包含apob100的免疫原性片段的免疫调节组合物、方法和系统的制作方法

包含apob100的免疫原性片段的免疫调节组合物、方法和系统的制作方法
【专利摘要】用于治疗和/或预防人类个体的多种病况的免疫刺激剂、T细胞、组合物、方法和系统。
【专利说明】包含AP0B100的免疫原性片段的免疫调节组合物、方法和系统[0001] 相关串请的交叉引用[0002]本申请要求于2010年11月12日提交的题目为“ Immunomodulatory Compositions,Methods and Systems Comprising Immunogenic Fragments of ApoblOO，，、 案卷号为P700-USP的美国临时申请S/m I/413，378的优先权，该申请全文通过引用并入本文。本申请还涉及于2002年4月5日提交的PCT申请W002/080954，于2011年11月11日提交的题目为 “ Immunomodulatory Methods and Systems for Treatment and/orPrevention of Aneurysms”、案卷号为 P686-PCT 的 PCT 申请 S/N_，并涉及于 2011 年 11月 11 日提交的题目为 “ Immunomodulatory Methods and Systems for Treatment and/or Prevention of Hypertension”、案卷号为 P694-PCT 的 PCT 申请 S/N—，每一篇全文通过引用并入本文。【技术领域】[0003]本发明涉及免疫调节组合物。包含Ap0BlOO的免疫原性片段的方法、系统、组合物、特别是疫苗适用于治疗或预防病况(condition)，比如动脉粥样硬化、动脉瘤、高血压和 /或其关联病况。[0004]发明背景[0005]ΑροΒΙΟΟ的免疫原性片段已与个体的多种病况的治疗和/或预防相关联。[0006]特别地，Ap0BlOO的某些免疫原性片段已与个体的动脉粥样硬化的治疗相关联。
【发明内容】
[0007]本文提供了下述组合物、方法和系统，其允许在若干种实施方式中治疗和/或预防用Ap0BlOO的免疫原性片段治疗的人类个体的多种病况。[0008]根据第一方面，描述了治疗和/或预防人类个体的下述病况的方法，所述病况能通过施用Ap0BlOO的一种或多种免疫原性片段或其免疫原性活性部分而治疗和/或预防。 所述方法包括以小于Img的浓度给个体施用apoB-100的一种或多种免疫原性片段或其免疫原性活性部分。[0009]根据第二方面，描述了下述药物组合物，其包含少于Img的ΑροΒΙΟΟ的一种或多种免疫原性片段或其免疫原性活性部分，和药物上可接受的载剂。[0010]本文所述的组合物、方法和系统可与下述应用联系使用，所述应用中期望在人类个体中治疗下述病况，所述病况能通过施用ΑροΒΙΟΟ的一种或多种免疫原性片段或其免疫原性活性部分治疗和/或预防。[0011]本发明的一种或多种实施方式的细节在下文的附图和说明书中阐明。其他特征、 目标和优势由说明书和附图和权利要求书阐明。[0012]附图简沭[0013]并入本说明书并构成其一部分的附图阐释了本发明的一种或多种实施方式，并与详细的说明书和实施例一起用来解释本发明的原理和实施。[0014]图1显示了根据本文所述的一个实施方式，针对节段性动脉瘤的平均直径检查的节段位置表示图。[0015]图2A和2B显示了根据本文所述的一个实施方式，用或不用p210免疫的小鼠的 Kaplan Meier存活曲线。[0016]图3显示了 p210免疫赋予了动脉粥样硬化防护性作用。⑷较之PBS和cBSA/明矾组，用天然P210免疫导致主动脉动脉粥样硬化显著减少(每组η = 9-10，示出了来自每组的代表性图片)。(B)在主动脉窦斑块中，分别通过皿)祖-2(每组11 = 9-10)和⑶Ilc(每组η = 7-12)免疫反应性评价，Ρ210免疫显著减少了巨噬细胞渗入和DC出现。[0017]图4显示了 ρ210免疫对DC的作用。初次免疫后一周，较之cBSA/明矾组，p210/ cBSA/明矾组中，免疫部位处的(A)⑶llc(+)细胞或(B)⑶I Ic (+)^86(+)细胞显著减少。 每组η = 10。(C)第三次免疫后一周，较之cBSA/明矾组，p210免疫的小鼠淋巴结中具有减少的⑶I Ic (+)^86(+)细胞(每组中η = 5 ;AN0VA后进行多个组比较)。[0018]图5显示了 p210免疫之前和之后对p210的IgM或IgG滴度(titer)。(A)免疫之前，p210IgG滴度是低的并且安乐死时在PBS组中依然是低的；但在cBSA/明矾和p210/ cBSA/明矾组中显著增加，在cBSA/明矾组中具有最高的滴度。⑶在免疫之前p210IgM滴度是低的并在安乐死时显著增加，在小鼠的3个组之间没有差异。6-7周时间点η = 5，25 周时间点η = 9。 [0019]图6显示了体内免疫之后活化的淋巴细胞群。(A)较之PBS或cBSA/明矾组，ρ210/ cBSA/明矾组中，淋巴结中的⑶8(+)⑶25(+)T-细胞群显著较高；(B)在三个组之间，淋巴结中的⑶4 (+)⑶25 (+) T-细胞没有差异。(C)在3个组之间，p210/cBSA/明矾组中有显著更大的脾脏 CD8 (+) CD25 (+) IL-10 (+) T-细胞群；(D)脾脏 CD8 (+) CD25 (+) IL12 (+) T-细胞在 3 个组之间没有差异。(E) cBSA/明矾组中，脾脏CD4 (+) CD25 (+) IL-10 (+) T-细胞群显著增加， 但被p210/cBSA/明矾免疫显著减弱；(F)脾脏CD4(+)CD25(+)IL12(+)T-细胞在3个组之间没有差异。