一种具有化疗后肠道粘膜保护的中药复方及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种具有化疗后肠道粘膜保护的中药复方及其应用，所述中药复方由下列重量配比的原料药制成：党参18-22份、黄芪28-32份、茯苓18-22份、炒白术13-17份、肉豆蔻13-17份、八月札13-17份、沙棘13-17份、苦豆子8-12份、红豆杉4-8份。本发明提供的中药复方采用科学配比，各组分之间能相互协调、相互促进，起到协同增效的作用。固扶正气、补血益阴，保护肠道粘膜，明显减轻化疗引起的消化道反应。
【专利说明】一种具有化疗后肠道粘膜保护的中药复方及其应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及中医药领域，尤其涉及一种具有化疗后肠道粘膜保护的中药复方及其应用。
【背景技术】
[0002]手术后辅助放化疗是当今肿瘤治疗的常用方法。但放化疗同时，可损害机体的正常反应，破坏机体内环境平衡，致使本己失衡的机体失调更加恶化，并易致胃肠道粘膜上皮细胞充血水肿，导致肠道屏障功能障碍，出现恶心、呕吐、腹泻、便秘等胃肠功能失调的临床症状。肠道屏障功能是指肠道上皮具有分隔肠腔内物质，防止致病性抗原侵入的功能，包括机械性屏障、免疫性屏障和菌群屏障，其中最关键的屏障是肠黏膜上皮屏障和肠道黏膜免疫屏障。
[0003]正常情况下，肠道除具有消化、吸收的基本功能外，还对细菌、毒素和其他有害物质形成肠黏膜屏障。这是肠道所具有的特定功能，是由上皮、分子与免疫等组成的复杂功能，能阻止肠内细菌及其分解产物逸出肠道外。化疗是在抑杀癌细胞的同时，又不可避免地对宿主产生一系列毒副反应，使肠道免疫功能处于严重抑制状态，损害机体的正常反应，破坏机体内环境平衡，致 使本己失衡的机体失调更加恶化。因此保护肠道黏膜屏障功能，并提高肠道免疫功能是治疗和改善化疗预后的关键措施之一。
[0004]长期的临床实践证明，中医药在肠道粘膜屏障功能方面具有明显的保护作用，中药保护肠屏障功能的研究已取得了很大进展，其疗效和优势也逐步得到肯定。中药对肠屏障的保护作用广泛地体现于肠黏膜的机械屏障、免疫屏障、化学屏障、生物屏障各个方面，益气健脾药如党参、黄芪等的不同提取部位对小肠上皮细胞增殖具有调控作用，从而保护黏膜损伤，促进黏膜修复。近期研究证实，利水渗湿中药白术、茯苓不仅对大鼠肠黏膜有保护作用，而且可以促进肠黏膜杯状细胞增生，分泌黏液保护肠黏膜，阻止毒素与上皮细胞接触，从而对肠黏膜完整性有较好的保护作用。在调节免疫功能方面，肉豆蘧也具有保留灌肠具有提高肠道免疫能力，保护肠黏膜的作用。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的问题是，提供一种具有化疗后肠道粘膜保护的中药复方。
[0006]本发明所要解决的第二个问题是，提供上述中药复方的制备方法。
[0007]本发明所要解决的第三个问题是，提供上述中药复方在制备保护化疗后肠道粘膜药物中的应用。
[0008]为了解决上述第一个问题，本发明提供了一种具有化疗后肠道粘膜保护的中药复方，所述中药复方由下列重量配比的原料药制成:
党参18-22份、黄芪28-32份、茯苓18-22份、炒白术13-17份、肉豆蘧13-17份、八月札13-17份、沙棘13-17份、苦豆子8-12份、红豆杉4_8份。
[0009]作为一个优选方案，所述原料药重量配比为:党参20份、黄芪30份、茯苓20份、炒白术15份、肉豆蘧15份、八月札15份、沙棘15份、苦豆子10份、红豆杉6份。
[0010]为了解决上述第二个问题，本发明提供了上述具有化疗后肠道粘膜保护的中药复方的制备方法，按配比(党参18-22份、黄芪28-32份、茯苓18-22份、炒白术13-17份、肉豆M 13-17份、八月札13-17份、沙棘13-17份、苦豆子8_12份、红豆杉4_8份，优选党参20份、黄芪30份、茯苓20份、炒白术15份、肉豆蘧15份、八月札15份、沙棘15份、苦豆子10份、红豆杉6份)称取饮片，加8倍体积的75%乙醇，回流提取煎煮2次，每次I h，将煎液合并后离心、浓缩、干燥至干品即得中药复方醇提物。
[0011]为了解决上述第三个问题，本发明提供了上述中药复方在制备保护化疗后肠道粘膜药物中的应用。
