专利名称：利用EphA3抗体治疗白血病和慢性骨髓增生性疾病的制作方法
利用EphA3抗体治疗白血病和慢性骨髓增生性疾病相关申请的交叉引用本申请要求于2009年3月6日提交的美国临时申请第61/158，285号和于2009 年4月9日提交的美国临时申请第61/168，130号的优先权。通过引用将每个申请并入本文。
背景技术：
Eph受体酪氨酸激酶(Eph)属于一大类受体酪氨酸激酶(RTK)，即在酪氨酸残基磷酸化蛋白的激酶。Eph和它们的膜结合印hrin配体(印hrin)控制细胞定位和组织结构 (Poliakov, et al.，Dev Cell 7 =465-80,2004)。与其它受体酪氨酸激酶相反，Eph受体活化不仅需要配体结合和二聚化，而且需要预先形成的配体寡聚体的参与。因此，Eph受体的酪氨酸磷酸化需要印hrin配体以它们的聚集或膜粘附形式存在(Davis et al. , Science 266 :816-819,1994)。功能性和生物化学Eph应答在较高的配体寡聚状态时发生(Stein et al.，Genes Dev 12 :667-678,1998)。在其它模式功能中，各种Eph和印hrin已被证明在血管发育中起作用。在成年人中还观察到一些印hrin及其受体的不受调节(de-regulated)的再现与肿瘤侵袭、 转移和新生血管发生有关。例如，显性负性的可溶EphA2或A3蛋白对体外^hrin诱导的内皮细胞功能和体内的肿瘤血管发生和发展有影响(Nakamoto，. et al, Microsc Res Tech 59 :58-67,2002 ；Brantley-Sieders, et al, Curr Pharm Des 10 :343卜42，2004 ； Brantley, et al Oncogene 21 :7011-26,2002 ；Cheng, et al. Neoplasia 5 :445-56,2003 ； 和Dobrzanski，et al Cancer Res 64 :910_9，2004)。此外，已经发现Eph家族成员在多种人类实体瘤的月中瘤细胞上过表达(Brantley-Sieders, et al, Curr Pharm Des 10 :3431-42, 2004 ；Marme, Ann Hematol 81 Suppl 2 :S66，2002 ；禾口 Booth，et al, Nat Med 8 :1360-1, 2002)。据报道，在加速期和急变期的慢性骨髓性白血病(CML)患者的⑶34+细胞上， Epha3 被激活并过表达(Cilloni et al, American Society of Hematology, Abstract 1092，2008(可在2008年11月14日后可在线获得))。据Cilloni等报道，当将原代CML 细胞或EphA3转染的正常细胞与被称为阻断抗体的特异性单克隆抗体一起孵育时，所述抗体诱导原代细胞和转染细胞的增殖显著下降，集落生长降低并诱导向粘附特征的改变。所述抗体在正常对照细胞或慢性期CML患者的细胞中没有诱导任何显著的改变。还没有关于EphA3是其它骨髓增生性病症中的治疗靶标的报道。发明概述本发明在一定程度上基于以下发现获自慢性骨髓性白血病(CML)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓单核细胞白血病(CMML)、青少年骨髓单核细胞白血病(JMML)、骨髓增生异常综合症(MDS)、真性红细胞增多症(PV)、原发性血小板增多症(ET)或特发性骨髓纤维化(EVI)患者的骨髓和外周血样品中的瘤性骨髓细胞(包括瘤性骨髓干细胞)在其细胞表面表达EphA3蛋白，并且可以用活化的抗EphA3抗体或诱导ADCC的抗体杀伤这类细胞。
一方面，本发明提供了杀伤AML细胞、MDS细胞、CMML细胞、JMML细胞、CML细胞、 PV细胞、ET细胞或IM细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与抗EphA3抗体接触。一方面，本发明提供了治疗AML、CCML、JMML、MDS、CML、PV、ET或IM患者的方法，所述方法包括给予所述患者抗EphA抗体。在一些实施方案中，所述抗EphA3抗体使EphA3 二聚化。在一些实施方案中，所述抗EphA3抗体激活EphA3并通过凋亡杀伤靶细胞。在一些实施方案中，所述抗EphA3抗体通过诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)杀伤靶细胞。在一些实施方案中，本发明提供了杀伤在表面上表达EphA3的骨髓增生性病症细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与抗EphA3抗体接触，其中所述抗EphA3抗体⑴激活EphA3和(ii)诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一些实施方案中，本发明提供了治疗患有骨髓增生性病症并具有在细胞表面上表达EphA3的骨髓增生性病症细胞的患者的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的抗EphA3抗体，其中所述抗EphA3抗体(i)激活EphA3 和(ii)诱导ADCC。在一些实施方案中，本发明提供了杀伤在表面上表达EphA3的骨髓增生性病症细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与激活EphA3或诱导ADCC的抗EphA3抗体接触，其中所述骨髓增生性病症细胞是急性骨髓性白血病(AML)细胞或骨髓增生异常综合症(MDQ细胞。在一些实施方案中，本发明提供了治疗患有骨髓增生性病症并具有在细胞表面上表达EphA3的骨髓增生性病症细胞的患者的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的抗EphA3抗体，其中所述抗EphA3抗体激活EphA3或诱导ADCC，其中所述骨髓增生性病症是AML或MDS。在一些实施方案中，本发明方法所用的抗EphA3抗体是重组或嵌合抗体。在一些实施方案中，所述抗EphA3抗体是人抗体。所述抗EphA3抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。在一些实施方案中，所述抗EphA3抗体是包含Fab、Fab'或Fv的多价抗体。在一些实施方案中，所述抗体是F (ab' )2。在一些实施方案中，所述抗EphA3抗体与mAb IIIA4竞争结合EphA3。在一些实施方案中，所述抗体与mAb IIIA4结合相同的表位。在典型的实施方案中，所述抗体不阻断^hrin配体(例如，印hrin-A5)与EphA3的结合。在一些实施方案中，所述抗EphA3抗体包含mAb IIIA4的V1^P八区。在一些实施方案中，所述抗EphA3 抗体包含mAb IIIA4的Vh和\区的⑶R1、⑶R2和⑶R3。在一些实施方案中，所述抗体包含mAb IIIA4 区⑶R3和Vl区⑶R3。在一些实施方案中，所述抗体诱导ADCC。因此， 在一些实施方案中，所述抗体具有活性同种型，例如，所述抗体具有人重链Yl或Y3恒定区。在一些实施方案中，所述抗体不诱导ADCC，例如所述抗体具有人重链Y2或恒定区。在本发明的背景下，“激活EphA3或诱导ADCC的抗EphA3抗体”是指⑴激活 EphA3、(ii)诱导ADCC或(iii)激活并诱导ADCC的抗体。在本发明的一些实施方案中，用本文所述的抗EphA3抗体治疗骨髓增生性病症患者，并且所述患者还接受所述疾病的另一种治疗剂的治疗。因此，在一些实施方案中，所述方法包括给予一种或多种其它治疗剂。例如，当骨髓增生性病症是CML时，其它治疗剂包括甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate)、尼罗替尼(nilotinib)、达沙替尼(dasatinib)或另一种化疗剂。当骨髓增生性病症是AML时，所述其它治疗剂可以是单独的阿糖胞苷或阿糖胞苷与柔红霉素的组合。正常的骨髓母细胞和干细胞在其细胞表面上不表达EphA3。因此，另一方面，本发
