含锶硅酸钙生物陶瓷及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及含锶硅酸钙生物陶瓷及其制备方法和应用，所述含锶硅酸钙生物陶瓷的化学组成通式为Ca1-xSrxSiO3，其中x=0.015～0.25，所述含锶硅酸钙生物陶瓷为陶瓷颗粒或多孔陶瓷。本发明将锶掺杂入硅酸钙生物陶瓷所获得的含锶硅酸钙陶瓷兼具硅酸钙陶瓷和锶的优点，具有良好的生物活性、降解性，其降解释放的硅离子具有良好的促进骨细胞的增殖、刺激成骨基因的表达。此外，材料降解形成的碱性微环境可以达到中和骨质疏松骨的酸性微环境，而降解释放的锶离子则具有良好的促成骨和抑制破骨细胞活力的双重功能。因此，在治疗伴随骨质疏松症的骨缺损修复领域中具有广阔的应用前景。
【专利说明】 含锶硅酸钙生物陶瓷及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及含锶硅酸钙生物陶瓷及其制备方法、以及作为骨质疏松骨缺损修复材料的应用，属生物材料领域。
【背景技术】
[0002]由于人口老龄化进程的快速到来，我国已成为世界上骨质疏松症患者最多的国家。据不完全统计，患者总数已达到总人口数的7%。而每年因骨质疏松症而并发骨折的发病率已超过9%，因而已成中老年骨病及致残的主要原因之一。特别是骨质疏松导致髋关节骨折，一年内病死率高达20%，生存一年以上者约25%丧失基本活动能力。然而，由于骨质疏松导致骨的脆裂性和极低的骨量使传统骨折内固定技术根本无法实现。到目前为止，其预防和治疗的手段仍然令人十分失望。因此，骨质疏松类骨缺损修复材料的研究和开发越来越受到该领域专家学者的重视。
[0003]研究表明，硅酸盐基生物材料如生物活性玻璃和生物活性陶瓷具有良好的成骨性能，其优良的生物活性和降解性通过两方面的表达促进新骨的再生:降解释放的硅(Si)组分能促进成骨细胞的增殖和诱导基因表达，其次通过碱性离子的释放调控局部PH值偏碱性，因而促进羟基磷灰石的沉积，这两方面的诱导作用是材料具有特殊生物活性的关键因素[B1materials, 2004;25:2941-8 ；J.Mater.Sc1.:Mater.Med., 2006;17:967-978.],并在临床应用中得到验证。
[0004]我们近期的研究结果显示:硅酸钙生物陶瓷的生物活性和降解性明显优于传统临床应用的磷酸钙类生物陶瓷，并具有明显的刺激成骨细胞和骨髓干细胞增殖和分化的能力，并通过碱性离子的释放能对周边溶液的PH值进行调控，因而诱导类骨磷灰石的沉积[J.B1med.Mater.Res.，2007; 80B: 174-83.];动物实验结果已表明硅酸钙生物陶瓷具有良好的生物相容性、骨诱导活性和骨修复性能，且其降解性和骨修复性能明显优于临床应用中的磷酸钙类生物陶瓷、其优良的生物活性具有促进成骨细胞增殖和骨组织再生的性能[B1materials, 2008; 29 (17): 2588-2596.；B1materials, 2013; 34 (I): 64-77.;Acta B1materialia, 2012;8:350-360.]。此外，硅酸钙生物陶瓷降解导致的材料周边局部升高的PH值可能对调控和中和由于机体老化而引起的体内酸性代谢产物的累积起到积极作用。据报道[J Cell B1Chem2008; 105:655-62.]，破骨细胞往往在酸性环境下被激活，但随着pH的升高而丧失活性。Kaunitz和Yamaguchi特别指出[J CellB1chem2008 ;105:655-62.]，骨重建过程中的局部碱性环境(pH>9)很有可能存在，因为碱性磷酸酶依赖于碱性的微观环境，同时这种碱性的环境直接诱导羟基磷灰石的沉积。同时据美国卫生研究院(NIH)报道，素食主义者发生骨质疏松的概率要明显低于其他人群，这种现象被归结于碱性食物对体内PH值的调控作用。而对于骨质疏松类骨流失的骨重建，提高局部PH值很有可能是一个关键的重要环节。而硅酸钙材料的降解往往由于碱性离子的释放而提供碱性的微环境，因而有助于改变由于体制酸化而导致的局部微环境失衡，因而可以看作是一种潜在的局部PH值调控材料，有助于局部中和由于酸性体质而导致的骨流失，并通过调控成骨细胞与破骨细胞通道，进而恢复细胞间的平衡。
[0005]锶(Sr)作为人体微量元素能明显抑制骨吸收，同时促进新骨的形成。因而含锶的口服药(如:Strontium Renalate, SrR)已被广泛研究和报道,尤其对绝经后中老年妇女骨质疏松症有特别的疗效。其机理在于锶不仅能促进成骨细胞的增殖，更关键在于对破骨细胞有明显的抑制作用，从而不仅能促进骨再生、还具有延缓骨吸收的功效。研究还表明锶组分能够起到促进骨蛋白和DNA的合成、提高碱性磷酸酶含量、促进骨的成长和矿化，并有效地抑制骨吸收，从而达到进一步增进骨密度的效果[B1materials，2005, 26:4073-83.；Bone,1996;18:253-8.； J B1med Mater Res, 2006;77B:409-15.]。