[0012]作为一个优选方案，所述药物包括将所述中药复方与药学上可接受的载体结合制成的各种剂型的药物，所述剂型为片剂、胶囊剂或颗粒剂。
[0013]本发明的优点在于，本发明提供的中药复方采用科学配比，各组分之间能相互协调、相互促进，起到协同增效的作用。固扶正气、补血益阴，保护肠道粘膜，明显减轻化疗引起的消化道反应。该方通过“益胃气”，补益的是后天脾胃之气，使体内生理功能尽量恢复平衡稳定，“调中焦”通腑降逆，消除或减轻有害物质的侵害。方以党参、黄芪为君药，大补元气、健脾养胃:白术、茯苓为臣药，健脾燥湿，肉豆蘧、八月札、沙棘共为佐药，芳香化湿、醒脾开胃，与补益药合用以防滋腻，全方共奏健脾益气、益胃生津、通腑降逆，复生中气之效，从而实现了带瘤生存，提高肿瘤患者的生存质量和远期疗效。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为中药复方对MFC胃癌荷瘤小鼠移植瘤抑瘤率的影响，其中▲表示与模型组比较 7X0.05。
[0015]图2为ELISA实验结果，各组小鼠血清D-乳酸、二胺氧化酶、内毒素、IgG含量的比较(η = 10)，其中▲表示与空白组比较，`▲有统计意义Gd < 0.05)，▲▲有显著差异Gd< 0.01) ;Λ表示与模型组比较，Λ有统计意义0° < 0.05)，ΛΛ有显著差异Gd < 0.01)。
[0016]图3为HE染色观察肠黏膜形态学变化(Χ200)。
[0017]图4为小肠肠粘膜ZO-1蛋白表达。
【具体实施方式】
[0018]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0019]实施例:复方醇提物的制备及肠道粘膜保护验证
1.中药复生方醇提物的制备
中药复方(益气复生方)的制备按比例(党参18-22份、黄芪28-32份、茯苓18-22份、炒白术13-17份、肉豆蘧13-17份、八月札13-17份、沙棘13-17份、苦豆子8-12份、红豆杉4-8份)称取一定量的饮片，加8倍体积的75%乙醇，回流提取煎煮2次，每次I h，将煎液合并后离心、浓缩、干燥至干品即得中药复生方醇提物。所述中药复生方醇提物得率为Ig生药/0.214g醇提物。实验前称取适量醇提物干粉，经涡旋、超声、水浴等方法使其充分溶解于RPMI 1640培养基后，0.22 μ m滤器过滤并配制成所需浓度的溶液，4°C保存备用。
[0020]原料药优选以下配比:党参20份、黄芪30份、茯苓20份、炒白术15份、肉豆蘧15份、八月札15份、沙棘15份、苦豆子10份、红豆杉6份。
[0021]2.细胞培养
小鼠MFC胃癌细胞株购自上海中科院细胞库，于含10%小牛血清的RPMI 1640培养液(含青霉素、链霉素各100( U /mL)中，37°C、5% CO2、饱和湿度培养箱中常规培养。
[0022]3.MFC胃癌荷瘤小鼠模型的制备
选取昆明种小鼠40只，雌雄各半，随机分成4组，每组10只。将无菌传代MFC胃癌细胞调为细胞悬液，其浓度为以107/1^，于小鼠背部右侧近前肢皮肤注射0.2 mL，待小鼠皮下肿瘤生长至1-1.2cm时选择肿瘤生长旺盛且无溃破的荷瘤小鼠进行手术，处死后剥离瘤块，放入75%酒精中浸泡5分钟后加入少许无PBS液，去除坏死和纤维组织，用眼科剪将瘤块将其剪碎成ImmX ImmX Imm大小，用20号套管针接种于小鼠背部右侧背部近前肢皮下，以此方法接种多只(40只)MFC胃癌荷瘤小鼠，小鼠造模一周后待瘤体长至直径0.5cm时开始干预。
[0023]4.动物实验的分组与给药
如此传3代后，大批接种裸鼠腋下，待瘤体生长约IOOmm3随机分为4组，每组10只。各组给予对应治疗，中药组(益气复生方组)给予中药灌胃，按照规定剂量，每日一次，每次
0.5ml，共14天。西药组(5-FU组):采用5-Fu，按照20 mg/kg剂量腹腔注射0.2 ml，I次/2天，共14天。中药+西药组(·益气复生方组+5-FU):予中药灌胃，按照规定剂量，每日一次，每次0.5ml,共14天，同时给予5-Fu,按照20 mg/kg剂量腹腔注射0.2 ml, I次/2天，连续14天，模型组每天注射等量的生理盐水。
[0024]5.抑瘤率的计算
常规饲养，每组予相应治疗14天后处死小鼠，取出瘤体测量各组瘤体的重量，计算各组小鼠肿瘤生长抑制率。抑瘤率:(模型组平均瘤重一实验组平均瘤重)/模型组平均瘤重 X 100%O
