专利名称：肿瘤细胞核靶向药物载体及其在制备抗肿瘤药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物药学技术领域，具体涉及一种肿瘤细胞核靶向药物载体及其在制 备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
攻克肿瘤一直是生物医学界的热点问题。近百年来已经发展形成了手术、放疗、 化疗三大肿瘤临床治疗方法。这些治疗手段在一定程度上延长了患者的带瘤生存期，但他 们在临床应用过程中除了切除和破坏肿瘤外还损伤到正常组织的结构和功能，尤其是在全 身使用化疗药物时，药物通过血液循环达到人体的各个组织并对正常细胞也产生了杀伤作 用，引起全身的不良反应，严重影响治疗的最终效果。因此，新型肿瘤特异治疗手段的研发 显得尤为重要，也是一直以来研究者不懈努力的目标。肿瘤细胞靶向性药物载体的研究无 疑是当前肿瘤学和药学研究中最活跃的领域之一。随着人类基因组计划(HGP)的完成以及人类癌症基因组解剖计划(CGAP)的深入 开展，人们在分子水平上对肿瘤细胞的认识有了很大的提高。研究者通过对一些与肿瘤细 胞密切相关的受体或分子，如表皮生长因子受体(印idermal growth factor，EGF)、精氨酰 甘氨酰天冬氨酸肽(Arg-Gly-Asp，RGD)分子的研究，为肿瘤靶向性药物载体的研发提供了 重要的理论依据。RGD、EGF导向分子等成为了设计肿瘤细胞靶向性载体的首选分子，使针 对肿瘤细胞的靶向治疗有了突破性的进展。然而，临床上理想的抗肿瘤药物的载体应该不仅能靶向性运送治疗性药物到达 肿瘤细胞，而且能运载药物进入发挥药效的亚细胞结构中。这样才能既不影响正常细胞 的生长，降低药物的毒副作用，又能充分发挥抗肿瘤药物的药效。由于现今绝大多数商 品化的抗肿瘤药物均是通过干扰细胞核内的生理过程导致肿瘤细胞死亡的，例如阿霉素 (Adriamycin/Doxorubicin, ADM)通过抑制细胞核内DNA及RNA的合成达到杀灭肿瘤细胞 的作用，因此，抗肿瘤药物的载体仅具有肿瘤细胞靶向性是不够的，它只能使药物接触到肿 瘤细胞，但却无法使药物有效进入肿瘤细胞核中，从而造成抗肿瘤药物疗效不高，用药剂量 增大，毒副作用增大。这是长期以来影响抗肿瘤药物药效性的关键。因此，抗肿瘤药物的载 体的核靶向功能至关重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型抗肿瘤药物的载体，它能携带抗肿瘤药物靶向性地 进入肿瘤细胞的细胞核，实现抗肿瘤药物对肿瘤细胞的特异性、有效性杀伤，同时对正常细 胞不会有亲和性或毒副作用。本发明提供的这种新型抗肿瘤药物的载体是一种具有肿瘤细 胞核靶向的蛋白质，可以在制备抗肿瘤药物中得到广泛的应用。本发明从肿瘤特异性和药物发挥作用的位点这两个方面入手，开发出双重靶向性 药物载体。这种药物载体既能对肿瘤细胞有特异性的识别，使药物直接接触肿瘤细胞并引 导肿瘤细胞对药物的吞噬作用，又能迅速介导药物的入核转运，使药物有效进入细胞核从而发挥杀灭肿瘤细胞的作用。使用本发明的药物载体能减少抗肿瘤药物的使用剂量，并显 著降低了药物的毒副作用，实现了对肿瘤细胞的精确杀灭。迄今为止国内外尚未报道过本发明的肿瘤细胞靶向药物载体。尚未见用这种药物 载体提高抗肿瘤药物杀伤肿瘤细胞能力的报道。本发明所述的一种肿瘤细胞核靶向药物载体，该药物载体蛋白包含至少一个核定 位序列(nuclear localization sequence)、至少一个RGD三肽序列和至少一个多聚组氨酸 肽序列，核定位序列通过至少一个共价键与所述的RGD三肽序列相偶联，而所述的多聚组 氨酸肽序列通过至少一个共价键与所述的核定位序列或所述的RGD三肽序列相偶联，形成 三者的线性重组蛋白序列。