㈧和⑶的每组中η = 9-10 ； (C)、⑶、(E)和(F)的每组中η = 5。[0020]图7显示了来自ρ210免疫的供体的⑶8 (+) T-细胞的过继转移重演 (recapitulate) 了 p210免疫的动脉粥样硬化防护性作用，而B-细胞或CD4 (+) CD25 (+) T-细胞的转移则没有。(A)较之来自其他2个组的⑶8(+)T-细胞的受者小鼠，来自p210/ cBSA/明矾免疫的供体的CD8(+)T-细胞的受者小鼠发展了显著更小的动脉粥样硬化病灶 (每组的η = 9-10)。⑶较之来自PBS或cBSA/明矾组的B-细胞的受者小鼠，来自p210/ cBSA/明矾供体的B-细胞的过继转移未减少动脉粥样硬化(每组η = 9)。2种不同剂量 (C.1 X IO5细胞/小鼠或D.3 X IO5细胞/小鼠)的CD4 (+) CD25 (+) T-细胞的受者小鼠(每组η = 9-13)未再现ρ210免疫的动脉粥样硬化减少作用。[0021]图8显示了来自ρ210免疫的小鼠的⑶8 (+) T细胞提高的针对树突细胞的体外细胞溶解活性。较之来自PBS或BSA/明矾组的那些，来自ρ210免疫的小鼠的⑶8(+)Τ-细胞显著具有更高的针对树突状细胞的细胞溶解活性。重复实验4次，每次使用从每组的5只小鼠合并得到的CD8(+)T-细胞。每次都一式两份或一式三份进行，每组中总计共11个数据点。[0022]图9显示了，较之来自PBS或cBSA/明矾组的那些，来自p210免疫的小鼠的⑶8 (+)T-细胞含有更高水平的粒酶B ;而穿孔素水平没有差异。[0023]图10显示了 p210免疫后针对KLH或TNP的IgG滴度。较之接受PBS或cBSA/明矾的小鼠，如通过IgG抗体滴度评价的，用p210的在先免疫不会影响随后的(A)T-细胞依赖型(KLH，每组η = 3-6)或(B) T-细胞非依赖型(ΤΝΡ，每组η = 4-5)免疫的效力。[0024]图11显示了根据本文所述的一个实施方式，多组小鼠中ρ210免疫对平均血压的作用。[0025]图12Α和12Β显示了根据本文所述的实施方式，多组小鼠中ρ210免疫对心率和平均血压的作用。[0026]图13显示了用或不用根据本文所述的一种实施方式的ρ210免疫的小鼠的Kaplan Meier存活曲线。[0027]图14显示了根据本文所述的一种实施方式，apoE-/-小鼠中对p210的抗体应答。[0028]图15显示了通过⑶25+细胞耗尽消除了 p210-免疫⑶8+T细胞的细胞溶解活性。 检验培养基中缺失血脂也消除了特异性针对P210的溶解活性。[0029]图16显示了根据本文所述的一种实施方式，DC对FITC-标记的p210的内吞作用。[0030]图17显示了根据本文所述的一种实施方式，如增加的活化的⑶25+细胞所示，DC 将肽p210体外呈递至⑶8+⑶25—T细胞。[0031]图18显示了根据本文所述的一种实施方式，在FITC+细胞上门控的⑶8+溶解活性。来用下述DC进行p210-接种的小鼠的CD8+T细胞的p210_特异性溶解活性，所述DC 载有用FITC-标记的p210。[0032]发明详沭[0033]本文描述了允许在若干种实施方式中治疗和/或预防人类个体的多种病况的方法和系统。[0034]本文中使用的术语“治疗”(动词形式或名词形式)表示下述任何行为，所述行为是医疗上或手术上对病况的医疗护理的一部分，或在医疗上或手术上对病况进行处理。本文中使用的术语“预防”(动词形式或名词形式)表示下述任何行为，所述行为减少个体中的来自病况的死亡率或发病率负担。这在一级、二级和三级预防水平下发生，其中:a) —级预防避免疾病发展；b) 二级预防行为的目标在于早期疾病治疗，从而增加干预机会，以预防疾病进展和症状出现；和c)三级预防，通过恢复功能并减少疾病相关的并发症来减少已确定的疾病的负面影响。[0035]本文中使用的术语“病况”(condition)表示与完整的身体、精神和可能的社会健康状态(well-being)关联的与个体的身体状况(总体上或其一个或多个部分)不一致的个体身体的身体状况(总体上或其一个或多个部分)。本文描述的病况包括但不限于病症 (disorder)和疾病(disease),其中术语“病症”表示与身体或任何其部分的功能异常关联的活个体的病况，术语“疾病”表示活个体的下述病况，所述病况损害身体或任何其部分的正常功能，并典型地通过有区别的体征和症状被表征。示例性的病况包括但不限于损伤、失能、病症(包括精神和身体病症)、综合征、感染、个体的反常行为和个体身体或其部分的结构和功能的非典型性变化。[0036]在一些实施方式中，通过给人类个体施用有效量的ΑροΒΙΟΟ的一种或多种免疫原性片段或其免疫原性活性部分，可提供多种病况的治疗和/或预防，其中所述有效量少于Img0[0037]本文中使用的术语“施用(administer) ”或“施用(administering) ”或“施用 (administration) ”表示以任何方式给个体提供物质的任何方法,所述方式包括但不限于本文讨论的那些。[0038]本文中使用的术语“个体”(单数或复数形式)表示单个生物体，比如高等动物和尤其是脊椎动物(比如哺乳动物)，更尤其是人类。在一些实施方式中，先前已基于通常与增加的动脉瘤风险相关联的病况(例如，较高的血压、动脉粥样硬化)的检测将个体鉴定为具有增加的动脉瘤风险。在一些实施方式中，个体未被鉴定为有增加的动脉瘤风险。在一些实施方式中，未对个体的动脉瘤风险进行研究。[0039]本文中使用的术语“免疫原性片段”或“抗原片段”表示能产生免疫应答的任何长度的多肽的一部分，比如抗原。抗原是被免疫系统识别的分子。ΑροΒΙΟΟ的抗原片段因此是呈现抗原性质(例如，特异性的体液或细胞应答)的ApoB-1OO的一部分。