具有低氧、高还原力的生物无机化合物复合体的制作方法

具有低氧、高还原力的生物无机化合物复合体的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种生物无机化合物复合体，其副作用少，在短期间内可治疗格雷夫斯病，可通过抑制成为其他疾病原因之一的活性氧的影响（氧化），谋求具有药理效果、美容效果、动植物的生长发育效果、环境改善效果，该生物无机化合物复合体具有低氧高还原力、不能利用合成化学进行制造。本发明提供一种具有低氧、高还原力的无机复合化合物，其包含植物成分的正原子价的元素和硫化合物。
【专利说明】具有低氧、高还原力的生物无机化合物复合体
【技术领域】
[0001]本发明涉及具有低氧、高还原力的生物无机化合物复合体，特别是涉及副作用少，谋求在短期间内治疗格雷夫斯病的效果，谋求对其他疾病的药理效果、以及美容效果、动植物的生长发育效果、环境改善效果，具有低氧、高还原力的生物无机化合物复合体。
【背景技术】
[0002]甲状腺是产生甲状腺激素的内分泌器官。甲状腺激素通常具有提高全身的代谢率的作用，具体地说作用于消化道、心脏、骨、神经系统来活化新陈代谢。 而且，该甲状腺激素的分泌量被各种激素调节，特别是被由下丘脑分泌的促甲状腺激素释放激素(TRH)及通过该TRH的刺激而由脑垂体分泌的促甲状腺激素(TSH)所调节。
[0003]当甲状腺激素的浓度降低时，则分泌TRH及TSH，刺激位于甲状腺表面的TSH受体，产生并分泌甲状腺激素(T3或T4)。另外，当甲状腺激素的浓度提高时，则TRH、TSH的分泌降低，甲状腺激素的产生、分泌降低。
[0004]这里，作为甲状腺功能的代表性疾病的格雷夫斯病，是通过产生结合于促甲状腺激素(以下为TSH)受体的自身抗体，该自身抗体代替TSH过量地刺激受体，从而过量地生成TSH，对身体造成各种影响，因而发病。
[0005]该格雷夫斯病的治疗方法有药物治疗或放射线碘治疗、外科手术，目前通常采用药物治疗。在药物治疗中，虽然使用甲巯基咪唑(以下、MMI)或丙硫氧嘧啶(以下为PTU)等抗甲状腺药，但已知这2个药剂具有副作用，MMI会引起过敏反应、肝脏的各种酶的上升、关节痛、严重时还会引起粒性白血球缺乏症(非专利文献I)。另外，已知PTU会引起严重的肝损伤(非专利文献2)，对于格雷夫斯病的患者而言，使用这两个药剂伴随有对身体非常高的负担。
[0006]现有技术文献
[0007]专利文献
[0008]非专利文献1: Cooper DS.(2005) Antithyroid drugs.N Engl J Med.352:905-17.[0009]非专利文献2: Cooper DS, Rivkees SA.(2009) Putting propylthiouracil inperspective.J Clin Endocrinol Metab.94:1881-2.
【发明内容】

[0010]发明要解决的技术问题
[0011]然而，即使是现在格雷夫斯病的药物治疗必须使用上述药剂、定期测定甲状腺激素的量、有规律并长期地服用适当量的药剂。这对于患者而言，对身体和精神上均造成负担，而且还伴有副作用的危险。因而，期待副作用少、通过短期间的治疗表现效果的药剂。
[0012]另一方面，在各种疾病的原因中“活性氧”的影响是原因之一。该活性氧在生物体内的代谢过程中产生、阻碍细胞的功能、对细胞本身造成伤害，因此已经清楚活性氧的增加与多种疾病或老化等的机制有关。氧对于生物是必要不可欠缺的，相反其也是将生物体氧化、引起各种障碍的原因。通常的生理条件下，因氧化所引起的障碍是极为缓和的，但当生物体的氧化反应与抗氧化的平衡被打破、处于氧化反应进行的状态时，则会认为关联疾病的发病。这种状态是过度氧化，由于该氧化应激长时间持续，因此产生各种疾病。另外，其对美容、动植物的生长发育、环境也有不良影响。
[0013]本发明鉴于所涉及的问题而完成，其目的在于提供具有低氧、高还原力的生物无机化合物复合体，根据美国?加利福尼亚大学(以下为UCLA)的菅原正博博士的临床疗效及各种实验数据，该生物无机化合物复合体副作用少、在短期间内能够治疗格雷夫斯病，通过抑制认为是其他疾病原因之一的活性氧的影响(氧化)而能够谋求各种药理效果、美容是效果、动植物的生长发育效果、环境改善效果。
[0014]用于解决技术问题的方法
[0015]本发明是开发并制造用于达成上述目的的物质的方法。材料为海带、裙带菜、墨角藻、羊栖菜、黑海带、腔昆布、马尾藻等海藻(草)，竹子、虎杖、苦艾、蕺菜、野葛、美洲榧、问荆、山白竹、杉树、柏树、栎树、松树等草木，将它们灰化、进而进行熔融糊状化。由此，将构成植物95%以上的氧(O:约70%)、碳(C:约18%)、氢(H:约10.5%)、氮(N:约0.3%)4元素的大半部分除去，可以使认为对生物体造成有害作用的大部分化合物消失。即，通过将植物熔融糊状化，可以生成几乎没有有害作用的、低氧、极为安全的“生物无机化合物复合体”。
[0016]将其称作植物糊状原料粉末(Bio Inorganic Elements:以下称作ΒΙΕ)。该BIE的主要元素是钙、硅、钾等。在其中加入水，进行煮沸、过滤，将水溶性的植物糊(ReducingInorganic Minerals:以下称作RIM)抽提。该RIM的主要元素是钠、钾、氯、硫等,具有与体液共同的矿物平衡。这些BIE和RIM的特征在于，具有很高的还原力，含有多种未与氧键合的硫化合物，不可以通过合成化学进行制造，提供含有存在于地球上的几乎所有元素的生物无机化合物复合体。
[0017]以上构成的特征在于，BIE的氧化还原电位的实测值利用T0A-RM-30P测定器达到-500mV左右。另外，其特征在于，RM液体的氧化还原电位的实测值为-600~-700mV左右的范围。另外，使该RM液体完全干燥的RM粉末的氧化还原电位的实测值显7]\ -80 ~_300mV。
[0018]该具有低氧、高还原力的生物无机化合物复合体的特征在于，是用于甲状腺机能亢进的治疗用的药剂的新物质。另外，其特征在于，可利用于包括过敏性皮肤炎、足癣、烧伤、伤口、痔疮、肺炎、肿胀、疼痛、发痒等的药理疗法。另外，该具有低氧、高还原力的生物无机化合物复合体的特征在于，还可作为化妆品利用或者混合在化妆品中进行利用。另外，该具有低氧、高还原力的生物无机化合物复合体的特征在于，可利用于植物或农作物的栽培、畜牧/养殖用的饲料中。另外，其特征在于，可利用于保持食品的鲜度、鲜味的抽提、污染物质的除去/洗涤、杀菌中。另外，具有低氧、高还原力的生物无机化合物复合体的特征在于，可利用于制造与体液共同的矿物平衡水。
[0019]发明效果
[0020]本发明的具有低氧、高还原力的生物无机化合物复合体包含植物成分的具有正原子价的元素和硫的复合化合物，由于具有低氧和高还原力，因此副作用少、可以在短期间内治疗格雷夫斯病，通过抑制认为其他各种疾病原因之一的活性氧的影响(氧化)，可以谋求药理效果、美容效果、动植物的生长发育效果、环境改善效果。【专利附图】

【附图说明】[0021][图1]表示甲状腺激素的生合成、分泌及甲状腺细胞的主要信号传导通路的图。
[0022][图2]表示DUOX分子的图。
[0023][图3]表示过氧化物酶的催化循环的图。
[0024][图4]表示氧化还原电位(ORP)计的图。(UCLA )
[0025][图5]表示RM的主要成分的图(UCLA)。
[0026][图6]表示利用X射线微量分析仪(EDS)分析获得的RIM粉末的元素分析结果的表(株式会社二 f々1J寸一子)。