6明提供了鉴定骨髓增生性病症患者是否是抗EphA3抗体治疗的候选者的方法，其中所述方法包括检测所述患者的骨髓母细胞和/或干细胞的EphA3表达。在一些实施方案中，本发明提供了确定AML患者或MDS患者是否是抗EphA3抗体治疗的候选者的方法，所述方法包括提供所述患者的样品，其中所述样品包含骨髓增生性病症细胞；和检测所述骨髓增生性病症细胞上EphA3的表达。在一些实施方案中，本发明提供了确定CMPD患者是否是抗EphA3抗体治疗的候选者的方法，所述方法包括提供所述患者的包含瘤性干细胞的样品；和检测所述瘤性干细胞的EphA3表达。在一些实施方案中，本发明提供了监测具有EphA3+骨髓增生性细胞的骨髓增生性病症患者的治疗功效的方法，其中所述骨髓增生性病症是AML或MDS，所述方法包括从进行了骨髓增生性病症治疗性处理之后的患者获得包含骨髓增生性病症干细胞和/或母细胞的样品；和检测所述骨髓增生性病症干细胞和/或母细胞上EphA3的表达。在一些实施方案中，本发明提供了监测具有表达EphA3的瘤性骨髓增生性病症干细胞的CMPD患者的治疗功效的方法，所述方法包括从进行了 CMPD治疗性处理后的患者获得包含瘤性干细胞的样品；和检测所述干细胞上EphA3 的表达。可以使用公知的技术检测EphA3表达。因此，在一些实施方案中，检测EphA3的表达包括，例如，使用流式细胞仪检测细胞表面的蛋白表达。在一些实施方案中，所述检测 EphA3表达的步骤包括，例如，使用诸如RT-PCR的扩增反应检测EphA3RNA水平。本发明还提供了用于治疗骨髓增生性病症患者的、包含本文所述的抗EphA3抗体的药物组合物。附图简要说明
图1提供的数据显示工程化人抗EphA3抗体与白血病干细胞的结合。用以下抗体对AML原代骨髓细胞进行染色，用于流式细胞仪分析(每个样品50，000个事件)工程化人抗EphA3抗体或IgGl对照和FITC偶联的抗人IgG ；PE偶联抗CD34 ；PEcy5偶联抗CD38 ； 和APC偶联抗⑶123抗体。A)⑶34分析的同种型对照画门。(B)用抗EphA3和抗⑶34染色的样品。(C) CD34和CD38染色的样品(R2表示⑶34+⑶38—细胞)。(D)对CD34+CD38"细胞上EphA3和CD123表达的鉴定(R2门)。图2提供的数据表明工程化人抗EphA3抗体诱导⑶16介导的ADCC活性。将来自原发性血小板增多症患者的外周血单核细胞用作靶标。在所示浓度的抗EphA3抗体的存在下，以200 1的效应细胞靶标的比例添加正常个体的PBMC效应细胞。在抑制Fc介导的效应功能的抗CD16抗体的存在下(圆形)或在不存在CD16阻断抗体的条件下(三角形)， 通过测定16小时后的LDH释放来分析ADCC活性。图3提供的数据显示α 1，6岩藻糖缺陷型工程化人抗EphA3抗体(IgGlk)表现出增强的ADCC活性。LK63靶细胞与所示浓度的岩藻糖基化的抗EphA3抗体(阴影线柱) 或kifimensine处理的细胞所产生的α 1，6岩藻糖缺陷型抗体(实心柱)一起孵育。以 100 1的效应细胞靶标的比例添加PBMC效应细胞，持续16小时，并通过测定LDH释放确定ADCC活性。图4提供了人工程化抗体的凋亡活性数据。来自CML患者的骨髓细胞(通过流式细胞仪98%为EphA3+)与所示浓度的人工程化抗EphA3抗体或IgGl对照抗体一起于96孔微滴定孔(每孔2X IO5个细胞)中孵育M小时。然后用膜联蛋白V-FITC和碘化丙啶对细胞进行染色，并进行流式细胞仪分析。显示经历凋亡(膜联蛋白V-阳性)的细胞的百分比。发明的详细描述本文使用的术语“骨髓增生性病症”是指分类为慢性骨髓增生性病症(CMPD)的某些慢性骨髓增生性疾病；急性骨髓性白血病(AML)；骨髓增生异常综合症(MDQ ；慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)；和青少年骨髓单核细胞性白血病(JMML)。在本发明的背景下， “骨髓增生性病症”因而是指慢性骨髓性白血病(CML)；真性红细胞增多症(PV)；原发性血小板增多症(ET)；特发性骨髓纤维化(IM)，也被称为原发性骨髓纤维化；AML ；MDS ；CMML和 JMML。术语“ JMML”包括被称为青少年慢性骨髓性白血病(JCML)、婴儿慢性骨髓单核细胞白血病和婴儿期单体7综合症的所有诊断。可以利用已知的标准诊断骨髓增生性病症，例如世界卫生组织(WHO)标准、法美英(FAB)分类系统、国际预后评分系统(IPSQ等。在2008 年WHO分类中，CMPD被称为骨髓增生性瘤(MPN)。骨髓增生性病症常见的特征为存在特定的突变。例如，CML的特征为存在BCR-ABL。PV,ET和IM是“非BCR-ABL” (本文还称为“无 BCR-ABL"或“BCR-ABL阴性”)的CMPD，因为这些病症没有BCR-ABL。但是BCR-ABL阴性病症的特征通常为存在JAK2突变，该突变在CML中是罕见的。本文使用的术语“骨髓干细胞”或“干细胞”是特征为⑶34+、⑶123+和⑶38_的造血干细胞。术语“骨髓增生性病症细胞”是指具有骨髓增生性病症特征的瘤性骨髓细胞。该术语包括可能还未被认为是恶性的骨髓细胞(例如具有骨髓增生异常综合症特征的骨髓细胞)以及诸如恶性急性白血病细胞的恶性细胞。该术语包括母细胞和干细胞。本文可交替使用的术语“癌细胞”或“肿瘤细胞”是指瘤性细胞。该术语包括良性以及恶性的细胞。瘤性转化与肿瘤细胞相对于其所来源于的细胞类型的表型改变有关。所述改变可以包括接触抑制的消失，形态改变和异常生长(参见，FreShney，Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique ( . 3 片反，1994)。本发明背景下的“抑制癌的生长”是指减慢骨髓增生性病症患者的癌细胞负载的生长和/或降低癌细胞负载。因此，“抑制癌的生长”包括杀伤癌细胞。本文使用的“EphA3”是指Eph受体A3。该受体还被称作“人胚胎激酶”、“hek”、 “印h样酪氨酸激酶l”、“etkl”或“tyro4”。EphA3属于蛋白酪氨酸激酶家族中的^hrin受体亚家族。EPH和EPH相关受体参与介导发育事件。EPH亚家族的受体通常具有单个激酶结构域和1个胞外区，所述胞外区包含1个 Cys富集结构域和2个III型纤维连接蛋白重复。基于^hrin受体的胞外结构域序列的相似性及它们结合^hrin-A和^hrin-B配体的亲和力，将^hrin受体分成两组。EphA3与印hrin-A配体结合。EphA3核酸和蛋白序列是已知的。示例性的人EphA3氨基酸序列可以通过登录号(EAW68857)获得。 为了本发明的目的，EphA3的“活化”弓I起EphA3的磷酸化和凋亡。激活EphA3的抗体或“激活抗体”引起EphA3的磷酸化和凋亡，并且因而被认为是本发明背景中的激动剂。 EphA3可通过二聚化而被激活，这引起凋亡。在一些实施方案中，激活EphA3的抗体与mAb IIIA4竞争结合EphA3。通常，“激活”抗体与配体结合结构域(EphA3的氨基酸四_202)结合，其中氨基酸残基131、132和136对结合是至关重要的。在一些实施方案中，所述激活抗体与包括人EphA3蛋白的配体结合结构域中的残基131、132和136的位点结合。在本发明中，“EphA3抗体”或“抗EphA3抗体”可以互换使用，是指与EphA3特异性地结合的抗体。在一些实施方案中，所述抗体可以使EphA3 二聚化。该术语包括在存在 ephrin配体(例如，印hrin_A5)结合的情况下与EphA3结合的抗体，以及能够与配体结合位点结合的抗体。“在存在印hrin配体结合的情况下与EphA3结合的EphA3抗体”是指不显著阻止诸如ephrin-A5的ephrin配体与EphA3结合的抗体。包含EphA3和ephrin配体(例如印hrin-A5)的结合反应中这种抗体的存在使^hrin配体与EphA3的结合降低少于约 30%，通常少于20%或10%。术语“mAb IIIA4”是指单克隆抗体IIIA4，其最初是针对LK63人急性前B白血病细胞而被激发的，以用于亲和分离 EphA3(Boyd，et al. J Biol Chem 267 =3262-3267,1992) mAb IIIA4与天然EphA3球状印hrin结合结构域结合(例如，Smith，et al.，J. Biol. Chem 279:9522-9531,2004)。它被保藏于欧洲动物细胞培养物保藏中心(European Collection of Animal Cell Cultures)，登录号为 91061920 (参见，例如，EP 专利号 EP0590030)。本文使用的“具有活性同种型的抗体”是指具有能够与免疫效应细胞上存在的Fc 受体结合的人Fc区的抗体。“活性同种型”包括IgGl、IgG3、IgM、IgA和IgE。该术语包括具有包含调节Fc效应功能的修饰的人Fc区的抗体，所述修饰例如糖基化的糖组成和/或水平的突变或改变。“Fe区”是指除第一恒定区免疫球蛋白结构域外的抗体恒定区。