[0006]因此，在硅酸钙具有良好生物活性、降解性、降解释放形成碱性微环境、以及降解释放的硅离子还具有特异的促进骨系细胞的增殖和成骨分化的基础上，将具有抑制破骨细胞活力和促进成骨细胞活力的锶离子掺杂引入硅酸钙材料体系，制备获得的含锶硅酸钙生物陶瓷有望在治疗伴随骨质疏松症的骨缺损修复领域中具有广阔的应用前景。
[0007]综上所述，利用硅酸钙陶瓷促进成骨细胞增殖和成骨以及降解产生的碱性pH环境，与锶对破骨细胞生长抑制作用相结合，设计制备掺锶硅酸钙生物活性陶瓷，并系统研究锶掺入量与材料生物学特性的关系，对于进一步设计和制备用于修复骨质疏松骨缺损的新型可降解生物活性材料具有重要意义和创新性。然而，含锶硅酸钙生物陶瓷材料应用于骨质疏松骨缺损修复领域的应用还未见报道。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于基于骨质疏松骨症的病症特点、以及骨质疏松骨缺损修复的特定要求，通过材料的活性组成设计与材料制备的特点将可降解生物活性的含锶硅酸钙生物陶瓷应用于骨质疏松骨缺损修复用，以满足老龄化人群中骨缺损修复的需要。
[0009]在此，一方面，本发明提供一种生物可降解含锶硅酸钙生物陶瓷，所述含锶硅酸钙生物陶瓷的化学组成通式为CahSrxS13，其中x=0.015?0.25，所述含锶硅酸钙生物陶瓷为陶瓷颗粒或多孔陶瓷。
[0010]本发明将锶掺杂入硅酸钙生物陶瓷所获得的含锶硅酸钙陶瓷兼具硅酸钙陶瓷和锶的优点，具有良好的生物活性、降解性，其降解释放的硅离子具有良好的促进骨细胞的增殖、刺激成骨基因的表达。此外，材料降解形成的碱性微环境可以达到中和骨质疏松骨的酸性微环境，而降解释放的锶离子则具有良好的促成骨和抑制破骨细胞活力的双重功能。因此，在治疗伴随骨质疏松症的骨缺损修复领域中具有广阔的应用前景。
[0011]在一个优选的实施形态中，所述含锶硅酸钙生物陶瓷为含锶硅酸钙生物陶瓷颗粒，所述陶瓷颗粒的颗粒度可以为10nm?2.5mm,优选为300 μ m?2.5mm。
[0012]在另一个优选的实施形态中，所述含锶硅酸钙生物陶瓷为含锶硅酸钙多孔陶瓷，所述多孔陶瓷的孔隙率可以为45?75%，孔径可以为200?800 μ m。
[0013]另一方面，本发明提供制备上述含锶硅酸钙生物陶瓷的第一方法，包括:以可溶性钙盐为钙源、以可溶性锶盐为锶源、以可溶性硅酸钠为硅源，按化学计量比配料后经化学共沉淀法制得含锶硅酸钙陶瓷粉体；以及将所述含锶硅酸钙陶瓷粉体于800?1300°C煅烧I?5小时、球磨过筛制得含锶硅酸钙生物陶瓷颗粒。
[0014]再一方面，本发明提供制备上述含锶硅酸钙生物陶瓷的第二方法，包括:以可溶性钙盐为钙源、以可溶性锶盐为锶源、以可溶性硅酸钠为硅源，按化学计量比配料后经化学共沉淀法制得含锶硅酸钙陶瓷粉体；将所述含锶硅酸钙陶瓷粉体于800?1300°C煅烧I?5小时、球磨过筛制得颗粒度为10nm?450 μ m的含锶硅酸钙生物陶瓷颗粒；将所述含锶硅酸钙生物陶瓷颗粒与造孔剂混合后干压成型制得含锶硅酸钙多孔素坯，其中所述造孔剂质量为所述锶硅酸钙生物陶瓷颗粒的20?70% ；以及将所述含锶硅酸钙多孔素坯于900?1400°C煅烧I?5小时制得含锶硅酸钙多孔陶瓷。
[0015]较佳地，所述造孔剂可以为聚乙二醇、聚乙烯醇、石蜡、和/或聚苯乙烯-二乙烯苯。
[0016]较佳地，所述造孔剂的颗粒度范围可以为100?900 μ m，优选300?700 μ m。
[0017]较佳地，所述干压成型可以是在所述含锶硅酸钙生物陶瓷颗粒与造孔剂的混合物中加入所述混合物质量的I?5%的黏结剂，混合均匀后，在钢模中以2?1MPa的压力干压成型，所述黏结剂为经造孔剂饱和的浓度为I?10%的聚乙烯醇。
[0018]较佳地，所述化学共沉淀法可以是将可溶性钙盐和可溶性锶盐的混合水溶液滴入到硅酸钠水溶液中，或将硅酸纳水溶液滴入到可溶性钙盐和锶盐的混合水溶液中，搅拌8?24小时、过滤、洗涤、以及烘干所得沉淀。
[0019]较佳地，在所述可溶性钙盐和锶盐的混合水溶液中，Ca2+和Sr2+离子的总浓度范围为0.05?2.0摩尔/升；在所述硅酸钠水溶液中，Si032_离子浓度范围为0.05?2.0摩尔/升。