[0027][图7]表示利用X射线微量分析仪(EDS)分析获得的BIE的元素分析结果的表(株式会社二 f夕'J寸一子)。
[0028][图8]表示粉末状的RM的结晶结构的图、Ca)为粉末状的RM的电子显微镜照片、(b)为将利用100%甲醇处理粉末状RM、使其空气干燥的产物可视化的图。
[0029][图9]图9(a)为以500倍率表示粉末状RIM的结晶结构的图、图9 (b)为以1000倍率表示粉末状RIM的结晶结构的图(株式会社二 7 fU寸一子)。
[0030][图10]为以2000倍率表示粉末状RM的结晶结构的图(株式会社二〃 f ^ 1J寸一幻。
[0031][图11]图11(a)为以500倍率表示粉末状BIE的结晶结构的图、图11 (b)为以1000倍率表示粉末状BIE的结晶结构的图(株式会社二 7 fU寸一子)。
[0032][图12]为以2000倍率表示粉末状BIE的结晶结构的图(株式会社二〃 f ^ 1J寸一幻。
[0033][图13]为RM结晶利用X射线衍射获得的结果的图表(UCLA)。
[0034][图14]表示利用X射线衍射装置获得的RIM粉末的化合物的定性结果的表(株式会社二 7亍夕1J寸一子)。
[0035][图15]表示利用X射线衍射装置获得的RIM粉末的化合物的定性结果的表(株式会社二 7亍夕1J寸一子)。
[0036][图16]表示利用X射线衍射装置获得的BIE粉末的化合物的定性结果的表(株式会社二 7亍夕1J寸一子)。
[0037][图17]表示利用X射线衍射装置获得的BIE粉末的化合物的定性结果的表(株式会社二 7亍夕1J寸一子)。
[0038][图18]表示利用X射线衍射装置获得的BIE粉末的化合物的定性结果的表(株式会社二 7亍夕1J寸一子)。
[0039][图19]表示利用X射线衍射装置进行的BM粉末中主要化合物的鉴定的图表(株式会社二 7 f夕1J寸一子)。
[0040][图20]表示利用X射线衍射装置进行的BM粉末中KNaS的鉴定的图表(株式会社二 7亍夕'J寸一子)。
[0041][图21]表示人体的水分分布和主要离子的图表。
[0042][图22]表示利用X射线衍射装置进行的BIE粉末中CaC03、Si02、KCl、NaCl，((Ca，Na) (Si7AD)4O8的鉴定(日本)的图表(株式会社二 7 f 寸一乎)。[0043][图23]表示利用X射线衍射装置进行的BIE粉末中KNaS的鉴定的图表(株式会社二 7亍夕'J寸一子)。
[0044][图24]表示利用ORP计测定RM的非结晶质的氧化还原电位的结果的图(UCLA)。
[0045][图25]图25(a)为表示RM各浓度下的氧化还原电位的图表、图25 (b)为表示RIM的还原性的照片(UCLA)。
[0046][图26]为将RM产生的抑制愈创木酚氧化的图表化的结果。
[0047][图27]为将RM产生的碘化抑制的图表。
[0048][图28]表示化合物II的水平的图。
[0049][图29]表示被RM或丽I所强化的分解的图表。
[0050][图30]表示甲状腺功能的检查结果的图。
[0051][图31]表示培养细胞中的过氧化氢和氧的细胞定位诊断及它们的生成量的调查结果的图。
[0052][图32]表示RM作用于质膜的图。
[0053][图33]表示研究RIM是否作用于由细胞膜-THS介导的cAMP生成来形成甲状腺激素的最重要的信号的结果的图。
[0054][图34]表示动物实验的结果的图。
[0055][图35]表示使用大鼠的实验的实验计划的图。
[0056][图36](a)表示矿物洗脱过滤器的构成的图、(b)表示制造矿物水的装置主体构成的截面图。
[0057][图37]表示使用图36所示装置进行的实验的结果的图。
[0058][图38]表示使用图36所示装置进行的实验的结果的图。
【具体实施方式】
[0059]接着，对本发明的实施方式进行说明。
[0060]< 序言 >
[0061]使用具有还原力的低氧的生物无机化合物复合体的药剂对于以格雷夫斯病为首的各种疾病不会产生副作用、治疗具有效果。本化合物复合体为在2000°C以上的高热下将海藻(草)、野草、树木等野生植物熔融糊状化而生成，为植物糊状原料粉末(Bil InorganicElements:BIE)0进而,在该BIE中添加水,进行加热、冷却后过滤,其为水溶性的高还原植物糊(Reducing Inorganic Minerals: RIM),存在液体和固体。
[0062]RIM作为食品防腐剂、护肤品、预防癌症而使用。该物质在至今的观察中，显示最强的还原电位。RM溶液0.5%利用氧化还原电位(ORP)计显示与IOOmM的丽I几乎相同的还原电位。RIM是甲状腺激素的形成解析的最初步骤的反应，抑制过氧化物酶-过氧化氢的反应。在人体中，对癌症患者(非甲状腺癌)的RM 口服相比较于(其他症状的)一般的人口(6.5%)，显示非常高的甲状腺功能减退(35%)。未见副作用或异常检查结果。
[0063]用于研究该RM的第I研究是通过粉末X射线衍射法和利用离子交换HPLC获得的RM非晶质部分(非结晶形)，赋予RM的结晶特征。上述2个过程在UCLA的化学部门实施。
[0064]第2研究是在体外(试验管)明确RIM的抗甲状腺作用的机制。在无细胞系统中，通过测定化合物II水平(由过氧化物酶/过氧化氢反应生成的氧化制品)和过氧化氢分解，来探讨过氧化氢生成系统上的RM或MMI (比较药)的效果。为了进行细胞实验，培养的人甲状腺滤泡被用于研究RM对过氧化氢的生成、碘化有机化及DUOX和N0X4(甲状腺过氧化氢生成酶)的蛋白质表达的影响 。
[0065]进而，FRTL-5大鼠甲状腺细胞或Nthy-or1-3-l的正常人甲状腺细胞株被用于测定应答RM所生成的细胞内细胞cAMP。其原因在于，RIM会对细胞膜的结构和可能的TSH受体介导性的信号造成影响。
[0066]第3研究是在使用于人体之前，为了获得RM的必要信息的动物实验(Sprague-Dawley大鼠)。具体地说，考察RM是否会引起不可逆的甲状腺功能减退、甲状腺萎缩或甲状腺肿。另外，通过大鼠试验RM的经皮效果。
[0067]最终目标是确立RM作为用于治疗格雷夫斯病的、非毒性的强大的抗甲状腺类药物。
[0068]<甲状腺机能亢进症的治疗>
[0069]格雷夫斯病的主要治疗方法有硫代酰胺(thionamide)药物疗法、甲状腺次全切除术或放射性碘治疗法。另外，β阻断药、无机碘化物或碘造影剂、碳酸锂、过氯酸钾的糖皮质激素和利妥昔单抗，(抗人CD20的嵌合型单克隆抗体)根据Fumalora再探讨那样，是二次治疗的选择。但是，这些二次治疗方法并不能代替一次处理。三个主要的上述方法在世界范围内被执业医师广泛地接受，在半世纪以上的时间内被广泛使用。在美国国内，用于格雷夫斯病的最常用的治疗仍是基于FDA的数据库的药物疗法。
[0070]<利用丙硫氧嘧啶的药物疗法(PTU)及甲巯基咪唑(丽I) >
[0071]目前来说，丽I是药物疗法的最初选择。其原因在于，PTU具有低粘附率及主要的毒性、特别是会引起严重的肝功能衰竭。FDA作为仅用于能够忍受MMI的患者或者妊娠初期女性的二线药物推荐PTU。一般来说，MMI的药物疗法为了达成其效果，必须持续12~18个月的时间。另外，已知MMI的副作用:过敏反应、肝酶的上升、关节痛等。作为严重的副作用，包括粒性白血球缺乏症、再生障碍性贫血或血管炎。
[0072]甲状腺的研究除了抗甲状腺药的领域之外，在世界范围内还有有名的研究大幅度地发展。对于患有格雷夫斯病的患者的更为良好的护理而言，迫切需要副作用少的新的治疗方法。因此，必须记载与所提出的研究有关的主题。