因此，Fc是指IgA、 IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域，IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域，以及这些结构域的柔性铰链N端。对IgA和IgM，Fc可以包括J链。对于IgG， Fc包括免疫球蛋白结构域C γ 2和C γ 3以及C γ 1和C γ之间的铰链。本领域内应当理解， Fc区的边界可以变化，但是，人IgG重链Fc区通常被定义为包括残基或P230到其羧基端，利用的编号是根据 Kabat 等的 EU 索引(1991，NTH Publication 91-3242，National Technical Information Service, Springfield, Va.) 术语“Fe 区”可以表示分离的该区域，或表示抗体或抗体片段环境中的该区域。“Fe区”包括Fc区的天然存在的等位基因变体以及调节效应功能的修饰。Fc区还包括不引起生物功能改变的变体。例如，可以从免疫球蛋白Fc区的N端或C端缺失一个或多个氨基酸而基本上不损失生物功能。可以根据本领域已知的一般规则选择这类变体以便对活性的影响最小(参见，例如，Bowie, et al.， Science 247 :306-1310,1990) 本文使用的“抗体”是指这样的一种蛋白其在功能上被定义为结合蛋白，并且在结构上被定义为包含被本领域技术人员公认的、来源于编码产抗体动物的基因的免疫球蛋白的框架区的氨基酸序列。抗体可以由一个或多个多肽组成，所述多肽基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、Υ、δ、ε禾口 μ恒定区基因，以及众多的免疫球蛋白可变区基因。轻链被分为κ或者λ。重链被分为 Y、μ、α、δ或者ε，其分别依次定义免疫球蛋白类型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。已知典型的免疫球蛋白(抗体)结构单元包括四聚体。每个四聚体由两个相同的多肽链对组成，每对具有一条“轻”链(大约25kD)和一条“重”链(大约50-70kD)。每条链的N端界定大约100到110个或者更多个氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别。术语
9可变轻链(V和可变重链(Vh)分别表示这些轻链和重链。本文使用的术语“抗体”包括保留结合特异性的抗体片段。例如，存在大量良好表征的抗体片段。因此，例如，胃蛋白酶在铰链区的二硫键的C端消化抗体而产生F(ab)' 2， 它是Fab的二聚体，其自身是通过二硫键与VH-CHl连接的轻链。在温和条件下，F(ab) ‘ 2可以被还原来断裂铰链区的二硫键，从而将(Fab' )2 二聚体转化为Fab'单体。Fab'单体本质上是具有部分铰链区的Fab (参见，Fundamental Immunology (基础免疫学)，W. E. Paul, ed. ,Raven Press,N. Y. (1993)对于其他抗体片段更详细的说明)。尽管不同抗体片段是以完整抗体的消化来限定，本领域技术人员应当理解，可以通过化学方法或利用重组DNA方法重新合成片段。因此，本文使用的术语抗体还包括通过完整抗体的修饰而产生的抗体片段或利用重组DNA方法合成的抗体片段。抗体包括二聚体，Vh-Vl 二聚体包括诸如单链Fv抗体(sFv或scFv)的单链抗体(以单一多肽链存在的抗体)，其中可变重链区和可变轻链区被连接到一起(直接地或通过肽接头)而形成连续多肽。单链Fv抗体是共价连接的VH-\，其可以从包括直接连接的或通过肽编码接头连接的V1^P Vl编码序列的核酸表达(例如，Huston, et al. Proc. Nat. Acad. Sci USA, 85 :5879-5883,1988)。尽管Vh和Vl作为单条多肽链互相连接，但Vh和八结构域非共价相联。或者，抗体可以是另一片段。例如，还可以利用重组技术来产生可溶性蛋白或获自展示方法的片段形式的其它片段。抗体还可以包括双抗体(diantibodies)和微型抗体。本发明的抗体还包括重链二聚体，例如来自骆驼(camelid)的抗体。为了本发明的目的，所用抗体的形式可以激活骨髓增生性细胞表面上存在的EphA3或者可以通过ADCC杀伤骨髓增生性细胞。因此，在一些实施方案中，抗体是二聚体。在其它实施方案中，抗体可以为具有活性同种型的单体形式。在一些实施方案中，抗体为可以与EphA3进行交联的多价形式，例如，三价或四价形式。本文使用的“V-区”是指抗体可变区结构域，其包含框架1、⑶R1、框架2、⑶R2和框架3的节段，包括CDR3和框架4，该节段是由于B细胞分化期间重链和轻链V-区基因的重排被添加到ν-节段。本文使用的“互补决定区(CDR) ”是指每条链的三个高变区，其分隔开由轻链和重链可变区确定的4个“框架”区。CDR主要负责与抗原表位的结合。每条链的CDR通常从N 端开始连续编号，被称为⑶R1、⑶R2和⑶R3，并且通常由特定⑶R所处的链来识别。因此， Vh CDR3位于其所在抗体的重链的可变结构域，而\ CDRl是来自其所在抗体的轻链可变结构域的⑶R1。在一个物种内不同轻链或重链的框架区序列是相对保守的。抗体的框架区(即组成性轻链和重链的联合框架区)用于在三维空间中定位和排列CDR。可以利用本领域各种公知的定义来确定CDR和框架区的氨基酸序列，例如， Kabat，Chothia，国际 ImMunoGeneTics 数据库(IMGT)，和 AbM(参见，例如，Johnson et al.， 同上；Chothia & Lesk，1987, Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins (免疫球蛋白高变区的典型结构).J. Mol. Biol. 196,901-917 ； Chothia C. et al. , 1989, Conformations of immunoglobulin hypervariable regions (免疫 求蛋白
的构D· Nature 342,877-883 ；Chothia C. et al. , 1992, structural repertoireof the human VH segments (人 VH 节段的结构组成)· J. Mol. Biol. 227，799-817 ； Al-Lazikani et al. , J. Mol. Biol 1997,273 0))。抗原结合位点的定义还描述于下列文献Ruiz et al.，IMGT,国际 ImMunoGeneTics 数据库.Nucleic Acids Res. ，28，219—221 (2000)；禾口 Lefranc，Μ. -P. IMGT,国际 ImMunoGeneTics 数据库· Nucleic Acids Res. Jan 1 ；29(1) :207-9(2001)； MacCallum et al.，Antibody-antigen interactions Contact analysis and binding site topography (抗体-抗原相互作用接触分析和结合位点拓扑图)，J. Mol. Biol. ,262 (5) ,732-745 (1996)；禾口 Martin et al. , Proc. Natl Acad. Sd. USA, 86, 9268-9272(1989) ；Martin, et al. , Methods Enzymol，203，121-153，(1991) ；Pedersen et al. ,Immunomethods,1,126,(1992)；禾口Rees et al. , In Sternberg M. J. E. (ed.),Protein Structure Prediction (蛋白结构预测)· Oxford University Press, Oxford, 141-172 1996)。“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上的抗体结合位点。表位可以由连续氨基酸形成，或由蛋白的三级折叠所安排的非连续氨基酸形成。当暴露于变性溶剂时，由连续氨基酸形成的表位通常被保留，而由三级折叠形成的表位在用变性溶剂处理时通常丢失。表位通常包含处于特定空间构象的至少3个氨基酸，更常见的，至少5或8-10个氨基酸。确定表位空间构象的方法包括，例如，X-射线晶体衍射法和二维核磁共振。