疫苗佐剂制备中的亲水过滤的制作方法

专利名称：疫苗佐剂制备中的亲水过滤的制作方法
技术领域：
本发明涉及例如通过微流化制备疫苗的水包油乳液佐剂的领域。
背景技术：
称作‘MF59’ [1-3]的疫苗佐剂是一种鲨烯、聚山梨酯80 (也称作吐温80)和去水山梨糖醇三油酸酯(也称作司盘85)的亚微米水包油乳液。它也可包含柠檬酸根离子，如IOmM柠檬酸钠缓冲剂。该乳液的体积组成可以是约5%角鲨烯、约0. 5%吐温80和约0. 5%司盘85。参考文献4的第10章、文献5的第12章、文献6的第19章更详细地描述了该佐 剂及其制备。如参考文献7所述，MF59的商业规模的制备是通过将司盘85分散在鲨烯相中且吐温80分散在水相中，然后高速混合得到粗乳液。然后将这种粗乳液重复通过微流化床，产生具有均一油滴尺寸的乳液。如参考文献6所述，然后将微流化乳液滤过0. 22 ii m膜，以除去任何大油滴，得到乳液的平均液滴尺寸在4°C下保持至少3年不变。可用参考文献8中所述的方法测定最终乳液中的鲨烯含量。许多文献(例如参考文献9-12)描述了可通过微流化然后经0. 22 Pm聚砜滤膜过滤除菌来制备MF59。聚砜是在主要聚合物主链中含有砜基(SO2)的聚合物，聚砜滤膜公知是疏水滤膜。本发明的目的是提供另一种制备微流化水包油乳液(例如MF59)的改良方法，特别是适合用于商业规模和使用过滤的方法。

发明内容
本发明提供了一种制备含有鲨烯的水包油乳液的方法，其中该方法包括步骤(i)制备具有第一平均油滴尺寸的第一乳液，也称作初始乳液或预乳液；(ii)微流化第一乳液形成具有比第一平均油滴尺寸小的第二平均油滴尺寸的第二乳液；和(iii)用亲水膜过滤第二乳液。本发明还提供了一种制备水包油乳液的方法，其包括步骤(i)制备具有5000nm或以下的第一平均油滴尺寸的第一乳液，也称作初始乳液或预乳液；(ii)微流化第一乳液形成具有比第一平均油滴尺寸小的第二平均油滴尺寸的第二乳液；和(iii)用亲水膜过滤
第二乳液。本发明还提供了一种制备水包油乳液的方法，其包括步骤(i)制备具有第一平均油滴尺寸的第一乳液，也称作初始乳液或预乳液；(ii)微流化第一乳液形成具有比第一平均油滴尺寸小的第二平均油滴尺寸的第二乳液；和(iii)用亲水聚醚砜膜过滤第二乳液。
可任选地，第一乳液可用匀质器如下所述制备。如下文详述，第一乳液可具有5000nm或以下的平均油滴尺寸，例如平均尺寸为300nm-800nm。如下所述，第一乳液中尺寸> I. 2 y m的油滴数量为5X10n/ml或以下。尺寸> I. 2 的油滴是不利的，因为它们由于液滴凝聚和聚结能导致乳液不稳定[14]。形成后，第一乳液可随之至少通过一次微流化，形成平均油滴尺寸减小的第二乳液。如下所述，第二乳液中的平均油滴尺寸为500nm或以下。如下所述，第二乳液中尺寸>
I.2 的油滴数量为SxIOltVml或以下。为了实现这些特征，必须将乳液组分通过微流化装置多次，例如2、3、4、5、6、7次。然后第二乳液可经亲水膜过滤，例如亲水聚醚砜膜，得到可适用作疫苗佐剂的水包油乳液。过滤后产生的水包油乳液的平均油滴尺寸为220nm或以下，例如135_175nm，145-165nm，或约155nm。过滤后产生的水包油乳液中存在的尺寸> I. 2 y m的油滴数量可以是5xl08/ml或更少，例如5xl07/ml或更少，5xl06/ml或更少，2xl06/ml或更少，或5xl05/ml 或更少。过滤后形成的最终水包油乳液中尺寸> I. 2 ii M的油滴可比第一乳液以少至少IO2倍，理想的是至少少IO3倍(例如少IO4倍)。在一些实施方式中，在步骤(iii)之前进行一轮以上的步骤(i)和(ii)。类似的，可多次重复独立步骤Q)和(ii)。本发明还可用于制备不利用微流化的水包油乳液，例如用于依靠其它技术如热可逆性的方法[40]。在这些实施方式中，本发明提供了一种制备含有鲨烯的水包油乳液的方法，其中该方法包括步骤(i)制备平均油滴尺寸在I U m以下(例如500nm以下，250nm以下，200nm以下，150nm以下，IOOnm以下)的水包油乳液；和(ii)用亲水膜过滤该乳液。因此，这些实施方式利用了亲水膜对制备含鲨烯的水包油乳液的适用性，但不需要预先使用微流化。类似的，本发明提供了亲水膜制备水包油乳液佐剂的用途。下文描述了膜和乳液佐剂的其它特征。一般，本发明的方法在20-60°C，理想地在40±5°C进行。虽然第一和第二乳液组分可能在较高温度下也相对稳定，但一些组分的热分解仍然会发生，因此优选较低温度。乳液组分可用动态光散射技术如参考文献13所述测定平均油滴尺寸(即乳液油滴的平均直径数)。动态光散射测量机的一个例子是Nicomp 380亚微米粒度分析仪(来自粒度分析仪公司(Particle Sizing Systems))。可用颗粒计数器，例如Accusizer 770(来自粒度分析公司)测定尺寸> I. 2yM的颗粒数。本发明的方法用于制备水包油乳液。这些乳液包含三种核心成分油；水性组分；和表面活性剂。由于乳液要用于药物学应用，油通常应该是可生物降解的(可代谢的)和生物相容的。所用油可包含角鲨烯，其是一种支链不饱和萜类鲨鱼肝油(C3tlH5tl ;[ (CH3)2C[=CHCH2CH2C (CH3)J2 = CHCH2-J2 ;2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22- 二十四碳己烯；CAS RN 7683-64-9)。鲨烯特别优选用于本发明。本发明的油可包括油的混合物(或组合)例如包含角鲨烯和至少一种其他油。不(或除了)使用鲨烯，乳液可含有来自例如动物(如鱼)或植物来源的油。植物油的来源包括坚果、种籽和谷物。最常见的花生油、大豆油、椰子油和橄榄油是坚果油的示例。也可使用获自(例如)霍霍巴豆的霍霍巴油。种籽油包括红花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。在谷物油中，最常见的是玉米油，但也可以使用其它谷类的油，如小麦、燕麦、黑麦、稻、画眉草、黑小麦等。可从坚果和种籽油开始，通过水解、分离和酯化合适物质制备甘油和1，2_丙二醇的6-10碳脂肪酸酯，其不是种籽油中天然产生的。来自哺乳动物乳汁的脂肪和油可代谢并因而可以使用。获得动物来源纯油所必需的分离、纯化、皂化和其它方法的过程为本领域熟知。大多数鱼类含有容易回收的可代谢油。例如，鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和诸如鲸蜡的鲸油是本文可用的几种鱼油示例。通过生化途径用5-碳异戊二烯单位合成许多支链油，其总
称为萜类。也可采用鲨烯的饱和类似物鲨烷。包括角鲨烯和角鲨烷在内的鱼油，易于从商业来源获得，或可以通过本领域已知的方法获得。其他有用的油为生育酚，特别是和角鲨烯结合。当乳液的油相包含生育酚时，可采用a、P、Y、S、e*&生育酚中的任何一种，但优选a -生育酚。可同时采用D-a -生育酚和DL-a-生育酚。优选的a生育酚是DL-a生育酚。生育酚可取多种形式，例如不同的盐和/或异构体。盐包括有机盐，例如琥珀酸盐、乙酸盐、烟酸盐等。如果采用这种生育酚的盐，那么优选的盐是琥珀酸盐。可使用包括角鲨烯和生育酚(如DL-a-生育酚)的油组合。所述水性组分可为淡水(如I f. i.)或可包括其他组分如溶质。例如，可包含盐以形成缓冲液，例如柠檬酸或磷酸盐，例如钠盐。常用缓冲剂包括磷酸盐缓冲剂；Tris缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂；或柠檬酸缓冲剂。包含的缓冲剂一般是 5-20mM。表面活性剂优选是可生物降解(可代谢)和生物相容性的。可通过'HLB/ (亲水/亲脂平衡)对表面活性剂分类，其中1-10范围内的HLB —般表示表面活性剂相比水更易于溶于油，而10-20范围内的HLB更易溶于水而不是油。乳液优选包含至少一种HLB为至少10，例如至少15或优选至少16的表面活性剂。