其中所述的核定位序列是来自人体蛋白的多肽序列，具有单一的核靶向功能，其 具有SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列，所述的RGD三肽序列具有SEQ ID NO 2所示的氨基 酸序列，所述的多聚组氨酸肽序列具有SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列。进一步，前面所述的一种肿瘤细胞核靶向药物载体的多聚组氨酸肽序列位于该药 物载体蛋白的N末端或者C末端。共价键是肽键。进一步，该药物载体的氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示。前面所述的一种肿瘤细胞核靶向药物载体在制备抗肿瘤药物中具有广泛的应用。 该药物载体通过至少一个共价键与抗肿瘤药物相偶联，形成肿瘤细胞核靶向载体-抗肿 瘤药物的共价偶联物。抗肿瘤药物为阿霉素(Adriamycin，ADM)、阿糖胞苷(Cytarabine， CPT)、雷替曲塞(Raltitrexed)或顺钼(Cisplatin Injection)。进一步，本发明还涉及一种编码前面所述的肿瘤细胞核靶向药物载体蛋白的基 因，其具有SEQ ID NO :5所示的DNA序列。本发明还涉及一种重组表达载体，其是SEQ ID NO 5所示DNA序列的基因与表达载体pEI^8a、pMA5或pGT22重组构建的重组表达载体。本发明实施例1中的肿瘤细胞核靶向药物载体的氨基酸序列如SEQ ID NO 4所 示，它是SEQ ID NO :1序列与SEQ ID NO 2序列和SEQ ID NO :3序列顺次重组而成，实施 例2中所制备的“肿瘤细胞核靶向载体-抗肿瘤药物”的共价偶联物中，载体的氨基酸序列 如SEQ ID NO :4所示，抗肿瘤药物是阿霉素(AdriamyCin，ADM)，实施例3中“肿瘤细胞核靶 向载体-抗肿瘤药物”的共价偶联物对肿瘤细胞特异性和有效性杀伤作用中，所应用的靶细 胞是Hela细胞。本发明的特点是以来自人体蛋白的核定位序列为药物载体蛋白的核心序列，同时 重组了与肿瘤细胞密切相关的小肽序列，充分体现出载体蛋白的肿瘤细胞特异性和核靶向 性，使本发明的抗肿瘤药物载体具有双重靶向性。
图1 实施例1所述的pET28a-P107RH重组表达载体的测序谱图；图2 实施例1所述的重组表达载体pET28a-P107RH构建示意图；图3 纯化得到的重组药物载体蛋白P107RH的SDS-PAGE图谱；其中M:蛋白质 Marker ；A :P107RH ；图4 :P107RH-ADM的纯度分析图；图5 :P107RH与ADM的偶联的荧光分光光度法分析图6 药物载体P107RH增强抗肿瘤药物ADM对HeLa细胞杀伤作用分析图；其中， 以对照细胞为100% ；图7 药物载体P107RH加速抗肿瘤药物ADM进入肿瘤细胞核并使ADM在肿瘤细胞 中聚集分析图；其中，ADM的免疫荧光显示出ADM的存在部位，DAPI染色的部位显示出细胞 核的区域；图8 药物载体P107RH增强抗肿瘤药物ADM对肿瘤细胞的特异性并减少ADM对非 肿瘤细胞的杀伤作用分析图；其中，以对照细胞为100%。
具体实施例方式实施例1 制备肿瘤细胞核靶向药物载体P107RH，包括以下步骤(1)设计本发明的药物载体蛋白序列本发明的肿瘤细胞核靶向药物载体P107RH的设计使得其完整氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示，它包含了 1个SEQ ID NO 1(核靶向)序列，1个SEQ ID NO :2(肿瘤细胞识 别)序列和1个SEQ ID NO 3 (组氨酸标签)序列；1个核靶向序列SEQ ID NO 1顺次与1 个肿瘤识别序列SEQ ID NO :2和1个组氨酸标签序列SEQ IDNO 3重组形成肿瘤细胞核靶 向药物载体序列SEQ ID NO 4 ；SEQ ID N0:3(组氨酸标签)序列既是该药物载体序列的一 部分，又是该药物载体蛋白的纯化标签。