参见，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology(分子生物学方法的表位作图实验步骤)，Vol. 66，Glenn Ε. Morris, Ed (1996)。本文使用的“嵌合抗体”是指这样的免疫球蛋白分子，其中(a)恒定区或其一部分被改变、替换或交换，使得抗原结合位点(可变区)与不同的或改变的类型、效应功能和/ 或物种的恒定区连接，或与赋予嵌合抗体新特性的完全不同的分子(例如，酶、毒素、激素、 生长因子、药物等)连接；或(b)可变区或其一部分被改变、替换或与具有不同或改变抗原特异性的可变区或其一部分交换；或与另一物种或另一抗体类型或亚类的相应序列交换。本文使用的“人源化抗体”是指这样的免疫球蛋白分子，其中来自供体抗体的CDR 被移植到人框架序列上。人源化抗体的框架序列中还可以包含供体来源的残基。人源化抗体还可以包含人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。人源化抗体还可以包含既不存在于接受体抗体也不存在于输入的CDR或者框架序列中的残基。可以利用本领域已知的方法进行人源化(例如，Jones et al. , Nature 321 :522-525 ； 1986 ；Riechmann et al. , Nature 332 :323-327,1988 ；Verhoeyen et al.，Science 239 :1534-1536,1988) ；Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593-596,1992 ；美国专利号4，816，567)，包括诸如“超级人源化”抗体 (Tan et al.，J. Immunol. 169 :1119,2002)禾口 “表面再建”(例如，Staelens et al.，Mol. Immunol. 43 :1243,2006 ；禾口 Roguska et al.，Proc. Natl. Acad. Sci USA 91 :969,1994)的技术。在本发明的背景下，“人工程化(humaneered )，，的抗体是指具有参照抗体的结合特异性的工程化人抗体。本发明所用的工程化人抗体具有包含源自供体免疫球蛋白的最小序列的免疫球蛋白分子。在一些实施方案中，所述工程化人抗体可以仅保留参照抗体CDR3 区的最小必需结合特异性决定簇。通常，通过将编码来自参照抗体重链CDR3区的结合特异性决定簇(BSD)的DNA序列与人Vh节段序列连接，并将参照抗体的轻链CDR3 BSD与人八节段序列连接，从而工程化得到工程化人抗体。“BSD”是指介导结合特异性的⑶R3-FR4区或该区的一部分。因此，结合特异性决定簇可以是⑶R3-FR4、⑶R3、⑶R3的最小必需结合特异性决定簇(其指当存在于抗体V区时赋予结合特异性的任何小于CDR3的区)、D节段 (关于重链区)，或赋予参照抗体结合特异性的CDR3-FR4的其它区。工程化人抗体的方法提供在美国专利申请公开第20050255552号和美国专利申请公开第20060134098号中。本文使用的术语“人抗体”是指本质上是人的抗体，即具有人免疫系统的FR区以及通常有⑶R区。因此，该术语包括人源化的和人工程化(humaneered )的抗体以及从利用人免疫系统重建的小鼠分离出的抗体和从展示文库分离到的抗体。“低岩藻糖基化(hypofucosylated)，，的抗体制剂是指α 1,6-岩藻糖的平均含量少于天然存在的IgG抗体制剂的50%的抗体制剂。如本领域内所理解的，“低岩藻糖基化” 是用来指抗体的群体。“去岩藻糖基化”的抗体缺少与IgG重链的CH2结构域连接的α 1,6-岩藻糖。当涉及核酸部分时，使用的术语“异源的”表示该核酸包括两个或更多个子序列， 所述子序列通常在自然界彼此之间不具有相同的关联。例如，通常通过重组方式产生核酸， 所述核酸具有例如来自无关基因的两个或更多个序列，经排列而形成新的功能性核酸。同样，异源蛋白通常是指两个或更多个在自然界彼此之间不具有相同的关联的子序列。当涉及例如细胞、核酸、蛋白或载体时，使用的术语“重组的”表示所述细胞、核酸、 蛋白或载体已经通过导入异源核酸或蛋白或天然核酸或蛋白的改变而被修饰，或所述细胞来源于如此修饰过的细胞。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞中不存在的基因，或者表达异常表达、低表达或者根本不表达的天然基因。本文的术语“重组核酸”表示最初通过例如利用聚合酶和核酸内切酶来操作核酸而在体外形成的通常不在自然界中存在的形式的核酸。采用这种方式可以实现不同序列的可操作连接。因此，线性形式的分离的核酸，或通过将通常不连接的DNA分子连接在一起而体外形成的表达载体，都被认为是本发明目的中的重组。应当理解，一旦制备重组核酸并将其再导入宿主细胞或生物体，它将非重组地复制，即，利用宿主细胞的体内细胞机制而不是体外操作进行复制；但是， 一旦重组产生这种核酸，尽管随后是非重组地复制，其仍被认为是本发明目的中的重组。同样，“重组蛋白”是利用重组技术，即通过如上文所述的重组核酸的表达而制备的蛋白。当涉及蛋白或肽时，短语与抗体“特异性(或选择性)地结合”或“特异性(或选择性)地与...发生免疫反应”是指所述抗体与目的蛋白的结合反应。在本发明的背景下， 抗体与EphA3的结合亲和力通常为其与其它抗原的结合亲和力的至少100倍。术语“平衡解离常数(Kd) ”是指解离速率常数(kd，时间―1)除以结合速率常数(ka， 时间—SM—1)。可以用本领域内已知的任何方法测定平衡解离常数。本发明的抗体是高亲和力抗体。这类抗体的亲和力超过500nM、通常超过50nM或ΙΟηΜ。因此，在一些实施方案中， 本发明的抗体的亲和力为500nM-100pM、或50或25nM_100pM、或50或25nM_50pM或50nM 或 25nM-lpM。本文使用的“癌治疗剂”是指以治疗有效量给予癌症患者时，能治愈或至少部分遏制疾病的症状以及与疾病相关的并发症的试剂。对于两个或更多个多肽(或核酸)序列，术语“相同的”或者“同一性”百分比是指通过使用下文所述默认参数的BLAST或者BLAST2. 0序列比较算法，或者通过手动比对和肉眼检查(参见，例如，NCBI网站)测定时，两个或更多个序列或子序列是相同的或具有规定百分比的相同氨基酸残基(或核苷酸)(即，当在比较窗口或者指定区域内进行最大对应性的比较和比对时，在规定区域具有约60 %的同一性，优选70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或者更高的同一性)。这些序列被称为 “基本上相同的”。“基本上相同的”序列还包括具有缺失和/或添加的序列，以及具有取代的序列，以及天然存在的变体，例如，多态性或等位基因变体和人工变体。如下所述，优选的算法能够解决空位等问题。优选地，蛋白序列同一性存在于至少为约25个氨基酸长的区， 或更优选为50-100个氨基酸长的区，或蛋白的全长。本文使用的“比较窗口，，包括一段序列的参照，该序列的连续位置数通常选自20 至600，通常约50至约200，更通常约100至约150，其中对两个序列进行最佳比对后，一个序列可以与相同连续位置数的参照序列进行比较。用于序列比较比对方法是本领域公知的。可以通过如下方法进行用于序列比较的最佳比对，例如，Smith & Waterman的局部同源性算法，Adv. Appl. Math. 2 =482(1981), Needleman & Wunsch 的同源性比对算法， J. Mol. Biol. 48 :443 (1970)，Pearson & Lipman 的相似性方法搜索，Proc. Nat ‘ 1. Acad. Sci USA 85 :2444(1988)，这些算法的计算机化实施方式(Wisconsin Genetics Software Package 中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTAW，Genetics Computer Group, 575 Science Dr.，Madison，WI)，或手动比对和肉眼检查(参见，例如，Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物实验技术)(Ausubel et al.，eds. 1995 supplement)。适用于确定序列同一性百分比和序列相似性百分比的算法的优选实例包括BLAST 和BLAST 2. 0算法，如 Altschul et al.，Nuc. Acids Res. 25 :3389-3402 (1977)和 Altschul et al.