方法包括将成分1溶解于成分2的水溶液中的步骤。如上所述，制备方法1中的成分1的水溶液可以含有水溶性高分子等其他成分，也 可以是溶解于不含离子的水中得到的溶液。而在制备方法2中，是将成分1的固体溶解于成分2的水溶液中，所以从溶解速度 的角度考虑，优选实现其形状的最优化。例如，将成分1制成粉状后再溶解等。
实施例(1)实施例中使用的材料如下。(i) CMCNa 羧甲基纤维素钠(第一工业制药(株)制、SER0GENPM-250L、羧甲基的 取代度0. 73)(ii) CMCNa:羧甲基纤维素钠(第一工业制药(株)制、P-603A、取代度0.69)(iii) CMCNa 羧甲基纤维素钠(日本制纸Chemical (株)制、取代度0. 69)(iv) HANa 透明质酸钠(纪文 R)odChemifa (株)制、FCH-80LE)(ν)四氢呋喃(和光纯药工业(株)制)(vi) 0. IM HCl (和光纯药工业(株)制)(vii)0. IM NaOH(和光纯药工业(株)制)(viii)EDC :1-乙基-3-[3_( 二甲基氨基)丙基]碳化二亚胺’HCl ((株)大阪合 成有机化学研究所制)(ix)HOBt · H2O 1_羟基苯并三唑一水合物((株)大阪合成有机化学研究所制)(χ) DMT-MM 氯化4-G，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉锚(国产 化学(株)制)(xi) L- α - 二油酰磷脂酰乙醇胺(C0ATS0ME ΜΕ-8181、日本油脂(株)制)(xii)乙醇(和光纯药工业(株)制)(xiii)NaCl (和光纯药工业(株)制)(xiv) KCl (和光纯药工业(株)制)(XV)注射用蒸馏水(大冢制药(株)制)(2)测定纤维素衍生物中的磷脂含量利用钼钒酸吸光光度法分析总磷的含量，求出纤维素衍生物中磷脂的比例。(3)测定水凝胶的复合弹性模量使用作为动态粘弹性测定装置的流变仪RFIII (TA Instrument)，在37 °C下以 IOrad/秒的角速度测定水凝胶的复合弹性模量。复合弹性模量是指表示弹性体的应力与形 变之比的常数。实施例1将1500mg CMCNa (第一工业制药(株)制、PM-250L、取代度0· 73)溶解于300mL 水中，再加入300mL四氢呋喃。向该溶液中添加709. 7mg L-α - 二油酰磷脂酰乙醇胺和 290. 4mg作为缩合剂的DMT-MM，之后搅拌一夜。搅拌后，将混合物加入到乙醇中，使之沉淀。 通过过滤除去乙醇，再次用乙醇清洗，将过滤物真空干燥，得到纤维素衍生物，测定其磷脂 含量。使用磷脂含量，通过计算求出磷脂酰乙醇胺的取代度时，结果为0.71% (摩尔)/糖残基。将20mg所得的纤维素衍生物溶解于1800mg注射用蒸馏水中，之后添加200mg 9 % 的NaCl，使其最终浓度达到0.9%，制备最终浓度为1.0% (重量)的水凝胶。即使倾斜容 器，所得的水凝胶也不流动。测定水凝胶的复合弹性模量，结果为M9. 1士观.3N/m2(平均 值士标准偏差)。比较例1除了添加200mg注射用蒸馏水以代替9%的NaCl以外，进行与实施例1相同的操 作，制备水凝胶。倾斜容器时，所得的水凝胶缓慢流动，观察到液面呈水平移动的倾向。测 定水凝胶的复合弹性模量，结果为36. 6 士0. 43N/m2(平均值士标准偏差)。实施例2将40mg纤维素衍生物溶解于1800mg蒸馏水中，之后添加200mg 9 %的NaCl使其 最终浓度达到0. 