[0020]又一方面，本发明还提供所述含锶硅酸钙生物陶瓷作为骨质疏松骨缺损修复材料的应用。本发明的材料特点及应用领域主要是从骨质疏松骨缺损修复的临床应用特点出发，去设计用于骨质疏松骨缺损修复用的含锶硅酸钙生物陶瓷材料。其材料设计的思想是:之前研究表明硅酸钙陶瓷有良好的促进成骨细胞细胞、骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化，并具有良好的诱导类骨磷灰石的沉积以及良好的降解性。而文献报道:锶元素具有双重功能——促进成骨细胞或骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化，并具有抑制破骨细胞的活力。因此，我们拟通过这硅酸钙陶瓷的促进骨修复性能与锶元素的双重功能(双重功能指促成骨、抑制破骨)相结合，将其应用于骨质疏松骨缺损修复的领域。而如何证实含锶硅酸钙生物陶瓷在骨质疏松骨缺损修复领域有用，我们开展了体外细胞培养与体内骨缺损修复实验。1、体外我们采用2类细胞——(I)成骨细胞方面，图1说明锶掺杂能促进成骨细胞增殖和成骨分化；(2 )针对骨质疏松症病人的特点，我们采用去卵巢大鼠模型(OVX-rat，模拟了绝经期导致女性骨质疏松模型)，该模型的骨髓间充质干细胞具有成骨活力(包括细胞增殖、成骨分化)降低，但向破骨细胞分化能力加强。因此，我们用数据验证掺锶硅酸钙能促进骨质疏松症下骨髓间充质干细胞的增殖与成骨分化，但能够提高骨保护素(0PG，可以保护成骨细胞)的表达、并抑制破骨细胞的活性因子RANKL的表达(即达到抑制破骨细胞活力的目的)。
[0021]所述含锶硅酸钙生物陶瓷将具有良好的骨质疏松骨缺损修复性能，在骨质疏松骨缺损的修复领域具有独特优势。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1a为MG-63成骨细胞在不同锶掺杂量的含锶硅酸钙陶瓷表面培养1、3和7天后的增殖情况；
图1b为MG-63成骨细胞在不同锶掺杂量的含锶硅酸钙陶瓷表面培养1、3和7天后的碱性磷酸酶(ALP)的表达情况；
图2为纯硅酸钙(CS)和含摩尔比10%的含锶硅酸钙(SrCS)生物陶瓷材料浸提液浓度对BMSCs-OVX的增殖作用，表明在1/64?1/8的浸提液浓度范围内，锶的掺杂显著促进BMSCs-OVX 的增殖；
图3a为纯硅酸钙(CS)和含摩尔比10%的含锶硅酸钙(SrCS)生物陶瓷材料1/32浸提液浓度下对BMSCs-OVX的碱性磷酸酶(ALP)表达作用的染色图；
图3b为图3a的定量分析结果图，表明CS和SrlOCS均能显著刺激BMSCs-OVX的ALP表达、而含锶硅酸钙材料具有最佳性能；
图4为纯硅酸钙(CS)和含摩尔比10%的含锶硅酸钙(SrCS)生物陶瓷材料1/32浸提液浓度下对BMSCs-OVX的Real-time PCR分析结果，研究结果表明CS和SrCS在早期(4天)都能明显促进BMSCs-OVX的成骨分化，而锶的掺杂则能持续增强相关的成骨基因(如RUNX2、BSP、0CN, VEGF等)的表达、并增强骨保护素(OPG)的高表达；而锶掺杂还能持续抑制BMSCs-OVX细胞中关键破骨因子——RANKL的表达。表明含锶硅酸钙生物陶瓷能够促进骨质疏松骨症病人的骨髓间充质干细胞的成骨分化、并抑制骨吸收；
图5为纯硅酸钙(CS)和含摩尔比10%的含锶硅酸钙(SrCS)生物陶瓷材料颗粒(尺寸300-450 μ m)植入0VX_rat颅骨缺损4和8周后的组织学切片(A)、新骨生成量(B)、植入材料的残余量(C)。图中灰色为骨组织、黑色为残留的硅酸钙(CS)或含锶硅酸钙(SrCS)陶瓷材料。研究表明:锶掺杂显著提高了骨质疏松骨缺损的修复进程。证实了含锶硅酸钙生物陶瓷具有良好的骨质疏松骨缺损修复性能；
图6为纯硅酸钙(CS)和含摩尔比10%的含锶硅酸钙(SrCS)多孔生物陶瓷材料植入OVX-rat股骨头缺损部位4周后的组织学切片(Al和A2为硅酸钙(CS)材料，BI和B2为含锶硅酸钙(SrCS)材料)、新骨生成量(C)、植入材料的残余量(D)。图中灰色为骨组织、黑色为残留的硅酸钙(CS)或含锶硅酸钙(SrCS)陶瓷材料。研究表明:锶掺杂显著提高了骨质疏松骨缺损的修复进程。证实了含锶硅酸钙生物陶瓷具有良好的骨质疏松骨缺损修复性能。
【具体实施方式】
[0023]以下结合附图和下述实施方式进一步说明本发明，应理解，附图及下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。
[0024]研究表明，硅(Si )组分能促进成骨细胞的增殖和刺激成骨基因表达。硅酸钙材料具有良好的生物活性和降解性，其降解释放的Si离子能够良好刺激成骨细胞、骨髓简充值干细胞的的增殖和成骨分化。动物体内植入实验研究结果证实硅酸钙生物陶瓷具有较传统临床应用的磷酸钙类生物陶瓷更好的促成骨活性和降解性。同时，硅酸钙陶瓷还具有良好的生物活性，在细胞培养液环境和体内植入环境下数小时内即可释放出硅离子，并在表面沉积上类骨磷灰石。类骨磷灰石的沉积有利于诱导成骨，并于宿主骨之间形成良好的骨性彡口口 ?
