专利名称：多孔壳聚糖支架、神经干细胞多孔壳聚糖支架及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种组织工程制品及其用途。
背景技术：
中枢神经系统(central nervous system, CNS)损伤后的再生一直是困扰人类的 难题，虽然1992年Reynolds和Richards最先从成鼠的纹状体和海马中分离出了神经干细 胞(neural stem cells, NSCs)，此后人们又相继发现成年哺乳动物CNS中的大脑皮质、嗅 球、隔区、脊髓等其它区域也存在NSCs，从而打破了传统认为CNS成年后不能再生的观念， 但是内源性的NSCs应对CNS损伤产生新的功能性神经元的能力有限。NSCs能够在体外扩 增并分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。随着胚胎和成体神经干细胞分离、培养 技术的成熟，移植外源性NSCs为治疗CNS损伤和神经系统退行性病变提供了广阔的应用前 景。目前，利用外源性NSCs移植治疗帕金森病、老年性痴呆、脊髓损伤、休克、癫痫、精神病 等神经系统疾病取得了不少进展。创伤性脑损伤(traumatic brain injury, TBI)是以细胞丢失为主要特征的进行 性退行性病变。以往TBI的治疗侧重于药物治疗以减轻急性期的继发性脑损伤和提高慢 性进展期存活脑组织的功能，而细胞移植作为TBI治疗手段之一只在最近才开始被研究。 作为可移植的细胞种类很多，如永生化祖细胞、NSCs、胚胎神经组织、骨髓基质细胞、脐血细 胞、有丝分裂后神经元等。而NSCs具有多分化潜能、低免疫原性、取材容易、来源广泛等特 点，因此从临床应用和伦理角度都具有更大的优势。以往的研究大多是单纯的细胞移植或 联合某种因子移植来治疗TBI，但移植物的长期存活仍然存在较高的可变性，为了移植的 细胞能真正替代中枢神经系统损伤丢失的细胞，移植的细胞必须有足够的存活数量以替代 死亡的细胞，因此有必要在损伤区想方设法重建组织结构以利于再生。研究发现如果不给 予干预因素，大部分NSCs分化成了胶质细胞，仅少数分化为神经元。单纯的细胞移植由于 缺乏必要的三维空间物质基础而不利于NSCs的存活和迁移，也不利于应用干预因素促进 NSCs向神经元分化。随着21世纪生命科学中组织工程(tissue engineering)的兴起，为 真正地实现细胞替代疗法提供了新的希望。组织工程是应用生命科学和工程学的基本原理，开发能恢复、维持或改善受损组 织或器官功能的生物替代物。新生的组织工程化组织首先需要构建细胞支架复合物， 主要包括合适的细胞载体及种子细胞，其关键之一就是组织工程三维多孔支架载体的制 备。支架载体的三维空间结构可以为细胞提供获取营养、气体交换、排泄废物和生长代谢的 场所，为人为地加入干预因素调控种子细胞的分化提供了条件，也是形成新的具有形态和 功能的组织、器官的物质基础。在应用组织工程修复神经系统的研究中，理想的载体应与细 胞外基质类似，与活体细胞有良好的生物相容性。壳聚糖的结构和某些性质与细胞外基质 中的主要成分氨基多糖极其相似，而且表面高密度的正电荷有利于粘附带负电荷的细胞。 而NSCs由于具有来源广泛、取材容易和多向分化潜能等特点，是一种理想的种子细胞。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与神经干细胞具有生物相容性、制备方便、可用于修 复脑损伤的多孔壳聚糖支架、神经干细胞多孔壳聚糖支架及其用途。本发明的技术解决方案是一种多孔壳聚糖支架，其特征是由下列方法制备而成将壳聚糖溶于乙酸中 成为2% W/V的溶液，向细胞培养板的孔中加入该溶液，盖好，于4°C预冷，再置于_28°C冷冻 过夜，后在_60°C下冷冻干燥，然后向细胞培养板的孔中加入0. lmol/L NaOH水化处理，再 用pH7. 2的0. 01mol/L PBS清洗，最后再进行两次_60°C冷冻干燥，得到多孔壳聚糖支架。