一种流感病毒减毒活疫苗及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种流感病毒减毒活疫苗，保藏编号为CCTCCNO:V201302，其基于M基因的突变而制备获得，该疫苗候选株具有较好的基因稳定性，减毒特性，具有较强的免疫原性，不仅能够诱导流感病毒特异性血清抗体和粘膜抗体，也能够诱导产生T细胞的不同亚群和分泌IFN-γ的CD8+T细胞数量，在现有的生产能力和技术下，能够有效的扩大免疫人群，在流感大流行时具有重要的社会意义和使用价值。
【专利说明】一种流感病毒减毒活疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物制品领域，更具体地讲，涉及一种流感病毒减毒活疫苗及其制备 方法。
【背景技术】
[0002] 流感病毒流行大致可以分为世界大流行、局部流行及散发三种。2009年4月以 来，一种新型流感病毒（甲型H1N1)在墨西哥开始蔓延并迅速引起了世界范围内流感大流行 [Mexico flu deaths raise fears of global epidemic. MSNBC. 2009-04-24·]。截止到 2011年5月26日，在全世界范围内共造成了 1,353, 141人感染，死亡人数为15, 934人。
[0003] 预防流感病毒流行的最有效的手段是疫苗接种。
[0004] 与传统的灭活疫苗相比，流感病毒减毒活疫苗具有较多优点，其保留了病毒原有 的部分活性，在接种人群后能通过病毒在上呼吸道复制模拟自然感染，可以诱导机体产生 更全面的免疫应答，使受试者获得更广泛有效的保护。同时减毒活疫苗能够在机体内存在 较长时间，故引起有效免疫应答的时间更加强烈和持久长，更加难得的是一些减毒活疫苗 能够诱导机体产生较强的交叉免疫反应，对表面抗原发生漂变的流行株病毒有一定的交叉 保护作用。此外，其使用方法简便容易。
[0005] 现在，上市的流感病毒减毒活疫苗主要包括美国研制的冷适应减毒活疫苗和俄罗 斯研制的减毒活疫苗。该疫苗在人的正常体温37°C时复制能力受到了极大的限制，对人 不具有或具有较低的致病性能力，但是在25°C和33°C能进行有效的复制的流感病毒株，具 有冷适应和温度敏感的特性[Ambrose CS, Luke C，Coelingh K. Current status of live attenuated influenza vaccine in the United States for seasonal and pandemic influenza.Influenza Other Respi Viruses. 2008, 2 (6): 193-202·]。但是由于专利和知 识产权的限制和保护，该类型的减毒活疫苗还没有在中国批准上市。
[0006] 流感病毒的基质蛋白，在其复制周期中发挥着重要的作用，基质蛋白Ml是流感病 毒颗粒中含量最多的蛋白，参与了病毒壳骨架的构成，此外其还能与病毒的RNA结合，与 RNP复合体相互作用，在病毒的复制和感染中起着重要的作用[Sha B，L uo M. Structure of a bifunctional membrane-RNA binding protein, influenza virus matrix protein Ml.Nat Struct Bio 1.1997,4(3):239-244.]〇Μ2蛋白具有离子通道和调节膜内PH值 的作用，该作用能够影响HA蛋白的构像，从而影响病毒的出芽和感染[Takeuch i K，L amb R A. Influenza virus M2protein ion channel activity stabilizes the native form of fowl plague virus hemagglutinin during intracellular transport.J Virol. 1994,68(2) :911-919.]。基于以上理由，本发明研究了基于M基因突变制备流感病 毒减毒活疫苗的方法和技术。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的第一个技术问题是，提供一种流感病毒减毒活疫苗。
[0008] 本发明所要解决的第二个技术问题是，提供一种流感病毒减毒活疫苗的制备方 法。
[0009] 本发明所要解决的第三个技术问题是，提供突变的Μ基因在制备预防流感疫苗制 剂中的应用。
[0010]为了解决上述第一个技术问题，本发明提供了一种流感病毒减毒活疫苗，其保藏 编号为：CCTCC N0:V201302。
[0011] 为了解决上述第二个技术问题，本发明提供了流感病毒减毒活疫苗的制备方法， 其特征在于，包括以下步骤：