(2)合成编码P107RH的基因及构建其表达载体依据本发明所设计的肿瘤细胞核靶向药物载体P107RH的氨基酸序列，设计并利 用DNA合成仪人工合成了编码P107R的基因片段，其序列如下aaccatggacctcttcggggacctgccggagcccgagcgctcgccgcgcccggctgccgggaaagaagc tcagaaaggacccctgctctttgatgacctccctccggccagcagtactgactcaggatcagggggacctttgcttt ttgatgatctcccacccgctagcagtggcgattcaggttctcttgccacatcaatatcccagatggtaaagactgaa gggaaaggagcaaagagaaaaacctccgaggaagagaagaatggcagtgaagagcttgtggaaaagaaagtttgtaa agcctcttcggtgatctttggtctgcgtggagatctcgagct其中5’端有下划线的CCatgg序列是内切酶Nco 1识别位点，3’端有下划线的 M^mg序列是内切酶》iol识别位点，所设计的此二酶切位点与本发明所用的原核表达载 体pED8a(通用的大肠杆菌表达载体，含有T7启动子、组氨酸标签及硫酸卡那霉素抗性基 因等，Novagen等公司有售)的Ncol和B10I相匹配，适合于在大肠杆菌中高效表达。利用 Ncol和Biol切割位点将此人工合成的编码P107R的基因片段克隆进表达载体pET28a中 Ncol和Biol酶切位点之间，连接便得到完整的编码P107RH的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO 5所示。上述表达载体的构建步骤具体如下双酶切反应将l.Oyg pET28a载体和上述用DNA合成仪人工合成的编码P107R 的基因片段5. Oug分别与适量去离子水混勻，使其总体积分别为16 μ 1，各加入2单位的限 制性内切酶Ncol和Xhol及2μ1相应的IOX K缓冲液及2 μ 1小牛血清白蛋白(BSA)，使其 终浓度为0. 01 % (质量浓度)，混勻，置于37°C水浴保温2小时后，分别使用常规琼脂糖凝 胶回收试剂盒(上海生工公司有售，货号BS413)回收目的DNA，分别获得载体pET28a片段 和编码P107R的基因片段。
编码P107R的基因片段与载体pET28a的连接取0. 5 μ g上述步骤回收的载体 pET28a片段，加入10倍摩尔量的上述步骤得到的编码P107R的基因片段、2 μ 1 10XT4DNA 连接酶缓冲液，加去离子水定容至20pl，最后加入1单位的T4DNA连接酶，混勻并瞬间离心 以使液滴聚集管底，置于16°C水浴过夜后，得到连接好的重组表达载体pET28a-P107RH。重组表达载体pET28a_P107RH转化Ε. coli DH5 α 取10 μ 1重组表达载体 pET28a-P107RH加入100 μ 1 Ε. coli DH5 α感受态细胞(Ε. coli DH5 α感受态细胞的制备 方法参照“分子克隆实验指南”第二版，科学出版社，49页)中，冰浴30分钟后置于42°C水 浴中保温1分钟，立即取出并置于冰浴中冷却2分钟。加入200μ1 37°C预热的SOC液体培 养基，370C 150rpm振摇培养60分钟后，取出100 μ 1培养液涂布于含硫酸卡那霉素的LB琼 脂培养平板上，37°C培养16小时后，出现转化菌落。