[0073]<甲状腺激素的形成的步骤>
[0074]图1表示以下所示的甲状腺激素的生合成、分泌及甲状腺细胞的主要信号传导通路。碘积极地通过基底外侧膜上的钠/碘化共输送(NIS)，主动地被输送至甲状腺细胞，一部分则通过顶端膜的pendrin (Η)3ΛΙΧ26Α4)被输送至滤胞腔中。碘化物在通过共价键合在顶端膜的内腔侧的甲状腺球蛋白(Tg)的酪氨酰残基上而获得的过氧化氢的存在下，被TPO迅速地氧化。通过该步骤，制造一碘化酪氨酸(MIT)和二碘酪氨酸(DIT)。进而，仅适当间隔的Tg内的MIT和DIT与偶联反应相关，用于形成甲状腺素(Τ4)和三碘甲状腺原氨酸(Τ3)。该反应还会被过氧化氢和TPO催化。甲状腺过氧化氢的来源是经DU0XA2 (DU0X成熟因子)调整的、在顶端部细胞膜表达的DU0X2。甲状腺激素在Tg的消化后被释放到循环中。MIT和DIT被碘酪氨酸去卤酶I (DEHALl)非碘化。甲状腺激素的形成主要受促甲状腺激素(TSH)调节。TSH与TSH受体的结合会激活Gs和Gq的蛋白质两者。前者激活成长调节、分化及甲状腺激素的分泌，后者则介由磷脂酶C依赖性肌醇磷酸Ca2+/甘油二酯的通路，激活过氧化氢的生成和结合于蛋白质的碘化物。
[0075]图1的缩略语的意义如下所述。
[0076]AC:腺苷酸环化酶、
[0077]cAMP:环腺苷酸、
[0078]DAG:甘油二酯、
[0079]DEHALl:去卤酶 1、
[0080]DIT:二碘化铬胺酸、
[0081]DUOX:双氧化酶、
[0082]DUOXA:双氧化酶的成熟因子、
[0083]IP3:肌醇三磷酸、
[0084]MIT:单碘化铬胺酸、
[0085]NI S:钠、碘化共输送体、
[0086]PDS:pendrin>
[0087]PKA:蛋白酶 A、
[0088]PKC:蛋白酶 C、
[0089]PLC:磷脂酶 C、
[0090]T3:三碘甲状腺原氨酸、
[0091]T4:甲状腺素、
[0092]TG:甲状腺球蛋白、
[0093]TPO:甲状腺过氧化物酶、
[0094]TSH:促甲状腺激素、
[0095]TSHR:促甲状腺激素受体
[0096]<甲状腺细胞中的DUOX过氧化氢生成体系>
[0097] 该提案由于过氧化氢发生伴有RM的影响，因此必须详细地记载甲状腺的过氧化氢发生体系。为了形成甲状腺激素，过氧化氢是必要的。
[0098]甲状腺的过氧化氢生成体系的详细情况虽然省略，但对甲状腺过氧化氢生产的重要侧面进行简单地说明。甲状腺中的NADPH氧化酶的存在在很早以前就是已知的。为了识别作为甲状腺过氧化氢的主要原因的双氧化酶(DUOX)蛋白质，用了 15年的时间。原本是被称作甲状腺酶。甲状腺中有DUOXl和DU0X2。DU0X2、但非DUOXl承担着甲状腺过氧化氢的生产。对于DUOX酶向顶端部细胞膜的运输而言，其成熟要因、DUOXlA和DU0XA2是必要的。DUOX是6个NADPH氧化酶(NOX)之一，其亚型与N0X2具有50%同源性。DUOX分子如图2所示。
[0099]< DU0X2蛋白质和经报道的突变部位的结构模式>
[0100]氨基酸水平上的突变部位用小黑实心圆表示。箭头说明因突变所产生的氨基酸的变化。过氧化物酶样结构域位于N末端细胞外部分。Ca2+结合部位的2个EF-hand位于最初的长胞内环中。FAD与NADPH结合空洞位于细胞内C末端部分。
[0101]FAD:黄素腺嘌呤二核苷酸
[0102]NADPH:磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸[0103]DUOX蛋白质具有7个跨膜区，而且具有第7区域结构那样的过氧化物酶。过氧化物酶的DUOX功能仍有争议。但特征性的是，DUOX具有用于钙结合的EF-hand，该钙结合是酶活性的主要刺激剂。如在所有氮氧化物成员中所观察到的那样，其跨膜区含有亚铁血红素。DUOX的功能为介由FAD和亚铁血红素，将单(单一的)电子由NADPH传递至氧。NADPH在DUOX体系中无法被置换成NADH。当将电子给予氧时，则形成超氧化物阴离子(02-)。但是，因超氧化物歧化酶由02-向过氧化氢的快速变换而无法进行02-的生物学检测。对RIM的添加是否会扰乱电子传递体系进行试验是很有意思的事。
[0104]< DUOX的影响因素〉 [0105]钙如上所述那样从结合到DUOX分子的EF-hand始终是DUOX的最有力的刺激物。另外，蛋白酶C不会激活DUOXl、而是激活DU0X2。TSH对甲状腺激素形成的几乎全部的过程进行刺激。但是，它不会刺激甲状腺细胞内DU0X2，除了 PCCI3的大鼠甲状腺细胞株之外。被TSH刺激的甲状腺DUOXl不会对过氧化氢的生成具有很大贡献。目前还没有NOX酶的有力且特异性的防止剂(阻碍剂)。大多数的防止剂(阻碍剂)是非特异性的。通常使用碘衍生物、二亚苯基碘(DPI)。其原因在于，该化合物从电子传递中取出电子，形成自由基。而且，该化合物会阻碍各自的电子传递。通常使用的抗氧化剂、N-乙酰半胱氨酸会抑制在甲状腺小鼠中表达的DUOX蛋白质。
[0106]<测定DUOX活性的方法>
[0107]测定DUOX活性有2个方法。Muhlbauer简单地说明了来自甲状腺颗粒状部分(10，OOOxg小球)的DUOX活性的检测方法。培养基含有钙、FAD和NADPH。过氧化氢的生产量是活性测定的终点(结束点)。Rigutto等人使用培养的Cos-7细胞共表达DU0X/DU0XA，在DU0X2活性0.8nMPMA的低浓度的存在下测定过氧化氢生产。为了测定DUOXl活性，在培养液中追加FSK。DU0XA2 (成熟因子)由于存在于人甲状腺细胞中，因此该方法在未进行DU0XA2的转染(使基因?病毒等的核酸进入细胞内使其增殖)的情况下，用于测定人甲状腺细胞中的DU0X2活性和过氧化氢生产。
[0108]<引起人类甲状腺功能减退的突变DUOX的基因>
[0109]已知异常的DUOX会引起甲状腺功能减退。在Moreno等人之后，2002年报道了DU0X2突变的最初的4个实例。迄今为止，已经报道了 22例的DU0X2突变。根据Moreno等人的报道，双等位基因突变与永久性甲状腺功能减退有关，单等位基因突变与一过性甲状腺功能减退有关。但是，Maruo等人报道了与导致截断DU0X2蛋白的双等位基因突变无关的一过性甲状腺功能减退例。该报告暗示，当DU0X2丧失其功能时，生成过氧化氢的代替机制的存在。
[0110]<过氧化氢的测定>
[0111]该方案中，过氧化氢的测定是非常重要的。为此必须使用有效的方法。这里，对实验中使用的过氧化氢的检测方法进行说明。过氧化氢的测定随着生物学流体(无细胞培养基和试验管反应混合物)或细胞内隔室这样的样品的来源而不同。由生物学流体测定过氧化氢较为简单。但是，细胞内的过氧化氢由于过氧化氢探针必须首先通过细胞膜，因此难以进行测定。另外，最通常使用的探针会与其他的活性氧或游离自由基发生交叉反应。但是，为了克服一些问题，已经有所进展。
[0112]<由生物学流体的H202试验>[0113]I)使用了作为超高灵敏度的荧光底物的Amplex Red试剂的Amplex Red[N-乙酰基-3，7 - 二氢吩噁嗪]方法
[0114]基本原理为过氧化氢在利用西洋辣根过氧化物酶(HRP)的催化反应中，以1:1的化学量与AmplexRed(Molecular Probes社-1nvitrogen社)反应。其产生显不波长587nm的最大荧光放射及最大激发563nm的高荧光产物试卤灵。其吸光系数为54，ΟΟΟΜ-lcm-l。该试验对于过氧化氢而言，是高灵敏度、选择性的试验，可以检测低于50nM的过氧化氢。该方法一般来说用于荧光或分光微孔板格式的过氧化氢的低水平测定。
