格瑞克霉素b在制备抗胶质瘤的药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于医学领域，公开了格瑞克霉素（Grincamycin）B化合物在制备抗胶质瘤的药物中的应用。本发明中格瑞克霉素B对恶性胶质瘤细胞有选择性作用，拥有非常好的生物活性，格瑞克霉素B通过诱导瘤细胞和肿瘤干细胞凋亡及阻滞细胞于G0-G1期；格瑞克霉素B有效抑制胶质瘤克隆的形成；格瑞克霉素B有效抑制胶质瘤干细胞的形成；格瑞克霉素B有效抑制胶质瘤干细胞干性基因的表达，能有效抑制胶质瘤干细胞的自我更新作用，是一个潜在的抗肿瘤药物，为靶向肿瘤干细胞（CSC）的肿瘤治疗提供了新的方案和药物，对提高肿瘤治疗效果，改善患者生存质量具有重要意义。
【专利说明】格瑞克霉素B在制备抗胶质瘤的药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于医学领域，涉及格瑞克霉素B化合物的新应用，特别涉及格瑞克霉素B化合物在制备抗胶质瘤的药物中的应用。
【背景技术】
[0002]恶性肿瘤是严重危害人类健康的高发病率和高致死率疾病。胶质瘤
[0003](glioma)是由神经外胚层分化而来的胶质细胞(星形胶质细胞、少突胶质细胞和室管膜等)引发的肿瘤，在颅内肿瘤中发病率位列第一。根据WH02007年中枢神经系统肿瘤分类，恶性胶质瘤定义为高于或等于WHO III级的胶质细胞瘤，具体包括间变性星形细胞瘤(III级)、间变性少突胶质细胞瘤(III级)、间变性少突星形细胞瘤(III级)、胶质母细胞瘤(IV级)和巨细胞胶质母细胞瘤(IV级)，其中前三者可统称为“间变性胶质瘤”。恶性胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤,恶性胶质瘤的发病率约为5~8/10万，约占所有胶质细胞瘤的50%。在美国，每年新增病例有14000例，近20年来发病率呈上升趋势。而且，因恶性胶质瘤呈浸润性无限制增生、与正常脑组织无明显界限并富含血管，还具有高复发率和低治愈率。虽经多年努力，其死亡率和致残率仍很高，间变型星形细胞瘤的中位生存期为2~5年，胶质母细胞瘤仅为12~15个月。
[0004]目前恶性胶质瘤的治疗已发展为手术、放疗和化疗联合的综合治疗模式。各治疗方法在改善患者生存、提高患者生活质量方面协同发挥作用，由于恶性胶质瘤具有侵袭性强的特点，致使神经外科手术无法完全切除，而后续进行的放疗和化疗又难以彻底地消除残存肿瘤细胞，这些细胞最终引起肿瘤的复发，导致患者预后差，死亡率高。恶性胶质瘤对传统的放疗和化疗不敏感，即使经过多年发展，目前治疗效果仍并不能令人满意，并且手术后一旦复发，愈后差，平均生存时间只有12~15个月。
[0005]近年研究发现，在多种实体瘤中均有为数不多的细胞具有无限增殖、自我更新、多向分化等类似干细胞的特征，并由此提出了 “肿瘤干细胞假说”，该假说认为肿瘤中大部分细胞经过短暂增殖分化后凋亡，只有一小部分细胞具有再生肿瘤的能力，将其与机体其它干细胞作比拟，称之为肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSCs)。肿瘤干细胞理论的提出，促使研究者重新审视恶性胶质瘤及其生物学特性。研究表明，恶性胶质瘤中存在胶质瘤干细胞(glioma stem cells, GSCs),这群细胞在胶质瘤中含量甚微,但却有很强的自我更新和多向分化能力，在肿瘤的发生、发展中都起着关键作用。人们先后从恶性胶质瘤组织中成功分离并证实了脑肿瘤干细胞的存在，人恶性胶质瘤干细胞已成功分离、鉴定。