以细菌纳米磁小体为载体的复合肿瘤基因疫苗及其制备方法

专利名称：以细菌纳米磁小体为载体的复合肿瘤基因疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物技术和肿瘤免疫领域，具体涉及一种以细菌纳米磁小体为载体的 复合肿瘤基因疫苗及其的制备方法。
背景技术：
肿瘤基因治疗是应用基因转移技术将外源基因导入宿主细胞，直接修复或纠正肿 瘤相关基因的结构与功能缺陷，或者通过增强宿主的免疫防御功能杀伤肿瘤细胞的一种治 疗。肿瘤免疫基因治疗研究的热点是肿瘤DNA疫苗。目前对于体内基因免疫的方式主要有 直接肌肉注射免疫，电脉冲，基因枪等，几种方法各有利弊。直接肌肉注射免疫虽然简单，但 是所需的基因量大，激起的免疫反应有效。电脉冲则影响的因素众多，而基因枪虽然所需基 因量极少，但是需要的特殊的设备，造价昂贵。因此建立一种新型安全简便的基因传递方式 极为重要。细菌纳米磁小体(BMP)是新型生物学纳米材料，主要成分是狗304，直径在25nm 45nm之间，外面被脂膜包被，膜上有大量的生物活性基团，可以与药物，基因等进行共价连 接，而且连接基因后可以通过外加磁场而易于分离纯化。由于其具有趋磁性，当利用其进行 体内基因传递时，可以用外加磁场使其具有磁靶向性。国内外虽然有研究报道其可以作为 一种基因传递方式，但是对其应用的条件并未研究透彻。探索其作为基因传递方式进行体 内外应用时的一系列条件，是利用BMP为载体建立一种复合基因疫苗，为基因治疗提供一 种新的治疗模式所必要的。本发明就是基于以上思路。发明内容
要解决的技术问题
本发明的目的是探索以细菌纳米磁小体为载体的复合肿瘤基因疫苗及其制备方法。
技术方案
本发明所涉及的以细菌纳米磁小体为载体的复合肿瘤基因疫苗是由细菌纳米磁 小体(BMP)、聚乙烯亚胺(PEI)和肿瘤基因疫苗组成，其中细菌纳米磁小体聚乙烯亚胺 肿瘤基因疫苗的连接质量比为0.3 1 1，其制备步骤包括
(1)对纯净的细菌纳米磁小体进行灭菌处理，并定量；
(2)将肿瘤基因疫苗进行紫外分光光度法测定，定量；
(3)将BMP PEI 肿瘤基因疫苗的连接质量比为0. 3 1 1，放入pH值为3 8的磷酸盐缓冲体系溶液中连接，制得细菌纳米磁小体-聚乙烯亚胺-肿瘤基因疫苗复合 物(BMP-PEI/肿瘤基因疫苗)，该复合物就是本发明的以细菌纳米磁小体为载体的复合肿瘤基因疫苗。
(4)以上的肿瘤基因疫苗为具有抗肿瘤效应的质粒DNA。
本发明所述的以细菌纳米磁小体为载体的复合肿瘤基因疫苗制备方法的详细描述
(1)对纯净的细菌纳米磁小体进行灭菌处理是采用Y射线照射进行，照射剂量为 15kGy ；依照Nakamura，N.等人的方法测定细菌纳米磁小体在660nm的吸光值(Nakamura， N. , Mutsunaga. Τ. Highly sensitive detection of allergen using bacterial magneticparticles :Biosensors. Anal Chem Acta, 1993, 281, 585-589)并根据 IOD660 = 172 μ g细菌纳米磁小体对其进行定量。
(2)将肿瘤基因疫苗进行紫外分光光度法测定，定量(具体方法参见《分 子克隆》第二版，科学出版社)，其中的肿瘤基因疫苗为pSLC-E7-Fc，pSLC-3P-Fc和 pCCL21-Te-Fc(Liu R, Zhou C, Wang D, et al. Enhancement of DNA vaccine potency by sandwiching antigen—codinggene between secondary lymphoid tissue chemokine(SLC) and IgG Fc fragment genes. Cancer Biol Ther.2006,5 (4) :427-34; Qin H, Zhou C, Wang D, et al. Enhancement ofantitumour immunity by a novel chemotactic antigen DNA vaccine encoding chemokinesand multiepitopes of prostate-tumour-associated antigens. Immunology.2006,117 (3) :419-30 ；Lin X, Zhou C, Wang S, et al. Enhanced antitumor effect against humantelomerase reverse transcriptase(hTERT)by vaccination with chemotactic-hTERTgene-modified tumor cell and the combination with anti-4—ΙΒΒ monoclonal antibodies. Int J Cancer. 2006,119(8) :1886-96.)；