[0115]2) TMB法(3，5为生成3' 5'四甲基联苯胺)
[0116]为了生成在波长653nm下以e=3.9 X 104M-lcm_l测定的TMB阳离子(阳离子)游离基(游离自由基)，TMB被西洋辣根过氧化物酶和H202氧化。通过与HRP的进一步氧化，生成二亚胺(波长450nm的吸光度和e=5.9X 104M-lcm-l)。其为高灵敏度、简单的方法。
[0117]<过氧化氢的胞内检测>
[0118]3)5、6氯甲基-2' 'V -二氯二氢荧光素二乙酸酯(CM-DCFH-DA)法
[0119]CM-DCFH被动地在细胞内扩散，利用ROS进行的该化合物的细胞内处理生成非常具有荧光性的CM-DCF，其可以通过530nm的发光和488nm的激发发光进行测定(26)。其实施容易、灵敏度良好。因此，为了检测作为主要的细胞内ROS的细胞内过氧化氢，被广泛使用。但是，该检查并非是过氧化氢所固有的。因为其还与其他氧化剂发生反应。
[0120]4)作为最具体的细胞内过氧化氢的检测方法的Hyper荧光法
[0121]作为基因编码的参比传感器的Hyper相对于过氧化氢的选择性超过其他的ROS (活性氧)，很高。Hyper由环状地改变顺序的YEP融合的细菌过氧化氢敏感性转录因子构成。OxyR部分的半胱氨酸氧化诱发了增加在500nm (YFP500)处所激发的发光、减少420nm (YFP420)处所激发的发光的立体结构变化。该变化在还原细胞质环境中是快速、可逆转的，而且其可进行细胞内H202浓度的动态监视。该方法适于利用荧光显微镜跟踪过氧化氢的生产。HyPer载体市场有售、可以获得(一 'I 二 7州Richmond Evrogen的代理店，和光夕^力卟文社)。
[0122]<过氧化物酶与过氧化氢的反应:光谱侧面>
[0123]过氧化氢、甲状腺过氧化物酶(TPO)之间的反应是甲状腺激素形成的最初步骤。下面的4个哺乳动物的过氧化物酶催化碘化物的氧化。:髓过氧物酶、嗜酸粒细胞过氧化酶、乳过氧化物酶(LPO)和甲状腺过氧化物酶(TPO)。
[0124]这4个过氧化物酶基于开放读码框架分析具有相同的结构。这里，LPO和TPO备受关注。原因在于，它们催化了甲状腺激素的形成(因具有催化作用)。作为其他的过氧化物酶，LPO和TPO在分子中具有过氧化物酶的电子转移(氧化还原)重要的要素-亚铁血红素。LPO近端的亚铁血红素配位基为His468和Asn554、TPO His494和Asn579。精制TPO由于难以获得，因此这里对LP0-H202反应的光谱特性进行说明。但是，同样的光谱应答也可以由TPO预想到。将过氧化物酶的催化循环示于图3。
[0125]<利用LOP和过氧化氢的化合物1、II和III的形成>
[0126]天然的LPO光谱在412nm处显示索瑞氏带(ε =114000M-lcm_l)。
[0127]暴露于等摩尔或者两倍过量的过氧化氢生成卟啉自由基CPD，其特征在于，具有在420或416nm处进行吸收。[0128]仅在过氧化物的存在下，CPD I自发地变换成能够在430nm处检测到的较稳定的化学种CPD II (200ms以内)。
[0129]当暴露于稍过量的过氧化物时,会迅速地将LPO惰性化、(424nm的带域处)生成CPD III。
[0130]CPD I具有对甲状腺激素形成的最后步骤的甲状腺球蛋白的酪氨酸残基的碘化进行催化、对iodityrosine的结合进行催化的作用。
[0131]进而，氧化力低于CPD I的异构体CPDl-[FeIV=O, aa+ ?]或CPD II也能对碘化酪氨酸的结合进行催化。
[0132]<氧化还原电位(ORP )计>
[0133]UCLA的菅原正博博士在所提案的研究中广范围使用ORP计。因此，说明用于ORP计的敏感电极。在UCLA中使用连接于便携式pH氧化还原计(型号6230、Jenco社、加利福尼亚州寸> Π 二 3')的带存储器的pH氧化还原电极(氧化还原电位-146C微小；9吁一^ 9卜〗J 一文社、口寸 > 七> ^、加利福尼亚州)。该装置的基本原理为对向溶液中的钼微电极的电子转移进行测量或对由溶液中的钼微电极的电子转移进行测量。例如，还原剂为供电子体。因此，该电极接受充电至负侧的电子，其负值地进行读取。相对照地，氧化剂 (电子接收体)变成正的mV。将装置的图示于图4。该电极的优点为灵敏度非常好、可适用于10~20 μ I的样品大小。
[0134]另外，日本国内使用DKK-TOA Corporation的ORP-meter RM30P,本申请的数据用实测值表示。
[0135]< 意义 >
[0136]格雷夫斯病是VA患者的一般的甲状腺疾病之一。许多格雷夫斯病患者苦于药物的副作用，必须采用放射性碘治疗。这里所提案的研究包括在临床上非常重要、但完全被忘却或忽视的甲状腺研究领域-抗甲状腺药。医生或患者在发生严重的药物副作用时，可以容易地理解开发新的药剂的必要性。本研究的结果不仅可以大幅度提高VA患者的格雷夫斯病治疗，还可大幅度提闻非VA患者的格雷夫斯病治疗。RIM剂由未使用有机化学物质的矿物构成、且是贫氧、有力的还原剂。因此，可以期待副作用很少。RIM的治疗将来会代替格雷夫斯病的60年以来的药物疗法。
[0137]实施例
[0138]图5表示美国.加利福尼亚大学(UCLA)菅原正博博士实施的3%RM液的元素分析结果。由图可知，钠、钾、硫绝对地多，氯紧跟其后。15%RIM液的分析委托日本食品分析中心，为钠3.35%、钾2.41% (原子吸光)、氯3.4% (电位滴定法)、硫1.79% (钡重量法)，具有大致相同的倾向。
[0139]接着，使用株式会社二 〃 f ^ U寸一 f的X射线微量分析仪分析RM粉末和BIE粉末，其结果示于图6及图7。
[0140]如图所示，RM中钠为15.8%、钾为12.1%、氯为18.4%，显示与日本食品分析中心几乎相同的结果，但发现硫为5.8%、很少，相反硼为11.1%、碳为14.3%、氧为22.0%。
[0141]另外，BIE粉末的钙为18.5%、硅为8.2%、钾为5.5%、氯为4.5%、钠为4.0%、且硫为
2.9%ο另外，氧为36.4%、碳为8.6%ο
[0142]由此，即便加热至糊状也未将氧和碳完全地除去。但是，本来植物中的氧量约为70%、碳约为18%，通过进行糊状化，几乎将氢和氮除去，氧和碳减少至大约一半，因此成为相当的低氧状态，即从富氧的无机复合化合物变成贫氧的无机复合化合物。[0143]图8表示UCLA进行的粉末状RM显示结晶结构。
[0144]图8 (a)为粉末状RM的电子显微镜照片，图8 (b)为利用100%甲醇处理粉末状RIM、将其空气干燥、进行可视化，从而可鲜明地确认结晶结构。
[0145]图9及图10表示株式会社二 〃 f ^ 寸一子进行的RM和BIE利用扫描型电子显微镜获得的结晶结构。图9 (a)为以500倍率拍摄的构成图像，图9 (b)为以1000倍率拍摄的构成图像。图10为以2000倍率拍摄的构成图像。
[0146]另外，图11及图12表不株式会社二 '7 f々I)寸一子进行的利用SEM(扫描型电子显微镜)获得的植物糊状原料粉末的构成图像的图。图11 (a)为以500倍率拍摄的构成图像，图11 (b)为以1000倍率拍摄的构成图像，图12以2000倍率拍摄的构成图像。
[0147]< RIM结晶质的分析>
[0148]接着，利用X射线衍射分析RIM的结晶质。
[0149]图13为将UCLA中RIM结晶的利用X射线衍射获得的结果制成图表的结果。