可以与本发明一起使用的表面活性剂包括但不限于聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为吐温)，特别是聚山梨酯20和聚山梨酯80 ;以商品名DOWF AX 出售的环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，如直链EP/P0嵌段共聚物；重复的乙氧基(氧-1，2-乙二基)数量不同的辛苯聚醇，特别感兴趣的是辛苯聚醇9(曲通(Triton) X-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPALCA-630/NP-40);磷脂如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；衍生自十二烷醇、十六烷醇、十八烷醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为苄泽表面活性剂)，如三乙二醇单月桂基醚(苄泽30);聚氧乙烯-9-月桂醚以及去水山梨糖醇酯(通常称为司盘)，如去水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)和去水山梨糖醇单月桂酸酯。乳液中包含的优选表面活性剂是聚山梨酯80 (吐温80 ;聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯)、司盘85 (去水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X100。所述乳液中可包括这些表面活性剂的混合物，如吐温80/司盘85混合物或吐温80/曲通-XlOO混合物。聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(吐温80)和辛苯聚醇如叔辛基苯氧基-聚乙氧基乙醇(曲通X-100)的组合也适用。另一种有用的组合包含月桂醇聚醚-9加聚氧乙烯去水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。有用的混合物可包括HLB值为10-20的表面活性剂(如吐温80，HLB为15. 0)和HLB值为1_10的表面活性剂(如司盘85，HLB为I. 8)。第一乳液的形成微流化步骤前，混合乳液组分形成第一乳液。第一乳液中油滴的平均尺寸可以是5000nm或以下，例如4000nm或以下，3000nm或以下，2000nm或以下，1200nm或以下，IOOOnm或以下，例如平均尺寸为800-1200nm或300nm-800nmo
在第一乳液中，尺寸〉I. 2iiM的油滴数可以是5xlOn/ml或更少，例如SxlOicVml或更少，或5xl09/ml或更少。然后，微流化第一乳液形成平均油滴尺寸比第一乳液更小和/或尺寸> I. 2UM的油滴更少的第二乳液。可通过将第一乳液组分在匀浆器中混合得到第一乳液的平均油滴尺寸。例如如图I所示，可将其在混合容器(12)中合并，然后将混合组分引入(13)机械匀浆器，例如转子-定子匀浆器(I)。可以垂直和/或水平方式操作匀浆器。为了方便在商业配置中使用，优选在线式匀浆器。将组分引入转子-定子匀浆器，并接触含有槽或孔的迅速旋转的转子。组分以类似泵的方式被向外离心甩出，通过槽和/或孔。在一些实施方式中，匀浆器包括多种转子和定子的组合，例如梳齿环同心排列，如图I的特征(3)&(4) ；(5)&(6)和(7)&(8)以及图2所示。用于大规模匀浆器的转子可以在水平方向的多刃叶轮边上具有梳齿环(例如图I中的特征(9))，彼此精密排列，以配合静态衬里中的齿。第一乳液通过转子和定子之间缺口内发生中的湍流、空化和机械剪切的组合来形成。以与转子轴平行的方向有用地引入组分。转子-定子匀浆器中的重要性能参数是定子的叶尖速度(圆周速度)。该参数是转速和转子直径的函数。至少lOms—1的叶尖速度是有用的，理想上更快例如> 20ms-1,彡30ms'彡40ms'可用小型勻衆器在10，OOOrpm轻易实现40msH的叶尖速度，或用较大的匀浆器在较低转速(例如2，OOOrpm)实现。合适的高剪切匀浆器可市售获得。对于商业规模生产，匀浆器应理想地具有至少300升/小时，例如彡400升/小时，彡500升/小时，彡600升/小时，彡700升/小时，彡800升/小时，彡900升/小时，彡1000升/小时，彡2000升/小时，彡5000升/小时，或甚至彡10000升/小时的流速。合适的高性能匀浆器可市售获得。优选的匀浆器提供的剪切率为3x105和IxlO6s-1,例如SxiO5-TxIOV1,4x105-6x105s S 例如约 5x105s、虽然转子定子匀浆器在操作过程中产热相对较少，但在使用中也可冷却匀浆器。理想的是，第一乳液的温度在匀浆过程中维持在60°C以下，例如45°C以下。在一些实施方式中，可对第一乳液成分匀浆多次(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或更多次)。为了避免对一长串容器和匀浆器的需要，也可循环乳液成分(例如图I中的特征(11))。具体说，可将第一乳液组分循环通过某一匀浆器多次(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100次等)形成第一乳液。然而，太多次循环可能不利，因为可
能如参考文献14中所述产生重聚结。因此，如果使用匀浆器循环，可监控油滴尺寸，以检查是否达到所需液滴大小，和/或不发生重聚结。通过匀浆器循环是有利的，因为可以减少第一乳液中的油滴平均尺寸。循环是有利的，还因为可以减少第一乳液中尺寸> I. 2iiM的油滴的数量。第一乳液中这些平均液滴尺寸和尺寸> I. 2 PM的液滴数量的减少可在下游过程中提供益处。具体说，第一乳液组分循环通过匀浆器可改善微流化过程，随后使得第二乳液中尺寸> I. 2 y M的油滴数量(即在微流化后)减少。第二乳液参数中的该改进可提供改善的过滤性能。改善的过滤性能可导使得滤过程中内含物损失更少，例如当水包油乳液是MF59时，鲨烯、吐温80和司盘85的损失。本文中的两种具体循环类型被称作“I型”和“II型”。I型循环如图5所示，II型 循环如图6所示。第一乳液组分的循环可包括在第一预混容器和匀浆器之间转移第一乳液组分的I型循环。第一预混容器的尺寸可以是50-500L，例如100-400L、100-300L、200-300L、250L-280L。可用不锈钢制造第一预混容器。I型循环可继续10-60分钟，例如10-40分钟，或20分钟。第一乳液组分的循环可以包含II型循环，所述循环将第一乳液组分从第一预混容器通过匀浆器转移到第二预混容器(可任选地具有与第一预混容器相同的性质)，然后通过第二匀浆器。第二匀浆器通常与第一匀浆器相同，但在一些配置方面第一和第二匀浆器也可不同。第一乳液组分通过第二匀浆器后，例如若要重复II型循环过程，第一乳液组分可转回第一预混容器中。因此，乳液组分可以图8的方式在第一和第二预混容器之间通过一个匀浆器运动(图6)。II型循环可以进行一次或多次，例如2，3，4，5次等。与I型循环相比，II型循环是有利的，因为它能帮助确保第一乳液中的所有组分通过匀浆器。清空第一预混容器意味着全部乳液内含物通过匀浆器进入第二预混容器。类似的，第二预混容器的内容物也可清空，再次确保它们全部通过匀浆器。因此，II型配置可方便地确保全部乳液组分至少匀浆两次，可以减少第一乳液中的油滴平均尺寸和尺寸>1.2UM的油滴数量。因此理想的II型循环涉及清空第一预混容器，将其几乎全部内含物通过匀浆器进入第二预混容器，然后请空第二预混容器，将其几乎全部内含物重新通过匀浆器回到第一预混容器内。因此全部颗粒通过匀浆器至少两次，这是I型循环难于实现的。在一些实施方式中使用I型和II型循环的组合，该组合提供了具有良好特性的第一乳液。具体地，该组合可以大幅减少第一乳液中尺寸> I. 2 PM的油滴的数量。该组合可包含任何顺序的I型和II型循环，例如I型而后II型，II型而后I型，I型而后II型而后再I型等。在一个实施方式中，所述组合包括20分钟的I型循环然后是一轮II型循环，即将循环过的第一乳液组分从第一预混容器通过第一匀浆器转移到第二预混容器，然后再通过第二勻衆器一次。第一和第二预混容器可以置于惰性气体，例如多至0. 5巴的氮气下。这可以防止乳液成分氧化，其在乳液组分之一是鲨烯时特别有利。这可提供乳液稳定性的增加。如上所述，匀浆器中的最初输入可以是非匀化第一乳液组分的混合物。可通过将各种第一乳液组分单独混合(但在一些实施方式中在该混合前合并多种组分)制备该混合物。例如，如果乳液包括HLB低于10的表面活性剂，那么该表面活性剂可与油在混合前先合并。类似的，如果乳液包括HLB高于10的表面活性剂，那么该表面活性剂可与水性组分在混合前先合并。缓冲盐可与水性组分在混合前先合并，或单独加入。本发明的方法可大规模使用。因此，该方法涉及制备第一乳液，其体积大于I升，例如> 5升，> 10升，> 20升，> 50升，> 100升，^ 250升等。所述第一乳液形成后，可进行微流化，或可储藏直到微流化。在一些实施方式中，特别是使用多重循环的步骤(i)和(ii)时，匀浆器的输入可以是微流化床的输出，因此第一乳液微流化，然后再进行匀浆。微流化