9 %，使纤维素衍生物的最终浓度达到2. 0% (重量)，除此之外，进行与实 施例1相同的操作，制备水凝胶。测定所得水凝胶的复合弹性模量，结果为955. 9士32. ON/ m2 (平均值士标准偏差)。实施例3除了向反应系统中添加1421. Omg L-α - 二油酰磷脂酰乙醇胺和581. ^ig作为缩 合剂的DMT-MM以外，按照与实施例1相同的方法得到纤维素衍生物，测定其磷脂含量。取 代度为2.2% (摩尔)/糖残基。将20mg纤维素衍生物溶解于1800mg注射用蒸馏水中，之后添加200mg 9 %的 NaCl使其最终浓度达到0.9%，制备最终浓度为1.0% (重量)的水凝胶。其结果，得到了 不溶于水、稍白浊的硬水凝胶。由于该凝胶硬、与流变仪的测定表面的滑动大，所以无法测 定其复合弹性模量的准确值。由以上结果确认由取代度为约0. 75% (摩尔)/糖残基的纤维素衍生物制备的 水凝胶，通过添加NaCl使其达到与体内相同程度的0. 9% (重量)，确认到水凝胶的复合弹 性模量显著增加。而由取代度为2. 2% (摩尔)/糖残基的纤维素衍生物制备的水凝胶，通 过添加NaCl使其达到0.9% (重量)，可以得到不溶于水的硬凝胶。由以上结果可知得到 了具有在与体内相同程度的氯化钠浓度下变硬的特性的水凝胶。实施例4将3000mg CMCNa(日本制纸 Chemical (株)制、F600MC、取代度0. 69)溶解于 600mL水中，再加入600mL四氢呋喃。向该溶液中添加^39mg L-α - 二油酰磷脂酰乙醇胺、 807mg作为缩合剂的EDC和643mg HOBt · H2O,之后搅拌一夜，除此之外，进行与实施例1相 同的操作，合成多糖衍生物。所得的多糖衍生物的磷脂酰乙醇胺的取代度为0.8% (摩尔)/
糖残基。将20mg所得的纤维素衍生物溶解于1800mg注射用蒸馏水中，之后添加200mg 9% 的NaCl使其最终浓度达到0.9%，制备最终浓度为1.0% (重量)的水凝胶。即使倾斜容 器，所得的水凝胶也不流动，其复合弹性模量为313. 4N/m2。比较例2除了添加200mg注射用蒸馏水以代替9%的NaCl以外，进行与实施例4相同的操 作，制备水凝胶。所得水凝胶的复合弹性模量为121.3N/m2。
实施例5除了在9% NaCl水溶液中含有1.0% (重量)的CMCNa (日本制纸Chemical (株) 制、F30MC)以外，使用实施例4中得到的多糖类衍生物，进行与实施例4相同的操作，制备 水凝胶。所得水凝胶的复合弹性模量为343. ON/m2。实施例6除了在9% NaCl水溶液中含有3%聚乙二醇(和光纯药工业(株)制)、分子量 2万)以外，使用实施例4中得到的多糖类衍生物，进行与实施例4相同的操作，制备水凝 胶。所得水凝胶的复合弹性模量为393. 6N/m2。实施例7除了使用日本制纸Chemical (株)制的F30MC(羧甲基的取代度0.69)作为羧甲 基纤维素以外，进行与实施例1相同的操作，合成多糖类衍生物。所得的多糖衍生物的磷脂 酰乙醇胺的取代度为0.8% (摩尔)/糖残基。将20mg该多糖衍生物溶解于1800mg注射用蒸馏水中，之后添加200mg 9 %的 NaCl使其最终浓度达到0.9%，制备最终浓度为1.0% (重量)的水凝胶。所得水凝胶的复 合弹性模量为181N/m2。实施例8除了使用9%的KCl水溶液以外，进行与实施例7相同的操作，制备水凝胶。