重组表达载体pET28a-P107RH的克隆与基因序列分析挑取转化菌落进行核酸序 列分析，结果如图1 (重组表达载体pET28a-P107RH测序谱图，其中编码P107RH的基因序号 为766 1122号)所示，证明获得了编码完整P107RH的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO 5所示，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA。重组表达载体pET28a-P107RH的构建过程如 图2所示，利用Ncol和B10I切割位点将合成的编码P107RGD的基因片段克隆进表达载体 pET28a中Ncol和Biol酶切位点之间，获得重组表达载体pET28a_P107RH。(3)肿瘤细胞核靶向药物载体P107RH的表达与制备在本实施例中使用E. coli BL21(DE3)系列细胞为宿主菌细胞，重组表达载体 pET28a-P107RH可转化E. coli BL21(DE3)细胞，并使用硫酸卡那霉素筛选出能稳定表达的 单克隆细胞株，获得表达的肿瘤细胞核靶向药物载体P107RH。具体操作将1. O μ g 的重组表达载体 pET28a-P107RH 加入到 100 μ 1 Ε. coli BL21 (DE3)感 受态细胞中，轻轻混勻，冰浴30分钟后置于42°C水浴中保温1分钟，立即取出并置于冰浴中 冷却2分钟。加入800 μ 1 37°C预热的SOC也液体培养基，37°C 150rpm振摇培养60分钟 后，取出100 μ 1培养液涂布于含硫酸卡那霉素的LB琼脂培养平板上，37°C培养16小时后， 获得转化的单菌落。挑取转化的单菌落，接种于aiil LB培养基中，37°C振摇培养过夜。以1 100(体积 比)的比例接种10ml LB培养基(50 μ g/ml Kana)，37 °C 200rpm振荡培养至OD600 = 0 . 8 -1.0，加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度lmM，37°C 200rpm振荡诱导12小时 后，4°C 5000rpm离心5分钟收集菌体。用1/10培养液体积的IOmM Tris-cl (pH8. 0)重悬 菌体，置于冰浴中超声波破碎菌体。破碎菌体4°C，5000rpm离心15分钟，获得上清液。最 后，使用Ni2+亲和层析柱(上海生工有售，货号BSP079)纯化得到本发明的肿瘤细胞核靶 向药物载体P107RH。图3中A示出了所制备的肿瘤细胞核靶向药物载体P107RH的SDS-PAGE鉴定结果， 纯化得到的肿瘤细胞核靶向药物载体P107RH的分子量为13kDa。本发明设计了肿瘤细胞核靶向药物载体P107RH的氨基酸序列，并合成了编码 P107RH的基因，使用该基因表达出了肿瘤细胞核靶向药物载体P107RH。所述的肿瘤细胞核 靶向药物载体P107RH以可溶性蛋白形式表达，使用Ni2+亲和层析法得到了本发明的肿瘤细 胞核靶向药物载体P107RH。实施例2抗肿瘤细胞核靶向药物P107RH-ADM的制备，包括以下步骤
(1)肿瘤细胞核靶向药物载体P107RH与抗肿瘤药物阿霉素(Adriamycin，ADM)偶 联将IOmg阿霉素盐酸盐(ADM · HCl)和MOmg肿瘤细胞核靶向药物载体P107RH置 于IOml终浓度为InM的1-乙基-3-(3- 二甲胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐[l-Ethyl-3-(3-dimethylIaminopropy 1) carbodiimide hydrochloride, EDC. HCl]及 InM 的 N-轻基琥拍酉先 亚胺(Hydroxysuccinimide，NHS)的水溶液中，置于37°C避光温和搅拌10小时，完成肿瘤 细胞核靶向药物载体P107RH与抗肿瘤药物ADM的偶联，得到偶联产物P107RH-ADM。