[0025]此外，硅酸钙陶瓷材料还具有降解后形成碱性微环境的特性。研究表明:骨质疏松症病人由于机体老化而引起的体内酸性代谢产物的累积，而破骨细胞往往在酸性环境下被激活，进而促进骨吸收，但破骨细胞会随着pH的升高而丧失活性。近期的研究也证实:在骨质疏松骨流失的骨重建中，提高局部PH值很有可能是一个关键的重要环节。因此，硅酸钙生物陶瓷降解性成的碱性微环境特性可以起到调控和中和由于机体老化而引起的体内酸性代谢产物的累积，从而达到缓和甚至抑制局部酸性微环境形成的功能。
[0026]临床应用研究证实锶(Sr)作为人体微量元素能明显抑制骨吸收，同时促进新骨的形成。如含银的口服药(如:Strontium Renalate, SrR)已被广泛研究和报道,在绝经后中老年妇女骨质疏松症预防领域有较好的疗效。其机理在于锶不仅能促进成骨细胞的增殖，更关键在于对破骨细胞有明显的抑制作用，从而不仅能促进骨再生、还具有延缓骨吸收的功效。
[0027]将锶掺杂入硅酸钙生物陶瓷制备获得的含锶硅酸钙陶瓷将具有良好的生物活性、降解性，其降解释放的硅离子具有良好的促进骨细胞的增殖、刺激成骨基因的表达。此外，材料降解形成的碱性微环境可以达到中和骨质疏松骨的酸性微环境，而降解释放的锶离子则可能具有良好的促成骨和抑制破骨细胞活力的双重功能。
[0028]综上所述，含锶硅酸钙生物陶瓷将可能具有良好的骨质疏松骨缺损修复性能，在骨质疏松骨缺损的修复领域具有独特优势。
[0029]因此，本发明提供一种生物可降解含锶硅酸钙生物陶瓷，其化学组成通式为CahSrxS13,其中 x=0.015 ?0.25。
[0030]通过将锶掺杂入硅酸钙生物陶瓷，使得本发明的含锶硅酸钙生物陶瓷兼具硅酸钙陶瓷和锶的优点，具有良好的生物活性、降解性，其降解释放的硅离子具有良好的促进骨细胞的增殖、刺激成骨基因的表达。此外，材料降解形成的碱性微环境可以达到中和骨质疏松骨的酸性微环境，而降解释放的锶离子则具有良好的促成骨和抑制破骨细胞活力的双重功能。因此，在治疗伴随骨质疏松症的骨缺损修复领域中具有广阔的应用前景。
[0031]本发明的含锶硅酸钙生物陶瓷可以形成为不同的性状。在一个示例中，本发明的含锶硅酸钙生物陶瓷为含锶硅酸钙生物陶瓷颗粒。其颗粒度为10nm?2.5_，优选为300 μ m?2.5_。在另一个示例中，本发明的含锶硅酸钙生物陶瓷为含锶硅酸钙多孔陶瓷，其孔隙率为45?75%,孔径为200?800 μ m。
[0032]在含锶硅酸钙生物陶瓷为含锶硅酸钙生物陶瓷颗粒的情况下，其制备方法包括:以可溶性钙盐为钙源、以可溶性锶盐为锶源、以可溶性硅酸钠为硅源，按化学计量比配料后经化学共沉淀法制得含锶硅酸钙陶瓷粉体；以及将所述含锶硅酸钙陶瓷粉体于800?1300°C煅烧I?5小时、球磨过筛制得含锶硅酸钙生物陶瓷颗粒。具体地，作为示例，可以包括以下步骤。
[0033](I)以可溶性钙盐为钙源、以可溶性锶盐为锶源、以可溶性硅酸钠为硅源，按化学计量比(Ca^SrxS13, x=0.015?0.25)分别称取原料，将可溶性钙盐和可溶性锶盐溶于水配制成混合溶液，以使钙离子和锶离子的总浓度为0.05?2.0mol/L ;将硅酸钠溶于水配制成硅酸钠水溶液，以使Si032_离子浓度为0.05?2.0moI/L0其中，可溶性钙盐包括但不限于硝酸钙和/或氯化钙，可溶性锶盐包括但不限于硝酸锶和/或氯化锶。
[0034](2)按(Ca+Sr)与Si等摩尔比的物料反应，将Na2S13溶液加入钙和锶的混合水溶液中，或将钙和锶的混合水溶液加入Na2S13水溶液中，物料加毕后继续搅拌8?24小时，过滤并用去离子水洗涤、过滤、烘干得到的粉体。
[0035](3)将上述粉体于800?1300°C煅烧I?5小时，球磨过筛后得到颗粒度为10nm?2.5mm(优选为300 μ m?2.5mm)的颗粒，即为本发明的含银娃酸I丐生物陶瓷颗粒。
[0036]在含锶硅酸钙生物陶瓷为含锶硅酸钙多孔陶瓷的情况下，其制备方法包括:以可溶性钙盐为钙源、以可溶性锶盐为锶源、以可溶性硅酸钠为硅源，按化学计量比配料后经化学共沉淀法制得含锶硅酸钙陶瓷粉体；将所述含锶硅酸钙陶瓷粉体于800?1300°C煅烧I?5小时、球磨过筛制得颗粒度为10nm?450 μ m的含锶硅酸钙生物陶瓷颗粒；将所述含锶硅酸钙生物陶瓷颗粒与造孔剂混合后干压成型制得含锶硅酸钙多孔素坯，其中所述造孔剂质量为所述锶硅酸钙生物陶瓷颗粒的20?70% ；以及将所述含锶硅酸钙多孔素坯于900?1400°C煅烧I?5小时制得含锶硅酸钙多孔陶瓷。具体地，作为示例，可以包括以下步骤。