[0025]图1为各组瘤体大小以及益气复生方对荷瘤小鼠抑瘤率的影响(η = 10，i 土S)。其中，中药组瘤重为1.466±0.104g，与模型组相比，有统计学意义0°〈0.05)，中药组的抑瘤率达到35.8% ;中药+西药组瘤重为1.237±0.112g，抑瘤率为45.8%，低于模型组(/X0.05);西药组瘤重与模型组相比，也存在差异性。结果提示益气复生方可有效抑制小鼠瘤体的生长。
[0026]6.ELISA法对各组小鼠外周血中D-乳酸、二胺氧化酶、内毒素、IgG的检测
常规饲养，每组予相应治疗14天后处死小鼠，经鼠眼眶收集血液0.4-0.9ml于抗凝管，室温自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右(3000rpm )，仔细收集上清，编号后保存-20°C冰箱后开始进行检测。
[0027]血清D-乳酸检测:使用前，将所有试剂都充分混匀。避免使液体产生大量的泡沫，以免在加样时加入产生的大量的气泡，产生加样上的误差。根据待测样品数量，加上了标准品的数量来决定所需的板条数。每个标准品和空白孔都做复孔。标本用标本稀释液1:1稀释后加入50ul于反应孔内。加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37°C温育I小时。甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37°C温育30分钟。甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。每孔加入底物A和B各50ul，轻轻振荡混匀，37°C温育10分钟。避免光照。取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。在450nm波长处测定各孔的OD值。
[0028]血清二胺氧化酶检测:使用前，将所有试剂都充分混匀。避免使液体产生大量的泡沫，以免在加样时加入产生的大量的气泡，产生加样上的误差。根据待测样品数量，加上了标准品的数量来决定所需的板条数。每个标准品和空白孔都做复孔。标本用标本稀释液I: I稀释后加入50ul于反应孔内。加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37°C温育I小时。甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次每孔加入SOul的亲和链酶素-HRP，轻轻振 荡混匀，37°C温育30分钟。甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液,用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。每孔加入底物A和B各50ul，轻轻振荡混匀，37°C温育10分钟。避免光照。取出酶标板，迅速加入50ul终止液,加入终止液后应立即测定结果。在450nm波长处测定各孔的OD值。
[0029]血清内毒素检测:使用前，将所有试剂都充分混匀。避免使液体产生大量的泡沫，以免在加样时加入产生的大量的气泡，产生加样上的误差。根据待测样品数量，加上了标准品的数量来决定所需的板条数。每个标准品和空白孔都做复孔。标本用标本稀释液1:1稀释后加入50U1于反应孔内。加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37°C温育I小时。甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37°C温育30分钟。甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。每孔加入底物A和B各50ul，轻轻振荡混匀，37°C温育10分钟。避免光照。取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。在450nm波长处测定各孔的OD值。