(3)将细菌纳米磁小体聚乙烯亚胺肿瘤基因疫苗的连接质量比为 0.3 1 1，放入pH值为3 8的磷酸盐缓冲体系溶液中连接，制得细菌纳米磁小体-聚 乙烯亚胺-肿瘤基因疫苗复合物，该复合物就是本发明的以细菌纳米磁小体为载体的复合 肿瘤基因疫苗(BMP-PEI/肿瘤基因疫苗，其中的肿瘤基因疫苗为具有抗肿瘤效应的质粒 DNA)。
本发明对BMP、PEI和肿瘤基因疫苗连接时的缓冲体系进行调整，将NaCl溶液换成 PBS,并调整其pH值，使得BMP-PEI连接肿瘤基因疫苗的效率最高。
在本发明中，复合肿瘤基因疫苗制备过程中，连接肿瘤基因疫苗，PEI, BMP所用的 溶液及其溶液的PH值对以上三者的连接效率有很大影响。本发明选用PBS作为连接缓冲 体系，比用150mM NaCl连接的效率高，用不同pH值的PBS缓冲液(pH值分别为3，4，5，6， 7,8)试验，结果发现用pH值为4 5的PBS连接效率最高，pH值超过此范围(< 4或是> 5)，连接效率均下降，进而影响复合肿瘤基因疫苗效率。
在本发明中，复合肿瘤基因疫苗体外转染的最佳条件是需要在细胞的培养皿下 放置磁铁8 10分钟，所用的磁场强度是500mT 600mT。
在本发明中，所选用的磁场强度是500mT 600mT，低于此范围，转染的效率会下 降。而且磁场作用的时间应为8 10分钟，高于10分钟或低于8分钟转染效率也会下降。
在本发明中，复合肿瘤基因疫苗体内免疫的最佳条件是，当用该复合肿瘤基因疫 苗进行体内基因治疗时，皮下注射该疫苗达到微克级，并且在注射部位固定磁铁8 10分 钟，所用磁铁的磁场强度是500mT 600mT，即可达到明显的免疫效果。
体内进行复合肿瘤基因疫苗免疫时，免疫方式不同，注入体内的部位不同，治疗的 效果不一样。采用皮下注射和肌肉注射复合肿瘤基因疫苗，并均在注射部位进行磁场作用，4发现采用皮下注射，外加磁场疗效最佳。皮下注射复合肿瘤基因疫苗的剂量，本发明摸索 40 μ g，20 μ g，10 μ g，5 μ g，发现在5 μ g复合肿瘤基因疫苗对肿瘤具有明显的治疗效果，且 与其他几组高剂量的治疗效果无差异。
换言之，本发明涉及到以细菌纳米磁小体为载体的复合肿瘤基因疫苗进行体内外 应用时，所用的磁场强度是500mT 600mT，磁场作用时间是8 10分钟，体内免疫的方式 是皮下注射并外加磁场作用，免疫剂量达到微克级即可达到明显的免疫效应。
有益效果
本发明涉及以细菌纳米磁小体为载体的复合肿瘤基因疫苗及其制备方法。本发明 具体提供细菌纳米磁小体连接基因疫苗的最佳磷酸盐缓冲体系的PH值范围，体外转染和 体内免疫所用的磁场强度和磁场作用时间，以及用该复合基因疫苗对肿瘤模型治疗时，确 定了治疗剂量范围和免疫途径。本发明从而建立一种新型简便的基因传递方式，为基因治 疗提供一种新的基因疫苗的制备条件和免疫方法。


图1 :pSLC-E7-Fc在小鼠体内肿瘤预防实验。pCMV组、pE7组、pFc组、pSLC组、 pE7-Fc组、pSLC-Fc组、pSLC-E7_Fc组和pSLC+pE7+pFc组，每组5只动物。免疫程序在 TC-I肿瘤细胞(以下称TC-I细胞)接种前第10天，用基因枪免疫各种质粒。在第0天，向 小鼠右腋皮下接种5 X IO4个TC-I细胞。观察出瘤时间。
图2 不同pH值的磷酸缓冲液对BMP连接肿瘤基因疫苗pSLC-E7_Fc效率的影响。
图3 透射电镜照片。图3-1是磁小体(BMP)，图3_2是磁小体(BMP)与基因疫苗 pSLC-E7-Fc连接后复合肿瘤疫苗(BMP-PEI/pSLC-E7-Fc)的透射电镜照片，200000 X。