[0012] (1)从接种流感病毒的鸡胚尿囊液中抽提病毒的RNA，利用RT-PCR的技术制备 cDNA，扩增流感病毒的基因片段，分别构建到表达质粒上；
[0013] (2) Μ基因定点突变，构建到质粒上并测序验证，突变后的Μ基因序列如SEQ ID NO. 1所示；
[0014] (3)突变的Μ基因质粒和未突变的其他基因质粒共同转染293T细胞；
[0015] (4)细胞培养上清接种鸡胚，验证稳定性、减毒特性，以及安全性和有效性评价。
[0016] 作为一个优选方案，所述流感病毒为Α型流感病毒。
[0017] 为了解决上述第三个技术问题，本发明提供了突变的Μ基因在制备预防流感疫 苗制剂中的应用，其特征在于，所述突变的Μ基因序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0018] 作为一个优选方案，所述疫苗制剂的免疫方式是经鼻腔免疫。
[0019] 作为又一个优选方案，所述流感病毒为A型流感病毒。
[0020] 本发明所要保护的流感病毒减毒活疫苗命名为甲型流感病毒Influenza Virus A M-PR8(下称M-PR8)，保藏在中国典型培养物保藏中心(保藏地址：湖北省武汉市武昌区珞珈 山路16号武汉大学中国典型培养物保藏中心邮编430072)，保藏日期为2013年3月5 日，保藏编号为CCTCC N0:V201302。
[0021] 本发明的有益效果：本发明提供了一种流感病毒减毒活疫苗，基于Μ基因的突变 而制备获得，该疫苗候选株具有较好的基因稳定性，减毒特性，具有较强的免疫原性，诱导 机体强烈的免疫应答，不仅能够诱导流感病毒特异性血清抗体和粘膜抗体，也能够诱导产 生Τ细胞的不同亚群和分泌IFN-Y的⑶8+Τ细胞数量，在现有的生产能力和技术下，能够 有效的扩大免疫人群，在流感大流行时具有重要的社会意义和使用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0022] 图1 :本发明实施的技术路线图。
[0023] 图2 :对比M-PR8和PR8流感病毒在MDCK细胞上的生长水平，分别在MDCK细胞上 接种0. 001Μ0Ι的PR8和M-PR8,分别收获接种后24h，48h，72h，96h的样本，使用半数组织感 染剂量的方法检测各个样本的病毒滴度。*表示与PR8组比较有显著性差异（P < 0. 05)。
[0024] 图3 :肺部病毒滴度，每组3只6-8周龄小鼠，滴鼻接种20μ 1 105TCID50剂量 MPR8或PR8病毒液，3天后处死小鼠，使用2ml的PBS (含0. 1%BSA)冲洗气管-肺泡，使用 半数组织感染剂量的方法检测各个样本的病毒滴度，*表示与PR8组比较有显著性差异（P < 0· 05)。
[0025] 图4:不同剂量的M-PR8疫苗免疫三周后，检测其脾细胞中IFN- γ的分泌水平。每 组3只6-8周龄小鼠，分别滴鼻接种20 μ 110TCID50, 100TCID50,1000TCID50剂量M-PR8病 毒液，对照组滴鼻接种20μ 1的PBS，21天后处死小鼠，分离脾细胞，使用ELISPOT assay检 测脾细胞中IFN-γ的分泌水平，*表示与对照组比较有显著性差异（P < 0. 05)。
[0026] 图5:分析疫苗免疫后的小鼠的脾细胞中⑶3+⑶4+T细胞的频率，A，阴性对照； B，10TCID50 免疫组；C，100TCID50 免疫组；D，1000TCID50 免疫组。
[0027] 图6 :分析疫苗免疫后的小鼠的脾细胞中⑶3+⑶8+T细胞的频率，A，阴性对照； B，10TCID50 免疫组；C，100TCID50 免疫组；D，1000TCID50 免疫组。
[0028] 图7:不同剂量的M-PR8免疫小鼠在10XLD5(I剂量的同源病毒PR8致死攻击后体 重变化。
[0029] 图8:不同剂量的M-PR8免疫小鼠在10XLD5(I剂量的同源病毒PR8致死攻击后的 存活率。
[0030] 图9:不同剂量的M-PR8免疫小鼠在10 X LD5(I剂量的异源病毒H9N2致死攻击后体 重变化。
[0031] 图10:不同剂量的M-PR8免疫小鼠在10XLD5(I剂量的异源病毒H9N2致死攻击后 的存活率。
【具体实施方式】
[0032] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无 特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途 径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例 中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室 手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制 造厂商所建议的条件。