，J. Mol. Biol. 215 :403-410(1990)中所述。利用本文描述的参数通过BLAST和BLAST 2.0测定本发明核酸和蛋白的序列同一性百分比。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用以下默认值字符长(W)为11，预期值(E)为10，M = 5，N = -4和两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用以下默认值字符长为3，预期值(E)为10和BL0SUM62评分矩阵 (参见 Henikoff & Henikoff，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :10915(1989))比对(B)为 50， 预期值(E)为10，M = 5，N = -4和两条链的比较。两条多肽基本上相同表示第一多肽与针对第二多肽产生的抗体发生免疫交叉反应。因此，例如，当两条肽的区别仅为保守型取代时，第一多肽与第二多肽通常是基本上相同的。术语“分离的”、“纯化的”或“生物学纯的”的物质是指本质上或基本上不含在天然状态下通常与之相伴的组分的物质。通常利用诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法的分析化学技术来确定纯度和同质性。制剂中以优势种类存在的蛋白是基本上纯化的。在一些实施方案中，术语“纯化的”表示蛋白在凝胶电泳中基本上只产生一个条带。优选地， 这表示该蛋白至少为85%纯，更优选的至少为95%纯，最优选的至少为99%纯。术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可以互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。 这些术语适用于这样的氨基酸聚合物，其中一个或者多个氨基酸残基是对应天然存在氨基酸的人工化学模拟物，这些术语也适用于包含修饰残基的天然存在的氨基酸聚合物、和非天然存在的氨基酸聚合物。术语“氨基酸，，是指天然存在的和合成的氨基酸，以及与天然存在的氨基酸功能
13类似的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及随后进行修饰的氨基酸，例如，羟脯氨酸，Y-羧基谷氨酸和0-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同基本化学结构的化合物，例如，与氢、羧基、氨基和R 基结合的α碳，例如，高丝氨酸，正亮氨酸，甲硫氨酸亚砜，甲硫氨酸甲基锍。这种类似物可以具有修饰的R基(例如，正亮氨酸)或者修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。“氨基酸模拟物”是指这样的化合物，其结构不同于氨基酸的一般化学结构，但功能类似于天然存在的氨基酸。本文的氨基酸可以用它们公知的3字母代号或者IUPAC-IUB生物化学命名委员会 (Biochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母代号表示。同样地，核苷酸可以用它们公认的单字母代码表示。“保守型修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列。对于具体的核酸序列，保守型修饰的变体是指编码相同的或者基本上相同的氨基酸序列的核酸，或当核酸不编码氨基酸序列时，表示基本上相同的或相关的(例如，天然连续的)序列。因为遗传密码具有简并性， 很多功能相同的核酸编码大部分蛋白。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU均编码丙氨酸。 因此，在由密码子规定为丙氨酸的每个位置，该密码子可以被改变为另一个所述对应密码子而不会改变编码的多肽。这种核酸变异是“沉默变异”，这是保守型修饰变异中的一种。 本文中编码多肽的每个核酸序列还描述了该核酸的沉默变异。本领域技术人员应当理解， 在一定情况下，核酸中的每个密码子(除了 AUG和TGG，AUG通常是甲硫氨酸的唯一密码子， TGG通常是色氨酸的唯一密码子)都可以被修改而产生功能相同的分子。因此，对于表达产物来说描述的序列通常隐含编码多肽的核酸的沉默变异，但这不适用于实际使用的探针序列。对于氨基酸序列而言，本领域技术人员应当理解，如果对核酸、肽、多肽或蛋白序列的各个取代、缺失或添加仅改变、添加或缺失编码序列中的单个氨基酸或小部分氨基酸， 则认为是“保守型修饰的变体”，其中所述改变导致氨基酸被化学类似的氨基酸取代。提供功能相似氨基酸的保守取代表是本领域公知的。这种保守型修饰的变体是除本发明的多态性变体、种间同系物和等位基因之外，但并不排除它们。通常，保守型取代在以下彼此之间进行1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G) ；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E) ；3)天门冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q) ；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K) ；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)； 6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W) ；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、 甲硫氨酸(M)(参见，例如 Creighton, Proteins (1984))。术语“a”或“an”通常意图表示“一个或多个”，除非文中指出并非这样。引言本发明在一定程度上基于以下发现可以通过使表达EphA3的骨髓增生性病症细胞与激活抗体和/或诱导ADCC的抗体接触来杀伤骨髓增生性病症患者中的表达EphA3的瘤性母细胞和/或瘤性干细胞。因此，一方面，本发明提供了治疗CML、PV、ET、IM、AML、MDS、 CMML或JMML患者的方法，包括给予患者抗EphA3激活抗体。在一些实施方案中，本发明的方法包括将诱导ADCC的抗EphA3抗体给予CML、PV、ET、IM、AML、MDS、CMML或JMML患者。 在一些实施方案中，给予CML、PV、ET、IM、AML、MDS、CMML或JMML患者的抗EphA3抗体⑴ 是抗EphA3激活抗体并(ii)诱导ADCC。
在一些实施方案中，用于本发明的抗EphA3抗体不阻断EphA3与印hrin(例如， ephrin-A5)的结合。在一些实施方案中，所述抗体使EphA3 二聚化。在一些实施方案中，所述抗体与EphA3进行交联。在一些实施方案中，所述抗体与mAb IIIA4竞争结合EphA3，例如，所述抗体可以与Mab IIIA4结合相同的表位。在一些实施方案中，所述抗体具有活性同种型，其中重链恒定结构域可以与免疫效应细胞上存在的Fc受体结合，导致ADCC。抗EphA3 抗体可以利用EphA3蛋白或片段激发本发明的抗EphA3抗体，或通过重组方法产生本发明的抗EphA3抗体。许多技术都可用于测定抗体结合特异性。参见，例如，Harlow & Lane， Antibodies, A Laboratory Manual (抗体实验室手册)(1988)，其中描述了可用于测定抗体的特异性免疫反应性的免疫分析形式及条件。在一些实施方案中，抗EphA3抗体是多克隆抗体。制备多克隆抗体的方法是本领域技术人员己知的(例如，Harlow & Lane，Antibodies，A Laboratory manual (抗体实验室手册)(1988) ；Methods in Immunology)。可以在哺乳动物中通过一次或多次免疫剂注射来激发多克隆抗体，并且如果需要，注射佐剂。所述免疫剂包括EphA3受体蛋白或其片段。在一些实施方案中，抗EphA3抗体是单克隆抗体。可以利用杂交瘤法制备单克隆抗体，例如Kohler & Milstein Nature 256:495(1975)描述的方法。在杂交瘤法中，通常用免疫剂来免疫小鼠、仓鼠或其它合适的宿主动物以激发淋巴细胞，所述淋巴细胞产生或能够产生特异性结合该免疫剂的抗体。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。