图4 半定量RT-PCR法选取复合肿瘤疫苗(BMP_PEI/pSLC-E7-Fc)进行体外基因 转染实验最佳条件。复合肿瘤基因疫苗转染B16细胞时，在不同的磁场下作用不同的时间， 强27 强磁场(磁场强度600mT)作用27分钟。强9 强磁场(磁场强度600mT)作用9分 钟。强3 强磁场(磁场强度600mT)作用3分钟。强1 强磁场(磁场强度600mT)作用1 分钟。弱27 弱磁场(磁场强度200mT)作用27分钟。弱9 弱磁场(磁场强度200mT)作 用9分钟。弱3 弱磁场(磁场强度200mT)作用3分钟。弱1 弱磁场(磁场强度200mT) 作用3分钟。48小时后，半定量RT-PCR进行测定。
图5 绿色荧光蛋白指示系统和流式细胞仪选取复合肿瘤基因疫苗(BMP-PEI/ pSLC-E7-Fc)体外基因转染实验最佳条件。将BMP-PEI/pEGFP-Nl转染B16F10细胞时，不 同的磁场作用不同的时间，a:脂质体转染pEGFP-Nl ；b 空白对照；c 强磁场(磁场强度 600mT)作用5分钟；d 强磁场(磁场强度600mT)作用10分钟；e 强磁场(磁场强度600mT) 作用20分钟；f 强磁场(磁场强度600mT)作用30分钟。48小时后，流式细胞仪检测转染 效率。
图6 活体小动物成像系统和荧光素酶指示系统显示磁场对复合肿瘤基因疫苗进 行体内基因传递效率的影响。+磁场组皮下注射10 μ g BMP-PEI/PGL4. 17皮下注射后，并 在磁场作用下10分钟。-磁场组皮下注射10 μ g BMP-PEI/pGL4. 17，但无磁场作用。48小 时后两组均腹腔注射荧光素酶底物(Iuciferin) 200 μ 1 (15mg/ml)，10分钟后可见在磁场 作用组中注射的部位有明显的荧光表达，非磁场组则无。右纵坐标轴代表荧光强度，越往上代表强度越高(红色)，往下代表强度最低(蓝色)。
图7 复合肿瘤基因疫苗(BMP-PEI/pSLC-E7-Fc)进行体内免疫的最佳免疫方式选 取。分为不治疗组，肌肉注射组，肌肉注射+磁场组，皮下肌肉注射组，皮下肌肉注射+磁场 组，第0天尾静脉接种TC-11 X IO5,第4天，第8天，第12天皮下注射20 μ g复合肿瘤基因 疫苗进行治疗，并外加强磁场作用(磁场强度600mT) 10分钟。第23天，取肺，计数结节(图 7-1，7-2)，称取肺重(图7-3)。
图8 复合肿瘤基因疫苗(BMP-PEI/pSLC_E7-Fc)治疗小鼠皮下肿瘤模型的最佳剂 量选择。第0天皮下注射TC-15X104，待肿瘤生长至5X5mm，随机分为5组，每组5只。第 6天，第10天，第14天分别皮下注射40 μ g，20 μ g，10 μ g，5 μ g复合肿瘤基因疫苗，并均用 外加磁场天啊作用10分钟。观察小鼠肿瘤生长情况，测量肿瘤的大小(图8-1)，记录小鼠 的生存期(图8-2)。
图9 复合肿瘤基因疫苗(BMP-PEI/pSLC_E7-Fc)治疗小鼠肺转移模型的最佳剂量 选择。分为不治疗组，IOyg 20分钟组代表IOyg复合肿瘤基因疫苗治疗，强磁场作用 20分钟；10 μ g 10分钟组代表10 μ g复合肿瘤基因疫苗治疗，强磁场作用10分钟；5 μ g 10分钟代表5 μ g复合肿瘤基因疫苗治疗，强磁场作用10分钟。第0天尾静脉接种TC-I 1 X IO5,第3天，第6天，第9天皮下注射BMP/pSLC-E7-Fc，并外加磁场，第23天取肺，计数 结节(图9-1，图9-2)。
图10 复合肿瘤基因疫苗(BMP-PEI/pSLC-E7-Fc)体内免疫的最佳磁场作用时间 选取。分为未治疗组，5 μ g 20min组代表5yg复合肿瘤基因疫苗治疗，强磁场作用20分 钟；5 μ g 10分钟组代表5 μ g复合肿瘤基因疫苗治疗，强磁场作用10分钟；5 μ g 5分钟 代表5 μ g复合肿瘤基因疫苗治疗，强磁场作用5分钟。5 μ g 1分钟代表5 μ g复合肿瘤基 因疫苗治疗，强磁场作用1分钟。第O天尾静脉接种TC-I IX 105，第3天，第6天，第9天 皮下注射复合肿瘤基因疫苗，并外加磁场，第23天取肺，计数结节(图10-1)，称量瘤重(图 10-2)。
图11 肿瘤中浸润的淋巴细胞。第0天皮下接种TC-I 5X IO4第4天，第8天，第 12天皮下注射5 μ g复合肿瘤基因疫苗(BMP-PEI/pSLC-E7-Fc)，并在注射部位用磁场(磁 场强度600mT)作用10分钟，第18天处死小鼠，将皮下肿瘤HE染色。左为未治疗对照组， 右为治疗组。
图12 乳酸脱氢酶法(LDH法)测小鼠脾细胞细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性。 第ο天皮下接种TC-I 5X IO4第4天，第8天，第12天皮下注射5 μ g复合肿瘤基因疫苗 (BMP-PEI/pSLC-E7-Fc)，并在注射部位用磁场(磁场强度600mT)作用10分钟，第18天处 死小鼠，将脾细胞作为效应细胞，以TC-I和B16为靶细胞，以效靶比为60 1进行细胞毒 测定。