所述的多孔壳聚糖支架，由下列方法制备而成将壳聚糖溶于乙酸中成为2% W/V的溶液，向24孔细胞培养板每孔中加入Iml该溶液，盖好，于4°C预冷6h，再置于_28°C 冷冻过夜，后在_60°C下冷冻干燥24h，然后向每孔中加入0. lmol/L NaOH Iml水化20min， 再用pH7. 2的0. 01mol/L PBS清洗3次，最后再进行两次各24小时_60°C冷冻干燥，得到 多孔壳聚糖支架。一种神经干细胞多孔壳聚糖支架，其特征是由下列方法制成取神经干细胞克 隆球接种于培养孔内灭菌的壳聚糖多孔支架上，加入DMEM/F12(即培养基中含有DMEM和 F12两种成分)无血清培养基或加入含NGF的DMEM/F12无血清培养基，培养得到神经干细 胞多孔壳聚糖支架。所述的神经干细胞多孔壳聚糖支架，由下列方法制成取神经干细胞克隆球以 IX IO5个/ml的密度，接种于培养孔内灭菌的壳聚糖多孔支架上，加入DMEM/F12无血清培 养基1. 5ml或加入含lOOng/ml NGF的DMEM/F12无血清培养基1. 5ml，培养板置饱和湿度、 37°C、5% CO2培养箱中培养2周，每隔4天换1/2培养液，得到神经干细胞多孔壳聚糖支架。一种神经干细胞多孔壳聚糖支架在制备修复脑损伤的制品中的应用。本发明采用低温冷冻干燥法制备得到的壳聚糖多孔支架孔隙均勻，孔隙率达 90%，平均孔径为50 350 μ m。NSCs可以在壳聚糖多孔支架中存活、迁移并向神经元、星 形胶质细胞和少突胶质细胞分化，壳聚糖多孔支架具有良好的NSCs生物相容性。大鼠创伤 性脑损伤后，经壳聚糖作载体的NSCs移植治疗，可明显改善伤后大鼠的学习、记忆等认知 功能。大鼠创伤性脑损伤后，经壳聚糖作载体的NSCs移植治疗，移植物可以抑制损伤区周 围的胶质疤痕的形成，减轻损伤侧海马的萎缩变形。大鼠创伤性脑损伤后，经壳聚糖作载体 的NSCs移植治疗，移植的NSCs在体内壳聚糖多孔支架中分化的功能性细胞可与宿主脑组 织建立联系。NGF在体内、外均可以促进壳聚糖多孔支架中的NSCs向神经元分化及，在体内 还可促进植入NSCs分化的神经元与宿主脑组织建立联系，并促进创伤性脑损伤大鼠认知 功能的改善。下面结合实施例对本发明作进一步说明。
具体实施例方式第一部分体外实验壳聚糖支架的制备及与神经干细胞生物相容性1实验材料1.1实验动物
孕15d Sprague-Dawley(SD)大鼠，清洁级，由南通大学实验动物中心提供，生产许 可证号SCXK (苏)2002-0019。1.2实验仪器①低温冷冻干燥仪(Lyopro3000，法国Jouan公司)；
②C02培养箱(法国Jouan公司)；③超净工作台(SW-CJ-1F，苏州安泰空气技术有限公司)；④低温冷冻离心机(美国Beckman公司)；⑤Leica CM1900恒冷箱冰冻切片机(德国)；⑥Leica DMR正置荧光显微镜(德国)；⑦Leica DMIRB倒置荧光显微镜(德国)；⑧NUAIRE超低温冰箱(-85°C，美国)；⑨捷达801系列形态学分析系统(江苏省捷达科技发展有限公司)。1. 3实验试剂1. 3. 1壳聚糖支架制备主要试剂壳聚糖(chitosan，Cat. No. 9012-76-4) Sigma公 司。0. lmol/L Na0H，0. 01mol/L PBS (pH7. 2)，无菌生理盐水，70% 的乙醇。1. 3. 2 细胞培养主要试剂 DMEM 培养基(Dulbecco，s Modified EagleMedium, 12100-038)，F12 培养基(F12Nutrient Mixture, Cat. No. 21700-026)，无血清培养添加 剂 B27(B27Supplement，Cat. No. 17504-044)，胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS, Cat. No. 16140-087)自 Gibco &司。