偶联产物P107RH-ADM以G50分子筛层析柱分离纯化，再经过透析、冻干，获得抗肿 瘤细胞核靶向药物P107RH-ADM。(2)抗肿瘤细胞核靶向药物P107RH-ADM的纯度检测分子筛层析法检测抗肿瘤细胞核靶向药物P107RH-ADM 将制备的抗肿瘤细胞核 靶向药物P107RH-ADM配制2ml、2mg/ml的溶液，使用G50分子筛层析柱检测目的产物的纯 度，结果如图4所示。目的产物峰为单一峰，分子量与理论值相符，表明制备的产物纯度较 高，达到了应用标准。荧光分光光度计检测抗肿瘤细胞核靶向药物P107RH-ADM 分别将2%ig/ml的肿瘤 细胞核靶向药物载体P107RH和抗肿瘤细胞核靶向药物P107RH-ADM以及lmg/ml的抗肿瘤 药物ADM置于EX470nm、Em585nm的波长处测定荧光强度，结果发现制备的抗肿瘤细胞核靶 向药物P107RH-ADM与相同当量的单体抗肿瘤药物ADM均在Ex470nm、Em585nm处检测到荧 光强度，而肿瘤细胞核靶向药物载体P107RH却未检测到荧光强度，如图5所示。这证明了 肿瘤细胞核靶向药物载体P107RH与抗肿瘤药物ADM偶联成功。实施例3肿瘤细胞核靶向药物载体P107RH增强了抗肿瘤药物ADM的抗肿瘤作用(1)肿瘤细胞核靶向药物载体P107RH增强了抗肿瘤药物ADM对肿瘤细胞的杀伤作 用将生长良好的1 X IO4HeLa细胞分为三组，使细胞均勻贴壁生长于96孔板底部后， 三组细胞中分别加入终浓度为20、40、80nmol/ml的单体抗肿瘤药物ADM，抗肿瘤细胞核靶 向药物P107RH-ADM，肿瘤细胞核靶向药物载体P107RH ；上述三组细胞孵育24h后以MTT法 测定细胞存活率，结构如图6所示，单纯的肿瘤细胞核靶向药物载体P107RH对HeLa细胞没 有杀伤作用(细胞存活率达100% )，而单纯的抗肿瘤药物ADM和抗肿瘤细胞核靶向药物 P107RH-ADM均对HeLa细胞有杀伤作用，其中抗肿瘤细胞核靶向药物P107RH-ADM的杀伤作 用较单纯的抗肿瘤药物ADM明显增强，表明肿瘤细胞核靶向药物载体P107RH显著增强了抗 肿瘤药物ADM对肿瘤细胞的杀伤作用，显示出肿瘤细胞核靶向药物载体的功效。(2)肿瘤细胞核靶向药物载体P107RH增强了抗肿瘤药物ADM在肿瘤细胞核内的聚 集。将生长良好的IX IO4HeLa细胞分为二组，使细胞均勻贴壁生长于M孔板底部的 玻璃片上后，分别加入终浓度为20nmol/ml的抗肿瘤细胞核靶向药物P107RH-ADM和单体 抗肿瘤药物ADM，并于5min、10min、30min时在荧光显微镜下观察ADM的亚细胞定位，并与 DAPI染色的细胞核区域相比较，结果如图7所示，相比之下，在加入单纯抗肿瘤药物ADM的 细胞中，ADM进入细胞核的速度较慢，IOmin时仍有部分ADM存在于细胞质中，直到30min 时，ADM的存在部位才与DAPI染色的细胞核区域基本吻合；而在加入抗肿瘤细胞核靶向药物P107RH-ADM的细胞中，5min时ADM的存在部位与DAPI染色的细胞核区域就已基本上一 致，到IOmin时，ADM的存在部位与DAPI染色的细胞核区域已完全吻合，而到30min时，ADM 在细胞核中的聚集进一步加强了。上述结果说明肿瘤细胞核靶向药物载体P107RH明显 增强了抗肿瘤药物ADM进入HeLa细胞核中的速度和数量，表明肿瘤细胞核靶向药物载体 P107RH能快速引导偶联的抗肿瘤药物ADM进入肿瘤细胞核并在核中聚集，显示出了肿瘤细 胞核靶向药物载体P107RH的细胞核靶向药物载体的作用。