[0150]图13所示的上面部分的图表表示原始峰、中间部分及下面部分的图表为除去原始峰之外的主峰的图表。如图所示，通过该方法分析的粉末显示多个峰，主要鉴定的2个峰为NaCl(氯化钠)和KC1(氯化钾)。另外,剩余的数个峰为连二亚硫酸钠(Na2S04)、aphitalite(NaK3SO4 )、硫酸钠(Na2SO4)15
[0151]但是，剩余的多个峰无法由JCPDS-1CXD数据库进行鉴定。
[0152]接着，参照图14~图20、图22、图23，对RM粉末及BIE粉末的化合物的定性结果及鉴定进行说明。
[0153]图14~图15为表示利用X射线衍射装置的RIM粉末化合物的定性结果的表。
[0154]如图所示，可见表示RM 粉末中含有 K3Na (SO4)JPNa4 (SO4)h39 (C03) 0.61、Na4(SO4)l45 (CO3) ο.55>Na4 (SO4)l51 (CO3) Q.49、KNa (S04)、KHS、S、Na2S、KNaS、Si02、NaS2、S6、Al(OH) 3、Na2S4 的峰。
[0155]另外，图16~18表示利用X射线衍射装置的BIE粉末化合物的定性结果的表。
[0156]如图所示，可知BIE粉末中含有K2CS3。
[0157]另外，图19为表示利用X射线衍射装置鉴定RM粉末中主要化合物的图表，图20为表示利用X射线衍射装置鉴定RM粉末中KNaS的图表。
[0158]如图所示，可见表示BIE 粉末中含有 NaCl 和 Na6 (CO3) (SO4)2^KCUK3Na (SO4)2'Na4 (SO4)l39 (CO3) 6、S、Na2S物质的峰。另外，图20可见表示BIE粉末中含有KNaS的峰。
[0159]图21为表示人体的水分分布和主要离子的图表。
[0160]如图所示可知，细胞内液及细胞外液的离子组成和RIM或BIE所含矿物成分共同点很多。
[0161]接着，图22为表示利用X射线衍射装置进行的BIE粉末中的CaC03、SiO2, KCl,NaCl, (Ca,Na) (Si，Al) 408鉴定的图，图23为表示利用X射线衍射装置进行的BIE粉末中KNaS鉴定的图表。
[0162]如图所示，可见表示BIE 粉末中含有 CaC03、SiO2, KCl，NaCl，(Ca，Na) (Si，AD4O8的峰。[0163]图23为表示利用X射线衍射装置进行的BIE粉末中KNaS的鉴定的图表。
[0164]如图所示，可见表示BIE粉末中含有KNaS的峰。
[0165]< R頂的非结晶质的分析>
[0166]接着，分析RM的非结晶质 。
[0167]对于RM的非结晶质而言，利用ORP计测定氧化还原电位。结果示于图24。
[0168]如图24所示，在精制水Iml中，氧化还原电位显示+22mV，而2mg的RM的非结晶质的溶解液显示-80mV，5mg的RM的非结晶质的溶解液显示_170mV。
[0169]由该结果可知，RIM显示还原性的部分为非结晶质。
[0170]<关于RM的还原性>
[0171]图25 (a)为表示RM的各浓度下的氧化还原电位的图表，图25 (b)为表示RM的还原性的照片。
[0172]首先，图25 (a)所示的图表表示RM各浓度下的氧化还原电位。如图所示，2~3%浓度的RIM显示-300mV以上的氧化还原电位，高于甲状腺机能亢进的治疗中所用甲巯基咪唑(丽I)所具有的还原力。
[0173]另外，如图25 (b)所示可知，将生锈的金属弹簧(示于上面部分)暴露于2%浓度的RIM中I周时，可以将金属弹簧的锈除去(示于下面部分)，RM具有强大的还原力。
[0174]另外，RM即便是煮沸还是冻结，还原力也不会减少，保持3个月以上稳定的状态。
[0175]<利用RM抑制过氧化物酶-过氧化氢反应>
[0176](I)愈创木酚氧化法
[0177]该分析用于甲状腺过氧化物酶(以下为ΤΡ0)和乳过氧化物酶(以下为LP0)活性的测定。
[0178]在利用TPO (LPO)和过氧化氢生成的四聚愈创木酚的愈创木酚氧化中，测定OD (吸光度)470nm。
[0179]图26表示将RIM对愈创木酚氧化的抑制制成图表的结果，RIM在剂量反应关系中通过LPO催化抑制愈创木酚氧化。
[0180]另外显示，即便是煮沸的RM，也抑制愈创木酚氧化。
[0181]反应混合物在pH7.0、总量Iml的0.05M的磷酸缓冲液中，含有300 μ M的愈创木酌.、10 μ g 的 LPO (Worthington Biochemical, Lakewood, NJ)>1% 的 RIM、ImM 的过氧化氢。将I分钟内测定的吸光度(470nm)考虑为过氧化物酶活性。结果为3个样品的平均值。SD值由于是非常小的值，因此从该图表中排除。
[0182](2)碘化分析方法
[0183]甲状腺激素的形成包括利用过氧化物酶和过氧化氢进行的甲状腺球蛋白的碘化。因此，在体外，在LPO和过氧化氢的存在下进行牛血清白蛋白(BSA)的放射性碘化。
[0184]在37°C下对5mg的BSA、微量的1251-碘化物(20，OOOcpm)、IOOnM的碘化钾、过氧化氢、20 μ g的LPO的反应混合物孵育10分钟，接着为了使反应停止添加100 μ I的冷却过的IM的三氯乙酸(TCA)。由此，产生TCA沉淀物的颗粒，利用PBS洗涤该颗粒后，测定放射线。将结果示于图27。
[0185]图27为表示利用RM抑制碘化的图表。
[0186]如图所示可知，RM在狭窄的范围内抑制了 LPO介导的碘化。由此确认，RM在生理条件下作用于甲状腺。
[0187]< R頂对过氧化物酶反应的抑制>
[0188]首先，为了分析RM对过氧化物酶反应的抑制，检查化合物II形成中的RM的影响和体外的过氧化氢的劣化。化合物I是最活跃的氧化游离自由基，虽然对碘化物氧化产生影响，但由于在0.2秒内消失、因而难以测定。因此，化合物II较稳定，吸光度也能在430nm下进行测定。化合物II水平在LPO和过氧化氢的混合后也可维持(参照图28)。添加了 50 μ I的1%RM的LPO-过氧化氢混合物完全地抑制化合物II，抑制化合物I或化合物II的形成或两者的形成。化合物II由于来源于化合物I，因此化合物I的抑制也可同样地进行说明。另外，由于化合物I和可能的化合物II被利用于碘化物氧化，因此I μ M的碘化钾部分地抑制了化合物II的形成。 [0189]< RIM导致的过氧化氢的分解>
[0190]RM对LPO-过氧化氢的抑制可以通过在无细胞体系中测定利用RM的过氧化氢的分解进行说明。
[0191]作为测定方法，在20 μ M的过氧化氢中混合RM或MMI，常温下放置后测定过氧化氢水平，将结果示于图29。
[0192]图29表示通过RM或丽I强化的分解的图表。
[0193]该测定方法为在96孔板中在20 μ M的过氧化氢的反应缓冲液(总容积50 μ I)中混合RIM,在37°C下定温放置30分钟。此时,添加Amplex red (Invitrogen),在暗室内定温放置30分钟。接着，利用突光全自动定量绘图酶标仪(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)测定560nm的吸光度。如图所示，标准曲线由O~20μΜ的过氧化氢获得，RM或丽I的O浓度表示20 μ M的过氧化氢。
[0194]RIM以剂量反应关系分解过氧化氢。另外，MMI虽然有必要为高浓度，但也可以分解过氧化氢。由此，RIM导致的过氧化氢的分解可以说明LPO-过氧化氢反应的抑制。
[0195]< RIM导致的人甲状腺功能减退>
[0196]RIM的体外数据说明作为抗甲状腺药剂使用，因此重要的是是否在体外抑制甲状腺激素的形成。