[0037](I)以可溶性钙盐为钙源、以可溶性锶盐为锶源、以可溶性硅酸钠为硅源，按化学计量比(Ca^SrxS13, x=0.015?0.25)分别称取原料，将可溶性钙盐和可溶性锶盐溶于水配制成混合溶液，以使钙离子和锶离子的总浓度为0.05?2.0mol/L ;将硅酸钠溶于水配制成硅酸钠水溶液，以使Si032_离子浓度为0.05?2.0mol/L。其中，可溶性钙盐包括但不限于硝酸钙和/或氯化钙，可溶性锶盐包括但不限于硝酸锶和/或氯化锶。
[0038](2)按(Ca+Sr)与Si等摩尔比的物料反应，将Na2S13溶液加入钙和锶的混合水溶液中，或将钙和锶的混合水溶液加入Na2S13水溶液中，物料加毕后继续搅拌8?24小时，过滤并用去离子水洗涤、过滤、烘干得到的粉体。
[0039](3)将上述粉体于800?1300°C煅烧I?5小时，球磨过筛制得颗粒度为10nm?450 μ m的含锶硅酸钙生物陶瓷颗粒。
[0040](4)将上述含锶硅酸钙生物陶瓷颗粒与造孔剂混合后，采取干压成型法，即在上述的混合料中加入I?5% (质量百分比)经造孔剂饱和的浓度为I?10%的PVA (聚乙烯醇)作黏结剂，混合均匀后，在钢模中以2?1MPa的压力干压成型得到多孔材料素坯，然后将素坯在900?1400°C煅烧I?5小时得到本发明的含锶硅酸钙多孔陶瓷。其中，造孔剂包括但不限于聚乙二醇、聚乙烯醇、石蜡、和/或聚苯乙烯-二乙烯苯等有机或高分子材料，其颗粒度范围为100?900 μ m,优选300?700 μ m。另外，在此作为示例选取PVA为黏结剂，但不限于此，例如还可以选取聚乙烯缩丁醛、聚乙烯吡咯烷酮等作为黏结剂。
[0041]〈性能评价〉
(I)体外细胞评价 I)细胞模型的构建:
健康成骨细胞模型:采用国际通用的成骨细胞株——MG-63细胞株，研究锶掺杂对成骨细胞增殖和碱性磷酸酶的表达作用。采用MG-63成骨细胞在陶瓷表面培养，并检测细胞的增殖和碱性磷酸酶(ALP)的表达情况；
骨质疏松症细胞模型:将健康的6个月龄的雌性大鼠的卵巢切除，卵巢切除术后饲养3个月后形成骨质疏松症大鼠模型。然后，按细胞生物学实验标准方法提取大鼠的骨髓间充质干细胞(简称:BMSCs-0VX)。该细胞很好地模拟了女性绝经期后因雌性激素大量下降导致的骨质疏松症、及其骨质疏松症环境下骨髓间充质干细胞的成骨分化能力降低而向破骨细胞分化能力增强的特性，是美国食品药品监督管理局(FDA)推荐的用于研究骨质疏松骨治疗相关的药物和医疗器械的标准细胞模型之一。
[0042]2)材料对骨质疏松症大鼠来源的骨髓间充质干细胞的增殖、分化的作用研究: 采用国家标准推荐的材料浸提液细胞培养方法考察材料不同浸提液浓度对BMSCs-OVX
的增殖、成骨分化特性研究。重点研究浸提液及其浓度对BMSCs-OVX细胞的增殖，成骨基因和骨保护素的表达、以及抑制向破骨细胞分化的关键基因(选取骨质疏松症下最有代表性的RANKL基因)表达作用。并以常规的不添加材料浸提液的细胞培养液培养模型作对照组。
[0043](2)体内动物植入实验
I)骨质疏松症动物模型的构建:
将健康的6个月龄的雌性大鼠的卵巢切除，卵巢切除术后饲养3个月后形成骨质疏松症大鼠(简称:0VX-rat)模型。OVX-rat很好地模拟了女性绝经期后因雌性激素大量下降导致的骨质疏松症病症，是FDA推荐的用于研究骨质疏松骨治疗相关的药物和医疗器械的标准细胞模型之一。
[0044]2)材料OVX-rat体内植入与评价实验
按动物植入实验的标准操作规程，将颗粒状以及多孔结构的含锶硅酸钙、以及纯硅酸钙陶瓷植入OVX-rat的颅骨缺损、以及股骨头缺损部位，采用组织学方法定量评价材料植入4、8周后的体内促成骨和降解性能。
[0045]参见图1a和图lb，其分别示出MG-63成骨细胞在不同锶掺杂量的含锶硅酸钙陶瓷表面培养1、3和7天后的增殖和碱性磷酸酶(ALP)的表达情况。从中可知，与纯硅酸钙相t匕，本发明的含锶硅酸钙生物陶瓷能够显著促进成骨细胞的增殖(图1a)和碱性磷酸酶的表达(图lb)。