可用可被技术人员鉴定的技术和程序来检测片段或其他分子产生免疫应答、特别是细胞和/或体液应答的能力。[0040]在本发明的意义上，术语片段不仅包括来自ΑροΒΙΟΟ的任何长度的片段，还包括通过遗传重组或化学合成产生的肽。在本发明的意义上，术语“免疫原性片段”还包括任何片段的衍生物，比如氧化衍生物和/或用MDA或铜处理的肽，其保持了原片段的可检测的抗原性质。[0041]本文中使用的关于第一肽(例如，免疫原性片段)的术语“衍生物”，表示结构上与第一多肽相关并通过下述修饰源自第一多肽同时保留第一肽功能性质的第二肽，所述修饰引入不在第一肽中存在的特性。因此，通过对与原肽或其部分不具有的其他功能可能关联或不关联的氨基酸序列进行修饰，免疫原性片段或其任何部分(例如其表位)的衍生肽通常与原免疫原性片段或其部分不同。但是免疫原性片段或其任何部分的衍生肽保留了本文描述的与免疫原性片段或其部分有关的一种或多种免疫原性活性。使用比如已针对免疫原性片段描述的那些方法和系统和对技术人员而言可鉴定的其他方法和系统，可检验抗原性质。典型地，免疫原性片段的衍生物包含免疫原性片段的至少一种表位。[0042]在本发明的意义上术语“免疫原性活性部分”表示可引起特异性免疫应答的参照抗原的任何部分。示例性的免疫原性活性部分是包含在免疫原性片段内的5个或更多个残基形成的表位。在一些实施方式中，一个片段内的表位可重叠。[0043]可通过重组技术(比如与亲和标记物或表位标记物的融合)、游离的或与载体蛋白轭合的寡肽的化学合成、或本领域已知表达ApoB-1OO肽的任何其他方法，来表达免疫原性片段。[0044]ΑροΒΙΟΟ的示例性的片段是下述肽，每一种肽包含如在实施例部分中更详细描述的在序列表中作为SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:302列出的序列之一。适于鉴定在本发明的意义上的免疫原性片段的方法和系统描述在W002/080954中，这里通过引用并入该文献。 其他方法在实施例部分中示出(见，例如实施例1)。本文中使用的术语“蛋白质”或“多肽” 或“肽”表示由两种或多种氨基酸单体和/或其类似物组成的有机聚合物。术语“多肽”包括任何长度的氨基酸聚合物(包括全长的蛋白质和肽 )，以及其类似物和片段。三个或更多个氨基酸的多肽也被称为寡肽。本文中使用的术语“氨基酸”、“氨基酸单体”或“氨基酸残基”是指天然存在的二十种氨基酸之任何，包括具有非天然侧链的合成氨基酸并包括D和L 两种光学异构体。术语“氨基酸类似物”是指其中一个或多个个别原子已用不同的原子、同位素或不同的功能基团替代的氨基酸，但所述氨基酸在其他方面与其天然氨基酸类似物是等同的。在一些实施方式中，ΑροΒΙΟΟ的一种或多种免疫原性片段与动脉粥样硬化减少相关联。[0045]鉴定与动脉粥样硬化减少关联的分子的方法可被技术人员鉴定，并且所述包括描述于W002/080954(其全文通过引用并入本文)中的示例性程序。特别地,可使用可被技术人员鉴定的程序，在以合适量施用分子后的动物模型中测试分子减少动脉粥样硬化的能力。例如，如在实施例部分中阐释的，皮下施用本文所述的分子之后，可在小鼠中测试分子影响动脉粥样硬化的能力。阅读本发明后，技术人员将能鉴定其他程序、施用时间表和剂量。[0046]因此，在示例性实施方式中，可如下鉴定出与动脉粥样硬化减少关联的免疫原性分子:鉴定能在感兴趣的个体中提供细胞和/或体液应答的候选免疫原性分子；并测试能减少动脉粥样硬化的候选免疫原性分子，以选择与动脉粥样硬化减少相关联的候选免疫原性分子。[0047]特别地，在一些实施方式中，ΑροΒΙΟΟ的免疫原性片段是产生与个体中的或动物模型中的动脉粥样硬化减少相关联的免疫应答的免疫原性片段。在这些实施方式中的一些中，动脉粥样硬化减少的百分比为至少约20%或至少约30%，从约40%至约60%或从约 50%至约 80%。[0048]在一些实施方式中，免疫原性片段包含下述肽的至少一种，所述每一种肽包含 pi (SEQ ID N0:l)、p2(SEQ ID NO:2)、pll (SEQ ID NO:11)、p25 (SEQ ID NO:25)、p45 (SEQ ID NO:45)、p74(SEQ ID NO:74)、p99 (SEQ ID NO:99)、pl00(SEQ ID NO: 100)、pl02 (SEQ ID NO:102)、pl03 (SEQ ID NO:103)、pl05 (SEQ ID NO:105)、pl29 (SEQ ID NO:129)、pl43 (SEQ ID NO:143)、pl48(SEQ ID NO:148)、p210(SEQ ID NO:210)或p301(SEQ ID NO:301)。[0049]在一种实施方式中，一种或多种免疫原性片段包含一种或多种肽，其中每一种肽包含 p2(SEQ ID NO:2)、pll (SEQ ID NO:11)、p45 (SEQ ID NO:45)、p74 (SEQ ID NO:74)、 pl02(SEQ ID NO:102)、pl48 (SEQ ID NO:148)或 p210(SEQ ID NO:210)。[0050]在一种实施方式中，一种或多种免疫原性片段包含两种肽，其中每一种肽包含 pl43(SEQ ID NO:143)或p210 (SEQ ID NO:210)。在一种实施方式中，与动脉粥样硬化减少相关联的一种或多种免疫原性片段包含三种肽，其中每一种肽包含pll (SEQ ID NO:11), p25(SEQ ID NO:25)或p74(SEQ ID NO:74)之一。