[0197]日本的Shunichi Magara医生在复发癌的治疗中日常地使用RM (3%的RM溶液100ml)。由接受该治疗的患者中随机进行选择，进行甲状腺功能的检查，将其结果示于图30。
[0198]使用RM的治疗基于以下的理由。活性氧种(ROS)在肿瘤细胞的多个种类中增加，ROS会增加肿瘤的血管新生。全部患者在结束长期间的化学疗法或放射线疗法后，至少要接受2个月或更长时间的RIM的给药。在治疗前，患者由于在临床上没有甲状腺功能减退的怀疑，因此未接受甲状腺功能检查。另外，所有患者并不是引起非甲状腺疾病的疾病。
[0199]17位患者中的6位(35%)在RM治疗期间患有甲状腺功能减退(4人是亚临床型甲状腺功能减退、2人为显性甲状腺功能减退)。随机选择的17位患者的35%的甲状腺功能减退的发病率即便考虑日本人口的6.5%的甲状腺功能减退的有病率，也是异常高的数值。进而，甲状腺功能减退的6位患者未患有基于TPO抗体检查的桥本氏甲状腺炎(甲状腺功能减退的最一般的原因)。在包含CBC、肝脏及肾功能检查的其他检查中，所有患者(此处未显示)正常。其结果可期待人体中的RM的抗甲状腺作用。[0200]但是，只要其是有效的抗甲状腺药，则所有患者会患上甲状腺功能减退。甲状腺功能减退的较低患病率(35%)是给药方法改变的重要关键。进行推测时，RM的口服基本无法期待效果，但涉及甲状腺的RIM的量是重要的方面。对颈部(甲状腺区域)的局部使用或者直接对甲状腺注射RIM有必要考虑作为RIM治疗是否有效。令人感兴趣的是RIM易于由皮肤吸收。
[0201]<具有还原活性的RM的核心构成要素的鉴定>
[0202]RM的核心构成要素的鉴定在该研究中很重要。该研究中由于必需无机化学和X射线结晶结构解析的专业知识，因此委托UCLA的Saeed 1.Khan博士和Herbert Kaesz教授合作地工作。在RM的核心构成要素的鉴定中，将焦点集中在RM中存在的钠、钾、硫。具体地说，由钠和钾形成的硫化合物或者NaKS的复盐为对象。
[0203]<结晶质的RM的分析>
[0204]RIM结晶的分析为Saeed 1.Khan博士在UCLA的JD.McClloughX射线结晶结构分析研究所进行。首先，使用各种结晶化技术获得高品质的单晶。该想法为选择性地使RIM的多个不同状态之一结晶化。我们为了选择性地抽提RIM的多个不同的相，提出了使用不同的溶媒(丙酮、乙醇、甲醇、甲酰胺(formide)等)的多样性，同时通过单结晶法、粉末法的两者对这些相进行鉴定。
[0205]结晶的性质可通过观察衍射斑进行判断，重叠的斑点作为单晶表示多个结晶。为了进行单晶分析，需要适于该分析的单晶。在单晶分析中使用Bruker Smart 1000 Apex II(Bruker AXS Inc, Madison WI )0 在粉末 X 射线衍射分析中使用 PANalytical X’Pert PRO衍射计(Westborough, MA)。
[0206]<非结晶质RM的分析>
[0207]已知RM具有非结晶质成分(非结晶物质)，水溶性非结晶质在利用ORP计测定时保持良好的还原力。因此，非结晶物质有可能是RM分子的核心。单一的Na2S和/或K2S的由X射线衍射获得斑点的欠缺作为重要的还原源有利地发挥作用。另外，还有I个可能性是仍未鉴定的NaKS化合物的复盐的结构，其结构在Dr.Kaesz (合作者)的预测中不会形成结晶结构。
[0208]为了从水溶性RIM中分离含硫化合物，使用离子交换或高效液相色谱。所分离的成分利用ORP计分析还原力。保持有效还原力的对象样品在进行结晶化之后，利用X射线衍射分析或元素分析进行分析。
[0209]在进行分析时，所关注的方面是基于RIM的含矿物物质的硫化合物和硫化合物的还原电位。在R頂形成的过程中，在液体硫中钠和钾进行作用的硫在2000°C的加热下简单地熔融。而且，高温下的钠和钾向液体硫中的混合可能生成无法预期的硫化合物，尽管具有强有力的硫化合物的还原活性，RIM也不会引起副作用。
[0210]<使用人甲状腺滤泡或甲状腺细胞株的实验>
[0211](I) RM对甲状腺滤泡的生理单位中过氧化氢生成的影响的试验
[0212]在实验中使用的人甲状腺滤泡是由Harbor-UCLA医院的Andrew Gianoukakis博士提供的从格雷夫斯病患者采集、冷冻的物质。在培养该滤胞时，在培养皿的底部涂覆1%浓度的琼脂培养基。当没有该涂覆时，滤胞分离成单层细胞。
[0213]人滤胞在6孔板中可以用2ml的6H培养基(TSH)或5H培养基(无TSH)进行保持。为了测定过氧化氢，在分析的前一天，在1.5mM的氯化钙和8mM的葡萄糖的存在下对滤胞进行预保温。此时，培养基与有无PH7.4的RM (1%的RMO~20 μ I)无关，改变成含有InM的PMA (DUOX2的直接刺激)、1.5mL的氯化钙、8mM的葡萄糖、TSH (O~ImU/ml)的1.2ml的HBSS。
[0214]利用C02培养箱培养该混合物I小时后，为了在吸光度560nm下使用全自动定量绘图酶标仪利用Ampex试剂混合物测定过氧化氢水平，将培养基50 μ I放入到96孔板中。过氧化氢生成量用微摩H202/mg蛋白质进行表示。
[0215](2)甲状腺细胞中的碘有机化的RM效果试验
[0216]甲 状腺滤泡的优势之一是在培养中显示碘有机化。在单层细胞中培养的甲状腺细胞由于3维滤胞形状不足，因此对于碘有机化不恰当。本实验的目的为RIM在细胞水平上是否抑制碘有机化。
[0217]12孔板中的人甲状腺滤泡如上所述，用5H培养基和6H培养基进行培养。在实验的当天，将培养基改变为含有1.5mM的氯化钙、2.8mM的葡萄糖、InM的ΡΜΑ、0~ImU/ml的TSH、0~20μ I的RIM的ρΗ7.4的HBSS0此时，将碘125的碘化物(30，OOOcpm)和IOnM的碘化钾(碘化物载体)的混合物添加在培养基中。培养在C02培养箱中37°C下进行2小时。利用超声波将培养基的所有滤胞分解，用离心机以5000Xg离心10分钟。
[0218](3)通过击倒(knockdown)DUOX和N0X4，测定RM是否主要作用于DUOX介导的或N0X4介导的过氧化氢生成
[0219]首先，进行N0X4和DU0X2的击倒实验。N0X4和DU0X2如何在甲状腺细胞中成为生成过氧化氢的原因还不清楚。因此，测定R頂是否作用于DUOX或N0X4介导的过氧化氢生成。该实验的方法是击倒N0X4或DU0X2基因，以及在有无RM的情况下研究是否生成了过氧化氢。使用合并的4个N0X4 siRNA或DU0X2 siRNA(Dharmacon, Chicag0.1L, siGENOME, SMART pool)和 scrambled siRNA control (Dharmacon)。然后，使用人滤胞来源的单分子层人甲状腺细胞。人甲状腺细胞的初代培养的转染如Weyemi等那样使用JetPEI转染介质(Ployplus，New York，NY)。人甲状腺细胞以无TSH的状态培养3天，接着在合并的N0X4或DU0X2 SiRNA-JetPEI复合体中培养8小时。击倒效率实时地利用定量PCR进行检查，通过免疫组织化学染色检查甲状腺细胞中的N0X4或DU0X2。过氧化氢生成使用下面的样品通过Amplex Red法(Invitrogen)实施。
[0220]使用特定的H202HyPer 蛋白质(30) (Wako Chemical Inc, Richmond, VA)和 02-特异性mitoSOX Red probe (Invitrogen)调查培养细胞中的过氧化氢和氧的细胞内局部化诊断和它们的生成量。结果示于图31。