可以利用本领域已知的各种技术产生人单克隆抗体，包括噬菌体展示文库 (Hoogenboom & Winter，J. Mol. Biol. 227 :381 (1991) ；Marks et al. , J. Mol.Biol. 222 581(1991))。Cole等人和Boerner等人的技术也可用于制备人单克隆抗体(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (单克隆抗体和癌症疗法)，p. 77 (1985)和 Boerner et al. , J. Immunol. 147(1) :86-95 (1991))。同样，可以通过将人免疫球蛋白基因座导入转基因动物(例如，内源免疫球蛋白基因部分失活或完全失活的小鼠)来制备人抗体。通过激发，观察到人抗体的产生，其在各个方面与在人类中观察到的抗体非常类似， 包括基因重排、组装和抗体各项功能。该方法描述于例如，美国专利第5，545，807号、第 5，545，806 号、第 5，569，825 号、第 5，625，126 号、第 5，633，425 号、第 5，661，016 号，和下列科学出版物Marks et al. ,Bio/Technology 10:779-783(1992) ；Lonberg et al. ,Nature 368 :856-859(1994) ；Morrison, Nature 368 :812-13(1994) ；Fishwild et al. , Nature Biotechnology 14 :845-51(1996) ；Neuberger, Nature Biotechnology 14 :826(1996)； Lonberg & Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 :65-93(1995)。在一些实施方案中，抗EphA3抗体是嵌合或人源化的单克隆抗体。如上文所述，抗体的人源化形式是嵌合免疫球蛋白，其中人抗体的CDR被具有所需特异性、亲和力及能力的非人物种(诸如小鼠、大鼠或兔)的CDR替换。本发明使用的抗体可以是多种形式。在一些实施方案中，抗体可以包括Fc区，例如人Fc区。例如，该抗体包括结合EphA3并具有活性同种型的IgG抗体。在一些实施方案中，所述抗体可以是抗体的活性片段(例如，可以使EphA3 二聚化的片段)或可以包含抗体的衍生物，例如i^ab、Fab'、F(ab' )2、Fv、scFv或单结构域抗体(〃 dAb〃)。例如，在一些实施方案中，所述抗体可以是F(ab' )2。可用于本发明的抗体的其它示例性实施方案包括纳米激活抗体(nanobodies)或骆驼激活抗体。还可以利用本领域技术人员公知的方法将这些抗体进行重组工程化。如上所述，可以利用已知的技术产生这些抗体。本领域技术人员应当理解，在一些实施方案中，当抗体采用可以是单价的形式(例如，Fv或Fab形式) 时，该抗体作为诸如三价或四价抗体的多价抗体使用。产生多价抗体的方法是已知的(参见，例如，King et al.，Cancer Res. 54 :6176-6185,1994)。在许多实施方案中，用于本发明的抗体具有Fc恒定区，该Fc恒定区具有效应功能，例如，与免疫效应细胞上存在的Fc受体结合。示例性的“效应子功能”包括Clq结合； 补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调等。这类效应功能通常需要Fc区与结合结构域(例如，抗体可变结构域)进行联合，并可以利用已知的分析法评价这类效应功能(参见，例如， 下文引用的参考文献)。具有活性同种型并与效应细胞(诸如巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞和NK细胞) 上的Fc受体结合的抗EphA3抗体可以通过ADCC诱导细胞死亡。Fc区可以来自天然存在的IgGl，或其它活性同种型，包括IgG3、IgM、IgA和 IgE。“活性同种型”包括这样的抗体，其中Fc区包含修饰而增强与Fc受体的结合或者提高抗体功效。这种Fc恒定区可以包括增强与Fc受体结合的修饰，例如糖基化水平的突变、改变等。本领域中已知许多可用于修饰Fc区的方法。例如，美国专利申请公开号 20060039904描述了具有增强的效应功能的Fc受体的变体，所述增强的效应功能包括对一个或多个Fc配体(例如，FcyR, Clq)的结合亲和力的改变。此外，这种Fc变体具有改变的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。 其它Fc变体包括以下文献公开的变体Ghetie et al.，Nat Biotech. 15 :637-40,1997 ； Duncan et al. , Nature 332 :563-564,1988 ；Lund et al. , J.Immunol 147:2657-2662， 1991 ；Lund et al. , Mol Immunol 29 :53-59,1992 ；Alegre et al. , Transplantation 57 1537-1543,1994 ；Hutchins et al. , Proc Natl Acad Sci USA 92 :11980-11984,1995 ； Jefferis et al.，Immunol Lett.44 :111-117,1995 ；Lund et al. , FASEB J 9:115—119， 1995 ；Jefferis et al. , Immunol Lett 54 101-104,1996 ；Lund et al. , J Immunol 157 4963-4969,1996 ；Armour et al. ,Eur J Immunol 29 :2613-2624,1999 ；Idusogie et al.， J Immunol 164 :4178-4184,200 ；Reddy et al., J Immunol 164 :1925-1933，2000 ;Xu et al.,Cell Immunol 200 :16-26,2000 ；Idusogie et al. ,J Immunol 166 :2571-2575,2001 ； Shields et al. , J Biol Chem 276 :6591-6604,2001 ；Jefferis et al. , Immunol Lett 82 :57-65. 2002；Presta et al.，Biochem Soc Trans 30 :487-490,2002；Lazar et al.， Proc. Natl Acad. Sci. USA 103 :4005-4010, 2006 ；美国专利第 5，624，821 号、第 5，885，573 号、第 5，677，425 号、第 6，165，745、第 6，277，375 号、第 5，869，046 号、第 6，121，022 号、 第 5，624，821 号、第 5，648，260 号、第 6，194，551 号、第 6，737，056 号、第 6，821，505 号、第 6，277，375 号、第 7，335，742 号和第 7，317，091 号；以及PCT 公开 WO 94/2935,WO 99/58572、 WO 00/42072、WO 02/060919 和 WO 04/029207。在一些实施方案中，可以修饰Fc区的糖基化。例如，修饰可以是去糖基化，例如， 通过改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点。这种方法更详细地描述于美国专利第 5，714，350号和第6，350，861号。还可以制备具有改变的糖基化类型的Fc区，诸如岩藻