[0046]参见图2，其示出纯硅酸钙(CS)和含摩尔比10%的含锶硅酸钙(SrCS)生物陶瓷材料浸提液浓度对BMSCs-OVX的增殖作用。从中可知，在1/64?1/8的浸提液浓度范围内，锶的掺杂显著促进BMSCs-OVX的增殖。
[0047]参见图3a和图3b，其分别示出纯硅酸钙(CS)和含摩尔比10%的含锶硅酸钙(SrCS)生物陶瓷材料1/32浸提液浓度下对BMSCs-OVX的碱性磷酸酶(ALP)表达作用的染色图(图3a)和定量分析结果(图3b)。从中可知，CS和SrlOCS均能显著刺激BMSCs-OVX的ALP表达、而含锶硅酸钙材料具有最佳性能。
[0048]参见图4，其示出纯硅酸钙(CS)和含摩尔比10%的含锶硅酸钙(SrCS)生物陶瓷材料1/32浸提液浓度下对BMSCs-OVX的Real-time PCR分析结果。从中可知，CS和SrCS在早期(4天)都能明显促进BMSCs-OVX的成骨分化，而锶的掺杂则能持续增强相关的成骨基因(如RUNX2、BSP、0CN、VEGF等)的表达、并增强骨保护素(OPG)的高表达；而锶掺杂还能持续抑制BMSCs-OVX细胞中关键破骨因子——RANKL的表达。表明含锶硅酸钙生物陶瓷能够促进骨质疏松骨症病人的骨髓间充质干细胞的成骨分化、并抑制骨吸收。
[0049]参见图5，其示出纯硅酸钙(CS)和含摩尔比10%的含锶硅酸钙(SrCS)生物陶瓷材料颗粒(尺寸300-450 μ m)植入OVX-rat颅骨缺损4和8周后的组织学切片(A)、新骨生成量(B)、植入材料的残余量(C)。图中灰色为骨组织、黑色为残留的硅酸钙(CS)或含锶硅酸钙(SrCS)陶瓷材料。结合该图和组织学统计分析可知，含锶硅酸钙生物陶瓷的新骨生成量达11.77 ± 1.60%，显著高于CS组(8.07 ±2.34%)。证实了含锶硅酸钙生物陶瓷具有良好的骨质疏松骨缺损修复性能。
[0050]参见图6，其示出纯硅酸钙(CS)和含摩尔比10%的含锶硅酸钙(SrCS)多孔生物陶瓷材料植入OVX-rat股骨头缺损部位4周后的组织学切片(Al和A2为硅酸钙(CS)材料，BI和B2为含锶硅酸钙(SrCS)材料)、新骨生成量(C)、植入材料的残余量(D)。图中灰色为骨组织、黑色为残留的硅酸钙(CS)或含锶硅酸钙(SrCS)陶瓷材料。结合该图和组织学统计分析可知，含锶硅酸钙生物陶瓷的新骨生成量达11.77 ± 1.60%，显著高于CS组(8.07 ±2.34%)。证实了含锶硅酸钙生物陶瓷具有良好的骨质疏松骨缺损修复性能。
[0051]下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的温度、时间等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。
[0052]实施例1
所用的原材料如上文所述，取0.45mol的Ca (NO3) 2和0.05mol的Sr (NO3) 2溶于100mL去离子水中，将0.5mol的Na2S13溶于100mL去离子水中。将上述的Na2S13溶液加入到Ca(NO3)2溶液中，加毕继续搅拌12小时，抽滤并用去离子水洗涤3次，在80°C烘干12小时得到干粉体，球磨并过100目尼龙网筛后在1100°C煅烧3小时，得到成分SrlOCS的粉体；此外，通过以0.475mol的Ca(NO3)2和0.025mol的Sr(NO3)2溶于100mL去离子水中，并与100mL浓度为0.5mol/L的Na2S13水溶液反应，获得Sr5CS的粉体。而通过以0.4mol的Ca(NO3)2和0.1mol的Sr (NO3)2溶于100mL去离子水中，并与100mL浓度为0.5mol/L的Na2S13水溶液反应，获得Sr20CS的粉体；
同时，采用摩尔比1:1的Ca(NO3)2与Na2S13水溶液反应，获得纯硅酸钙(CS)材料做对照样品用；
将上述制备得到的Sr5CS、SrlOCS和Sr20CS的粉体在900°C煅烧2小时过筛获得150目以下的粉体。采用干压成型方法并于1090度煅烧3小时获得含CS、Sr5CS、SrlOCS和Sr20CS的陶瓷样品；