[0221](4)暴露于RM后的DUOX和N0X4分子的蛋白质印迹试验
[0222]其为研究RM是否直接作用于细胞膜DUOX和细胞内N0X4分子。这是由于RM作用于质膜(参照图32)，而且证明了通过在BHP细胞(未发表记录)中暴露于RM后，细胞内还原电位增加，由此认为RM透过了质膜。在6孔培养皿中，在有无1%RM的情况下，用6H培养基培养人滤胞2小时。然后，根据Song等人从合并的滤胞中获得所培养的滤胞的质膜的一部分。细胞膜的一部分保管在_80°C下直至用于蛋白质印迹法。用于DU0X2和N0X4的兔多克隆抗体分别由 Dr.Jacqueline Van Sande (University Libre de Brussels)和Novus biological、Littleton有限公司获得。我们使用caveolin-1兔多克隆抗体(CellSignaling Technology, Danvers, MA)作为细胞膜蛋白质的内部对照。
[0223]< RIM对cAMP生成的影响>
[0224]该实验为研究RIM是否作用于由细胞膜-THS介导的cAMP生成而形成甲状腺激素的最重要的信号。cAMP的生成具有引起配体(TSH)结合于G蛋白质偶联受体、刺激酶腺苷酸环化酶、催化ATP环化的作用。若该信号受RIM影响，则是抑制甲状腺激素形成的其他机制。
[0225]作为步骤使用FRTL-5细胞。 [0226]24孔中的细胞在C02培养箱中在5H培养基(无THS)中培养5天。实验当天，将培养基改变成HBSS培养基，将pH7.4、P/oRIM的50 μ I添加至一些组中。将细胞暴露于RMlO分钟后，将牛属TSH(lmU/m)或200 μ M的福司柯林(forskolin)添加至一些组中。培养I小时后，将细胞溶解在0.1M的盐酸中，根据处理说明书利用参数cAMP分析试剂盒(R&D Inc.Minneapolis丽)测定细胞内cAMP水平。结果示于图33。
[0227]<无细胞实验>
[0228]进行丽I和RM的抗甲状腺药效能的比较。为了证明作为抗甲状腺药剂的RM的相对效能，通过下面的两个方法比较MMI的抗甲状腺药的效能。
[0229]BSA的放射线碘化在LP0、过氧化氢、1251-碘化物和BSA的存在下进行。在该反应混合物中添加不同浓度的RM或丽I，测定由RM或丽I导致的BSA的放射线碘化的比例。抗甲状腺药的效能通过利用RM或MMI抑制碘化的50%所计算的浓度进行测定。化合物II(用于形成甲状腺激素的过氧化物酶-过氧化氢反应的氧化产物)的R頂或MMI的效能通过化合物II (430nm)的光谱分析进行分析。
[0230]第I实验为在添加LPO和过氧化氢之前，预先混合RM或MMI。反应混合含有RM或MM1、LP0。430nm的吸光度通过岛津分光仪在添加过氧化氢之后立即记录。
[0231]第2实验涉及首先添加LPO和过氧化氢，接着添加RIM或MMI，从而预先形成化合物II。化合物II水平在混合LPO和过氧化氢之后立即进行记录。此时，添加RM或MMI，使用分光仪的运动模式记录化合物II水平的变化3分钟。
[0232]<动物实验>
[0233]动物实验的主要目的为证明RIM是否会诱导可逆性或不可逆性的甲状腺功能减退、甲状腺肿形成或甲状腺萎缩。除此之外，考虑为了治疗格雷夫斯病的RM的局部应用的可能性，对RM的经皮效果进行试验。作为甲状腺实验中通常使用的动物之一，使用Sprague Dawly大鼠。另外，大鼠的性别并不是特别重要。更大年龄的大鼠由于有自发性甲状腺肿或肿瘤的可能性，因此使用I~2个月龄的大鼠。将该大鼠收养在GLA VA病院指定的动物设施中，由具有资格的动物职员或兽医进行饲养。动物实验根据GLA-VAInstitutional Animal Care and Use Committee (IACUC)所制定的指导进行。
[0234]试验性实验通过RM的最佳服用量、对治疗为最佳的持续时间、数据统计功效的分析来获得大鼠的数个信息。另外为了进行数学统计功效分析，使用StatMate (GraphPadSoftware Inc, La Jolla, CA)。结果不于图 34。
[0235]实验结束后，在C02室内处理大鼠。为了测定TSH血清、游离T4、CBC、肾脏、肝脏功能，用Antech Diagnostics, Irvine, CA,通过对心脏进行穿刺立即采集血液样品。颈部为了对甲状腺的大小进行拍摄而实施解剖、进行剥离，将甲状腺取出。甲状腺为了进行显微镜分析，称量重量、切片，进行苏木精-伊红染色。将大鼠甲状腺组织的一部分用于甲状腺的T3和T4的分析。甲状腺激素的含量测定如下进行:利用含有蛋白酶抑制剂混合物的PBS对甲状腺组织进行超声波处理，进行链霉蛋白酶消化(CalbioChem，La Jolla CA)。此时，甲状腺激素用乙醇进行抽提。
[0236]甲状腺组织内含有的T3和T4的总量通过放射免疫测定进行测定。用超声波分解的甲状腺的一定分量用于利用ORP计测定组织还原力。在对照组与进行了 RIM处理组之间进行的甲状腺还原力的比较应该公开甲状腺组织内的RIM效果的存在。
[0237]试验性实验提供用于决定将来的RM的最佳服用量、处理时间(治疗期间)、将来实验所使用的大鼠数的数学统计功效分析的信息。RIM的口服摄取由于RM自消化道的吸收易于变化成无法预测的吸收，因此并未探讨饮料水中的RIM的口服给予。从很小的大鼠甲状腺组织难以测定T3和T4的总量。为了避免该问题，利用蓄积的甲状腺组织进行试验。Dr.GH Pez或病理学者作为合作者研究了大鼠甲状腺组织结构。另外，实际的问题是频繁的RIM的导入。作为备选的选择,对颗粒进行皮下注入,其中Innovative Research ofAmerica提供的定制颗粒用于缓慢释放药剂。有利的方面是可期待RIM有效地到达甲状腺、作为植入部位在颈部使用颗粒。该方法虽然是未进行初步研究，但具有在试验性实验中尝试的价值。
[0238]<甲状腺中RIM的可逆性或不可逆性效果的试验>
[0239]RIM是否会引起永久性或可逆性甲状腺功能减退是在人体中使用时重要的问题。使用大鼠的实验是为了回答这个问题而进行。其中，将其实验计划示于图35。
[0240]RIM的服用量和动物数在试验性实验后进行决定。该实验中不包含对照组(NS导入)。
[0241]< R頂的经皮效果>
[0242]其为RM的局部涂抹是否会穿过皮肤、到达皮肤组织的试验，探讨了 RM对容易感知格雷夫斯甲状腺处的颈部进行局部涂抹。该物质易于由皮肤吸收。首先，作为步骤在该实验中使用Sprague-Dawley大鼠(η = 5)。RIM和通常生理盐水的应用区域为了暴露于皮肤而用电动剃须刀进行剃毛。RIM (5%溶液)或通常生理盐水(对照)为在指定的位置上使用小的画笔进行涂抹，每日2次。进行该实验I周。
[0243]对大鼠进行处理后，由皮肤采集皮肤组织，称量重量，利用PBS (磷酸缓冲生理盐水)进行超声波分解。通过超声波进行了分解的一定分量利用ORP计测定还原力。对来自对照和RM部位的皮肤组织的ORP测定值进行比较。RIM的渗透深度通过测定不同部分(表面组织和很深的组织)的皮肤组织的还原力进行探讨。
[0244]在大鼠颈部上的局部适用认为是用于研究TSH/游离Τ4的血中浓度的局部RIM效果的最实用的方法。但是，大鼠甲状腺与可容易感知的人的甲状腺相比时，被肌肉覆盖。另外，只要不导入浅麻醉，则难以剃除大鼠的颈部区域。