[0030]血清IgG检测:使用前，将所有试剂都充分混匀。避免使液体产生大量的泡沫，以免在加样时加入产生的大量的气泡，产生加样上的误差。根据待测样品数量，加上了标准品的数量来决定所需的板条数。每个标准品和空白孔都做复孔。标本用标本稀释液1:1稀释后加入50ul于反应孔内。加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37°C温育I小时。甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37°C温育30分钟。甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。每孔加入底物A和B各50ul，轻轻振荡混匀，37°C温育10分钟。避免光照。取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。在450nm波长处测定各孔的OD值。
[0031]图2为各组小鼠血清D-乳酸、二胺氧化酶、内毒素、IgG含量的比较(η = 10，i
土s)。与空白组相比，模型组、中药组、西药组、联合组的小鼠血清血清D-乳酸、二胺氧化酶、内毒素、IgG的均升高，差异明显Gd < 0.01);与模型组相比，中药组、西药组、联合组二胺氧化酶含量显著降低Gd <0.01);与模型组相比，西药组、联合组三组中联合组内毒素含量显著降低0° < 0.01);与模型组相比，只有中药组IgG明显降低，而西药组、联合组与模型组的差异则只有统计意义。结果提示荷瘤小鼠血清D-乳酸、二胺氧化酶、内毒素、IgG的含量均高于空白组，益气复生方可以降低二胺氧化酶、内毒素的含量，差异显著0°< 0.01);益气复生方可以降低D-乳酸、IgG的含量，差异有统计学意义Gd < 0.05)。
[0032]7.HE染色法检测各组小鼠肠黏膜形态学变化
常规饲养，每组予相应治疗14天后处死小鼠，取各组小鼠相同位置的肠管进行固定，常规制做行病理组织HE切片染色。
[0033]取相同位置的肠管用生理盐水冲洗后，置入4%多聚甲醛固定24h，在PBS中漂洗Ι-lOh，用上行酒精脱水。把组织块油浸2天进行透明，吸油纸吸干。移入温箱中已融化的石蜡中包埋，修块，5 μ m厚度连续切片，展片，粘片。
[0034]图3为各组小鼠肠黏膜形态学变化。其中，空白组肠黏膜绒毛结构正常，清晰可见，数目多，直立，凸起，排列较整齐，排列整齐。模型组的肠黏膜绒毛完整性被破坏，部分微绒毛坏死、脱落、融合、稀疏、变短，排列紊乱。中药组、西药组、联合组肠粘膜绒毛较模型组相比明显恢复，程度较模型组轻，肠粘膜绒毛尚完整。
[0035]HE染色将得到的切片行HE染色，具体方法如下:
(1)60°C温箱lh，二甲苯1、二甲苯II各5分钟梯度脱蜡。
[0036](2)纯酒精、95%酒精、90%酒精、80%酒精梯度水化各3分钟，蒸馏水洗lmin。
[0037](3)去氧化膜后苏木素染色5分钟，水化I分钟。
[0038](4)盐酸酒精分化20秒。
[0039](5)氨水返蓝5~10分钟。
[0040](6)伊红染色2分钟，蒸馏水化I分钟。
[0041](7) 80%酒精、90%酒精、95%酒精、纯酒精1、纯酒精II梯度酒精脱水各5分钟。
[0042](8) 二甲苯1、二甲苯II固定、透明各5分钟。
[0043](9)封片，阅片。
[0044]8.免疫组化法检测各组小鼠肠粘膜ZO-1蛋白的表达
ZO-1蛋白主要在小肠上皮细胞的边缘，定位于细胞质和细胞膜，呈棕褐色粗颗粒状表达，中药组、西药组、联合组三组均成阳性表达，秩和检验表明，与模型组相比，中药组、西药组、联合组三组表达量均降低Gd < 0.05)。三组组间无显著差异0° > 0.05)。
[0045]取相同位置的肠管用生理盐水冲洗后，置入4%多聚甲醛固定24h，在PBS中漂洗Ι-lOh，用上行酒精脱水。把组织块油浸2天进行透明，吸油纸吸干。移入温箱中已融化的石蜡中包埋，修块，4 μ m厚度连续切片，展片，粘片。
[0046](I) 6(TC 温箱 lh，二甲苯 1、2 各 25min。
[0047](2) 100%酒精 1、2 各 5min，95%酒精 1、2 各 5min，80%酒精 5min。[0048](3) PBS 液漂洗 3 次，每次 5min。
[0049](4)将组织切片放入装有枸橼酸缓冲液的一次性杯子中，放入微波炉中火3min(主要作用为抗原修复)。
[0050](5) PBS 液漂洗 3 次，每次 5min。