第一乳液形成后，进行微流化以降低其平均油滴尺寸和减少尺寸> I. 2UM的油
滴数量。微流化仪器通过形态固定的通道以高压和高速推动输入流组分来降低油滴平均尺寸。交互作用室入口处的压力(也称作“第一压力”)可以在组分加料至微流化床的至少85%时间内基本恒定(即±15% ;例如±10%、±5%、±2% )，例如组分加料至微流化床的至少87%、至少90%、至少95%，至少99%或100%时间。在一个实施方式中，在乳液加料微流化床的85%的时间内第一压力为1300巴±15% (18kPSI± 15% )，即1100-1500巴(15-21kPSI)。图3显示了两种适合的压力分布。图3A中，压力在至少85%的时间内基本恒定，而在图3B中压力一直保持基本恒定。微流化装置通常包括至少一个强化泵(优选两个泵，可同步)和交互作用室。强化泵理想上是电-液压驱动的，提供高压(例如第一压力)以迫使乳液进入和通过交互作用室。可用强化泵的同步性质提供如上所述的乳液基本恒定压力，意味着乳液滴在微流化过程中都接触基本相同水平的剪切力。使用基本恒定压力的一个优点是可减少微流化装置中的疲劳破坏，从而延长装置寿命。使用基本恒定压力的另一个优点是可改善第二乳液的参数。具体说，可减少存在于第二乳液中尺寸> I. 2 的油滴数量。另外，当使用基本恒定压力时，可减少第二乳液的平均油滴尺寸。减少第二乳液中平均油滴尺寸和尺寸> I. 2 ii M的油滴数量可提高滤过性能。改善的滤过性能可使得过滤过程中内含物损失更少，例如当乳液是MF59时,S烯、吐温80和司盘85的损失。交互作用室可包含多个，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10个等通过乳液的固定形状通道。乳液通过直径为200-250 ii M的输入管线进入交互作用室。乳液进入交互作用室时，分成液流，在高压下加速到高速。当经过通道时，高压产生的力能够减少乳液的油滴尺寸，并减少尺寸> I. 2 ii M的油滴数量。这些力包括剪切力,通过使乳液液流接触通道壁而变形；冲击力，通过高速乳液液流彼此碰撞时产生的碰撞；和空化力，通过液流内空腔的形成和瓦解。交互作用室通常不包括运动部件。其可包括陶瓷(例如氧化铝)或钻石(例如多晶钻石)通道表面。其它表面可用不锈钢制成。交互作用室内多条通道的固定形状可以是“Y”型几何体或“Z”型几何体。在Y型几何体交互作用室中，一条输入乳液流分成第一和第二乳液流，然后重新组合成一条输出乳液流。在重组合前，第一和第二乳液流可以单独分成第一和第二的多条(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10等)子流。当乳液流重新组合时，第一和第二乳液流(或其子流)理想地以基本相对的方向流动(例如第一和第二乳液流或其子流基本在同一平面(±20° )内流动，而第一乳液流的流动方向与第二乳液流的流动方向有180±20°的差异)。当乳液流重新组合时，产生的力能用于减少乳液的油滴尺寸，并减少尺寸> 1.2iiM的油滴数目。在Z型几何体 交互作用室中，乳液流通过多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10等)几乎成直角的拐角(即90° ±20° )。突4显示了具有Z型几何体的交互作用室，其在流动方向中有两个直角拐角。在其绕过拐角流动时，输入的乳液流可以分成多条(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10等)子流，然后重新组合成一条输出乳液流(如图4所示，有4条子流(32))。分裂然后重新组合(31)可在输入和输出之间的任何点发生。当乳液绕过拐角并接触通道壁时，产生的力能够减少乳液的油滴尺寸，并减少尺寸> I. 2 ii M的油滴数目。Z型交互作用室的一个例子是Microfluidics的E230Z交互作用室。在一个实施方式中，乳液流绕过两个基本直角的拐角。在输入乳液流绕过第一个基本直角的拐角时，其分成5条子流。在当子流绕过第二个基本直角的拐角时，其重新组合成一条输出乳液流。在现有技术中，有利的是对类似本发明的水包油乳液使用Y-型交互作用室。然而，我们发现对于水包油乳液使用Z型通道形状交互作用室是有利的，因为这使得第二乳液中存在的尺寸> I. 2 ii M的油滴数目相比Y型形状交互作用室大幅减少。减少第二乳液中尺寸> I. 2 ii M的油滴数目可提供改善的过滤性能。改善的过滤性能可使得过滤过程中的内含物损失更少，例如当乳液是MF59时，鲨烯、吐温80和司盘85的损失。优选的微流化装置在170-2750巴(大约2500psi-40000psi)，例如约345巴、690巴、1380巴、2070巴等的压力下操作。优选的微流化装置在达20升/分钟，例如多至14升/分钟，多至7升/分钟，多至3.5升/分钟的流速下操作。优选的微流化装置具有剪切率超过IxlOfV1,例如彡2.5x106s-1，彡5x10V1,彡IO7JT1等的交互作用室。微流化装置可包括多个平行使用的交互作用室,例如2、3、4、5或更多个,但包括一个交互作用室更为有用。微流化装置可包括含至少一条通道的辅助处理模块(APM)。APM也有助于通过微流化装置的乳液中油滴的平均尺寸降低，虽然主要降低是在交互作用室中发生的。如上所述，乳液组分通过强化泵在第一压力下被引入交互作用室。乳液组分通常可以低于第一压力(例如大气压)的第二压力离开APM。一般通过交互作用室第一和第二压力之间的压力差下降了 80-95% (例如图4中的Pl到P2)，通过辅助处理模块第一和第二压力之间的压力差下降了 5-20%，例如，交互作用室可提供约90%的压降，而APM可提供约10%的压降。如果通过交互作用室的压降和通过辅助处理模块的压降对于整个第一和第二压力之间的压力差可不计，这可能是由于交互作用室和辅助处理模块之间接头的压降有限。APM通常不包括运动部件。其可包括陶瓷(例如氧化铝)或钻石(例如多晶钻石)通道表面。其它表面可由不锈钢制成。APM通常位于交互作用室下游，也可与交互作用室依次排列。在现有技术中，APM通常位于包含Y型通道的交互作用室下游，以抑制空化并从而使Y型室中的流速提高多至30%。另外，在现有技术中APM通常位于包含Z型通道的交互作用室上游，以减少大聚集物的尺寸。在后一种情况下，APM仅使Z型室中的流速减少至多3%。然而，已发现将APM置于包含多条Z型通道的交互作用室下游在本发明中是有利的，因为它能导致第二乳液中平均油滴尺寸和尺寸> I. 2 的油滴数目下降更大。如上所述，减少第二乳液中尺寸> I. 2 PM的油滴数目可提供改善的过滤性能。改善的滤过性能可使得过滤过程中内含物损失更少，例如当水包油乳液是MF59时，鲨烯、吐温80和司盘85的损失。放置Z型交互作用室和下游APM的另一个优点是能够在交互作用室后产生较慢的压力下降。较慢的压力下降能使得广物稳定性提闻，因为减少了包封在乳液中的气体。APM含有至少一条通过乳液的古代形状通道。APM可包含多个，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10个等通过乳液的固定形状通道。APM的通道可以是线性或非线性。