[0245]接着，对具有上述强大还原力的包含钠、钾等正原子价元素和硫的低氧的生物无机化合物复合体的其他药理效果或美容效果等进行说明。
[0246]<关于其他的药理效果>
[0247]具有强大还原力的包含钠、钾、硫的低氧的生物无机化合物复合体利用其强大的还原力，缓和氧化应激状态，进行疾病的改善或修复。例如，为过敏性皮肤炎或足癣等皮肤炎时，通过在患部涂抹RIM的水溶液，可利用强大的还原作用缓和皮肤炎的炎症。另外，对烧伤或伤口、痔疮等也有效果，通过强大的还原力能够进行患部的修复。进而，对肺炎或肿胀物、疼痛或发痒也有效果，通过涂抹在身体表面上可以抑制症状。
[0248]由于该R頂与体液的矿物平衡大致相同，因此通过对RM的0.6~0.8%的液体进行PH调整，可以作为点滴剂进行利用 。
[0249]<关于美容效果>
[0250]具有强大还原力的包含钠、钾等正原子价元素和硫的低氧的生物无机化合物复合体通过混合在肥皂、乳霜、化妆水、美容液等化妆品中进行使用，可以对肌肤赋予适度的刺激和使用时的快感、保持肌肤的湿度、赋予湿润感。另外，通过对氧化状态的肌肤进行涂抹，利用强大的还原力改善肌肤的状态，还可以防止因紫外线对肌肤造成的伤害。另外，还有生发效果。
[0251]<在农业中的利用>
[0252]具有强大还原力的RM或BIE也可以适用于植物或农作物的栽培。
[0253]在RM的0.01~0.1%液中浸溃种子一天，从而将附着在种子上的化学药剂除去，同时使RIM的还原力和自然界的矿物平衡浸溃于种子中。若作为肥料使用时，可以对植物或农作物赋予充分的矿物。另外，通过作为水溶液散布在植物或农作物本身中，可有助于疾病的预防和驱除害虫。另外，通过在所收获的农作物或花草中散布可以进行洗涤且可保持鲜度。另外，还具有人即便直接摄取也不会对人体造成影响的优点。
[0254]<在畜产.养殖中的利用>
[0255]在牛或猪、鸡等畜产或鱼贝类的养殖中，可以利用具有强大还原性的RIM或BIE。通过将该新物质混合在饲料中，不需之前使用的合成饲料或抗生素等，可以安全且耐病地饲养家畜或鱼贝类。
[0256]<在食品中的利用>
[0257]该具有强大还原力的RIM还可以用于食品中。例如，可以用于食品的鲜度保持或鲜味的抽提、洗涤。另外，通过将该RM的水溶液喷雾或浸溃于食品，通过强大的还原力，可以进行食品的杀菌，预防食物中毒。
[0258]接着，对利用具有强大还原力的BIE制造矿物水的装置进行说明。
[0259]图36 Ca)表示矿物洗脱滤器的构成的图，图36 (b)为表示制造矿物水的装置主体的构成的截面图。
[0260]首先，将野草或草木、树叶、海藻燃烧制成灰后，在2000°C下将其熔融，制成粉末状，溶解于水中进行过滤，从而将水溶性的矿物成分除去，获得不溶性植物矿物成分。将该不溶性植物矿物成分制成10 μ m以下的微粉末，作为矿物洗脱滤器I的原料。
[0261]矿物洗脱滤器I是纤维状或网格状的尼龙制滤器，通过热等使上述在2000°C下熔融后的粉末物质和不溶性植物矿物成分吸附在该滤器上。另外，还可添加活性炭或具有杀菌效果的银、矿石等使其吸附。该矿物洗脱滤器I为重叠多张滤器，形成为中空的圆柱状，将其装在比该滤器I的直径更大的外壳2中。
[0262]外壳2上连接有供给自来水的供给管3和取出所生成的矿物水的取水管4。首先将自来水由供给管3供至外壳2内(矿物洗脱滤器I的外侧)。所供给的水通过矿物洗脱滤器I内，由中空部分通过取水管4可获得矿物水。[0263]其中，向外壳2供给自来水、取出矿物水的构造可使用公知的技术进行。
[0264]当使供至外壳2的自来水通过矿物洗脱滤器I中时，自来水中含有的氯吸附在矿物洗脱滤器I上，可以除去。另外，预先吸附在矿物洗脱滤器I上的矿物成分洗脱，可生成含有多量矿物成分的水。进而，通过上述具有强大还原力的RM，将具有氧化力的自来水还原，氧化还原电位(ORP )降低，可以生成显示碱性的矿物水。
[0265]所生成的矿物水当然是最适合生物体的水，可以利用于植物或农作物的栽培或家畜的用水中，另外，由于对人体安全，因此还适于制成食品或进行食品的洗涤。
[0266] 如图37所示，对所生成的矿物水的含有矿物进行测定，为钾1.6mg/100g、钠1.lmg/100g、|丐0.6mg/100g、镁0.2mg/100g、pH9.8,的确显示与体液同样的矿物平衡。
[0267]<实验例>
[0268]50cm型的矿物洗脱滤器(装有活性炭)的性能测试
[0269].使用的水:东京都的自来水
[0270]?水量:以8L/1分的流速使其通过滤器。
[0271]将实验的结果示于图38。
[0272]如上述实验例所示可知，通过矿物洗脱滤器I中的自来水的ORP值降低具有还原力、pH值也变化成碱性。
[0273]另外，将矿物洗脱滤器I设置在空气净化装置或空调机、唤气装置中，通过使污染的空气通过可以将空气净化。污染的空气通过滤器1，则污垢吸附在纤维状或网格状的滤器上，通过还原性的矿物将污染物质还原使其净化。这种装置通过设置在动物的饲养室或植物生产室、吸烟所、卫生间等场所可以发挥效果。
[0274]符号说明
[0275]I 矿物洗脱滤器
[0276]2 外壳
[0277]3 供给管
[0278]4 取水管
【权利要求】
1.一种具有低氧、高还原力的生物无机化合物复合体，其包含植物成分的正原子价的元素和硫的复合化合物，具有高的氧化还原电位。
2.根据权利要求1所述的具有低氧、高还原力的生物无机化合物复合体，其特征在于，所述氧化还原电位具有_500mV~-700mV的实测值的高氧化还原电位(ORP值)。
3.根据权利要求1所述的具有低氧、高还原力的生物无机化合物复合体，其特征在于，其含有像钠、钾这样的正原子价的元素。
4.根据权利要求1所述的具有低氧、高还原力的生物无机化合物复合体，其特征在于，其具有与含有地球上存在的几乎所有元素的体液共同的元素平衡，为水溶性，所述元素以钠、钾等具有正原子价的元素、氯等具有负原子价的元素、S、C032—、SO/—等为中心，不能通过合成化学进行制造。
5.根据权利要求1~4任一项所述的具有低氧、高还原力的生物无机化合物复合体，其特征在于，可利用于甲状腺机能亢进症的治疗用药剂。
6.根据权利要求1~4任一项所述的具有高氧化还原电位的、具有低氧、高还原力的生物无机化合物复合体，其特征在于，可利用于包括过敏性皮肤炎、足癣、皮肤炎、烧伤、伤口、痔疮、肺炎、肿胀、疼痛、发痒的药理疗法。
7.根据权利要求1~4任一项所述的具有高氧化还原电位的、具有低氧、高还原力的生物无机化合物复合体，其特征在于，可作为化妆品利用或者混合在化妆品中进行利用。
8.根据权利要求1~4任一项所述的具有高氧化还原电位的、具有低氧、高还原力的生物无机化合物复合体，其特征在于，可利用于植物或农作物的栽培。
9.根据权利要求1~4任一项所述的具有高氧化还原电位的、具有低氧、高还原力的生物无机化合物复合体，其特征在于，可利用于畜产.养殖用的饲料中。
10.根据权利要求1~4任一项所述的具有高氧化还原电位的、具有低氧、高还原力的生物无机化合物复合体，其特征在于，可利用于食品的鲜度保持、鲜味的抽提、洗涤、杀菌中。
11.根据权利要求1~4任一项所述的具有高氧化还原电位的、具有低氧、高还原力的生物无机化合物复合体，其特征在于，可利用于制造含有很多矿物成分的矿物水。
【文档编号】A61P37/08GK103547274SQ201280021225
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2012年6月29日 优先权日:2011年7月1日
【发明者】中山荣基, 菅原正博 申请人:中山荣基, 平川顺子