在一种实施方式中，与动脉粥样硬化减少相关联的一种或多种免疫原性片段包含五种肽，其中每一种肽包含p99 (SEQ ID NO:99)、 pl00(SEQ ID NO:100)、pl02 (SEQ ID NO:102)、pl03 (SEQ ID NO:103)和pl05(SEQ ID NO: 105)之一。[0051]在一种实施方式中，一种或多种免疫原性片段包含一种或多种肽，其中每一种肽包含 p2(SEQ ID NO:2)、p45(SEQ ID NO:45)、p74 (SEQ ID NO:74)、pl02 (SEQ ID NO:102) 或p210(SEQ ID NO:210)。[0052]在一种实施方式中， 一种或多种免疫原性片段包含下述肽，所述肽包含人类 apoB-100 的氨基酸 16-35 (p2 ；SEQ ID NO:2)。[0053]在一种实施方式中，一种或多种免疫原性片段包含下述肽，所述肽包含人类 apoB-100 的氨基酸 661-680 (p45 ；SEQ ID NO:45)。[0054]在一种实施方式中，一种或多种免疫原性片段包含下述肽，所述肽包含人类 apoB-100 的氨基酸 3136-3155 (P210 ;SEQ ID NO:210)。[0055]在一种实施方式中，一种或多种免疫原性片段包含下述肽，所述肽包含人类 apoB-100 的氨基酸 4502-4521 (P301 ；SEQ ID NO:301)。[0056]在一种实施方式中，一种或多种免疫原性片段包含下述肽，所述肽包含人类 apoB-100 的氨基酸 1-20 (PI ；SEQ ID NO:1)。[0057]显示上述肽与动脉粥样硬化减少相关联的示例性数据在本发明的实施例5和国际申请W002/080954中示出，该文献全文通过引用并入(特别见表1、表2、表A和表B)。特别地，对于这些肽中的一些或其组合而言，已检测到64.6% (pl43和p210) ,59.6% (pll、p25 和 ρ74)、56.8% (ρ129、ρ148 和 ρ167)，ρ67.7(ρ2)、57.9% (ρ210) ,55.2% (ρ301) ,47.4% (ρ45),31% (ρ?)的减少百分比(见通过引用全文并入本文的W0/02080954，特别见表B)。[0058]技术人员可使用电子(in silico)和/或体外方法，鉴定包含本文所述序列之任一的免疫原性肽或这些肽的免疫原性活性部分。例如，电子方法可用来鉴定基于本文所述序列任一的所述表位或免疫原性肽之任一。参考例如文献[44]至[51]，其每一篇全文通过引用并入本文。[0059]这些文献描述了各种算法，比如Tepitope (Radrizzani等2000)、 Adept (Maksuytov 等 1993)、抗原指数(antigenic index) (Jameson 等 1988)和其他可用来鉴定包含所述序列或任何有关表位的免疫原性分子的算法。[0060]可被技术人员用来证实电子数据和/或鉴定包含本文所述序列之任一或这些序列的免疫原性活性部分的免疫活性分子的、适于单独使用或连同电子鉴定一起使用的其他体外和/或体内测试和实验室程序(例如ELISA、抗原-特异性T细胞增殖检验、ELISP0T、 抗体测量)是可以被技术人员鉴定的。[0061]因此，在示例性实施方式中，可通过对本文所述的序列之任一进行电子分析来鉴定候选肽、候选活性部分和/或候选衍生物，和通过对候选肽、候选活性部分和/或候选衍生物进行体外和/或体内测试来鉴定免疫原性肽、免疫原性活性部分和/或衍生物，来鉴定本文所述的免疫原性肽、其免疫原性活性部分以及其衍生物。特别地，可用适于鉴定分子或其部分的免疫原性的算法，通过分析候选序列，进行电子分析。类似地，体外和/或体内测试包括直接鉴定候选肽、候选活性部分和/或衍生物的免疫原性以及这些分子对动脉瘤的作用(特别是关于形成或衰退)的方法。阅读本发明后，技术人员可鉴定合适的方法和技术。[0062]在若干种实施方式中，预期免疫原性肽、其活性部分及其衍生物包括至少约5个氨基酸的序列，和如W002/080954中所示的表位的典型长度一致，所述文献其全文通过引用并入本文。[0063]可用本文所述的免疫原性片段或其免疫原性活性部分治疗的其他病况包括动脉瘤和高血压。[0064]本文中使用的术语“动脉瘤”表示血管或其部分的局部被血液填充的扩张症 (dilation)。特别地，动脉瘤可以是由于血管壁薄弱而导致动脉的一部分异常加宽或气球样变(ballooning)，并且可在体内的任何脉管系统中发生。动脉瘤可以是“真的(true)”， 其中血管内层凸出到血管外层外部；或者可以是“假的(false)”，其是动脉或静脉的渗漏的血液的收集处。动脉瘤通常，但不限于在脑基部动脉中或携带来自心脏左心室的血液的主要动脉中的主动脉处发生。特别地，对主动脉而言，动脉瘤可在主动脉的不同节段处发生，所述节段包括但不限于弓的始端(beginning of the arch)、弓的末端(the end of the arch)、顶点(the apex)、在 3 和 5 节段之间(between segments 3 and 5)、肾上节段(the supra renal segment)、肾下节段(the inffa renal segment)、权前(before bifurcation)和肾动脉之间(between the renal artery)。动脉瘤的症状包括疼痛、外围栓塞、出血和本领域技术人员可鉴定的其他症状。[0065]在一种实施方式中，用本文所述的一种或多种免疫原性分子的免疫降低了实验中的主动脉的动脉瘤破裂的发生率(见实施例2和11)。[0066]在一种实施方式中，用本文描述的一种或多种免疫原性分子的免疫减少了主动脉动脉瘤节段形成。特别地，在这些实施方式的一些中，动脉瘤减少可在主动脉的不同节段处发生，所述节段包括但不限于弓的始端、弓的末端、顶点、在3和5节段之间、肾上节段、肾下节段、杈前和肾动脉之间(见，例如实施例3)。