[0051](6)将组织块周边的水吸干，滴入3% H2O2 30ul/组织块，室温下静置15min (主要作用是封闭内源性过氧化物酶)。
[0052](7) PBS 液漂洗 3 次，每次 5min。
[0053](8)将组织块周边的水吸干，按30ul/组织块滴入BSA。将组织切片放入湿盒(湿盒下面一定要有水)放入37°C温箱，30min。
[0054](9)滴入稀释的一抗(用抗体稀释液稀释为l:50)，30ul/组织块。将组织切片放入湿盒，外套塑料袋，37°C温箱孵育1.5h后室温过夜。
[0055](10)将湿盒放入37°C温箱lh。
[0056](11) PBS 液漂洗 3 次，每次 5min。
[0057](12)组织块周边的水分吸干，按30ul/组织块滴入PBS稀释的二抗。将组织切片放入湿盒，置于37°C温箱15min。
[0058](13) PBS 液漂洗 3 次，每次 5min。
[0059](14)组织块周边的水分吸干，按30ul/组织块滴入显色液DAB。待出现棕黄色，光镜下观察染色结果理想，即可用自来水冲洗30min。
[0060](15)苏木素复染30秒，自来水冲洗30min。盐酸酒精溶液分化30秒，自来水冲洗20min.(16)80%酒精5min，95%酒精1、2各5min，100%酒精1、2各5min，上行脱水。
[0061](17) 二甲苯 1、2 各 25min。
[0062](18)中性树脂封片。
[0063](19)光学显微镜观察并摄像。每一组组织切片随机选取染色清晰者5张，于光镜下随机选取3个视野，并在高倍镜(X200)下观察。染色结果判断标准:细胞中出现棕黄色颗粒为阳性。强阳性(+ + + )表示明显染色(深棕黄)，细胞中的棕色颗粒占75%以上；阳性(+ + )表不中度染色(黄色)，棕色颗粒占50%~75%;弱阳性(+ )表不轻度染色(浅黄色)，棕色颗粒10%~50%;阴性(-)表示无染色，棕色颗粒〈10%，结果见图4。
[0064]临床用药结果显示，肿瘤患者化疗后服用益气复生方后，炎症逐步控制，肠粘膜通透性也逐渐下降，患者临床症状已明显好转，术后并发症低于常规治疗组，体温及白细胞基本降到正常，营养状态保持较好，综合体现为患者康复较快，住院时间缩短。
[0065]主要表现为，益气复生方应用于胃癌化疗后，患者恶心、呕吐、腹泻、便秘等胃肠功能失调的临床症状得到改善；益气复生方应用于肠癌化疗后，患者腹胀、腹痛、腹泻、便秘等胃肠功能失调的临床症状得到改善；益气复生方应用于肝癌等其他肿瘤以及肿瘤转移患者后，可以调整机体免疫功能，减轻放、化疗毒副作用，延长生存期、促进康复。
[0066]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种具有化疗后肠道粘膜保护的中药复方，其特征在于，所述中药复方由下列重量配比的原料药制成: 党参18-22份、黄芪28-32份、茯苓18-22份、炒白术13-17份、肉豆蘧13-17份、八月札13-17份、沙棘13-17份、苦豆子8-12份、红豆杉4_8份。
2.根据权利要求1所述的一种具有化疗后肠道粘膜保护的中药复方，其特征在于，所述原料药重量配比为: 党参20份、黄芪30份、茯苓20份、炒白术15份、肉豆蘧15份、八月札15份、沙棘15份、苦豆子10份、红豆杉6份。
3.权利要求1所述具有化疗后肠道粘膜保护的中药复方的制备方法，其特征在于，按权利要求1所述的配比称取饮片，加8倍体积的75%乙醇，回流提取煎煮2次，每次I h，将煎液合并后离心、浓缩、干燥至干品即得中药复方醇提物。
4.权利要求1所述中药复方在制备保护化疗后肠道粘膜药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物包括将所述中药复方与药学上可接受的载体结合制成的·各种剂型的药物，所述剂型为片剂、胶囊剂或颗粒剂。
【文档编号】A61K36/489GK103845394SQ201210508155
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2012年12月3日 优先权日:2012年12月3日
【发明者】邓皖利, 陆明, 吕书勤, 王昕宇, 段春燕, 王巧琳, 何娜娜, 李向黎, 任小娟, 林燕, 马金丽, 吴涛, 肖亮亮 申请人:新疆维吾尔自治区中医医院