合适的非线性通道是“Z”型几何体或“Y”型几何体，其与上面对于交互作用室所述的相同。在一个实施方式中，APM的通道是Z型几何体。当乳液进入APM时，多条Z型通道将其分成液流。与生产商的推荐相反，使用含有多条固定形状通道的APM与含有一条固定形状通 道的APM相比是有利的，因为其能使第二乳液中尺寸> 1.2UM的油滴数目减少更多。如上所述，减少第二乳液中尺寸> I. 2 ii M的油滴数目可提供改善的过滤性能。改善的过滤性能可使得过滤过程中内含物损失更少，例如当水包油乳液是MF59时，鲨烯、吐温80和司盘85的损失。在操作过程中微流化装置产热，其可将乳液温度与第一乳液相比提高15_20°C。因此，有利的是尽可能快地冷却微流化乳液。第二乳液的温度可维持在60°C以下，例如45°C以下。因此，交互作用室的输出和/或APM的输出可以注入冷却机制，例如热交换器或冷却旋管。输出和冷却机制之间的距离应保持尽可能短，以通过减少冷却延迟而缩短总时间。在一个实施方式中，微流化床输出和冷却机制之间的距离为20-30cm。当乳液进行多次微流化步骤时，冷却机制特别有用，用以防止乳液过热。微流化的产物是水包油乳液，第二乳液，其中油滴的平均尺寸为500nm或以下。该平均尺寸特别有用，因为它能促进乳液过滤除菌。特别有用的乳液是其中至少80%的油滴数量具有500nm或以下，例如400nm或以下，300nm或以下，200nm或以下或165nm或以下的乳液。另外，第二乳液中尺寸〉1.21^的油滴数目为51101%11或更少，例如511071111或更少，5xl08/ml或更少，或2xl08/ml或更少。微流化的初始输入可以是第一乳液。然而在一些实施方式中，微流化的乳液再次进行微流化，因此发生多轮微流化。具体说，可将第二乳液组分循环通过某一微流化装置多次(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100等次)形成第二乳液。可将第二乳液组分通过微流化装置循环4-7次，形成第二乳液。第二乳液组分的循环可包括I型循环，所述循环将第二乳液组分在第一乳液容器(可任选地与第一预混容器具有相同性质)和微流化装置之间转移。第二乳液组分的循环可以包含II型循环，所述循环将第二乳液组分从第一乳液容器通过第一微流化装置转移到第二乳液容器(可任选地具有与第一预混容器相同的性质)，然后通过第二微流化装置。第二微流化装置可与第一微流化装置相同。或者第二微流化装置也可与第一微流化装置不同。第一乳液容器可与第一预混容器相同。或者，第一乳液容器可与第二预混容器相同。第二乳液容器可与第一预混容器相同。或者，第二乳液容器可与第二预混容器相同。第一乳液容器可与第一预混容器相同，第二乳液容器可与第二预混容器相同。或者，第一乳液容器可与第二预混容器相同，第二乳液容器可与第一预混容器相同。或者，第一和第二乳液容器可以与第一和第二预混容器不同。第二乳液组分通过第二微流化装置后，例如若要重复II型循环过程，第二乳液组分可转移回第一乳液容器中。II型循环可以进行一次或多次，例如2，3，4，5次等。 II型循环是有利的，因为它确保所有第二乳液组分通过微流化装置至少2次，减少了第二乳液中的平均油滴尺寸和尺寸> I. 2 的油滴数目。微流化过程中可组合使用I型循环和II型循环。该组合可包含任何顺序的I型和II型循环，例如I型而后II型，II型而后I型，I型而后II型而后再I型等。第一和第二乳液容器可以置于惰性气体，例如多至0. 5巴的氮气下。这可以防止乳液成分氧化，其在乳液组分之一是鲨烯时特别有利。这使得乳液稳定性提高。本发明的方法可大规模使用。因此，该方法涉及微流化，其体积大于I升，例如> 5升，> 10 升，> 20 升，> 50 升，> 100 升，^ 250 升等。过滤微流化后，过滤第二乳液。该过滤除去任何可能经受匀化和微流化过程的大油滴。虽然数目很少，这些油滴体积可能很大，它们可用作聚集的成核位点，导致储藏过程中乳液降解。另外，该过滤步骤可实现过滤除菌。适用于过滤除菌的特定过滤膜取决于第二乳液的流体特性和所需过滤程度。滤膜的特征可影响其过滤微流化乳液的适用性。例如，其孔径和表面特征是重要的，尤其在过滤基于鲨烯的乳液时。用于本发明的膜孔径应允许所需液滴通过，而保留不需要的液滴。例如，其应当保留尺寸> I U M的液滴而允许< 200nm的液滴通过。0. 2 y m或0. 22 y m的滤膜是理想的,而且也能实现过滤除菌。可将乳液预先过滤例如通过0.45 iim滤膜。可用已知的双层膜一步实现预过滤和过滤，所述膜包括具有较大孔的第一膜层和具有较小孔的第二膜层。双层滤膜对于本发明特别有用。第一层理想上孔径> 0. 3 ii m，例如0. 3-2 ii m或0. 3-1 y m，或0. 4-0. 8 u m,或0. 5-0. 7iim。优选第一层中的孔径< 0.75 iim。因此，第一层的孔径为例如0. 6 y m或0. 45 u m0第二层理想上孔径小于第一层孔径的75% (理想地小于一半)，例如第一层的孔径的25-70 %或25-49 %，例如30-45 %，如1/3或4/9。因此，第二层的孔径< 0. 3 y m，例如0. 15-0. 2811111或0. 18-0. 24iim，例如0. 2 y m或0. 22 孔径的第二层。在一个实施例中，具有较大孔的第一膜层提供0. 45 y m滤膜，而具有较小孔的第二膜层提供0. 22 y m滤膜。滤膜和/或预过滤膜可以是不对称的。不对称膜是滤膜一侧与另一侧尺寸不同，例如进入面的孔径比离开面的孔径要大。不对称膜的一面可称为“粗糙多孔表面”，而不对称膜的另一面可称为为“精细多孔表面”。在双层滤膜中，两层之一或(理想地)两者都是不对称的。滤膜可以是多孔或均匀的。均匀膜通常是10-200 PM的致密膜。多孔膜具有多孔结构。在一个实施方式中，滤膜是多孔的。在双层滤膜中，两层都可以是多孔的，两层都可以是均匀的，或可以是一层多孔一层均匀。优选的双层滤膜中两层均为多孔。在一个实施方式中，第二乳液预先滤过不对称的亲水多孔膜，然后滤过另一孔小于预过滤膜的不对称亲水多孔膜。这可用双层滤膜。滤膜可在使用前高压灭菌，以确保其无菌。滤膜通常由聚合支撑材料制成，例如PTFE (聚四氟乙烯)、PES (聚醚砜)、PVP (聚乙烯吡咯烷)、PVDF(聚偏二氟乙烯)、尼龙(聚酰胺)、PP(聚丙烯)、纤维素(包括纤维素酯)、PEEK(聚乙醚乙醚酮)、硝基纤维素等。(虽然本发明优选避免使用基于纤维素的滤膜)。这些支撑材料具有不同性质，一些载体本质上是疏水的(例如PTFE)而另一些本质上
是亲水的(例如醋酸纤维素)。然而，可通过处理膜表面来改变这些固有性能。例如，已知通过用其它材料(例如其它聚合物、石墨、硅等)处理以涂覆膜表面来制备亲水化或疏水化膜，例如见参考文献15的2. I节。在双层膜中，两层膜可由不同材料或(理想地)由相同材料制成。用于本发明的理想滤膜具有亲水表面，与参考文献9-12应使用疏水(聚砜)滤膜的教导相反。可用亲水材料，或通过使疏水材料亲水化形成具有亲水表面的滤膜，优选用于本发明的滤膜是亲水聚醚砜膜。已知多种不同方法将疏水PES膜转化成亲水PES膜。通常通过在膜上涂覆亲水聚合物实现。为了使得亲水聚合物永久结合于PES，通常使亲水涂覆层进行交联反应或接枝。参考文献15公开了一种改变具有可官能化链末端的疏水聚合物表面性质的方法，包括使聚合物接触连接接头部分溶液，形成共价连接，然后使反应的疏水聚合物与改性剂溶液接触。参考文献16公开了一种通过直接膜涂覆使PES膜亲水化的方法，包括预先用醇湿润，然后浸入含有亲水单体、多官能单体(交联剂)和聚合引发剂的水溶液中。然后用热或UV引发单体和交联剂的聚合，在膜表面形成交联亲水聚合物涂层。类似的，参考文献17和18公开了通过将PES膜浸入亲水聚合物(聚环氧烷)和至少一种多官能单体(交联剂)的水溶液中，然后聚合单体得到不可提取的亲水涂层来涂覆PES膜。参考文献19描述了通过接枝反应使PES膜亲水化，其中PES膜经历低温氦等离子体处理，然后将亲水性单体N-乙烯-2-吡咯烷(NVP)接枝到膜表面。其它的这种方法见参考文献20-26。在不依赖于涂层的方法中，PES可溶于溶剂，与可溶性亲水添加剂混合，然后用混合溶液成型亲水膜，例如通过沉淀或引发共聚。这种方法见参考文献27-33。例如，参考文献33公开了一种制备亲水带电改性膜的方法，该膜可提取物少，能够快速恢复超纯水电阻率，具有形成的交联互穿聚合物网络结构，通过混合PES、PVP、聚乙二亚胺和脂族二缩水甘油醚制备聚合物溶液，形成溶液薄膜，并沉淀薄膜形成膜。类似的方法公开于文献参考34。可使用杂交方法，其中亲水添加剂在膜形成过程中存在且稍后还作为涂层添加，例如见参考文献35。也可通过低温等离子体处理实现PES膜的亲水化。参考文献36描述了通过低温CO2等离子体处理来亲水改性PES膜。还可通过氧化如参考文献37所述实现PES膜的亲水化。该方法涉及用具有低表面张力的液体预润湿疏水PES膜，使润湿的PES膜接触氧化剂水溶液，然后加热。