将MG-63成骨细胞种植于含CS、Sr5CS、SrlOCS和Sr20CS陶瓷样品表面，并培养1、3和7天进行锶含量与细胞增殖关系评价。图1a和图1b表明与纯硅酸钙相比，本发明的含锶硅酸钙生物陶瓷能够显著促进成骨细胞的增殖(图1a)和碱性磷酸酶的表达(图lb)。
[0053]实施例2
所用的原材料如上文所述。将沉淀法制备得到的CS和SrlOCS粉体于1150度煅烧5小时，然后过筛分离获得300-450微米的颗粒作为骨质疏松骨缺损修复用材料；
将CS和SrlOCS颗粒的浸提液与BMSCs-OVX细胞培育，以评价材料对骨质疏松骨来源的骨髓间充质干细胞的作用。图2结果显示在1/64?1/8的浸提液浓度范围内，锶的掺杂显著促进BMSCs-OVX的增殖。表明锶的掺杂能够显著促进骨质疏松病症病人的骨髓间充质干细胞的增殖能力。图3a为CS和SrlOCS生物陶瓷材料1/32浸提液浓度下对BMSCs-OVX的碱性磷酸酶(ALP)表达作用的染色图，定量分析结果(图3b)表明CS和SrlOCS均能显著刺激BMSCs-OVX的ALP表达、而含锶硅酸钙材料具有最佳性能。显示锶掺杂能够显著促进骨质疏松病症病人的骨髓间充质干细胞的早期成骨增殖能力。图4为CS和SrlOCS生物陶瓷材料1/32浸提液浓度下对BMSCs-OVX的Real-time PCR分析结果。研究结果表明CS和SrCS在早期(4天)都能明显促进BMSCs-OVX的成骨分化，而锶的掺杂则能持续增强相关的成骨基因(如RUNX2、BSP、OCN、VEGF等)的表达、并增强骨保护素(OPG)的高表达；而锶掺杂还能持续抑制BMSCs-OVX细胞中关键破骨因子——RANKL的表达。表明含锶硅酸钙生物陶瓷能够促进骨质疏松骨症病人的骨髓间充质干细胞的成骨分化、并抑制骨吸收。图5为CS和SrlOCS植入OVX-rat股骨头缺损部位4和8周后的组织学切片(A)、新骨生成量(B)、植入材料的残余量(C)。组织学统计分析表明SrlOCS的新骨生成量达11.77±1.60%，显著高于CS组(8.07±2.34%)。证实了含锶硅酸钙生物陶瓷具有良好的骨质疏松骨缺损修复性倉泛。
[0054]实施例3
所用的原材料如上文所述。将沉淀法制备得到的CS和SrlOCS粉体于900度煅烧3小时，然后过筛分离获得小于150目的粉体。按质量比40:60% (陶瓷粉体:PEG)，将陶瓷粉体与300-450微米的PEG颗粒混合，加入陶瓷颗粒质量6%的浓度为6%的PVA溶液作黏结剂，调均匀后，于6MPa干压成型获得直径为6_的圆片，脱模获得多孔材料的素坯。将素坯以2V /min的升温速率升至400°C，保温2小时，之后以2V /min的升温速率升至1090°C，并保温2小时，随炉冷却。制得CS和SrlOCS多孔陶瓷材料；
将多孔陶瓷植入到OVX-rat的颅骨缺损部位4周后，评价其体内成骨与降解性。图6为CS和SrlOCS多孔陶瓷植入OVX-rat颅骨缺损4周后的组织学切片(Al和A2为CS材料，BI和B2为Sr 1CS材料、新骨生成量(C )、植入材料的残余量(D )。图中灰色为骨组织、黑色为残留的硅酸钙(CS)或含锶硅酸钙(SrCS)陶瓷材料。组织学统计分析表明SrlOCS的新骨生成量达11.77 ± 1.60%，显著高于CS组(8.07 ±2.34%)。证实了含锶硅酸钙生物陶瓷具有良好的骨质疏松骨缺损修复性能。
[0055]本发明的材料特点及应用领域主要是从骨质疏松骨缺损修复的临床应用特点出发，去设计用于骨质疏松骨缺损修复用的含锶硅酸钙生物陶瓷材料。其材料设计的思想是:之前研究表明硅酸钙陶瓷有良好的促进成骨细胞细胞、骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化，并具有良好的诱导类骨磷灰石的沉积以及良好的降解性。而文献报道:锶元素具有双重功能——促进成骨细胞或骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化，并具有抑制破骨细胞的活力。因此，我们拟通过这硅酸钙陶瓷的促进骨修复性能与锶元素的双重功能(双重功能指促成骨、抑制破骨)相结合，将其应用于骨质疏松骨缺损修复的领域。而如何证实含锶硅酸钙生物陶瓷在骨质疏松骨缺损修复领域有用，我们开展了体外细胞培养与体内骨缺损修复实验。1、体外我们采用2类细胞——(I)成骨细胞方面，图1说明锶掺杂能促进成骨细胞增殖和成骨分化；(2)针对骨质疏松症病人的特点，我们采用去卵巢大鼠模型(OVX-rat，模拟了绝经期导致女性骨质疏松模型)，该模型的骨髓间充质干细胞具有成骨活力(包括细胞增殖、成骨分化)降低，但向破骨细胞分化能力加强。因此，我们用数据验证掺锶硅酸钙能促进骨质疏松症下骨髓间充质干细胞的增殖与成骨分化，但能够提高骨保护素(0PG，可以保护成骨细胞)的表达、并抑制破骨细胞的活性因子RANKL的表达(即达到抑制破骨细胞活力的目的)。