图13 =BMP的免疫原性。第0天皮下注射20 μ g BMP, 5 μ g BMP, PBS对照，并在注 射部位用磁场(磁场强度600mT)作用10分钟，第22天重复免疫一次。第四天取小鼠外 周血。收集血清，用酶联免疫吸附法(ELISA法)测定血清中抗BMP抗体的浓度。图为各组 的吸光度值。
图14 复合肿瘤基因疫苗(BMP-PEI/pSLC-E7-Fc)的毒副作用。左为正常对照组， 右为治疗组。第O天皮下接种TC-I 5X IO4第4天，第8天，第12天皮下注射5yg复合肿瘤基因疫苗，并在注射部位用磁场(磁场强度600mT)作用10分钟，第观天处死小鼠，取心， 肝，肾，HE染色。
具体实施例本发明的实施例是为进一步说明本发明，不用来限制本发明的范围。
实施例1
质粒的转化，提取与纯化(具体方法参见《现代分子生物学实验技术》第二版，中 国协和医科大学出版社)
此法制备的质粒pSLC-E7-Fc、pEGFP-Nl和pGL4. 17 (DNA)用于后续的实验。
实施例2
复合肿瘤基因疫苗(BMP-PEI/pSLC-E7_Fc)的制备
(1)对纯净的细菌纳米磁小体(由中国农业大学李颖教授惠赠)进行灭菌处理是 采用15kGyY射线照射；依照Nakamura，N.等人的方法测定细菌纳米磁小体在660nm的 吸光值(Nakamura, N. , Mutsunaga, T. Highly sensitive detection of allergen using bacterialmagnetic particles :Biosensors. Anal Chem Acta, 1993, 281, 585-589)并根据 IOD660 = 172 μ g细菌纳米磁小体对其进行定量。
(2)将实施例1制备的质粒pSLC-E7_Fc(肿瘤基因疫苗)进行紫外分光光度法 测定，定量(具体方法参见《分子克隆》第二版，科学出版社)，其中的肿瘤基因疫苗为本发 明人所在实验室构建的三联抗肿瘤疫苗pSLC-E7-Fc，大小为2. 31cb(Liu R，Zhou C，Wang D, etal.Enhancement of DNA vaccine potency by sandwiching antigen-coding gene betweensecondary lymphoid tissue chemokine(SLC) and IgG Fc fragment genes. Cancer Biol Ther. 2006,5(4) :427-34)；
(3)将BMP PEI pSLC-E7_Fc的连接质量比为0. 3 1 1，放入pH值为3 8的磷酸盐缓冲体系溶液中连接，制得BMP-PEI/pSLC-E7-Fc复合物，该复合物就是本发明 的以细菌纳米磁小体为载体的复合肿瘤基因疫苗。
在本发明中，复合肿瘤基因疫苗进行体外基因转染实验最佳条件的选取所用的绿 色荧光蛋白指示系统pEGFP-Nl与BMP，PEI连接制备成BMP-PEI/pEGFP-Nl复合物，以及 显示磁场对复合肿瘤基因疫苗体内基因传递的影响所用的荧光素酶指示系统PGL4. 17与 BMP, PEI连接制备成BMP-PEI/pGL4. 17复合物，均按照实施例2。
实施例3
质粒pSLC-E7_Fc在小鼠体内肿瘤预防实验
将40只6周龄的C57雌性小鼠，随机分为8组pCMV组、pE7组、pFc组、pSLC组、 pE7-Fc组、pSLC-Fc组、pSLC-E7_Fc组和pSLC+pE7+pFc组，每组5只动物。免疫程序在 TC-I肿瘤细胞接种前第10天，用基因枪免疫各种质粒。在第0天，向小鼠右腋皮下接种 5X104个TC-I细胞。观察出瘤时间。结果如图1所示，在60天内，pSLC-E7-Fc组免疫的 小鼠100%的不长瘤，而所有对照质粒免疫的小鼠全长瘤；而且，pSLC、pE7与pi^c三种质粒 混合免疫的小鼠也全长瘤。
实施例4:
复合肿瘤基因疫苗连接效率最高的磷酸盐缓冲液pH值选择和制备
(1)复合肿瘤基因疫苗的制备最佳条件选择质粒DNA选取pSLC-E7_Fc质粒。对 纯净的细菌纳米磁小体进行灭菌处理，并将BMP，PEI和DNA三者准确定量(具体操作方法参见实施例2)。