所得 水凝胶的复合弹性模量为180N/m2。比较例3除了添加200mg注射用蒸馏水以代替9 %的NaCl以外，进行与实施例7相同的操 作，制备水凝胶。测定所得水凝胶的复合弹性模量，结果为15.3N/m2。实施例9将1500mg 透明质酸钠(纪文 FoodChemifa(株)制、FCH-80LE)溶解于 300mL 水中，再加入300ml四氢呋喃。向该溶液中加入将1113mg(0. 01496mol)L-a-二油酰 磷脂酰乙醇胺(相对于100当量HA-Na的羧基为40当量)、316mg(0. 01645mol)EDC和 251. 8mg(0. 016456mol)H0Bt · H2O溶解于75mL四氢呋喃/水=1/1中得到的溶液，之后搅 拌一夜。搅拌后，除去四氢呋喃，使水一定程度蒸发，之后将该混合物加入到乙醇中，使之沉 淀。通过过滤除去乙醇，再次用乙醇清洗，将过滤物真空干燥，得到透明质酸衍生物。将20mg所得的透明质酸衍生物溶解于ISOOmg注射用蒸馏水中，之后添加200mg 9%的NaCl使最终浓度达到0.9%，制备最终浓度为1.0% (重量)的水凝胶。即使倾斜容 器，所得的水凝胶也不流动。测定水凝胶的复合弹性模量，结果为139.4士16.4^!112(平均 值士标准偏差)。比较例4除了添加200mg注射用蒸馏水以代替9%的NaCl以外，进行与实施例9相同的操 作，制备水凝胶。测定所得水凝胶的复合弹性模量，结果为56. 9士9. ΙΝ/m2 (平均值士标准 偏差)。实施例10H2N-CH2-CO- (O-CH2CH2) ^O-C18H35 的合成相对于Immol油醇聚乙二醇醚(H_(O-CH2CH2)7-O-C18H35、和光纯药(株)制)，将Immol N-丁氧基羰基甘氨酸(Boc-Gly-OH、和光纯药(株)制)溶解于二氯甲烷中，之后在 室温下滴加含有Immol作为缩合剂的二环己基碳化二亚胺(和光纯药(株)制)的二氯甲 烷溶液。过滤反应液以除去副产物二环己基脲，之后进行浓缩、干燥，得到氨基被保护的中 间体(Boc-NH-CH2-CO-(O-OI2CH2)7-O-C18H35)。向该中间体中加入约1 2mL的三氟乙酸(和光纯药(株)制)，通过酸处理在室 温下进行2小时脱Boc反应。通过TLC确认反应的进行。减压浓缩反应液，除去过量的三 氟乙酸，得到作为目标物的胺化合物的三氟乙酸盐。通过1H-NMR来确认产物。实施例11羧甲基纤维素(CMC-Na)与H2N-CH2-CO- (O-CH2CH2) ^O-C18H35 的耦联将1500mg CMC-Na (日本制纸 Chemical (株)制、F600MC、取代度0. 69)溶解于 300ml水中，再加入300ml四氢呋喃，混合，得到均勻的溶液。向该溶液中加入相对于1当量 CMC-Na的羧基为0. 2当量的实施例10中合成的H2N-CH2-CO-(O-CH2CH2)7-O-C18H35的三氟盐 酸盐，混合。将作为缩合剂的DMT-MM溶解于相对于KN-CH2-CO-(O-Ol2CH2)7-O-C18H35为1. 1当 量的30ml四氢呋喃/水=1/1中，之后将该溶液添加到反应系统中，搅拌一夜。搅拌后，通 过用旋转蒸发仪浓缩反应液，除去四氢呋喃，并使水蒸发，将总量浓缩至约1/3时，将反应 液加入到乙醇中，形成沉淀。过滤分离沉淀，将该沉淀物悬浮于乙醇中，搅拌M小时，回收 沉淀并进行真空干燥，从而得到纤维素衍生物。