16糖残基的量减少的低岩藻糖基化Fc变体或具有增加的二等分GIcNAC结构的Fc变体。可以通过，例如在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体来实现这类碳水化合物修饰。具有改变的糖基化机制的细胞(包括酵母和植物)在本领域中已有描述，并且可以用做宿主细胞来表达本发明的重组抗体，从而产生具有改变的糖基化的抗体。用于修饰糖基化的技术包括下列文献中公开的技术，例如，Umana et al.，Nat. Biotechnol 17:176-180， 1999 ；Davies, et al.，Biotechnol Bioeng. 74 :288-294,2001 ；Shields et al.，J Biol Chem 277 :26733-26740,2002 ；Shinkawa et al.，J Biol Chem 278 :3466-3473,2003 ；Niwa et al Clinc. Cancer Res. 1_ :6248-6255,2004 ；Presta et al., Biochem Soc Trans 30 487-490,2002 ；Kanda et al. , Glycobiology 17 104-118，2006 ；美国专利第 6，602，684 号、第6，946，292号和第7，214，775号；美国专利申请公开号20070248600,20070178551, 20080060092、20060253928 ;PCT 公开 WO 00/61739、WO 01/292246、WO 02/311140 和 WO 02/30954 ；以及 Potillegent 技术(Biowa, Inc. Princeton, N. J.)；和 GlycoMAb 糖基化工程技术(GLYCART biotechnology AG，^irich, Switzerland)。通常在低岩藻糖基化抗体的制备中，抗体分子中的至少50-70 %，通常分子中的至少80%或分子中的至少90 %缺少岩藻糖。在本发明的一些实施方案中，对抗体进行额外的工程化来降低免疫原性，例如，以便抗体适合于重复给药。用于产生免疫原性降低的抗体的方法包括人源化和人工程化的方法以及诸如脱免疫的修饰技术，在脱免疫中，抗体在例如一个或多个框架区被进一步工程化以去除T细胞表位。在一些实施方案中，抗体是人工程化(HUMANEERED )的抗体。人工程化的抗体是具有参照抗体的结合特异性的工程化人抗体，其是通过以下方式获得的将编码参照抗体重链CDR3区的结合特异性决定簇(BSD)的DNA序列与人Vh节段序列连接，并将参照抗体的轻链⑶R3 BSD与人\节段序列连接。产生这类抗体的方法提供于美国专利申请公开号 20050255552和美国专利申请公开号200601；34098中。可以进一步将抗体脱免疫，从而从抗体的V区去除一个或多个预测的T细胞表位。 这类方法描述于，例如WO 00/34317中。在一些实施方案中，可变区由人V基因序列组成。例如，可变区序列与人类种系V 基因序列具有至少80%的同一性，或至少85%或至少90%的同一性，或者更高的同一性。本发明使用的抗体可以包含人恒定区。轻链恒定区可以是人κ或λ恒定区。重链恒定区通常是Y链恒定区，例如，Y-I或Υ-3恒定区。在一些实施方案中，例如，当抗体是片段时，该抗体可以被偶联到另一分子，例如， 为了提供延长的体内半衰期，所述另一分子例如聚乙二醇(聚乙二醇化)或血清白蛋白。 抗体片段PEG化的实例提供于Knight et al. ,Platelets 15 :409，2004 (关于阿昔单抗)； Pedley et al. , Br. J. Cancer 70 1126，1994 (关于抗 CEA 抗体)；和 Chapman et al.， Nature Biotech. 17 :780,1999 中。抗体特异性用于本发明的抗体激活EphA3和/或通过ADCC杀伤EphA3+细胞。适用于本发明的抗体的实例是具有mAb IIIA4的结合特异性的抗体。单克隆抗体mAb IIIA4与天然 EphA3 球状 ephrin 结合结构域结合(Smith et al.，J. Biol Chem. 279 :9522-9531，2004 ；和 Vearing et al. ,Cancer Res. 65 :6745-6754,2005) 与 EphA3 表面结合的高亲和力 mAb IIIA4对印hrin-A5与EphA3相互作用的总亲和力几乎没有影响。在一些实施方案中，使用与mAb IIIA4竞争结合EphA3的单克隆抗体，或使用与 mAb IIIA4结合相同表位的单克隆抗体。可以使用多种竞争性结合测定来测定两种抗体与相同抗原结合之间的竞争。例如，为了这个目的可以使用夹心ELISA测定。在示例性的测定中，利用捕获抗体包被孔的表面来进行ELISA。然后向捕获表面添加亚饱和浓度的带有标签的抗原。该蛋白通过特异性的抗体抗原相互作用而结合抗体。洗涤后，向ELISA中添加连接有可检测部分的二抗。如果该抗体与捕获抗体结合抗原上的相同位点，或干扰与该位点的结合，则该抗体将不能结合靶蛋白，因为所述位点已不再能用于结合。但是如果该二抗识别抗原上的不同位点，则它将能够结合。通过对结合的可检测标记进行定量，可以测定结合。利用单个抗体作为捕获和检测抗体来确定背景，而通过用抗原特异性抗体进行捕获并利用针对抗原上的标签的抗体进行检测来确定最大信号。利用背景和最大信号作为参照， 可以采用配对方式评价抗体以确定特异性。通常通过这种竞争性测定确定具体抗体与另一抗体识别相同表位的能力。利用如上所述的任意测定，在第一抗体存在的条件下，如果第二抗体与抗原的结合降低至少30 %，通常至少约40 %、50 %、60 %或75 %，经常是至少约90 %，则认为所述第一抗体竞争性抑制所述第二抗体的结合。在一些实施方案中，所述抗体与mAb IIIA4结合相同的表位。IIIA4及工程化的人衍生物的表位位于EphA3的N末端球状配体结合结构域中(下文所示的部分人EphA3序列中的氨基酸四-202)1 MDCQLSILLL LSCSVLDSFG ELIPQPSNEV NLLDSKTIQG ELGffISYPSH GffEEISGVDE61 HYTPIRTYQV CNVMDHSQNN WLRTNWVPRN SAQKIYVELK FTLRDCNSIP LVLGTCKETF121 NLYYMESDDD HGVKFREHQF TKIDTIAADE SFTQMDL⑶R ILKLNTEIRE VGPVNKKGFY181 LAFQDVGACV ALVSVRVYFK KCIIIA4抗体结合在受体附近，而基本上不干扰EphrinA5与受体的结合。抗体IIIA4 的表位由Smith et al,J. Biol. Chem. 279 :9522，2004使用定点诱变进一步表征。在本分析中，132位的甘氨酸突变至谷氨酸(G132E)，这消除了与IIIA4的结合。缬氨酸133突变至谷氨酸(V133E)使EphA3与IIIA4抗体的结合降低大约100倍。本发明人随后观察到，精氨酸136也是表位的一部分。在大鼠中的高度保守的EphA3蛋白的序列中，该残基变为亮氨酸(R136L)。大鼠EphA3不与IIIA4或IIIA4的工程化人衍生物结合。因此，G132、V133 和R136(以上序列中粗体并划线的)是IIIA4表位中重要的氨基酸。结合亲和力在一些实施方案中，适用于本发明的抗体对人EphA3具有高的结合亲和力。用于本发明的目的，如果抗体的解离常数(Kd) <约ΙΟηΜ，例如，约5nM，或约2nM，或约InM，或更低，则抗体和抗原间存在高亲和力结合。可以使用多种方法测定抗体对其靶抗原的结合亲和力，例如表面等离子体共振测定、饱和测定或诸如ELISA或RIA的免疫测定，这些都是本领域技术人员公知的。用于测定结合亲和力的示例性方法是如Krirmer等Q007)，Mol. Immunol. Feb ；44 (5) :916-25. (2006 年 5 月 11 日电子出版)所述，在 BIAcore 2000 装置 (Biacore AB, Freiburg, Germany)上利用CM5传感芯片进行的表面等离子体共振分析。
抗EphA3抗体可以与EphA3的任何区结合。在一些实施方案中，抗EphA3抗体激活EphA3。通常，所述抗体使EphA3 二聚化。在一些实施方案中，所述抗体使EphA3聚集。 在一些实施方案中，还可以使用具有活性同种型(诸如IgGl、IgG3、IgM、IgA或IgE)并且通过ADCC对骨髓增生性病症细胞具有细胞毒性的抗EphA3抗体。本发明使用的抗体还可以是多价的，包括单体形式在内，该单体进行交联或以其它方式发生多聚而形成多价抗体。在一些实施方案中，用于本发明的抗体不与EphA3配体竞争结合EphA3，而在其它的实施方案中，用于本发明的EphA3抗体可以竞争EphA3配体(诸如印hrin，例如， ephrin-A5)与EphA3的结合。可以利用如上所述的技术鉴定与配体竞争结合EphA3的抗体，其中使用诸如印hrin-A5的^hrin配体替代另一种抗体用于竞争分析。在示例性的实施方案中，抗EphA3抗体包含mAb IIIA4的八和Vh区。在其它的实施方案中，抗EphA3抗体包含mAb IIIA4的⑶R 1、2和3。在一些实施方案中，抗EphA3抗体包含mAb IIIA4的⑶R3。表1提供了与mAb IIIA4结合相同表位的抗体的⑶R序列(根据Kabat编号限定)。通过ELISA测定对EphA3抗原的亲和力。因此，本发明的抗体还可以具有表1所示的重链和/或轻链CDR。表 1