将三者按照质粒DNA PEI BMP的连接质量比为1 1 0.3，分别放入pH值 为3，4，5，6，7，8的PBS溶液和150mM NaCl中连接，反应30分钟，制得BMP-PEI/质粒DNA 复合物，即是复合肿瘤基因疫苗，并检测各自质粒DNA的连接效率。
附图2是在不同的pH值缓冲液中BMP-PEI与质粒pSLC-E7_Fc的连接效率，可以看 到当连接缓冲液的PH值为4，5的时候，连接效率最高，达到96 %。当pH值低于4或是pH 值高于5的时候，连接率均下降。但是不管pH值为多少，PBS的连接效率是高于NaCl，NaCl 中的连接效率只有79%。附图3是在pH值为4 5的缓冲液中制得的复合肿瘤基因疫苗 (BMP-PEI/pSLC-E7-Fc)的电镜照片，可以看出该复合物的大小在IOOnm以内，与BMP相比， 分散性和均一性无差异。
(2)复合肿瘤基因疫苗(BMP-PEI/pSLC-E7-Fc)的制备对纯净的细菌纳米磁小体 进行灭菌处理，并将BMP，PEI和pSLC-E7-Fc三者准确定量(具体操作方法参见说明书技术 方案的相应部分)
将三者按照质粒pSLC-E7-Fc PEI BMP的连接质量比为1 1 0.3，放入PH =4 5的PBS溶液中连接，反应30分钟，制得复合肿瘤基因疫苗(BMP-PEI/pSLC-E7-Fc)。
实施例4
复合肿瘤基因疫苗进行体外基因转染实验最佳条件的选取
(l)BMP-PEI/pSLC-E7-Fc(复合肿瘤基因疫苗，以下同)和BMP-PEI/pEGFP-附复合 物的制备(具体操作方法参见实施例2)。
(2)半定量RT-PCR选取体外基因转染实验最佳条件
将复合肿瘤基因疫苗加至培养好的细胞B16F10细胞(C57BL/6小鼠黑色素瘤细胞 系)，共同孵育。在此期间，在细胞培养板下放置不同磁场强度的磁铁(磁场强度为600mT 和200mT)，在不同的磁场强度的磁场下作用不同的时间(作用1分钟，3分钟，9分钟，27分 钟)
撤去磁场，B16F10细胞继续培养48小时后，半定量RT-PCR测定(用 总RNA提取试剂盒Trizol Reagent提取细胞总RNA，DNA酶消化，逆转录，PCR扩 增。以β-actin为内参照，各重组基因扩增产物、引物及反应条件如下用于克隆 人 HPV16E7 扩增产物为 340bp,其上游引物5，-CGAATTCATGCACGGAGATACACC-3，，下 游弓丨物5，-TGATATCTGGTTTCCGAGAACAG-3，。β -actin 扩增产物 750bp，上游引物是 5，-TTGTTACCAACTGGGACGACATGG-3，，下游引物5，-GATCTTGATCTTCATGGTGCTAGG-3，。反应 条件均为94°C变性2分钟；94°C变性30秒、60°C退火30秒、72°C延伸45秒，共28个循环； 最后72°C 7分钟，4°C保温。1. 2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果)。附图4可以看到在强 磁场(磁场强度600mT)作用9分钟时，体外转染效率最高。
(3)绿色荧光蛋白指示系统和流式细胞仪选取复合肿瘤基因疫苗体外基因转染实 验最佳条件
将BMP-PEI/pEGFP-Nl加至培养好的B16F10肿瘤细胞，共同孵育。在此期间，在 细胞培养板下放置磁铁(磁场强度为600mT)，但是作用不同的时间(作用5min，10min， 20min，30min)，并设脂质体转染的阳性对照和空白对照。撤去磁场后，B16F10细胞在培养 箱继续培养48小时后，用流式细胞仪检测转染效率，附图5可以看到磁场强度为600mT的磁铁作用10分钟，转染效率最高，达到11.7%。
实施例5
活体小动物成像系统和荧光素酶指示系统显示磁场对复合肿瘤基因疫苗进行体 内基因传递效率的影响
(1) BMP-PEI/pGL4. 17复合物的制备(具体操作方法参见实施例2的相应部分)
(2将4只6周龄的C57雌性小鼠随机分为两组，每组2只。小鼠进行注射之前， BMP-PEI/pGL4. 17复合物用超声波轻微击打使该复合物分散。皮下注射10 μ g BMP-PEI/ PGL4. 17后，并在注射部位固定600mT的磁铁，作用时间为10分钟。另设一组皮下注 射10 μ gBMP-PEI/pGL4. 17，但无磁场作用。48小时后两组均腹腔注射荧光素酶底物 (Iuciferin) 200 μ 1 (15mg/ml)，10分钟后观察。附图6可见在磁场作用组中注射的部位有 明显的荧光表达，非磁场组则无。
实施例6
复合肿瘤基因疫苗的制备和最佳免疫方式选取