较之对照测量值，免疫后预期动脉瘤减少至少约20 %，特别地，约20 % -80 %。[0067]在一种实施方式中，用本文描述的一种或多种免疫原性分子的免疫降低了与主动脉动脉瘤破裂相关联的死亡率(见，例如实施例4和11)。[0068]在一种实施方式中，用本文描述的一种或多种免疫原性分子的免疫与高血压降低相关联。[0069]本文中使用的术语“高血压”是指高的血压。特别地，高血压(HTN)或高的血压是其中全身动脉血压被提高的慢性医学病况。高血压与低血压相反。高血压被分为原发性 (本质性)或继发性的。约90-95%的案例被称为“原发性高血压”，是指无法找到医学原因的高的血压。剩下的5-10%的案例(继发性高血压)由影响肾、动脉、心脏或内分泌系统的其他病况引起。[0070]在一种实施方式中，用一种或多种本文所述的免疫原性分子进行的免疫减少血压的发生率(例如实施例10和11)。[0071]当与对照测量值相比较时，免疫后预期血压降低至少约10%，特别地，预期从约 10%降至由医师基于病况和待免疫的个体而测定的量(例如实施例10和11)。[0072]本文中使用的术语“有效量”意欲描述诱导抗原特异性免疫应答的抗原(例如 P210)的量。[0073]本文所述的治疗和/或预防病况的`免疫原性片段和一种或多种免疫原性分子的有效量取决于其中进行活化的个体，并且阅读本发明后，可被技术人员鉴定。例如在一种实施方式中，可用从约100 μ g到少于约1000 μ g的有效量的免疫原性片段或其免疫原性活性部分，在小鼠中实现期望的作用。[0074]现已出乎意料地发现，就其中将ΑροΒΙΟΟ的一种或多种免疫原性片段(包括其任何衍生物，见相关的W002/080954，于2011年11月11日提交的题目为“ Immunomodulatory Methods and Systems for Treatment and/or Prevention of Aneurysms，，、案卷号为 P686-PCT的PCT中请S/N_，以及于2011年11月11日提交的题目为“ ImmunomodulatoryMethods and Systems for Treatment and/or Prevention of Hypertension，，、案卷号为P694-PCT的PCT申请S/N_，每一篇全文通过引用并入本文)或其免疫原性部分施用给人类的所有应用而言，用与在小鼠中使用的浓度类似的浓度治疗人类个体是特别有效的。[0075]在一种实施方式中，用于治疗或预防的有效量可为约IOOyg或更多。特别地，预期用约IOOyg治疗来预防人类的动脉瘤破裂(见，例如实施例2)。[0076]取决于如在本发明中阐释的期望的作用，在一些实施方式中可使用更大的浓度。 例如，在其中期望治疗病况的实施方式中，预期用250μ g或更多，特别地用约SOOyg的有效量进行治疗。在另一实施方式中，预期治疗病况的有效量为250 μ g或500 μ g或更高范围内的量也预期是有效的，这也取决于影响个体中分子的药理学活性的其他因素。[0077]根据相同的数据，可用从约0.1至约IOOmg的有效量的免疫原性片段或其免疫原性活性部分在人类中进行病况的治疗或预防。[0078]特别地，预期有效量取决于下述因素而变化:针对每种具体疫苗利用的肽的数目和组合，和被治疗的个体的具体特征和病况(例如免疫系统、膳食和总体健康和可被技术人员鉴定的其他因素)。更特别地，取决于多种因素，比如个体的重量、年龄、性别以及可被技术人员鉴定的其他因素，预期在所定义的范围内的更低或更高的量对个体是有效的。[0079]有从在动物中有效的剂量推断人类等效剂量(HED)的若干公认的方法。一种流行的方法是转化每份体重的剂量，另一种是使用考虑体表面积的异速生长转换(allometric conversion)。这些方法对于存在典型的S型剂量-应答关系的小分子而言是最可靠的。用于免疫调节疗法而言，剂量-应答关系是非典型的并且通常是不可预知的。动物和人类免疫系统的差异(见附件)而使这种状况进一步复杂化。另外，在人类中会起作用的剂量不需要是在动物中起作用的剂量的“η”多倍。其可以是相同的或甚至更少的。有一些最近已成为可用的电子(EpiVax)和体外(Vax Design, Probiogen)工具,其可用来更准确地预测什么样的配方/剂量将会和将不会对人类起作用。[0080]也预期有效量取决于下述因素而变化:针对每种具体疫苗利用的肽的数目和组合，和被治疗的个体的具体特征和病况(例如免疫系统、膳食和总体健康和可被技术人员鉴定的其他因素)。更特别地，取决于多种因素，比如个体的重量、年龄、性别以及可被技术人员鉴定的其他因素，预期在所定义的范围内的更低或更高的量对个体是有效的。在一些实施方式中，本文所述的免疫原性肽或相关的免疫原性活性部分可与适于影响并特别地提高肽或其活性部分的免疫原性的佐剂或其他载体组合施用。特别地，在一些实施方式中，根据对技术人员而言可鉴定的程序，免疫原性肽或其活性部分可与佐剂或载体轭合。合适的载体包括BSA，特别是阳离子化的BSA，铝盐，比如磷酸铝和氢氧化铝和其他可被技术人员鉴定的载体。[0081]在一些实施方式中，本文所述的免疫原性分子可以以如下的免疫原性分子:载体:铝的重量与重量比率施用:约1: 2: 35、1: 2: 20.6、1: 2: 7.7,1: 2: 3.3、1:1: 13.8。特别地，在一些实施方式中，可提供这样的比率，其中肽的数目与每一载体分子轭合，同时最小化铝(佐剂)的量。特别地在一种实施方式中，可提供导致高至2.7mg 轭合物/mL的浓度的比率。