Hepes (N_2_hydroxyethylpiper￡izine_N’ -2-ethane sulfonic acid，羟乙基哌嗪乙硫磺酸，Cat.No.H3375)，小牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA, Cat. No. A3156)， @ & H 因〒(Epidermal Growth Factor, EGF, Cat. No. E4127)，碱性成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor-Basic, bFGF, Cat. No. F0291),白血病抑制因子(Leukemialnhibitory Factor, LIF, Cat. No. L5283)均购自 Sigma公司。1. 3. 3抗体试剂小鼠抗微管相关蛋白_2单克隆抗体(MouseAnti-MAP-2 Monoclonal Antibody, Cat. No. MAB3418)，小鼠抗胶质纤维酸性蛋白单克隆抗体(Mouse Anti-Glial Fibrillary Acidic ProteinMonoclonal Antibody, Cat. No. MAB360), /]、 鼠抗2，3_环核苷酸磷酸二酯酶单克隆抗体(Mouse Anti-2，，3，-cyclic nucleotide 3' -phosphodiesteraseMonoclonal Antibody, Cat. No. MAB326R)肖 _ 自 Chemicon 司。结合生物素的山羊抗鼠抗体(biotinylated anti-mouse IgG(H+L)made ingoat, Cat.No.BA-9200)，卵白素-生物素结合的辣根过氧化物酶复合物(avidin biotion horseradish peroxidase complex, ABC, Cat. No. PK-4000)均购自 Vector 公司。3，3_ 二甲 基联苯胺(3，3-Diaminobenzidine, DAB, Cat. No. D-5637)购自 Sigma 公司。1. 3. 4 其它试剂 0. 9 % 生理盐水，0. 01mol/L PBS (pH7. 2) (phosphatebuffer saline，磷酸盐缓冲液)，TritonX-100，10%山羊血清，4%多聚甲醛(0. lmol/L PB配制，pH 7. 4)，20%、30%蔗糖溶液(0. lmol/L PB 配制，pH7. 4)。复合麻醉剂 Chlorpent :4. 25g 水 合氯醛，2. 12g硫酸镁，0. 88g戊巴比妥钠，14. 25ml无水酒精，33. 80ml丙二醇，双蒸水定容 至 100ml。抗体稀释液用 pH7. 2 的 0. 01mol/L PBS、10% 山羊血清、0. 3% TritonX-100 和 0.03%NAN3配制 成。焦油紫染液(Cresylecht Violet) 1 %焦油紫溶液中滴加冰醋酸，调节PH至3. 75-3. 85。分化剂95%乙醇中滴加冰醋酸，调节pH至4. 10。2实验方法2. 1多孔壳聚糖支架的制备将壳聚糖溶于乙酸中成为2% (W/V)的溶液，向24孔细胞培养板每孔中加入 lml该溶液，迅速盖好，于4°C预冷6h，再置于_28°C冷冻过夜，后在-60°C下冷冻干燥24h。 然后向每孔中加入0. lmol/L NaOH lml水化20min，再用pH7. 2的0. 01mol/L PBS清洗3次， 最后再进行两次冷冻干燥得到多孔壳聚糖支架。接种细胞前用70%乙醇灭菌，再用无菌生 理盐水浸洗3次，最后在密封条件下经紫外灯照射20min。2. 2多孔壳聚糖支架孔径的检测将制备好的多孔壳聚糖支架用0. 01mol/L PBS固定于冻台，行冠状位冰冻连续切 片，切片厚度为15ym，待阴干后立即镜下观察，捷达801系列形态学分析软件检测多孔支 架的孔径。2. 