还可使用相转化法，如参考文献38所述。可通过用PVP (亲水性)处理PES (疏水性)获得理想的亲水PES膜。发现用PEG (亲水性)代替PVP处理得到容易积垢的亲水PES膜(特别是在用含鲨烯的乳液时)，而且在高压灭菌时不利地释放甲醛。优选双层滤膜具有第一亲水PES膜和第二亲水PES膜。当过滤首先通过双层醋酸纤维素滤膜，然后通过第二双层醋酸纤维素滤膜，其中第一滤膜的较小孔径大于第二滤膜的较大孔，而第二双层滤膜实现过滤除菌时，这种实施方式不是优选的(有时应当被排除)。已知的亲水膜包括Bioassure (来自坤诺公司(Cuno)) ；EverLUX 聚醚砜；STyLUX 聚醚砜(都来自迈斯纳公司(Meissner)) ；Millex GV, Millex HP, Millipak 60， Millipak 200和Durapore CVGLO1TP3膜(来自密理博(Millipore)) ；Fluorodyne EX EDF膜，Supor EAV ；Supor EBV, Supor EKV(都来自颇尔公司(Pall)) ;Sartopore (来自赛多利斯(Sartorius)) ；Sterlitech 的亲水 PES 膜；和 Wolftechnik 的 WFPES PES 膜。过滤过程中，乳液可维持在40 V或以下的温度，例如30°C或以下，以促进无菌过滤成功。一些乳液可能在温度高于40°C时不能通过无菌滤器。优选在产生第二乳液的24小时内，例如在18小时内，12小时内，6小时内，2小时内，30分钟内进行过滤步骤，因为这段时间以后可能第二乳液不能通过无菌滤器而同时不对其造成堵塞，如参考文献39中所述。本发明的方法可大规模使用。因此，该方法涉及过滤，其体积大于I升，例如> 5升，> 10 升，> 20 升，> 50 升，> 100 升，^ 250 升等。最终乳液微流化和过滤的结果是水包油乳液，其中油滴的平均尺寸为220nm以下，例如155±20nm，155±10nm或155±5nm，其中尺寸> I. 2 y M的油滴数目可以为5xl08/ml或以下，例如5x107/ml或以下，5xl06/ml或以下，2xl06/ml或以下,或5xl05/ml或以下。本文所述的乳液的平均油滴尺寸(包括第一和第二乳液)通常不小于50nm。本发明的方法可大规模使用。因此，该方法涉及制备最终乳液，其体积大于I升，例如> 5升，> 10升，> 20升，> 50升，> 100升，^ 250升等。一旦形成水包油乳液，可转移到无菌玻璃瓶内。玻璃瓶的大小可以是5、8、或10升。或者，水包油可以转移到无菌柔性袋(柔性袋)内。柔性袋的大小可以是50、100、或250升。另外，柔性袋可接上一个或多个无菌接头，将柔性袋与系统连接。使用装有无菌接头的柔性袋与玻璃瓶相比是有利的，因为柔性袋比玻璃瓶更大，意味着不需要更换柔性袋来储藏一批中制备的全部乳液。这可为乳液制备提供无菌的密闭系统，从而减少了最终乳液中杂质存在的几率。如果最终乳液用于药物学目的，例如若最终乳液是MF59佐剂，这就特别重要。最终乳液中油的含量(体积％ )优选为2-20%，例如约10%。约5%或约10%的角鲨烯含量特别有用。30-50mg/ml的鲨烯含量(w/v)是有用的，例如35_45mg/ml，36_42mg/ml, 38-40mg/ml 等。最终乳液中表面活性剂的优选量(重量％ )为聚氧乙烯山梨醇酯(例如吐温80)0. 02-2%，特别是约0.5%或1% ;去水山梨醇酯(例如司盘85)0. 02-2%，特别是约0.5%或1% ;辛基或壬基苯氧基聚氧乙醇(例如曲通X 100)0. 001-0. 1%，特别是0. 005-0. 02%;聚氧乙烯醚(例如月桂醇聚醚9)0. 1-20%，优选0. 1_10%，特别是0. 1-1%或约0.5%。4-6mg/ml的聚山梨醇酯80含量(w/v)是有用的,例如4. 1-5. 3mg/ml。4_6mg/ml的去水山梨糖醇三油酸酯含量(w/v)是有用的,例如4. 1-5. 3mg/mlo该方法特定用于制备任何下列水包油乳液 含有鲨烯、聚山梨酯80(吐温80)和去水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)的乳液。该乳液的体积组成可以是约5%角鲨烯、约0. 5%聚山梨酯80和约0. 5%去水山梨糖醇三油酸酯。以重量计，这些含量变为4. 3%鲨烯、0. 5%聚山梨酯80和0. 48%去水山梨糖醇三油酸酯。这种佐剂称为‘MF59’。MF59乳液宜包含柠檬酸根离子，如IOmM柠檬酸钠缓冲液。 包含鲨烯、a -生育酚(理想的是DL- a -生育酚)和聚山梨酯80的乳液。这些乳液可含有(重量计)2-10%鲨烯，2-10% a生育酚和0.3-3%聚山梨酯80，例如4. 3%鲨烯、4. 7% a-生育酚、I. 9%聚山梨酯80。鲨烯生育酚的重量比优选< I (例如0. 90)，因 为这提供了更稳定的乳液。鲨烯和聚山梨酯80的体积比可以约为5 2，或者重量比约为11 5。可通过以下方法制备一种这类乳液将聚山梨酯80溶解于PBS产生2%溶液，然后将90ml该溶液与5g DL- a -生育酚和5ml角鲨烯的混合物混合，然后使该混合物微流体化。得到的乳液可含有如尺寸为100-250nm，优选约180nm的亚微米油滴。 鲨烯、生育酚和曲通去污剂(如曲通X-100)的乳液。所述乳液还可包含3-0-去酰基单磷酰脂质A( ‘3d MPL’)，虽然含3d MPL的乳液在本发明中不是优选的(有时要被排除)。所述乳液可包含磷酸盐缓冲液。 含有鲨烯、聚山梨酯(如聚山梨酯80)、曲通去污剂(如曲通X100)和生育酚(如琥珀酸a-生育酚)的乳液。该乳液可包含这三种组分，其质量比约为75 11 10(如750 u g/ml聚山梨酯80、110 ii g/ml曲通X-100和100 u g/ml琥珀酸a -生育酚)，这些浓度应包括抗原中这些组分的贡献。该乳液也可包含3d-MPL。该乳液也可包含皂苷，如QS21。所述水相可包含磷酸盐缓冲液。 含有鲨烯、水溶剂、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子型表面活性剂(如聚氧乙烯
(12)十六十八醚)和疏水性非离子型表面活性剂(如去水山梨糖醇酯或二缩甘露醇酯，如去水山梨糖醇单油酸酯或‘司盘80’)的乳液。该乳液优选为热可逆的和/或其中至少90%油滴(以体积计)的尺寸小于200nm[40]。该乳液也可含有以下一种或多种物质糖醇；低温保护剂(例如，糖，如十二烷基麦芽苷和/或蔗糖)；和/或烷基聚糖苷。也可包含TLR4激动剂，如化学结构不含糖环的TLR4激动剂[41]。这类乳液可冻干。如上以百分数表达的这些乳液组成的稀释度或浓度可改变(例如以整数形式如2或3倍，或以分数形式例如2/3或3/4)，其中其比例保持不变。例如，2倍浓缩的MF59可包含约10%鲨烯，约1%聚山梨酯80和约1%去水山梨糖醇三油酸酯。可对浓缩形式进行稀释(例如用抗原溶液)，得到所需的终浓度乳液。本发明的乳液理想地储存在2-8V之间。其不应冷冻。理想地，其应避直射光保存。具体地，本发明含鲨烯的乳液和疫苗应当受到保护避免鲨烯的光化学分解。如果储存本发明的乳液，则优选在惰性气体，例如氮气或氩气中储存。疫苗虽然可能将水包油乳液佐剂本身给予患者(如为单独给予患者的抗原提供佐剂效应)，但更常见的是在给药前将佐剂与抗原混合后形成免疫原性组合物，例如疫苗。可以在临用前或者在疫苗生产过程中混合乳液和抗原。本发明的方法可用于这两种情况。因此，本发明方法可包括将乳液与抗原组分混合的加工步骤。或者，还可包括另一将佐剂与抗原组分一起包装到药盒中形成药盒组件的步骤。因此，综上所述，制备混合的疫苗时或制备包含易混合的抗原和佐剂的药盒时，可使用本发明。如果在生产过程中混合，那么所混合的散装抗原和乳液的体积一般大于I升，例如> 5升、> 10升、> 20升、> 50升等。如果在使用时混合，那么所混合的体积一般小于I毫升，例如< 0. 6ml、< 0. 5ml、< 0. 4ml、< 0. 3ml、< 0. 2ml等。在这两种情况下，通常所混合的乳液和抗原溶液的体积基本相等，即基本上为I : I (例如I. I 1-1 1.1，优选I. 05 1-1 I. 05，更优选1.025 1-1 1.025)。然而，在一些实施方式中，可采用过量的乳液或过量的抗原[42]。当使用过量体积的一种组分时，过量通常为至少I. 5 1，例如彡2 I、彡2. 5 I、彡3 I、彡4 I、彡5 I等。