[0082]免疫途径可取决于本文描述的免疫目的而改变。例如，小鼠中成功的动脉瘤预防和治疗通过免疫的皮下施用途径进行(见实施例2、3和4)。触发的免疫应答类型很大程度上是由免疫途径决定的。可使用各种途径，包括皮下的、肠胃外的和全身性的，以及其他。特别地，气管和肠的粘膜衬里含有淋巴组织，所述淋巴组织当暴露于抗原时，引起抗炎性的、 免疫抑制的应答。当通过鼻腔或口腔途径进行抗原暴露时，呼吸和肠粘膜的不同的免疫特性导致部分不同的防护性免疫类型。[0083]在一些实施方式中，可根据考虑到个体的适应性免疫系统所需的时间量而设计的施用时间表，来施用本文所述的免疫原性分子，以发动对免疫原的第一次暴露的应答。典型地，应答被预期在暴露后2-3周达到平台期(plateau)。随后的暴露通常引起更为快速的应答。在各种实施方式中，随后的时间表和施用方式可遵循:(I)单次施用，(2)间隔2-3周的两次施用，⑶三次每周一次的施用，⑷以每3周I次的时间表进行高至6次施用。通过下述方式施用疫苗:(I)皮下注射；(2)腹膜内注射；(3)鼻腔装置；(4)皮下输注。 [0084]特别地，在一种实施方式中，施用一种或多种免疫原性片段或其免疫原性活性部分可通过皮下或肌肉进行。[0085]在一些实施方式中公开了药物组合物，其含有与一种或多种相容的药物上可接受的载剂组合的，特别是与药物上可接受的稀释剂或赋形剂组合的，本文描述的至少一种免疫原性片段、其活性部分。在这些药物组合物中，本文描述的免疫原性片段、其活性部分可作为活性成分被施用，用于治疗或预防个体的病况。[0086]本文中使用的术语“赋形剂”表示用作药物活性成分的载体的非活性物质。本文公开的用于药物组合物的合适的赋形剂包括增强个体身体吸收本文描述的免疫原性片段、 其活性部分的能力的任何物质。合适的赋形剂还包括可用来增大含有本文所述的免疫原性片段、其活性部分的配方量以允许便利和准确的剂量的任何物质。除了它们在单剂量数量中的用途以外，赋形剂可在制造过程中使用，以帮助处理本文描述的免疫原性片段、其活性部分。取决于施用的途径和药物形式，可使用不同的赋形剂。示例性的赋形剂包括但不限于抗粘着剂、粘合剂、涂覆崩解剂、填充剂、香料(比如甜味剂)和颜料、助流剂、润滑剂、防腐剂、吸着剂。[0087]本文中使用的术语“稀释剂”表示用于稀释或携带组合物的活性成分的稀释试剂。 合适的稀释剂包括可降低药物制剂的粘性的任何物质。[0088]在一些实施方式中，药物组合物可包括(I)单独施用的本文描述的肽或其他免疫原性分子；(2)本文所述的肽或其他免疫原性分子+ (—种或多种)载体；(3)本文所述的肽或其他免疫原性分子+佐剂；(4)本文所述的肽或其他免疫原性分子+载体+佐剂。特别地，用于示例性组合物⑴至⑷的每一种的载体可分别包括:(l)cBSA、(2)rHSA、(3)KLH,(4)霍乱毒素B亚基，其每一种可以是基于矿物质盐的。本领域技术人员知道的其他载体被预期是合适的，并将被技术人员鉴定出。这些佐剂的例子包括具有Th2作用的佐剂、具有佐剂性质的载体，例如，白喉类毒素，和能作为载体起作用的佐剂，例如，水包油乳液。在一些实施方式中，对药物组合物而言必要的、和在某些情况下充分的组件是免疫原性肽。如技术人员所已知的，可选择组合物的其他组件来调控本文所述的肽或其他免疫原性分子的免疫效果。[0089]在一种实施方式中，本文描述的免疫原性分子的任何一种可用来特异性活化T细胞，特别是CD8 (+) T细胞，所述T细胞可使用ΑροΒΙΟΟ的一种或多种免疫原性片段或其免疫原性活性部分来活化。[0090]本文中使用的术语“T细胞”表示T淋巴细胞，属于称为淋巴细胞的白细胞的一个组，并参与体液免疫或细胞-介导的免疫。通过其细胞表面上特殊标记物比如T细胞受体 (TCR)的存在，T细胞可与其他淋巴细胞类型比如B细胞和天然杀伤细胞(NK细胞)区分开。鉴定T细胞的其他标记物包括CDla、CD3和技术人员所知道的可能与T细胞状态和/ 或功能关联的其他标记物。
[0091]术语“⑶8 (+) T细胞”表示在其表面上表达⑶8糖蛋白的T细胞，其中⑶8 (分化簇 8)糖蛋白是跨膜糖蛋白，其作为T细胞受体(TCR)的辅助受体发挥作用。类似于TCR，CD8 与主要的组织相容性复合体(MHC)分子结合，但对I类MHC蛋白是特异性的。示例性的CD8T 细胞包括细胞毒性记忆⑶8T细胞、调控⑶8T细胞、细胞毒性效应器(effector)⑶8T-细胞和技术人员可鉴定的其他细胞。该蛋白质存在两种同种型 α和β，每一种由不同的基因所编码。在人类中，两种基因都位于染色体2上的2ρ12位置。[0092]本文中使用的术语“活化的”和“活化”表示下述过程，通过所述过程，在导致T细胞在免疫系统内具有预先指定的免疫作用(例如细胞毒性)的条件下，T细胞与呈递特异性抗原的抗原呈递细胞相互作用一段时间。术语“抗原-呈递细胞”(antigen-presenting cell,APC)表示在其表面上显示(display)具有主要组织相容性复合体(MHC)的抗原复合物的细胞。T-细胞使用其T-细胞受体(TCR)识别该复合物。示例性的APC包括树突细胞 (DC)，所述树突细胞已知在联系先天免疫和获得性免疫中发挥重要作用，见参考文献(3， 4)，且这两种免疫应答都参与动脉粥样硬化形成，见参考文献(5)，(6)。[0093]T细胞、特别是⑶8 (+) T细胞的检测，可通过单独的标记物(比如⑶8)或与TCR和可由技术人员鉴定的其他标记物组合的标记物(比如CD8)的检测来进行。可使用适于检测表面标记物的方法和技术，通过检测T细胞标记物，特别是比如⑶25、⑶44、⑶62的标记物，和可由技术人员鉴定的其他标记物，进行活化的CD8(+)T细胞的检测。[0094]本文中使用的术语“检测”(动词形式或名词形式)表示测定有限部分的空间(包括但不限于样品、反应混合物、分子复合物和底物)中分子或细胞的存在、出现或事实。