[0056]从以上可知，本发明的含锶硅酸钙生物陶瓷具有良好的成骨活性、降解性，其降解释放的锶、硅离子具有良好的促进骨细胞的增殖、刺激成骨基因的表达。此外，材料降解形成的碱性微环境可以达到中和骨质疏松骨的酸性微环境，而降解释放的锶离子则可能具有良好的促成骨和抑制破骨细胞活力的双重功能。因此，本发明的含锶硅酸钙生物陶瓷可以应用于骨质疏松骨缺损修复材料。
【权利要求】
1.一种生物可降解含锶硅酸钙生物陶瓷，其特征在于，所述含锶硅酸钙生物陶瓷的化学组成通式为CahSrxS13，其中x=0.015?0.25，所述含锶硅酸钙生物陶瓷为陶瓷颗粒或多孔陶瓷。
2.根据权利要求1所述的含锶硅酸钙生物陶瓷，其特征在于，所述陶瓷颗粒的颗粒度为 10nm ?2.5mm ,优选为 300 μ m ?2.5mm。
3.根据权利要求1所述的含锶硅酸钙生物陶瓷，其特征在于，所述多孔陶瓷的孔隙率为45?75%，孔径为200?800 μ m。
4.一种制备权利要求1或2所述的含锶硅酸钙生物陶瓷的方法，其特征在于，包括: 以可溶性钙盐为钙源、以可溶性锶盐为锶源、以可溶性硅酸钠为硅源，按化学计量比配料后经化学共沉淀法制得含锶硅酸钙陶瓷粉体；以及 将所述含锶硅酸钙陶瓷粉体于800?1300°C煅烧I?5小时、球磨过筛制得含锶硅酸钙生物陶瓷颗粒。
5.一种制备权利要求1或3所述的含锶硅酸钙生物陶瓷的方法，其特征在于，包括: 以可溶性钙盐为钙源、以可溶性锶盐为锶源、以可溶性硅酸钠为硅源，按化学计量比配料后经化学共沉淀法制得含锶硅酸钙陶瓷粉体； 将所述含锶硅酸钙陶瓷粉体于800?1300°C煅烧I?5小时、球磨过筛制得颗粒度为10nm?450 μ m的含银娃酸I丐生物陶瓷颗粒； 将所述含锶硅酸钙生物陶瓷颗粒与造孔剂混合后干压成型制得含锶硅酸钙多孔素坯，其中所述造孔剂质量为所述锶硅酸钙生物陶瓷颗粒的20?70% ;以及 将所述含锶硅酸钙多孔素坯于900?1400°C煅烧I?5小时制得含锶硅酸钙多孔陶瓷。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述造孔剂为聚乙二醇、聚乙烯醇、石蜡、和/或聚苯乙烯-二乙烯苯，所述造孔剂的颗粒度范围为100?900 μ m，优选300?700 μ m。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述干压成型是在所述含锶硅酸钙生物陶瓷颗粒与造孔剂的混合物中加入所述混合物质量的I?5%的黏结剂，混合均匀后，在钢模中以2?1MPa的压力干压成型，所述黏结剂为经造孔剂饱和的浓度为I?10%的聚乙烯醇。
8.根据权利要求4至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述化学共沉淀法是将可溶性钙盐和可溶性锶盐的混合水溶液滴入到硅酸钠水溶液中，或将硅酸纳水溶液滴入到可溶性钙盐和锶盐的混合水溶液中，搅拌8?24小时、过滤、洗涤、以及烘干所得沉淀。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在所述可溶性钙盐和锶盐的混合水溶液中，Ca2+和Sr2+离子的总浓度范围为0.05?2.0摩尔/升；在所述硅酸钠水溶液中，Si032_离子浓度范围为0.05?2.0摩尔/升。
10.权利要求1至3中任一项所述的含锶硅酸钙生物陶瓷作为骨质疏松骨缺损修复材料的应用。
【文档编号】A61L27/54GK104436295SQ201310439715
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2013年9月25日 优先权日:2013年9月25日
【发明者】常江, 林开利, 金晓刚 申请人:中国科学院上海硅酸盐研究所