抗原和佐剂包装为药盒中的单独组分时，它们在药盒中物理上相互分离，这种分离可通过多种方式实现。例如，组分可以装在不同的容器，如药瓶中。需要时，可通过(例如)取出一个药瓶的内容物并将其加入另一个药瓶，或者分别取出两个药瓶的内容物并在第三个容器中将它们混合在一起，来混合两个药瓶的内容物。在一种配置中，药盒的一种组分在注射器中，另一种组分在容器如药瓶中。可使用该注射器(例如装有针头的注射器)将其内含物注入小瓶中混合，然后将该混合物抽回注射器中。然后，一般通过新的无菌针头将该注射器中的混合成分给予患者。将一种组分包装到注射器中无需用单独注射器对患者给药。在另一优选配置中，这两种药盒组分一起保存在同一注射器，例如双室注射器(如参考文献43-50等所述)中但各自分开。当注射器运作时(例如给予患者期间)，将这两室中的内容物混合。这种配置在使用时无需单独的混合步骤。不同药盒组件的内容物通常均为液体形式。在一些配置中，组分(一般是抗原组分而非乳液组分)是干燥形式(例如冻干形式)，而另一组分是液体形式。可将这两种组分混合，以再次激活干燥组分，得到给予患者的液体组合物。冻干组分一般装在药瓶中，而非注射器中。干燥组分可包含稳定剂，例如乳糖、蔗糖或甘露醇，及其混合物，如乳糖/蔗糖混合物、蔗糖/甘露醇混合物等。一种可能的配置使用在预填装注射器中的液态乳液组分和药瓶中的冻干抗原组分。如果疫苗还含有乳液和抗原以外的其它组分，那么这些其它组分可包含在这两种药盒组分之一中，或者可以是第三种药盒组分的一部分。适用于本发明混合疫苗或单独药盒组分的容器包括药瓶和一次性注射器。这些容器应无菌。组合物/组分装在药瓶中时，药瓶优选由玻璃或塑料材料制成。在将组合物加入药瓶之前，优选对其进行灭菌。为了避免胶乳过敏患者可能产生的问题，药瓶优选用无胶乳塞子密封，且优选所有包装材料均不含胶乳。在一个实施方式中，药瓶具有丁基橡皮塞。药瓶可包含单一剂量的疫苗/组分，或者可以包含一个以上剂量('多剂量'药瓶)，如10个剂量。在一个实施方式中，药瓶包含10x0. 25ml剂量的乳液。优选的药瓶由无色玻璃制成。药瓶可以有适合的帽(如鲁尔(Luer)锁)，从而预填装注射器可插入该帽，可以将注射器的内容物推入药瓶(如在其中重建冻干物质)，可以将药瓶的内容物吸回注射器中。从药瓶中移出注射器后，可连上针头，将该组合物给予患者。该帽优选位于封口或盖子内侧，从而在封口或盖子移除后才能接触到该帽。将组合物/组分包装到注射器中时，注射器通常不会连接有针头，但可提供单独的针头与注射器组装和使用。优选安全性针头。一般是I-英寸23号、I-英寸25号和5/8-英寸25号针头。可提供有剥离标签的注射器，该标签上可打印有内含物的批号、流感季节和过期日期，以帮助记录保存。注射器的活塞优选带有防脱装置，以防止活塞在吸出时偶然脱出。注射器可以有胶乳橡胶帽和/或活塞。一次性注射器含有单一剂量的疫苗。注射器通常带有顶帽以在连接针头前密封顶端，所述顶帽优选由丁基橡胶制成。如果注射器和针头分开包装，则针头优选装有丁基橡胶护罩。可用缓冲液稀释乳液，然后包装入药品或针筒。常用缓冲剂包括磷酸盐缓冲剂；Tris缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂；或柠檬酸盐缓冲剂。稀释可 降低佐剂组分的浓度，而同时维持其相对比例，例如提供“半强度”佐剂。容器可标注显示半剂量体积，例如以利于递送给儿童。例如，含有0. 5ml剂量的注射器可标有显示0. 25ml体积的标记。采用玻璃容器(如注射器或药瓶)时，优选采用由硼硅酸盐玻璃，而非钠钙玻璃制成的容器。各种抗原均可用于水包油乳液，包括但不限于病毒抗原，如病毒表面蛋白；细菌抗原，如蛋白质和/或糖抗原；真菌抗原；寄生虫抗原；和肿瘤抗原。本发明特别可用于针对以下的疫苗流感病毒、HIV、钩虫、乙肝病毒、单纯疱疹病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒、巨细胞病毒、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、衣原体、SARS冠状病毒、水痘-带状疱疫病毒、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、脑膜炎奈瑟氏菌(NeisseriaMeningitidis)、结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、炭疽杆菌(Bacillusanthracis)、EB病毒、人乳头瘤病毒等。例如 流感病毒抗原。这些抗原可以采取活病毒或者灭活病毒的形式。采用灭活病毒时，该疫苗可包含完整的病毒颗粒、裂解病毒颗粒或纯化的表面抗原(包括血凝素，通常也包括神经氨酸酶)。流感抗原也可以病毒体形式出现。抗原可具有选自下组的任何血凝素亚型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15 和 / 或 H16。疫苗可包括来自一种或多种(例如1、2、3、4或更多种)流感病毒株(包括甲型流感病毒和/或乙型流感病毒)的抗原，例如单价A/H5N1或A/H1N1疫苗或三价A/H1N1+A/H3N2+B疫苗。流感病毒可以是重组株，并可通过逆向遗传学技术获得[例如51-55]。因此，该病毒可包含来自A/PR/8/34病毒(一般是来自A/PR/8/34的6个区段，HA和N区段来自疫苗株，即6 2重组株)的一个或多个RNA区段。可以在鸡蛋(如含胚鸡蛋)或细胞培养物上培养用作抗原来源的病毒。使用细胞培养物时，细胞底物一般是哺乳动物细胞系，如MDCK ；CH0 ；293T ；BHK ；Vero ;MRC_5 ；PER. C6 ;WI_38 ;等。用于培养流感病毒的哺乳动物细胞系优选包括=MDCK细胞[56-59]，衍生自马达二氏(Madin Darby)犬肾；Vero细胞[60-62]，衍生自非洲绿猴肾；*PER.C6细胞[63]，衍生自人胚视网膜母细胞。在哺乳动物细胞系上培养病毒时，该组合物宜不含鸡蛋蛋白质(如卵清蛋白和卵类粘蛋白)和鸡DNA，从而降低变应原性。通常参照血凝素(HA)含量(通常用SRID测定)标准化疫苗的单位剂量。现有的疫苗一般含有约15yg HA/毒株，尽管也可使用更低的剂量，特别是使用佐剂时。分数剂量如1/2 (即7. 5 ii g HA/毒株)、1/4和1/8 [64，65]以及较高剂量(如3x或9x剂量[66，67])已有应用。因此，疫苗可包含每流感毒株0. 1-150 u g HA，优选0. l_50ii g，例如0. 1-20 y g、0. 1-15 u g、0. 1-10 u g、0. 1-7. 5 u g、0. 5-5 y g 等。具体剂量包括例如，每毒株约 15、约 10、约 7. 5、约 5、约 3. 8、约 I. 9、约 I. g 等。 人免疫缺陷病毒,包括HIV-I和HIV-2。该抗原一般是包膜抗原。 乙肝病毒表面抗原。该抗原优选通过重组DNA方法获得，例如在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达后获得。