( 肿瘤细胞核靶向药物载体P107RH增强了抗肿瘤药物ADM对肿瘤细胞的特异性 杀伤作用分别将生长良好的1X104HEI^93、HeLa细胞各分为二组，使细胞均勻贴壁生 长于96孔板底部，二种细胞中分别加入终浓度为20nmol/ml的抗肿瘤细胞核靶向药物 P107RH-ADM和单体的抗肿瘤药物ADM，并于24h后以MTT法分别测定细胞的存活率，结果如 图8所示，二种ADM对肿瘤细胞HeLa均有杀伤作用，但抗肿瘤细胞核靶向药物P107RH-ADM 更明显，而对于人胚胎肾正常细胞HEK293，结果却截然相反单体的抗肿瘤药物ADM对 HEK293的杀伤作用明显高于抗肿瘤细胞核靶向药物P107RH-ADM，而抗肿瘤细胞核靶向药 物P107RH-ADM对HEK293细胞只表现出微弱的杀伤作用，这表明肿瘤细胞核靶向药物载体 P107RH可以明显增强偶联的ADM对肿瘤细胞的特异性，降低ADM对正常细胞的杀伤作用，降 低ADM的毒副作用。
权利要求
1.一种肿瘤细胞核靶向药物载体，其特征在于该药物载体蛋白包含至少一个核定位 序列、至少一个RGD三肽序列和至少一个多聚组氨酸肽序列，核定位序列通过至少一个共 价键与所述的RGD三肽序列相偶联，而所述的多聚组氨酸肽序列通过至少一个共价键与所 述的核定位序列或所述的RGD三肽序列相偶联，形成三者的线性重组蛋白序列，其中所述 的核定位序列具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列，所述的RGD三肽序列具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列，所述的多聚组氨酸肽序列具有SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的一种肿瘤细胞核靶向药物载体，其特征在于多聚组氨酸肽序 列位于该药物载体蛋白的N末端或者C末端。
3.如权利要求1所述的一种肿瘤细胞核靶向药物载体，其特征在于共价键是肽键。
4.如权利要求2或3所述的一种肿瘤细胞核靶向药物载体，其特征在于该药物载体 的氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示。
5.权利要求1所述的一种肿瘤细胞核靶向药物载体在制备抗肿瘤药物中的应用。
6.如权利要求5所述的一种肿瘤细胞核靶向药物载体在制备抗肿瘤药物中的应用，其 特征在于该药物载体通过共价键与抗肿瘤药物相偶联，形成肿瘤细胞核靶向载体-抗肿 瘤药物的共价偶联物。
7.如权利要求6所述的一种肿瘤细胞核靶向药物载体在制备抗肿瘤药物中的应用，其 特征在于抗肿瘤药物为阿霉素ADMJI^SCisplatin Ejection、雷替曲塞Raltitrexed或 阿糖胞苷CPT。
8.一种编码权利要求4所述的肿瘤细胞核靶向药物载体的基因，其特征在于它具有 SEQ ID NO 5所示的DNA序列。
9.一种重组表达载体，其特征在于是SEQ ID NO :5所示DNA序列的基因与表达载体 pET28a, pMA5或pGT22重组，构建的重组表达载体。
全文摘要
本发明属于生物药学技术领域，具体涉及一种用于增强抗肿瘤药物特异性识别肿瘤细胞并携带抗肿瘤药物进入肿瘤细胞核、特异而有效地杀灭肿瘤细胞的肿瘤细胞核靶向药物载体蛋白以及编码这种肿瘤细胞的肿瘤细胞核靶向药物载体蛋白的基因，还涉及该药物载体在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明的肿瘤细胞核靶向药物载体包含至少一个肿瘤特异性识别序列、至少一个细胞核定位序列、至少一个多聚组氨酸序列。本发明的肿瘤细胞核靶向药物载体既可以增强抗肿瘤药物对肿瘤细胞的特异性识别，又能高效运载抗肿瘤药物进入细胞核发挥抑制肿瘤细胞核酸合成的功效，载体具有双重靶向性，能显著降低抗肿瘤药物的使用剂量和毒副作用。
文档编号A61K31/7068GK102038956SQ20101060536
公开日2011年5月4日 申请日期2010年12月24日 优先权日2010年12月24日
发明者周旺, 张应玖, 郑宇 申请人:吉林大学