本文中使用的“检测”(动词形式或名词形式)可包括对目标物的化学和/或生物性质的测定，所述性质包括但不限于与其他化合物相互作用特别是结合的能力、活化另一化合物的能力和阅读本发明后可由技术人员鉴定的其他性质。检测可以是定量的或定性的。当检测表示、涉及或包括对目标物或信号的数量或量进行测量时，检测是“定量的”(也称为定量分析)，其包括但不限于被设计为测定目标物或信号的量或比例的任何分析。当检测表示、涉及或包括按照对另一目标物或信号的相对丰度对目标物或信号的品质或种类进行鉴定时， 检测是“定性的”，其不是被量化的。[0095]适于检测T细胞标记物的示例性技术包括使用标记有允许进行检测的适当分子的合适的单克隆或多克隆抗体或抗原-特异性HLA或MHC五聚物或六聚物，以及可由技术人员鉴定的其他方法和技术。在一种示例性方法中，如在实施例部分中描述的，通过流式细胞分析鉴定T细胞标记物。适于检测T细胞标记物的示例性技术包括使用标记有允许进行检测的适当分子的合适的单克隆或多克隆抗体或抗原-特异性HLA或MHC五聚物或六聚物，以及可由技术人员鉴定的其他方法和技术。在一种示例性方法中，如在实施例部分中所述，通过流式细胞分析鉴定T细胞标记物。[0096]特别地，在一些实施方式中，从约100 μ g到少于约1000 μ g的有效量的本文描述的免疫原性分子与CD8+T细胞活化相关联，所述CD8+T细胞活化对活化的免疫原性分子是特异性的(见，例如实施例12)。[0097]用于特异性CD8+T细胞活化的免疫原性片段或其免疫原性活性部分的其他有效的浓度包括从100 μ g至250 μ g的浓度和从250 μ g至约500 μ g的浓度和从约0.1至约 IOOmg的浓度。[0098]特别地，可使用以适于治疗或预防动脉瘤的量体内施用的本文所述的任何分子， 进行T细胞活化(见，例如实施例部分)。还可使用方法和程序(比如参考文献[52]描述的那些)以及可被技术人员鉴定的其他程序，体外进行T细胞活化。下文的详细公开将使本发明的其他优势和和特征更加明了，所述公开仅以阐述的方式涉及实验部分。[0099]在一些实施方式中，预期本文描述的活化的CD8(+)T细胞在可用本文描述的相应的活化的免疫原性分子治疗的病况的 治疗和/或预防中是有效的。特别地，在一些实施方式中，根据下述施用时间表，本文所述的活化的CD8+T细胞被预期是有效的，所述施用时间表中每日(高至21天)和按照每10天的时间表(0、10、20天)给个体施用所述细胞。预期有效的其他时间表可由技术人员基于病况(比如HIV和/或癌症)的细胞治疗来确定。[0100]下文的详细公开将使本发明的其他优势和和特征更加明了，所述公开仅以阐述的方式涉及实验部分。实施例[0101]本文描述的组合物、方法和系统在下述实施例中进一步阐释，所述方法和系统通过阐释的方式提供并且并非意图限制。[0102]特别地，下述实施例阐释了示例性的免疫原性片段，以及使用片段P210的方法。 本领域技术人员会意识到使本部分详细描述的特征适合于其他免疫原性片段的可行性和必要的改进，所述免疫原性片段按照本发明的实施方式皮下施用或使用其他施用途径体内或体外施用。[0103]除非另外指出，下文报告的实施例中遵循下述材料和方法。[0104]用于免疫的肽的选择及其制备已报道了人类apoB-100肽的确定和筛选(8)。基于 申请人:的初步试验和先前报道，见参考文献(9)、(10)， 申请人:选择了肽210(p210，KTTKQ SFDLS VKAQY KKNKH-SEQ ID NO:210)作为候选免疫原。使用先前描述的方法，见参考文献 (3)、(4),使天然p210肽(Euro-Diagnostica AB,瑞典)与用作载体的阳离子牛血清白蛋白(cBSA)轭合。明矾被用作佐剂，并与肽/cBSA轭合物用体积比1:1的比率混合。肽轭合物以及与明矾的混合物在每次免疫之前新鲜制备。[0105]免疫方案雄性apoE (-/-)小鼠(Jackson实验室)饲养在由美国实验室动物管理认证协会(American Association of Accreditation of Laboratory Animal Care)认可的动物设施中，并进行无限制得到水和食物的12-小时日/夜周期的喂养。Cedars-Sinai 医学中心的实验动物护理与使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee of Cedars-Sinai Medical Center)批准了实验方案。在初步实验中，较之25或50 μ g剂量，使用100 μ g剂量的p210免疫赋予了最佳的动脉粥样硬化-减少。因此，IOOyg剂量用于所有随后的实验。以正常食物膳食饲养的小鼠，在6-7周龄时在肩胛骨之间的脊背区域接受皮下的初次免疫，随后在9和12周龄时加强剂量。最后一次加强剂量后一周，膳食被转变为高胆固醇食物(TD88137，Harlan-Teklad)，并持续至在25周龄时安乐死。在相同的免疫时间点下接受PBS或cBSA/明矾的单独小鼠组作为对照。一些小鼠在8或13周龄时被处死以评价对P210的免疫应答。[0106]组织收获和制备安乐死时，收获心脏并包埋进OCT化合物(Tissue-Tek)中用于冷冻切片。全部的主动脉被清洁、处理并用油红O染色，从而用计算机辅助的组织形态测量技术前位分析(en face)来评价动脉粥样硬化程度，见参考文献(3)、(4)。[0107]免疫组织化学和组织形态测量使用标准方案，将来自主动脉窦的切片用 M0MA-2 (Serotec)或⑶lie (eBioscience)抗体染色，以免疫组织化学地鉴定巨噬细胞或树突细胞。使用标准方案进行针对斑块尺寸的油红O染色。如前文所述进行计算机辅助的形态测量分析来评价组织形态，见参考文献(3)、(4)。