对所得的纤维素衍生物进行元素分析，由碳 与氮的比率算出取代度。其结果，取代度为13% (摩尔)/糖残基。实施例12将20mg实施例11中得到的衍生物溶解于1800mg注射用蒸馏水中，之后添加 200mg 9%的NaCl使其最终浓度达到0.9%，制备最终浓度为1.0% (重量)的水凝胶。即 使倾斜容器，所得的水凝胶也不流动。测定水凝胶的复合弹性模量，结果为1448. 4N/m2。比较例5除了添加200mg注射用蒸馏水以代替9%的NaCl以外，进行与实施例12相同的操 作，制备水凝胶。测定水凝胶的复合弹性模量，结果为729. 7N/m2。实施例13将3000mg CMCNa(第一工业制药(株)制、P-603A、取代度0. 69)溶解于200mL 水中，再加入200mL四氢呋喃。向该溶液中添加349mg L-α - 二油酰磷脂酰乙醇胺和646mg 作为缩合剂的DMT-MM，之后搅拌一夜。搅拌后，将该混合物加入到乙醇中，使之沉淀。通过 过滤除去乙醇，再次用乙醇清洗，将过滤物真空干燥，从而得到纤维素衍生物，测定其磷脂 含量。使用磷脂含量，通过计算求出磷脂酰乙醇胺的取代度时，取代度为1.31% (摩尔)/ 糖残基。将30mg所得的纤维素衍生物溶解于2700mg注射用蒸馏水中，之后添加270mg 10 倍浓度的PBS(-)水溶液(NaCl 8%,NaH2PO4 :0. 35%,Na2HPO4 :1.)，使各自的最终浓度 如下=NaCl 为 0.8%、NaH2PO4 为 0. 0；35%、Nei2HPO4 为 0. 1 %，制备最终浓度为 1.0% (重 量)的水凝胶。即使倾斜容器，所得的水凝胶也不流动。测定水凝胶的复合弹性模量，结果 为101. 6 士 3. 4N/m2 (平均值士标准偏差)。实施例14
将40mg按照实施例13所述的方法合成的纤维素衍生物溶解于3960mg PBS㈠水 溶液(NaCl 0. 8%, NaH2PO4 :0. 035%、Na2HPO4 0. 128% )中，制备最终浓度为 1.0% (重 量)的水凝胶。即使倾斜容器，所得的水凝胶也不流动。测定水凝胶的复合弹性模量，结果 为70. 9 士 1. 5N/m2 (平均值士标准偏差)。实施例15将30mg按照实施例13所述的方法合成的纤维素衍生物溶解于^70mg磷酸氢钠 水溶液(0. 17% )中，制备最终浓度为1. 0% (重量)的水凝胶。即使倾斜容器，所得的水凝 胶也不流动。测定水凝胶的复合弹性模量，结果为16.9士0.4^!112(平均值士标准偏差)。实施例16将30mg按照实施例13所述的方法合成的纤维素衍生物溶解于^70mg磷酸氢钠 (0. 17% )和氯化钠(0. 27% )的水溶液中，制备最终浓度为1. 0% (重量)的水凝胶。即使 倾斜容器，所得的水凝胶也不流动。测定水凝胶的复合弹性模量，结果为72. 7 士 4. lN/m2(平 均值士标准偏差)。实施例17将30mg按照实施例13所述的方法合成的纤维素衍生物溶解于^70mg磷酸氢钠 (0. 17% )和氯化钠(0. 53% )的水溶液中，制备最终浓度为1. 0% (重量)的水凝胶。即使 倾斜容器，所得的水凝胶也不流动。测定水凝胶的复合弹性模量，结果为91. 5 士 0. 5N/m2(平 均值士标准偏差)。实施例18将30mg按照实施例13所述的方法合成的纤维素衍生物溶解于^70mg磷酸氢钠 (0.17%)和氯化钠(0.8%)的水溶液中，制备最终浓度为1.0% (重量)的水凝胶。