研究显示，这部分细胞具有不同于肿瘤内其它亚群细胞的增殖和自我更新能力，人胶质瘤干细胞能在无血清、无外源性生长因子的培养液(serum-free medium w ithout exogenous grow thfactor, SGFF-M)中增殖、更新形成神经球样细胞球,这些细胞球细胞具有胶质瘤干细胞的特点。恶性胶质瘤干细胞的自我更新不依赖于外源性细胞因子，它可能拥有自我更新的自身活化机制。肿瘤干细胞是肿瘤发生、复发、侵袭、转移的“根源”。抑制肿瘤干细胞的自我更新作用可以消除肿瘤的复发、侵袭等恶性性质，因此，抑制肿瘤干细胞的自我更新是治愈肿瘤行之有效的新策略，具有重要的临床意义。
[0006]目前从海洋微生物代谢产物中，发现了几类化合物结构新颖、抗肿瘤细胞生物活性强，海洋微生物代谢产物已经成为国内外抗癌药物研究与开发的热点。
[0007]海洋放线菌包括链霉菌属(Streptomyces)、小单孢菌属(Micromonosporas)、红球菌属(Rhodococcus)、诺卡氏菌属(Nocardias)、游动放线菌属(Actinoplanes)等,近年还发现很多新菌属，如Salinisporas属、Verrucosisporas属等。近年来,从海洋放线菌中发现的活性物质有很多种，如含氮杂环类、大环内酯类、肽类、氨基糖苷类、醚类、酮类、萜类、酯类、醌类等。它们有广泛的生物活性。由于自身特殊的生存环境，海洋放线菌具有复杂独特的代谢途径，产生了诸多结构新颖、生物活性显著的次级代谢产物，为新药物的发现提供了丰富的先导化合物，其中有些已经进入临床前研究。 [0008]格瑞克霉素系列化合物是深海放线菌次级代谢产物，最开始发现格瑞克霉素在 1987 (Hayakawa, Y.; Iwakiri, T.; Imamura, K.; Seto, H.; Otake, N.J.Antibiot.1987,40，1785-1787)，发现格瑞克霉素能够抑制小鼠白血病细胞P388的生长。目前已研究证实了格瑞克霉素系列化合物能够抑制肿瘤细胞的增殖并诱导其凋亡，具有抗HepG2肝癌，Sff-1990膜腺癌，HeLa宫颈癌,NC1-H460肺癌和MCF-7乳腺癌的作用。但迄今为止，格瑞克霉素系列化合物是否具有抗肿瘤干细胞的作用及是否具有抑制恶性胶质瘤肿瘤干细胞的作用尚未见报道。
【发明内容】
[0009]本申请的发明人通过对深海放线菌次级代谢产物抗肿瘤细胞株生物活性筛选，发现深海放线菌次级代谢产物格瑞克霉素B对恶性胶质瘤细胞株拥有非常好的生物活性，格瑞克霉素B的化学结构式如式I所示:
[0010]
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[0011]本发明的目的在于提供了格瑞克霉素B化合物的新应用，寻找新的抗肿瘤先导化合物。
[0012]为实现上述目的，本发明的技术方案为:
[0013]格瑞克霉素B在制备治疗I父质瘤的药物中的应用。
[0014]进一步，所述胶质瘤为恶性胶质瘤。
[0015]进一步，所述治疗胶质瘤的药物为抗胶质瘤干细胞的药物。
[0016]进一步，所述治疗胶质瘤的药物为诱导胶质瘤细胞和/或胶质瘤干细胞凋亡的药物。[0017]进一步，所述治疗胶质瘤的药物为阻滞胶质瘤细胞和/或胶质瘤干细胞细胞分裂周期的药物。
[0018]进一步，所述治疗胶质瘤的药物为抑制胶质瘤克隆形成的药物。
[0019]进一步，所述治疗胶质瘤的药物为抑制胶质瘤干细胞形成的药物。
[0020]进一步，所述治疗胶质瘤的药物为抑制胶质瘤干细胞干性基因表达的药物。
[0021]格瑞克霉素B在制备抗肿瘤的药物中的应用，所述抗肿瘤的药物为抗肿瘤干细胞的药物。