[0108]血清ELISA使用标准方案，将平底96-孔聚苯乙烯平板(MaxiSorp，德国)分别用 100 μ 1(20 μ g/ml) p210、KLH、TNP-KLH (Biosearch Technologies T-5060)或 BSA (针对 IgG 为2 μ g/ml或针对IgM为10 μ g/ml)预先涂覆，在4°C孵育过夜，以评价抗体水平。初步实验中最佳化涂覆浓度。山羊抗-小鼠HRP-1gG(Pierce31437)或IgM(Southern Biotech) 用作检测抗体，并通过在作为底物的ABTS (Southern Biotech)中显影检测结合抗体,并在 405nm下记录光密度值。[0109]流式细胞计量分析使用标准方案用下文表1中列出的抗体和FACScan(Becton Dickinson)或CyAn ADP分析仪(Beckman Coulter)进行流式细胞计量分析。对于细胞内的细胞因子染色，将Brefeldin A (3 μ g/ml)添加至培养过的细胞2小时，之后细胞经受染色程序。可渗透化处理细胞膜，用于染色细胞内的分子。[0110]表1`
【权利要求】
1.治疗和/或预防人类个体的能用ApoB-1OO的免疫原性片段或其免疫原性活性部分治疗的病况的方法，所述方法包括:给个体施用有效量的apoB-ΙΟΟ的免疫原性片段或其免疫原性活性部分，其中所述有效量少于lmg。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述免疫原性片段与动脉粥样硬化减少相关联。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述免疫原性片段包含一种或多种免疫原性片段或其免疫原性活性部分。
4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫原性片段包含一种或多种肽，所述每一种肽包含 SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO: 25,SEQ ID NO:45,SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO: 100,SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103,SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO: 143,SEQ ID NO: 148,SEQ ID NO:210 和 SEQ ID NO:301 之一。
5.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫原性片段包含一种或多种肽，所述每一种肽包含 SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO:148 和 SEQ ID NO:210 之一。
6.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫原性片段包含具有SEQ ID NO:143的肽和具有SEQ ID NO:210的肽。
7.根据权利要求1至6任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫原性片段包含具有SEQ ID NO:11的肽、具有SEQ ID NO:25的肽和具有SEQ ID NO:74的肽。
8.根据权利要求1至7任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫原性片段包含具有 SEQ ID NO:2 的肽。
9.根据权利要求1至8任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫原性片段包含具有 SEQ ID NO:45 的肽。
10.根据权利要求1至9任一项所述的方法，其中所述一种或多种免疫原性片段包含具有 SEQ ID NO:210 的肽。
11.根据权利要求1至10任一项所述的方法，其中所述有效量是约IOOyg至约 1000 μ go
12.根据权利要求1至10任一项所述的方法，其中所述有效量是约100μ g至约500 μ g 或约500 μ g至约少于1000 μ g。
13.根据权利要求1至10任一项所述的方法，其中所述有效量是约IOOyg至约 250 μ g,或至少约250 μ g。
14.药物组合物，其包含少于Img的ApoB-1OO的一种或多种免疫原性片段或其免疫原性活性部分，和药物上可接受的载剂。
15.根据权利要求14所述的药物组合物,其中所述组合物包含约100μ g至约1000 μ g 的ApoB-1OO的一种或多种免疫原性片段或其免疫原性活性部分。
16.根据权利要求14所述的药物组合物,其中所述组合物包含约Iyg至约500μ g或约500 μ g至约1000 μ g的ApoB-1OO的一种或多种免疫原性片段或其免疫原性活性部分。
17.根据权利要求14所述的药物组合物,其中所述组合物包含约100μ g至约250 μ g 或至少约250 μ g的ApoB-1OO的一种或多种免疫原性片段或其免疫原性活性部分。
【文档编号】A61K39/00GK103561760SQ201180064980
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2011年11月11日 优先权日:2010年11月12日
【发明者】普里迪曼·K·沙赫, 匡-宇·邱 申请人:赛达斯西奈医疗中心