即使 倾斜容器，所得的水凝胶也不流动。测定水凝胶的复合弹性模量，结果为87. 6 士 3. lN/m2(平 均值士标准偏差)。比较例6将30mg按照实施例13所述的方法合成的纤维素衍生物溶解于^70mg注射用蒸 馏水中，制备最终浓度为1.0% (重量)的水凝胶。倾斜容器时，所得的水凝胶慢慢流动，观 察到液面呈水平流动的倾向。测定水凝胶的复合弹性模量，结果为15.0 士 0. 14N/m2(平均 值士标准偏差)。实施例19将3000mg CMCNa (第一工业制药(株)制、PM-250L、取代度0· 73)溶解于600mL 水中，再加入600mL四氢呋喃。向该溶液中添加1405mg L- α -二油酰磷脂酰乙醇胺和575mg 作为缩合剂的DMT-MM，之后搅拌一夜。搅拌后，减压馏去四氢呋喃，将残余物添加到乙醇 中，使之沉淀。通过过滤除去乙醇，再次用乙醇清洗，将过滤物真空干燥，从而得到纤维素衍 生物，测定其磷脂含量。使用磷脂含量，通过计算求出磷脂酰乙醇胺的取代度时，取代度为 0. 78% (摩尔)/糖残基。对所得的30mg纤维素衍生物进行环氧乙烷气体灭菌，之后将其溶解于5970mg注 射用蒸馏水中(浓度为0.50% (重量))。向1075mg该溶液中加入359mg模拟体液，所述 模拟体液是将下表的试剂溶解于1升蒸馏水中得到的。
权利要求
1.水凝胶，该水凝胶含有多糖类、钙离子以外的无机离子类和水，所述多糖类在侧链具 有羧基的多糖类的羧基上结合有两亲性侧链。
2.权利要求1所述的凝胶，其中，钙离子以外的无机离子类至少含有钠离子。
3.权利要求1或2所述的凝胶，其中，结合有两亲性侧链的多糖类是结合有磷脂酰乙醇 胺的多糖类。
4.权利要求1或2所述的凝胶，其中，两亲性侧链为-NH-X-C0-Y-Z，式中，X表示碳原 子数为1 10的二价烃基，Y表示两末端具有氧原子的二价聚氧化烯烃类，Z表示碳原子数 为1 M的烃基或-C0-R1，其中R1表示碳原子数为1 23的烃基。
5.权利要求1 4中任一项所述的凝胶，其中进一步含有水溶性高分子。
6.权利要求1 5中任一项所述的凝胶，其中，具有羧基的多糖类为羧甲基纤维素。
7.权利要求1 5中任一项所述的凝胶，其中，具有羧基的多糖类为透明质酸。
8.权利要求3所述的凝胶，其中，磷脂酰乙醇胺的取代度为0.3 2.0%(摩尔)/糖 残基。
9.水凝胶制备用试剂盒，该试剂盒由下述两种水溶液构成多糖类的水溶液，所述多 糖类在侧链具有羧基的多糖类的羧基上结合有两亲性侧链；以及含有钙离子以外的无机离 子类的水溶液。
10.水凝胶的制备方法，该制备方法包括将多糖类的水溶液和钙离子以外的无机离 子类的水溶液混合的步骤，所述多糖类在侧链具有羧基的多糖类的羧基上结合有两亲性侧 链。
11.水凝胶的制备方法，该制备方法包括将多糖类溶解于钙离子以外的无机离子类 的水溶液中的步骤，所述多糖类在侧链具有羧基的多糖类的羧基上结合有两亲性侧链。
全文摘要
含有多糖类、钙离子以外的无机离子类和水的水凝胶及其制备方法，所述多糖类在侧链具有羧基的多糖类的羧基上结合有两亲性侧链。所述凝胶具有高粘弹性、包含使用注射器等器具可以注入到体内的凝胶，可用作各种医用材料。
文档编号A61K47/36GK102112496SQ20098013095
公开日2011年6月29日 申请日期2009年8月5日 优先权日2008年8月5日
发明者伊东雅弥, 兼子博章, 田中大士, 远藤信幸 申请人:帝人株式会社