抗体CDRHlCDRH2CDRH3亲和力(nM)IIIA4SYWINDIYPGSGNTNYDEKFKRSGYYEDFDS2. 5FA3AM-H12ATYWISDIYPGSGNTNYDEKFQGSGYYEEFDS3. 2K3DTYWISDIYPGSGNTNYDEKFEGSGYYEEFDS2权利要求
1.杀伤在细胞表面上表达EphA3的骨髓增生性病症细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与抗EphA3抗体接触，其中所述抗EphA3抗体(i)激活EphA3和(ii)诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
2.治疗患有骨髓增生性病症并具有在细胞表面上表达EphA3的骨髓增生性病症细胞的患者的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的抗EphA3抗体，其中所述抗EphA3 抗体⑴激活EphA3和(ii)诱导ADCC。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述骨髓增生性病症细胞是慢性骨髓增生性病症(CMPD)细胞。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述CMPD细胞是BCR-ABL阴性的CMPD细胞。
5.如权利要求3所述的方法，其中所述CMPD细胞是CML细胞。
6.如权利要求5所述的方法，还包括给予至少一种其它治疗剂，其中所述至少一种其它治疗剂是化疗剂。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述化疗剂是甲磺酸伊马替尼、尼罗替尼或达沙替尼。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体包含人重链Yl或Y3恒定区。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体是低岩藻糖基化的。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗EphA3抗体与mabIIIA4竞争结合 EphA3。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗EphA3抗体是重组抗体或嵌合抗体。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗EphA3抗体是人抗体。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述抗EphA3抗体是单克隆抗体。
14.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述抗EphA3抗体是多克隆抗体。
15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体包含mAbIIIA4的Vh区⑶R3 和\区CDR3。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述抗EphA3抗体包含mAbIIIA4的Vh和\区的 CDR1、CDR2 和 CDR3。
17.杀伤在表面上表达EphA3的骨髓增生性病症细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与激活EphA3或诱导ADCC的抗EphA3抗体接触，其中所述骨髓增生性病症细胞是急性骨髓性白血病(AML)细胞或骨髓增生异常综合症(MDQ细胞。
18.治疗患有骨髓增生性病症并具有在细胞表面上表达EphA3的骨髓增生性病症细胞的患者的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的抗EphA3抗体，其中所述抗EphA3 抗体激活EphA3或诱导ADCC，其中所述骨髓增生性病症是AML或MDS。
19.如权利要求17或18所述的方法，其中所述骨髓增生性病症细胞是AML细胞。
20.如权利要求19所述的方法，还包括给予至少一种其它治疗剂，其中所述至少一种其它治疗剂是单独的阿糖胞苷或阿糖胞苷与柔红霉素的组合。
21.如权利要求17或18所述的方法，其中所述抗体激活EphA3。
22.如权利要求17-20中任一项所述的方法，其中所述抗体包含人重链恒定区。
23.如权利要求17-38中任一项所述的方法，其中所述抗EphA3抗体与mAbIIIA4竞争结合EphA3。
24.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体是(Fab')2。
25.如权利要求17-23中任一项所述的方法，其中所述抗EphA3抗体是重组抗体或嵌合抗体。
26.如权利要求17-25中任一项所述的方法，其中所述抗EphA3抗体是人抗体。
27.如权利要求17-26中任一项所述的方法，其中所述抗EphA3抗体是多克隆抗体。
28.如权利要求17-26中任一项所述的方法，其中所述抗EphA3抗体是单克隆抗体。
29.如权利要求17- 中任一项所述的方法，其中所述抗EphA3抗体是包含Fab、Fab‘ 或Fv的多价抗体。
30.如权利要求17- 中任一项所述的方法，其中所述抗EphA3抗体包含mAbIIIA4的 Vh和八区。
31.如权利要求17- 中任一项所述的方法，其中所述抗EphA3抗体包含mAbIIIA4的 Vh 和 Vl 区的 CDR1、CDR2 和 CDR3。
32.如权利要求17- 中任一项所述的方法，其中所述抗体包含mAbIIIA4的Vh区⑶R3 和\区CDR3。
33.如权利要求17-32中任一项所述的方法，其中所述抗EphA3抗体诱导ADCC。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述抗体阻断印hrinA5配体与EphA3的结合。
35.如权利要求33所述的方法，其中所述抗体是低岩藻糖基化的。
36.如权利要求33所述的方法，其中所述抗体具有人Yl或Y3恒定区。
37.如权利要求33所述的方法，其中所述抗体阻断印hrinA5配体与EphA3的结合。
38.如权利要求22-32中任一项所述的方法，其中人重链恒定区是Y2或区。
39.确定AML患者或MDS患者是否是抗EphA3抗体治疗的候选者的方法，所述方法包括提供来自所述患者的样品，其中所述样品包含骨髓增生性病症细胞；以及检测所述骨髓增生性病症细胞上EphA3的表达。
40.如权利要求39所述的方法，其中检测母细胞上的EphA3。
41.如权利要求39所述的方法，其中检测干细胞上的EphA3。
42.如权利要求39所述的方法，其中检测母细胞和干细胞上的EphA3。
43.如权利要求39所述的方法，其中所述检测EphA3表达的步骤包括检测细胞表面上的蛋白表达。
44.如权利要求39所述的方法，其中所述检测EphA3表达的步骤包括检测EphA3的RNA 水平。
45.如权利要求44所述的方法，其中检测EphA3的RNA水平包括进行扩增反应。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述扩增反应包括RT-PCR。
47.确定CMPD患者是否是抗EphA3抗体治疗的候选者的方法，所述方法包括 提供来自所述患者的包含瘤性干细胞的样品；以及检测所述瘤性干细胞的EphA3表达。
48.监测具有EphA3+骨髓增生性细胞的骨髓增生性病症患者的治疗功效的方法，其中所述骨髓增生性病症是AML或MDS，所述方法包括从进行了骨髓增生性病症的治疗性处理后的患者获得包含骨髓增生性病症干细胞和/ 或母细胞的样品；以及检测所述骨髓增生性病症干细胞和/或母细胞上EphA3的表达。
49.监测具有表达EphA3的瘤性骨髓增生性病症干细胞的CMPD患者的治疗功效的方法，所述方法包括从进行了 CMPD的治疗性处理后的患者获得包含瘤性干细胞的样品；以及检测所述干细胞上EphA3的表达。
全文摘要
本发明提供用于治疗骨髓增生性病症的包含抗EphA3抗体的方法和组合物。
文档编号A61K39/395GK102405237SQ201080017671
公开日2012年4月4日 申请日期2010年3月5日 优先权日2009年3月6日
发明者克里斯托弗·R·贝炳东, 杰弗里·T·亚兰东, 瓦尔盖斯·帕拉斯 申请人:卡罗拜奥斯制药公司