与天然病毒JffisAg不同，重组酵母表达的抗原是非糖基化抗原。它可以是基本呈球形的颗粒形式(平均直径约为20nm)，包括含有磷脂的脂质基质。不像天然HBsAg颗粒，酵母表达的颗粒可能包含磷脂酰肌醇。HBsAg可来自以下任何亚型aywl> ayw2> ayw3> ayw4> ayr、adw2> adw4> adr q-和 adrq+。 钩虫，特别是犬中发现的钩虫(犬钩虫(Ancylostoma caninum))。这种抗原可以是重组Ac-MTP-I (虾红素样金属蛋白酶)和/或天冬氨酸血红蛋白酶(Ac-APR-I)，它可以在杆状病毒/昆虫细胞系统中表达为分泌蛋白[68,69]。 单纯疱疹病毒抗原(HSV)。用于本发明的优选HSV抗原是膜糖蛋白gD。优选使用HSV-2毒株的gD (' gD2'抗原)。该组合物可使用C-末端膜锚定区缺失的gD形式[70]，如包含天然蛋白的氨基酸1-306且C-末端加入天冬酰胺和谷胺酰胺的截短的gD。这种蛋白质形式包括信号肽，信号肽被切割后产生成熟的283个氨基酸的蛋白质。缺失锚定物可将该蛋白制备成可溶形式。 人乳头瘤病毒抗原(HPV)。用于本发明的优选HPV抗原是LI衣壳蛋白，该蛋白可组装形成称为病毒样颗粒(VLP)的结构。可通过在酵母细胞(例如酿酒酵母(S. cerevisiae))或昆虫细胞(例如夜蛾(Spodoptera)细胞，如草地贪夜蛾(S. frugiperda),或果蚬(Drosophila)细胞)中重组表达LI来产生VLP。对于酵母细胞，质粒载体可携带LI基因；对于昆虫细胞，杆状病毒载体可携带LI基因。更优选地，该组合物包含来自HPV-16和HPV-18毒株的L1VLP。已证明这种二价组合非常有效[71]。除了HPV-16和HPV-18毒株外，也可能包含来自HPV-6和HPV-Il毒株的L1VLP。也可能采用致癌性HPV毒株。疫苗可包含20-60 u g/ml (如约40 u g/ml)Ll/HPV毒株。 炭疽抗原。炭疽是由炭疽杆菌(Bacillus anthracis)引起的。合适的炭疽杆菌抗原包含A组分(致死因子(LF)和水肿因子(EF) )，二者共有称为保护性抗原(PA)的B组分。任选地，可使抗原脱毒。其它详情可参见参考文献[72-74]。 金黄色葡萄球菌抗原。已知各种金黄色葡萄球菌抗原。合适的抗原包括荚膜糖(例如5型和/或8型菌株)和蛋白(例如IsdB，Hla等)。荚膜糖抗原理想地与载体蛋白偶联。 肺炎链球菌抗原。已知各种肺炎链球菌抗原。合适的抗原包括荚膜糖(例如来自一种或多种的血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F、和/或23F)和蛋白质(例如肺炎球菌溶血素、脱毒的肺炎球菌溶血素、聚组氨酸三聚体蛋白D(PhtD)等)。荚膜糖抗原理想地与载体蛋白偶联。 癌抗原。R知各种肿瘤特异件抗原。本发明可使用引发针对肺癌、黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌等的免疫治疗性应答的抗原。
抗原溶液通常与乳液，例如以I : I的体积比混合。该混合可以由疫苗厂商在装填前进行，或可在使用时由健康护理工作者进行。药物组合物用本发明方法制备的组合物是药学上可接受的。它们可包含除了乳液和可任选的抗原以外的组分。组合物可含有防腐剂，如硫柳汞或2-苯氧乙醇。然而，疫苗优选应基本无(即小于5 ii g/ml)含汞物质，如不含硫柳汞[75，76]。更优选无汞的疫苗和组分。组合物的pH通常为5. 0-8. 1，更常为6.0-8. 0，例如6. 5-7. 5。因此，本发明方法可包括在包装前调整疫苗PH的步骤。
该组合物优选无菌。该组合物优选无热原，如每剂量含有< 1EU(内毒素单位，标准量度)，优选每剂量< 0. IEU0该组合物优选不含谷蛋白。该组合物可含有一次免疫的物质，或者可含有多次免疫的物质(即‘多剂量’药盒)。多剂量配置优选含有防腐剂。疫苗的给药剂量体积一般为约0. 5ml，但可将一半剂量(即约0. 25ml)给予儿童。治疗方法和所述疫苗给药本发明提供用本发明方法制备的药盒和组合物。根据本发明的方法制备的组合物适合给予人类患者，本发明提供了在患者中产生免疫应答的方法，包括将这种组合物给予患者的步骤。本发明也提供用作医药品的这些药盒和组合物。本发明也提供以下应用⑴抗原的水性制剂；和(ii)按照本发明制备的水包油乳液在制备引起患者免疫应答的药物中的应用。这些方法和应用引起的免疫应答通常包括抗体应答，优选保护性抗体应答。可以各种方式给予该组合物。最优选的免疫途径是肌肉内注射(如注射到上肢或下肢)，但其它可用的途径包括皮下注射、鼻内[77-79]、口服[80]、皮内[80，81]、经皮、透皮[83]等。可用按照本发明制备的疫苗治疗儿童和成年人。患者可以小于I岁、1-5岁、5-15岁、15-55岁或至少55岁。患者可以是老年人(如彡50岁，优选彡65岁)、青年(如< 5岁)、住院患者、健康护理人员、军队服务人员和军人、怀孕妇女、慢性疾病患者、免疫缺陷患者和出国旅行人员。然而所述疫苗不仅适用于这些人群，还可用于更广泛的人群。可在与其它疫苗基本相同的时间(例如在向健康护理专业人员的同一次医疗咨询或就诊期间)，将本发明疫苗给予患者。中间过程本发明还提供了制备水包油乳液的方法，包括微流化第一乳液形成第二乳液，然后过滤第二乳液。第一乳液具有如上所述的特征。本发明还提供了制备水包油乳液的方法，包括过滤第二乳液，即微流化乳液。微流化乳液具有如上所述的特征。本发明还提供了制备疫苗的方法，包括组合乳液和抗原，其中乳液具有上述特征。
具体实施方式
本发明的具体实施方式
包括 一种制备含鲨烯的水包油乳液的方法，包括步骤(i)形成具有第一平均油滴尺寸的第一乳液；(ii)微流化第一乳液形成具有比第一平均油滴尺寸小的第二平均油滴尺寸的第二乳液；和(iii)用具亲水膜过滤第二乳液。 一种制备水包油乳液疫苗的方法，包括步骤(i)形成具有5000nm或以下的第一平均油滴尺寸的第一乳液；(ii)微流化第一乳液形成具有比第一平均油滴尺寸小的第二平均油滴尺寸的第二乳液；和(iii)用亲水膜过滤第二乳液。
一种制备水包油乳液疫苗的方法，包括步骤(i)形成具有第一平均油滴尺寸的第一乳液；(ii)微流化第一乳液形成具有比第一平均油滴尺寸小的第二平均油滴尺寸的第二乳液；和(iii)用亲水聚醚砜膜过滤第二乳液。
一种制备含有鲨烯的水包油乳液的方法，包括步骤(i)用匀浆器形成具有第一平均油滴尺寸的第一乳液，其中第一乳液是通过使第一乳液组分循环通过匀浆器多次形成 的。
一种制备含鲨烯的水包油乳液的方法，该方法包括步骤(b)微流化具有第一平均油滴尺寸的第一乳液，形成具有比第一平均油滴尺寸小的第二平均油滴尺寸的第二乳液，其中第二乳液是通过循环第二乳液组分形成的，所述循环通过将第二乳液组分从第一乳液容器经第一微流化装置转移到第二乳液容器，然后通过第二微流化装置，其中第一和第二微流化装置相同。
一种制备水包油乳液的方法，包括使具有第一平均油滴尺寸的第一乳液通过微流化装置形成第二平均油滴尺寸小于第一平均油滴尺寸的第二乳液；其中微流化装置包括交互作用室，其包含多个Z型通道和包含至少一个通道的辅助处理模块；其中辅助处理模块位于交互作用室下游。
一种制备水包油乳液的方法，包含步骤使具有第一平均油滴尺寸的第一乳液通过微流化装置形成具有小于第一平均油滴尺寸的第二平均油滴尺寸的第二乳液；其中微流化装置包含含多条通道的交互作用室和辅助处理模块。
一种制备水包油乳液的方法，包括步骤使具有第一平均油滴尺寸的第一乳液通过微流化装置形成具有小于第一平均油滴尺寸的第二平均油滴尺寸的第二乳液，其中微流化装置包括交互作用室，其中交互作用室入口处的乳液组分压力在乳液加入微流化床期间至少85 %的时间内基本恒定。
一种制备水包油乳液的方法，包括步骤形成具有第一平均油滴尺寸的第一乳液，其中在惰性气体例如氮气，例如在多至0. 5巴的压力下形成第一乳液。
一种制备水包油乳液的方法，包含步骤使具有第一平均油滴尺寸的第一乳液通过微流化装置形成具有小于第一平均油滴尺寸的第二平均油滴尺寸的第二乳液；其中在惰性气体例如氮气，例如在多至0. 5巴的压力下形成第二乳液。