3多孔壳聚糖支架孔隙率的检测采用乙醇替代法测定，将一定体积的壳聚糖多孔支架材料置于一定体积(VI)的 乙醇中，循环抽真空至无气泡逸出，材料和乙醇的总体积记为V2，视(V2-V1)为壳聚糖多孔 支架固体的体积。将含乙醇的支架材料移出后记所剩乙醇体积为V3，以材料中所含乙醇的 体积(V1-V3)为材料孔隙所占的体积，则材料的总体积为V= (V2-V1) + (V1-V3) =V2-V3。 所以壳聚糖多孔支架的孔隙率P = (V1-V3)/(V2-V3)。2. 4鼠胚神经干细胞单细胞克隆球的制备2. 4. 1鼠胚神经干细胞原代克隆和传代取孕15d SD大鼠1只，腹腔注射复合麻醉剂Chlorpent 2ml/100g体重。无菌条 件下取出鼠胚置无血清DMEM培养基中，分离出前脑，剔除脑膜和脉络膜，然后参照谭雪锋 等报道的方法(谭雪锋，金国华，田美玲等.人胚胎神经干细胞的分离、克隆和分化.神经 解剖学杂志，2004 ;20 (3) 262-266)进行NSCs的分离培养、原克隆和传代。2. 4. 2单细胞克隆及扩增参照黄镇等报道的方法(黄镇，金国华，张新化等.提高成年大鼠神经干细胞单克 隆形成率的方法.解剖学报，2002 ；33 (6) 594-598)进行单细胞克隆和扩增，最后得到大量 来源于同一细胞的第4代亚细胞系神经干细胞克隆球。2. 5NSCs的多孔壳聚糖支架培养取第4代神经干细胞克隆球以1X105个/mi的密度，接种于培养孔内灭菌的壳 聚糖多孔支架上，分成两组，每组12孔NSCs+支架组加入DMEM/F12无血清培养基1. 5ml ； NSCs+支架+NGF组加入含100ng/mlNGF的DMEM/F12无血清培养基1. 5ml。培养板置饱和 湿度、37°C、5% C02培养箱中培养2W，每隔4d换1/2培养液。2. 6组织固定及切片体外培养2W后，吸去各孔中的培养液，用0. 01mol/L PBS(pH7. 2)清洗3遍，吸去 PBS再用含有4%多聚甲醛的0. lmol/L PBS(pH7. 2)室温下固定20min，吸去多聚甲醛溶液， PBS清洗后，将贴附有NSCs的多孔壳聚糖支架行冠状位冰冻连续切片，切片厚15i!m，各壳 聚糖支架收集5套切片，每套取前、中、后的切片各一张，贴于涂有多聚赖氨酸的载玻片上， 阴干待染色。
2. 7切片染色2. 7. INissI染色两组各取一套切片，用焦油紫行Nissl染色，常规脱水、透明、封 片，镜下观察。2. 7. 2MAP-2免疫组化染色两组各取一套切片，置于染缸再用0. Olmol/ LPBS(pH7. 2)中漂洗后，每张切片滴加10%山羊血清50 ill封闭过夜，吸去山羊血清每张切 片滴加1 200稀释的小鼠抗MAP-2的单克隆抗体50111，41湿盒孵育2411。用0. Olmol/ L PBS (pH7. 2)漂洗3遍，每张切片滴加1 200稀释的结合有生物素的山羊抗小鼠的第二 抗体50 u 1，4°C湿盒孵育24h。再用PBS洗片3遍后，每张切片滴加ABC液50 u 1，4°C湿盒 孵育24h。最终切片经PBS洗片3遍后，用DAB呈色。常规脱水、透明、封片，镜下观察。2. 7. 3GFAP免疫组织化学染色除滴加的一抗为小鼠抗GFAP的单克隆抗体外，其余 均同2. 7. 2。2. 7. 4CNP免疫组织化学染色除滴加的一抗为小鼠抗CNP的单克隆抗体外，其余均 同 2. 7. 2。在作上述免疫组化染色时，同时另取3张切片作为阴性对照，用山羊血清替代一 抗，其余步骤相同，结果为阴性。2. 8图像处理、细胞计数、统计分析在放大40倍和400倍的显微镜下，将摄取的照片导入图像处理系统。应用捷达 801系列形态学分析软件，测量40倍视野下壳聚糖多孔支架每个孔的最大孔径和最小孔 径。计数400倍视野内MAP-2阳性细胞数，并通过图像处理系统得到相应照片中MAP-2阳 性细胞的胞体面积和细胞(包括突起)周长，每孔均取3张切片的相应平均值作为统计数 据。对GFAP和CNP阳性细胞作一般形态学观察。采用stata7. 