[0033] 实施例1.流感病毒减毒活疫苗的制备
[0034] 从接种A/Puerto Rico/8/34(HlNl)病毒的鸡胚尿囊液中抽提病毒的RNA，利用 RT-PCR的技术制备cDNA，扩增流感病毒的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS八个基因片段。利 用重叠 PCR的方法分别在Μ基因上引入突变，突变后的Μ基因序列如SEQ ID NO. 1所示。在 转染试剂脂质体Lip〇fectamine2000辅助下八质粒共同转染293T细胞。72小时后，收获样 本，接种10日龄鸡胚，48-72小时后，收获鸡胚尿囊液，血凝实验和基因抽提、测序验证病毒 序列的正确性。该毒株命名为M-PR8。
[0035] M-PR8毒株Μ基因序列（突变后序列）
[0036] agcgaaagca tgtagatatt gaaagatgag tcttctaacc gaggtcgaaa cgtacgtact ctctatcatc ccgtcagggc ccctgaaagc cgagatcgca cagagacttg aagatgtctt tgcagggaag aacactgatc ttgaggttct catggaatgg ctaaagacaa gaccaatcct gtcacctctg actaagggga ttttaggatt tgtgttcacg ctcaccgtgc ccagtgagcg aggactgcag cgtagacgct ttgtccaaaa tgcccttaat gggaacgggg atccaaataa catggacaaa gcagttaaac tgtataggaa gctcaagagg gagataacat tccatggggc caaagaaatc tcactcagtt attctgctgg tgcacttgcc agttgtatgg gcctcatata caacaggatg ggggctgtga ccactgaagt ggcatttggc ctggtatgtg caacctgtga acagattgct gactcccagc atcggtctca taggcaaatg gtgacaacaa ccaatccact aatcagacat gagaacagaa tggttttagc cagcactaca gctaaggcta tggagcaaat ggctggatcg agtgagcaag cagcagaggc catggaggtt gctagtcagg ctagacaaat ggtgcaagcg atgagaacca ttgggactca tcctagctcc agtgctggtc tgaaaaatga tcttcttgaa aatttgcagg cctatcagaa acgaatgggg gtgcagatgc aacggttcaa gtgatcctct cgctattgcc gcaaatatca ttgggatctt gcacttgaca ttgtggattc ttgatcgtct ttttttcaaa tgcatttacc gtcgctttaa atacggactg aaaggagggc cttctacgga aggagtgcca aagtctatga gggaagaata tcgaaaggaa cagcagagtg ctgtggatgc tgacgatggt cattttgtca gcatagagct ggagtaaaaa actacattgt ttctact。
[0037] 所述的M基因突变序列，不仅适用于所描述的A型流感减毒活疫苗，其它型别流感 减毒活疫苗也在使用范围之内，比如B型流感减毒活疫苗。
[0038] 实施例2. M-PR8生物学特性的研究
[0039] 1)基因稳定性研究：在MDCK细胞上接种M-PR8病毒株，连续传10代，收取第1、5、 10代细胞培养上清，抽提总RNA，反转录成cDNA，PCR扩增基因，构建到PMD18-T Vector上， 进行序列测定，软件比对基因，鉴定突变毒株能否稳定传代。
[0040] 2)病毒株细胞水平上生长特性研究：按照0. 001M0I接种病毒，分别测定病毒感染 后24, 48, 72, 96小时的TCID5(I，用来对比M-PR8病毒与PR8病毒的生长情况。
[0041] 3)减毒特性的研究：用戊巴比妥钠腹腔麻醉小鼠，每只小鼠经鼻滴注20 μ L105TCID5(I的病毒液，3天后，麻醉断颈处死，无菌解剖，取肺，用病毒稀释液洗涤支气 管-肺泡灌洗液3次，离心，分装，用细胞半数感染剂量检测小鼠肺部病毒滴度。