一种制备水包油乳液疫苗的方法，包括步骤(i)形成具有第一平均油滴尺寸的第一乳液；(ii)微流化第一乳液形成具有比第一平均油滴尺寸小的第二平均油滴尺寸的第二乳液；(iii)过滤第二乳液；(iv)将水包油乳液转移入无菌柔性袋中。概述术语“包含”涵盖“包括”以及“由……组成”，例如，“包含”X的组合物可以仅由X组成或可以包括其它物质，例如X+Y。术语“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含”Y的组合物可能完全不含Y。必要时，术语“基本上”可从本发明定义中省略。与数值X相关的术语“约”是可选的并表示例如x±10%。除非另有说明，包括混合两种或多种组分的步骤的过程不要求任何特定的混合顺序。因此，组分可以任何顺序混合。有三种组分时，可将两种组分相互合并，然后可将合并物再与第三种组分混合等。将动物(具体是牛)材料用于培养细胞时，其应获自未患传染性海绵状脑病(TSE)的来源，具体是未患牛海绵状脑病(BSE)的来源。总之，优选在完全不含动物来源材料的情况下培养细胞。
附图
简要说明图I显示了能用于形成第一乳液的匀浆器的具体例子。图2显示了可用于这种匀浆器的转子和定子的细节。图3显示了同步强化泵模式的两种压力分布。图4显示了 Z型通道交互作用室。图5显示了 I型循环，而图6显示了 II型循环。容器标为“C”，匀浆器标为“H”。显示了流体运动的方向和顺序。在图6中，匀浆器具有两个输入箭头和两个输出箭头，但是实际上匀浆器只有一个输入通道和一个输出通道。
具体实施例方式实施例I根据本发明制备含鲨烯、聚山梨酯80、去水山梨糖醇三油酸酯和柠檬酸钠缓冲液的微流化乳液。微流化乳液直到其平均油滴尺寸为165nm或以下，尺寸> I. 2 的油滴数目为5x107ml或以下。乳液滤过除菌级滤筒(滤器A)，其具有孔径为0. 45 y M的亲水性不对称多孔聚醚砜预过滤膜，和孔径为0. 2 PM的亲水性不对称多孔聚醚砜终过滤膜。过滤中乳液维持在40 ± 5 °C的温度下。上述过程独立运行4次，测定滤过乳液的特征并示于表I。
测试参数实际值一__轮次I 轮次2 轮次3 轮次4
平均油滴尺寸148144144150
尺寸的油滴数目 0.08 X 0.08 X 0.12 x 0.20 x_IO6IO6IO6IO6表I如表I所示，滤器A持续降低乳液中油滴的平均尺寸。另外，滤器A持续使乳液中尺寸> I. 2 i! M的油滴数减少约IO3倍。实施例2
将实施例I中所用的相同微流化乳液滤过不同的除菌级滤筒(滤器B)。滤器B具有亲水性不对称多孔聚醚砜的预滤膜和孔径为0. 2 y M的亲水性不对称多孔聚醚砜终滤膜。在过滤过程中，乳液维持在40±5°C的温度下。该过程独立运行4次，测定滤过乳液的特征并示于表2。
权利要求
1.一种制备含鲨烯的水包油乳液疫苗佐剂的方法，所述方法包括步骤 (i)形成具有第一平均油滴尺寸的第一乳液； (ii)微流化第一乳液形成具有比第一平均油滴尺寸小的第二平均油滴尺寸的第二乳液；和 (iii)用具有较大孔的第一膜层和较小孔的第二膜层的亲水双层滤膜过滤第二乳液，从而提供疫苗佐剂。
2.一种制备含鲨烯的水包油乳液疫苗佐剂的方法，所述方法包括步骤 (i)形成具有5000nm或以下的平均油滴尺寸的第一乳液； (ii)微流化第一乳液形成具有500nm或以下的平均油滴尺寸的第二乳液；和 (iii)用亲水膜过滤第二乳液，从而提供疫苗佐剂。
3.如权利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述亲水膜是亲水聚醚砜膜。
4.一种制备含鲨烯的水包油乳液疫苗佐剂的方法，所述方法包括步骤 (i)形成具有第一平均油滴尺寸的第一乳液； (ii)微流化第一乳液形成具有比第一平均油滴尺寸小的第二平均油滴尺寸的第二乳液；和 (iii)用亲水聚醚砜膜过滤第二乳液，从而提供疫苗佐剂。
5.如权利要求1、3或4所述的方法，其特征在于，所述第一平均油滴尺寸是5000nm或以下。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一乳液中尺寸>1.2i!m的油滴数量为5X10n/ml或以下。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述第二平均油滴尺寸是500nm或以下。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述第二乳液中尺寸>1.2i!m的油滴数量为SxIOltVml或以下。
9.一种制备含鲨烯的水包油乳液疫苗佐剂的方法，所述方法包括步骤 (i)形成具有5000nm或以下的平均油滴尺寸的含鲨烯乳液； (ii)用具有较大孔的第一膜层和较小孔的第二膜层的亲水双层滤膜过滤含鲨烯乳液，从而提供疫苗佐剂。
10.如前述权利中任一项要求所述的方法，其特征在于，过滤后的平均油滴尺寸小于220nm。
11.如前述权利中任一项要求所述的方法，其特征在于，所述过滤后尺寸>I. 2 的油滴数量为5x107ml或以下。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述第二乳液在过滤前预先滤过膜。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述预过滤和过滤步骤用双层滤膜进行。
14.如权利要求12或13所述的方法，其特征在于，所述预过滤膜是不对称和/或多孔的。
15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述滤膜是不对称和/或多孔的。
16.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述滤膜和任选的预过滤膜包含聚合支撑材料。
17.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，(i)所述第一层孔径>0.3 ii m,和/或(ii)所述第二层孔径< 0. 3 ii m。
18.—种制备疫苗组合物的方法，其特征在于，所述方法包括如权利要求1-17中任一项所述制备乳液佐剂，并将乳液佐剂与抗原混合。
19.一种制备疫苗药盒的方法，其特征在于，所述方法包括如权利要求1-17中任一项所述制备乳液佐剂，并将乳液佐剂作为药盒组分与抗原组分一起包装入药盒。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述药盒组分在独立的小瓶中。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述小瓶由硼硅酸盐玻璃制成。
22.如权利要求18-21中任一项所述的方法，其特征在于，所述乳液佐剂是散装佐剂，该方法包括从散装佐剂提取单位剂量用于包装成药盒组分。
23.如权利要求18-22中任一项所述的方法，其特征在于，所述抗原是流感病毒抗原。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述乳液与抗原的组合形成疫苗组合物，其中所述疫苗组合物包含每流感病毒株约15 u g、约10 y g、约7. 5 ii g、约5 ii g、约3. 8 ii g、约3. 75 ii g、约I. 9 ii g或约I. 5 ii g血凝素。
25.如权利要求23或24所述的方法，其特征在于，所述乳液和抗原组合形成疫苗组合物，其中所述疫苗组合物包含硫柳汞或2-苯氧基乙醇防腐剂。
26.具有较大孔的第一膜层和较小孔的第二膜层的亲水双层滤膜在制备水包油乳液疫苗佐剂中的应用。
27.如权利要求26所述的应用，其特征在于，所述第一和/或第二膜层包含亲水聚醚砜。
全文摘要
一种用于制备水包油乳液的改良方法，涉及三个步骤(i)制备初始乳液；(ii)微流化初始乳液以减少其液滴尺寸；和(iii)将微流化乳液滤过亲水膜。乳液可用作疫苗佐剂。
文档编号A61K39/39GK102858322SQ201080056000
公开日2013年1月2日 申请日期2010年12月3日 优先权日2009年12月3日
发明者G·克劳斯, R·埃斯克斯 申请人:诺华有限公司