(1)复合肿瘤基因疫苗的制备(具体操作方法参见实施例2的相应部分)
(2)复合肿瘤基因疫苗的最佳免疫方式选取将25只6周大小的C57雌性小鼠尾 静脉接种ι χ IO5TC-I肿瘤细胞，随机分为5组。复合肿瘤基因疫苗用前超声波分散。肿瘤 接种后第4天皮下注射20 μ g复合肿瘤基因疫苗，在注射部位固定600mT磁场，作用10分 钟，同时设不加磁场对照组；或肌肉注射20 μ g复合肿瘤基因疫苗，在注射部位加或不加磁 场(方法同前)；并设不治疗对照组。第8天，第12天重复治疗两次。第23天，取肺，计数 结节，称取肺重。附图7(a)显示皮下注射+磁场组治疗效果最好。说明用复合肿瘤基因疫 苗免疫时，注射的方式很重要，皮下注射显然好于肌肉注射，而且有磁场作用比没有磁场作 用效果明显好。(b)计数各组的肺脏的肿瘤结节，皮下注射+磁场组显示最少的肿瘤结节。 (c)称重各组的肺脏，皮下注射+磁场组肺重最小，与正常对照组无统计学差异。
实施例7
复合肿瘤基因疫苗的制备和体内免疫的最佳剂量选取
(1)复合肿瘤基因疫苗的制备(具体操作方法参见实施例2的相应部分)
(2)复合肿瘤基因疫苗治疗小鼠皮下肿瘤模型的最佳剂量选取第0天将25只6 周龄的C57雌性小鼠皮下注射TC-I细胞5 X 104，待肿瘤生长至5 X 5mm，随机分为5组，每 组5只。复合肿瘤基因疫苗用前超声波分散。第6天，第10天，第14天皮下注射不同剂 量(40yg，20yg，10yg，5yg)的复合肿瘤基因疫苗，并在注射部位固定磁场(磁场强度 600mT)作用10分钟，同时设不加磁场对照组；观察小鼠肿瘤生长情况，测量肿瘤的大小，记 录小鼠的生存期。附图8显示这四组治疗组相比不治疗组，肿瘤生长明显减慢，生存期明 显延长，但是这四组的肿瘤生长情况和生存期没有统计学差异。图(b)显示平均生存期中， 5 μ g+磁场组是最长的，达到52. 6天，并对照组37. 2天延长14. 7天。由此可见用复合肿瘤 基因疫苗治疗小鼠皮下肿瘤模型只需要5 μ g就能达到明显的疗效。
(3)复合肿瘤基因疫苗治疗小鼠肺转移肿瘤模型的最佳剂量选取第0天将20只 6周大小的C57雌性小鼠尾静脉接种TC-I细胞IX 105，随机分为4组，复合肿瘤基因疫苗 用前超声波分散。第3天，第6天，第9天皮下注射5 μ g复合肿瘤基因疫苗，并在注射部位 固定磁场(磁场强度600mT)作用10分钟；10 μ g复合肿瘤基因疫苗，并在注射部位固定磁场(磁场强度600mT)作用10分钟和20分钟。第23天取肺，计数结节，称量肺重。附图9 显示5yg 10分钟效果最好，显示最少的肺结节和肺重，其效果与IOyg 10分钟组无明显 差异，但是与10yg20分钟组有差异，说明用复合肿瘤基因疫苗治疗小鼠肺转移肿瘤模型 同样只需要5 μ g就能达到明显的疗效。而且磁场作用时间并非越长越好，10分钟足够。
实施例8
复合肿瘤基因疫苗的制备和体内免疫的最佳磁场作用时间选取
(1)复合肿瘤基因疫苗的制备(具体操作方法参见实施例2的相应部分)
(2)复合肿瘤基因疫苗体内免疫的最佳磁场作用时间选取第0天将20只6周大 小的C57雌性小鼠尾静脉接种TC-I细胞1 X IO5,随机分为4组，，复合肿瘤基因疫苗用前超 声波分散。第3天，第6天，第9天皮下注射5 μ g复合肿瘤基因疫苗，并在注射部位固定磁 场(磁场强度600mT)作用20分钟，10分钟，5分钟，1分钟；第23天取肺，计数结节，称量 肺重。附图10显示5yg 10分钟效果最好，显示最少的肺结节和肺重，其他组治疗效果不 好，说明用复合肿瘤基因疫苗进行体内免疫的最佳磁场作用时间是10分钟，多于或是少于 10分钟治疗效果不佳。
实施例9
复合肿瘤基因疫苗的制备以及诱发的机体免疫效应
(1)复合肿瘤基因疫苗的制备(具体操作方法参见实施例2的相应部分)
(2)复合肿瘤基因疫苗诱发的机体免疫效应第0天将6只6周龄的C57雌性小鼠 皮下注射TC-I细胞5 X 104，待肿瘤生长至5 X 5mm，随机分为2组，未对照组和治疗组，每组 3只。给治疗组小鼠进行注射之前，复合肿瘤基因疫苗用前超声波分散。第4天，第8天，第 12天皮下注射5 μ g的复合肿瘤基因疫苗，并在注射部位固定磁场(磁场强度600mT)作用 10分钟，第17天处死未治疗组和治疗组小鼠。
将皮下肿瘤剥出，HE染色。附图11可见在治疗组其肿瘤局部有大量的肿瘤浸润 性淋巴细胞。而肿瘤浸润性淋巴细胞的多少与预后成正相关。