0统计软件，对两组MAP-2 阳性细胞数以及胞体面积和细胞周长进行t检验。结果1壳聚糖多孔支架2%壳聚糖溶液在-60°C下冷冻干燥制备的多孔支架呈海绵状，孔隙率为90%，孔 隙均勻，多孔支架孔径为50-350 u m。2Nissl 染色两组切片的壳聚糖支架已溶解，但可见大量细胞从神经干细胞球中迁移出来，并 以集落形式贴附于壳聚糖多孔支架的孔壁上，NSCs+支架+NGF组可见到较多胞体较大的细 胞。3MAP-2、GFAP和CNP免疫组织化学染色3. 1MAP-2免疫组织化学染色两组均可见到以集落形式贴壁生长的MAP-2阳性细胞，呈棕黄色，但NSCs+支架 +NGF组MAP-2阳性细胞染色较深，细胞较多、胞体较大，多呈圆形或椭圆形，突起较长，有多 个突起；而NSCs+支架组MAP-2阳性细胞较少、胞体较小呈圆形或椭圆形，突起较少、较短， 以双突起为主。两组MAP-2阳性细胞的数量、面积、周长及统计分析结果见表1-1。T检验 结果显示，两组MAP-2阳性细胞数、胞体面积和细胞周长之间的p值均小于0. 01，说明两组 间三项指标均有显著性差异。表1-1MAP-2阳性细胞数、胞体面积、细胞周长结果以及统计分析结果(S±s，n =12)
权利要求
一种多孔壳聚糖支架，其特征是由下列方法制备而成将壳聚糖溶于乙酸中成为2％W/V的溶液，向细胞培养板的孔中加入该溶液，盖好，于4℃预冷，再置于 28℃冷冻过夜，后在 60℃下冷冻干燥，然后向细胞培养板的孔中加入NaOH水化处理，再用PBS清洗，最后再进行两次 60℃冷冻干燥，得到多孔壳聚糖支架。
2.根据权利要求1所述的多孔壳聚糖支架，其特征是由下列方法制备而成将壳聚糖 溶于乙酸中成为2% W/V的溶液，向24孔细胞培养板每孔中加入Iml该溶液，盖好，于 4°C预冷6h，再置于-28°C冷冻过夜，后在_60°C下冷冻干燥24h，然后向每孔中加入0. Imol/ L NaOH Iml水化20min，再用pH7. 2的0. 01mol/L PBS清洗3次，最后再进行两次各24小 时-60°C冷冻干燥，得到多孔壳聚糖支架。
3.—种神经干细胞多孔壳聚糖支架，其特征是由下列方法制成取神经干细胞克隆 球接种于培养孔内灭菌的壳聚糖多孔支架上，加入DMEM/F12无血清培养基或加入含NGF的 DMEM/F12无血清培养基，培养得到神经干细胞多孔壳聚糖支架。
4.根据权利要求3所述的神经干细胞多孔壳聚糖支架，其特征是由下列方法制成取 神经干细胞克隆球以IXlO5个/ml的密度，接种于培养孔内灭菌的壳聚糖多孔支架上，加 入DMEM/F12无血清培养基1. 5ml或加入含100ng/ml NGF的DMEM/F12无血清培养基1. 5ml, 培养板置饱和湿度、37°C、5% CO2培养箱中培养2周，每隔4天换1/2培养液，得到神经干 细胞多孔壳聚糖支架。
5.一种神经干细胞多孔壳聚糖支架在制备修复脑损伤的制品中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种多孔壳聚糖支架、神经干细胞多孔壳聚糖支架及其用途，将壳聚糖溶于乙酸中成为2%的溶液,向细胞培养板的孔中加入该溶液，冷冻干燥，然后向细胞培养板的孔中加入NaOH水化处理，最后再进行两次-60℃冷冻干燥，得到多孔壳聚糖支架。取神经干细胞克隆球接种于培养孔内灭菌的壳聚糖多孔支架上，加入DMEM/F12无血清培养基或加入含NGF的DMEM/F12无血清培养基，培养得到神经干细胞多孔壳聚糖支架。本发明采用低温冷冻干燥法制备得到的壳聚糖多孔支架孔隙均匀，孔隙率达90%，平均孔径为50～350μm，壳聚糖多孔支架具有良好的NSCs生物相容性。创伤性脑损伤后，经壳聚糖作载体的NSCs移植治疗,可明显改善伤后的学习、记忆等认知功能。
文档编号A61L27/20GK101979104SQ20101053290
公开日2011年2月23日 申请日期2010年11月4日 优先权日2010年11月4日
发明者毛伟峰, 田美玲, 秦建兵, 衣昕, 金国华, 高宜录 申请人:南通大学