[0042] 4)流感病毒减毒活疫苗候选株M-PR8病毒免疫原性的研究：
[0043] 免疫程序和步骤：6-8周龄的雌性BALB/c小鼠共分4组：① M-PR8病毒株 (1000TCID50)，② M-PR8 病毒株（100TCID50)③ M-PR8 病毒株（10TCID50)④ PBS 空白对 照组。一次免疫后21天，取血和鼻腔洗液，用于抗体滴度检测，并同时分离脾脏细胞，用于 ELISP0T检测分泌IFN- γ的T细胞和流式细胞仪检测T细胞亚群。
[0044] a抗体检测：
[0045] (1)用10 μ g/ml的PR8全病毒灭活疫苗包被96孔酶标板，4°C，孵育过夜。
[0046] (2)用PBST洗涤三次后，加入100 μ 1 PBST溶液(含8%脱脂奶粉)，37°C放置1小 时。
[0047] (3)血清或鼻腔洗液使用封闭液稀释后加入酶标板，37°C反应1小时。
[0048] (4)PBST洗涤三次，每孔加入100μ 1标记HRP的羊抗鼠二抗工作夜，37°C放置1 小时。
[0049] (5) PBST洗涤三次，每孔加入100 μ 1 TMB液，室温反应15-30分钟。
[0050] (6)每孔加入50 μ 12Μ的H2S04终止反应，用酶标仪检出450nm出的0D值，记录数 据，用对照组的平均值加上2SD，作为阳性结果的判断标准。
[0051] b酶联免疫斑点实验（ELISPOT):
[0052] 为了检测小鼠的细胞免疫应答水平，使用ELISP0T检测了小鼠脾脏淋巴细胞分泌 的细胞因子IFN-γ的情况，简单介绍如下：
[0053] (1)预包被板的活化：每孔加入200 μ 1 DMEM，室温静置lOmin，扣出液体。
[0054] (2)加入细胞悬液：每孔加入100 μ 1浓度为IX 103Cells/μ 1脾脏单核细胞。
[0055] (3)加入刺激物：3复孔只加入100 μ 1 DMEM,用作背景负对照，在正对照孔中加 入10 μ 1工作浓度的PMA和Ionomycin，负对照孔中加入10 μ 1 DMEM，实验组加入终浓度 10 μ g/ml的PR8全病毒灭活苗。
[0056] (4)培养：37°C，5%C02细胞培养箱中培养24hr。
[0057] (5)裂解细胞：倾倒扳内的培养基和细胞，加入200 μ 1预冷的去离子水，4°C放置 lOmin，低渗裂解细胞。
[0058] (6)洗板：甩去孔内液体，用200 μ 1/孔1 XWashing buffer洗5次。
[0059] (7)检测抗体：每孔加入100 μ 1稀释好的生物素标记的一抗，37°C孵育1小时。
[0060] (8)洗板：甩去孔内液体，用200 μ 1/孔1 XWashing buffer洗6次。
[0061] (9)酶联亲和素孵育：每孔加入100 μ 1稀释好的酶表亲和素工作液，37°C孵育1小 时。
[0062] (10)洗板：甩去孔内液体，用200 μ 1/孔1 XWashing buffer洗5次。
[0063] (11)显色：每孔加入100 μ现用现配的AEC显色液，室温避光显色30min左右。
[0064] (12)终止：倾倒孔内液体，打开底座，用去离子水洗涤5遍正反面，将板放置于阴 凉处室温晾干。
[0065] (13) ELISP0T斑点计数，统计分析数据。
[0066] ELISP0T斑点计数是由达科为生物技术有限公司读数。
[0067] C流式细胞仪检测⑶4+，⑶8+的T细胞亚群：
[0068] (1)脾细胞标本：取有盖的Falcon管分别编号，编号1阴性对照、编号2⑶3,编号 3⑶3 +⑶4、编号4⑶3 +⑶8、编号5⑶3 +⑶4 +⑶8+，这六管用于用于调节补偿和电压， 其余的实验组分别做好标记，用于检测，每管中分别加入500μ 1106个对应的细胞。
[0069] (2)取出Falcon管，用2%FCS_PBS洗两遍，lOOOrpm，离心5分钟。慢慢吸出上清。
[0070] (3)按照管上标记分别加入1 μ g⑶3APC，1 μ g⑶4FITC或1 μ g⑶8PE荧光抗体， 实验组加入三种荧光抗体，混匀，室温避光孵育15分钟。
[0071] (4)每管加入2ml含3%PBS-PBS，1000rpm，离心5分钟，洗两遍，留下200μ 1上清， 用枪吹打均匀细胞。
[0072] (5)上机检测：在CellQuest软件下，获取10万个细胞。
[0073] (6)数据统计分析
[0074] 实施例3.流感病毒减毒活疫苗M-PR8候选株能提供针对同源病毒保护