乳酸脱氢酶法(LDH法)测小鼠脾细胞中细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性处 死未治疗组和治疗组小鼠，收集脾细胞。加入红细胞裂解液(Tris-NH4Cl，0. 16M的NH4C1 和0. 17M的Tris按9 1的比例混合，pH 7. 2)，作用，加入生理盐水，洗两遍。台盼 蓝计数，用含5%胎牛血清的1640培养基稀释作为效应细胞，待用。采用CytoTox 96 : Non-RadioactiveCytotoxicity Assay (Promage USA)试剂盒，以 TC-1 细胞和 B16 细胞为靶 细胞，将脾细胞按60 1的比例加入到上述96孔板中，以效靶比为60 1进行细胞毒测 定。酶标仪测490nm处的吸光值，计算杀伤率。附图12显示当效靶比为60 1时，治疗组 的脾细胞对TC-I细胞和B16细胞的杀伤率分别是26. 06%和5 %，而未治疗组对这两种细 胞均没有杀伤，说明治疗组中产生了特异性杀伤的细胞毒性T淋巴细胞。
实施例10
复合肿瘤基因疫苗的质量控制和生物相容性毒副作用和免疫原性
(1)细菌纳米磁小体(BMP)的免疫原性
对纯净的细菌纳米磁小体进行灭菌处理，定量(具体操作方法参见说明书技术方 案的相应部分)。将9只6周龄的C57雌性小鼠，随机分为三组，每组3只。第0天分别给 每组小鼠皮下注射20 μ g BMP, 5 μ g BMP, PBS,并在注射部位固定磁场(磁场强度600mT)作用10分钟。给小鼠进行注射之前，BMP需要用超声波轻微击打使其更好的分散。第22 天重复免疫一次，第27天处死三组小鼠。收集小鼠外周血，4°C冰箱过夜。2000r/min离心 30分钟，吸取血清，用含0. 05%吐温-20和10%胎牛血清的PBS将血清对倍稀释成1 2， 1 4,1 8,1 16,1 32,1 64,1 128,1 256。在每个 96 孔反应孔中加入 20 μ g BMP,用洗涤缓冲液(含0. 05 %吐温-20和10 %胎牛血清的PBS)洗3次，每次3分钟(简 称洗涤，下同)。将各种稀释度的小鼠血清0. ImL加入上述反应孔中，室温孵育1小时。洗 涤，同时做标准品、空白孔及阳性对照孔。加入新鲜稀释的酶标抗体0. lmL，室温孵育0. 5 1小时，洗涤。于各反应孔中加入底物溶液O.lmL，室温放置10 30分钟。于各反应孔中 加入终止液0. 05mL。以酶标仪检测450nm处OD值，570nm作为校正波长。
附图13显示，20yg ΒΜΡ,δμ g BMP与PBS组相比，其OD值无明显差异。在本发明 中，复合肿瘤基因疫苗使用的免疫剂量上限为40 μ g，其中连接的BMP剂量为20 μ g ；下限为 5 μ g，其中连接的BMP剂量为2. 5μ g。因此，在复合肿瘤基因疫苗使用的免疫剂量范围中， BMP无免疫原性。
(2)复合肿瘤基因疫苗诱发的机体的毒副作用
1)复合肿瘤基因疫苗的制备(具体操作方法参见实施例2的相应部分)
2)复合肿瘤基因疫苗的毒副作用
第O天将3只6周大小的C57雌性小鼠皮下注射TC-15X 104，待肿瘤生长至 5X5mm，对小鼠进行治疗。复合肿瘤基因疫苗用前超声波分散。第4天，第8天，第12天皮 下注射5 μ g复合肿瘤基因疫苗，并在注射部位固定磁场(磁场强度600mT)作用10分钟， 第28天处死未治疗组和治疗组小鼠。
我们将治疗组小鼠的心，肝，肾做HE染色后，附图14显示，其与正常对照组没有明 显变化，说明复合肿瘤基因疫苗对机体无毒副作用。
实施例11
复合肿瘤基因疫苗(BMP-PEI/pSLC-3P_Fc)的制备
(1)本实验室从人前列腺特异膜抗原(hPSM)、小鼠前列腺酸性磷酸酶(mPAP)和人 的前列腺特异抗原(hPSA)选取DNA片段，将所选取的片段克隆并拼接成hPSM-mPAP-hPSA 融合基因，即3P基因。在3P的5'端连接次级淋巴组织趋化性细胞因子(SLC)，而在其 3'端连接人IgG的Fc基因，从而构建肿瘤基因疫苗，称pSLC-3P-Fc(Qin H，Zhou C，Wang D, et al. Enhancement of antitumour immunity by a novel chemotactic antigen DNA vaccineencoding chemokines and multiepitopes of prostate-tumour-associated antigens. Immunology. 2006,117(3) :419-30.)
(2)对纯净的细菌纳米磁小体进行灭菌处理，并定量；
(3)将肿瘤基因疫苗进行紫外分光光度法测定，定量；
(4)将细菌纳米磁小体聚乙烯亚胺肿瘤基因疫苗(pSLC-3P_Fc)的连接质量 比为0.3 1 1，放入pH值为4 5的磷酸盐缓冲体系溶液中连接，制得细菌纳米磁小 体-聚乙烯亚胺-肿瘤基因疫苗(pSLC-3P-Fc)复合物，该复合物就是本发明的以细菌纳米 磁小体为载体的复合肿瘤基因疫苗(BMP-PEI/pSLC-3P-Fc)。
该复合肿瘤基因疫苗(BMP-PEI/pSLC-3P-Fc)对人前列腺癌有显著的杀伤效应。
实施例12
复合肿瘤基因疫苗(BMP-PEI/pCCL21-Te-Fc)的制备
(1)本实验室分别在人端粒酶逆转录酶通用肿瘤抗原基因(简称Te)的上 游连接趋化因子CCL21(即是SLC基因)，在其下游连接IgG Fc基因片段，构建肿瘤 基因疫苗 pCCL21-Te-Fc (Lin X, Zhou C, Wang S, et al. Enhanced antitumor effect against humantelomerase reverse transcriptase(hTERT)by vaccination with chemotactic-hTERTgene-modified tumor cell and the combination with anti-4—ΙΒΒ monoclonal antibodies.Int J Cancer. 2006,119(8) :1886-96.)；
(2)对纯净的细菌纳米磁小体进行灭菌处理，并定量；
(3)将肿瘤基因疫苗进行紫外分光光度法测定，定量；
(4)将细菌纳米磁小体聚乙烯亚胺肿瘤基因疫苗(pCCL21-Te-Fc)的连接质 量比为0.3 1 1，放入pH值为4 5的磷酸盐缓冲体系溶液中连接，制得细菌纳米磁小 体-聚乙烯亚胺-肿瘤基因疫苗(pCCL21-Te-Fc)复合物，该复合物就是本发明的以细菌纳 米磁小体为载体的复合肿瘤基因疫苗(BMP-PEI/pCCL21-Te-Fc)。
该复合肿瘤基因疫苗(BMP_PEI/pCCL21-Te-Fc)对于人前列腺癌细胞系LNCap细 胞，人乳腺癌细胞系MCF7，人卵巢癌细胞系SK-0V-3、人骨肉瘤细胞系U20S/Te具有显著的 杀伤效应。
权利要求
1.一种以细菌纳米磁小体为载体的复合肿瘤基因疫苗，其特征在于该疫苗主要是由细 菌纳米磁小体、聚乙烯亚胺和肿瘤基因疫苗组成。
2.一种以细菌纳米磁小体为载体的复合肿瘤基因疫苗的制备方法，其特征在于包括以 下步骤(1)对纯净的细菌纳米磁小体进行灭菌处理，并定量；(2)将肿瘤基因疫苗进行紫外分光光度法测定，定量；(3)将细菌纳米磁小体聚乙烯亚胺肿瘤基因疫苗的连接质量比为0.3 1 1，放 入PH值为3 8的磷酸盐缓冲体系溶液中连接，制得细菌纳米磁小体-聚乙烯亚胺-肿瘤 基因疫苗复合物，该复合物就是本发明的以细菌纳米磁小体为载体的复合肿瘤基因疫苗。
3.如权利要求1，2所述的一种以细菌纳米磁小体为载体的复合肿瘤基因疫苗，其特征 在于其中的肿瘤基因疫苗为具有抗肿瘤效应的质粒DNA。
4.如权利要求1 3所述的一种以细菌纳米磁小体为载体的复合肿瘤基因疫苗， 其特征在于其中的肿瘤基因疫苗优选的为含有序列5的pSLC-3P-Fc、含有序列6的 pSLC-E7-Fc和含有序列7的pCCL21-Te_Fc抗肿瘤效应的质粒DNA。
5.如权利要求2所述的一种以细菌纳米磁小体为载体的复合肿瘤基因疫苗的制备 方法，其特征在于连接所使用的磷酸盐缓冲体系的配方为1000ml蒸馏水NaCl 8g, KCl 0. 2g，Na2HPO4 · Iffl2O 2. 87g，KH2PO4 0. 2g ；磷酸盐缓冲体系最优化的pH值范围为4 5。
6.一种以细菌纳米磁小体为载体的复合肿瘤基因疫苗的使用，其特征在于本发明的细 菌纳米磁小体为载体的复合肿瘤基因疫苗在使用时是通过皮下途径接种，需要在被注射部 位固定磁铁8 10分钟，所用的磁铁的磁场强度是500mT 600mT，疫苗接种剂量达到微克 级时，即能产生免疫效应。
全文摘要
本发明涉及以细菌纳米磁小体为载体的复合肿瘤基因疫苗及其制备方法。本发明具体提供细菌纳米磁小体连接基因疫苗的最佳磷酸盐缓冲体系的pH值范围，体外转染和体内免疫所用的磁场强度和磁场作用时间，以及用该复合基因疫苗对肿瘤模型治疗时，确定了治疗剂量范围和免疫途径。本发明从而建立一种新型简便的基因传递方式，为基因治疗提供一种新的基因疫苗的制备条件和免疫方法。
文档编号A61K48/00GK102028958SQ20101060545
公开日2011年4月27日 申请日期2010年12月24日 优先权日2010年12月24日
发明者刘容枝, 周春霞, 唐翌姝, 张叔人, 王冬梅, 马文波 申请人:中国医学科学院肿瘤研究所