[0075] 免疫程序和步骤：6-8周龄的雌性BALB/c小鼠共分分4组：① M-PR8病毒株 (1000TCID50)，② M-PR8 病毒株（100TCID50)③ M-PR8 病毒株（10TCID50)④ PBS 空白对照 组。免疫一次，21天后10LD50的PR8攻毒，病毒攻击后3天，取支气管-肺泡灌洗液测定 病毒滴度，其余的观察体重变化和存活率。
[0076] 病毒滴度的测定：将气管-肺洗液作系列10倍稀释，用每个稀释度感染培养于 96孔板中的MDCK细胞(密度约为80%?90%)，每个稀释度平行接种4个细胞孔，并将感 染细胞置于C0 2培养箱中。37°C培养72hr后，血凝试验检测每个温度下病毒的滴度，用 Reed-Muench方法计算TCID5(I。每个实验组病毒滴度是用每组所有5只小鼠样本的病毒滴 度的平均值土 SD来表示。
[0077] 实施例4.流感病毒减毒活疫苗候选株M-PR8能提供针对异亚型病毒保护
[0078] 免疫程序和步骤：6-8周龄的雌性BALB/c小鼠共分3组：① M-PR8病毒株 (1000TCID50)，② M-PR8 病毒株（100TCID50)③ M-PR8 病毒株（10TCID50)④ PBS 空白对照 组。免疫一次，21天后10LD50的H9N2攻毒，病毒攻击后3天，取支气管-肺泡灌洗液测定 病毒滴度，其余的观察体重变化和存活率。
[0079] 实验结果：
[0080] 1)病毒株遗传稳定性测定：M-PR8病毒株接种MDCK细胞进行连续传代10代，分别 取第1，5, 10代基因测序，比对基因序列，结果表明基因序列没有发生突变，证明了毒株具 有较好的遗传稳定性。
[0081 ] 2 ) M-PR8病毒株生长特性研究：按0. 001M0I接种病毒，分别测定病毒感染后 24, 48, 72, 96小时的病毒滴度，用来对比M-PR8病毒株与PR8病毒株的生长情况。如图2所 不，接种后24小时，2株病毒的的生长没有明显的差异。72小时时，M_PR8病毒株与PR8病 毒株相比，其病毒滴度降低了约300多倍，证明了病毒的复制能力有了较大的减弱，初步证 明了 M-PR8病毒株具有减弱毒力的特性。
[0082] 3)减毒特性的研究：每只小鼠经鼻滴注20 μ 1105TCID50的M-PR8或者PR8病毒 液，3天后取肺部支气管灌洗液，测定病毒滴度。结果表明滴注M-PR8病毒株组的平均病毒 滴度l〇g 1(l3. 5TCID50/ml，PR8病毒感染组的平均滴度为log1(l6. 4TCID50/ml，二者具有显著 性的差异，说明M-PR8在呼吸道内的复制受到了有效的抑制，显示了该毒株具有减毒或者 弱毒的特性（图3)
[0083] 4) M-PR8病毒株免疫原性
[0084] a :ELISA 抗体：
[0085] 为了评价壳M-PR8减毒活疫苗能否诱导小鼠产生特异性抗体应答能力，小鼠免疫 后21天采用眼球静脉取血的方法收集血清，通过ELISA方法测定血清中PR8特异性IgG抗 体。结果表明（表1)，1000TCID 5(IM-PR8组具有最高的血清抗体和鼻腔洗液抗体，且抗体滴度 的增加存在剂量依赖关系。
[0086] 表1经鼻免疫不同剂量的M-PR8疫苗在小鼠中诱导机体产生的抗体应答水平
[0087]
【权利要求】
1. 一种流感病毒减毒活疫苗，其保藏编号为：CCTCC NO:V201302。
2. 权利要求1所述流感病毒减毒活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 从接种流感病毒的鸡胚尿囊液中抽提病毒的RNA，利用RT-PCR的技术制备cDNA，扩 增流感病毒的基因片段，分别构建到表达质粒上； (2) Μ基因定点突变，构建到质粒上并测序验证，突变后的Μ基因序列如SEQ ID NO. 1 所示； (3) 突变的Μ基因质粒和未突变的其他基因质粒共同转染293T细胞； (4) 细胞培养上清接种鸡胚，验证稳定性、减毒特性，以及安全性和有效性评价。
3. 根据权利要求2所述流感病毒减毒活疫苗的制备方法，其特征在于，所述流感病毒 为Α型流感病毒。
4. 突变的Μ基因在制备预防流感疫苗制剂中的应用，其特征在于，所述突变的Μ基因序 列如SEQ ID NO. 1所示。
5. 根据权利要求4所述突变的Μ基因在制备预防流感疫苗制剂中的应用，其特征在于， 所述疫苗制剂的免疫方式是经鼻腔免疫。
6. 根据权利要求4所述突变的Μ基因在制备预防流感疫苗制剂中的应用，其特征在于， 所述流感病毒为Α型流感病毒。
【文档编号】A61P31/16GK104056276SQ201310090753
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2013年3月20日 优先权日:2013年3月20日
【发明者】陈则, 易应磊 申请人:上海生物制品研究所有限责任公司