[0022]本发明的有益效果:本发明提供了格瑞克霉素B在制备抗胶质瘤的药物中的应用，格瑞克霉素B有效抑制胶质瘤干细胞的自我更新作用，是一个潜在的抗肿瘤药物，为靶向肿瘤干细胞(CSC)的肿瘤治疗提供了新的方案和药物，对提高肿瘤治疗效果，改善患者生存质量具有重要意义。另一方面，格瑞克霉素B是深海放线菌次级代谢产物，提取工艺简单；微生物发酵工艺成熟且简单、不污染环境、生产成本低廉和无原料后顾之忧。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中:
[0024]图1对照组U251肿瘤细胞株凋亡检测Annexin-V FITC+PI+结果。
[0025]图2格瑞克霉素B处理实验组U251肿瘤细胞株凋亡检测Annexin-V FITC+PI+结果O
[0026]图3对照组与格瑞克霉素B实验组处理U251肿瘤细胞株细胞周期检测结果。
[0027]图4胶质瘤克隆形成图。
[0028]图5胶质瘤克隆形成结果。
[0029]图6格瑞克霉素B抑制胶质瘤干细胞的形成检测图。
[0030]图7格瑞克霉素B抑制胶质瘤干细胞形成结果。
[0031]图8胶质瘤干细胞干性基因表达结果。
【具体实施方式】
[0032]下面结合实施例对本发明作进一步说明。所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述
【发明内容】
对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
[0033]本发明所举实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0034]统计学分析:定量数据均以均值土标准差表示，采用SPSS12.0统计软件进行分析，使用独立样本t检验分析两个组之间的差异，单因素方差分析比较多个组之间的差异。
[0035]恶性胶质瘤细胞系U251、U87和胶质瘤原代细胞株091214、9944及脐静脉内皮细胞HUVECs-12培养用含10%胎牛血清的Gibco公司的DMEM培养基(货号:12800-082，配置:按照说明书，使用新鲜的Millipore双纯水稀释，补加NaHC032.0g/L (成都市科龙化工试剂厂，分析纯)，HEPES2.38g/L (Scientific research special，货号:7365-45-9_5009)，调pH值7.26，用0.22 μ m滤膜过滤除菌，用前加Hyclone的双抗青霉素和链霉素，都是IOOU/mL (货号:SV30010)，放置于37°C、C02气体体积分数为5%培养箱中培养。细胞每过2_3天换液，用PBS (0.01Μ，ρΗ7.2-7.4)(北京中杉金桥生物技术有限公司生产，货号:ZLI_9062，配置:按照说明书，蒸懼水稀释后使用)洗漆,0.25%的胰酶(Scientific Research Special,货号:0458-10g，配置:按照说明书，用上述PBS稀释，再加EDTA0.8g(Solarbio，货号:E8030.))消化传代，第3-10代用于做实验。
[0036]恶性胶质瘤细胞系U251、U87及脐静脉内皮细胞HUVECs_12购买于美国ACTT公司；胶质瘤原代细胞株091214和9944来自于我们医院手术刚切除的临床标本，并获得病人的知情同意。实验中所用的格瑞克霉素系列化合物是由广州中科院南海海洋研究所鞠建华研究员所提供，格瑞克霉素系列化合物是深海放线菌次级代谢产物。
[0037]实施例1不同浓度的格瑞克霉素系列化合物恶性胶质瘤细胞株的抑制率
[0038]采用CCK8 (购自碧云天，货号:C0038)检测不同浓度的格瑞克霉素系列化合物对恶性胶质瘤细胞株的抑制率，按照如下步骤进行:
[0039]1、取第3-10代生长状态良好的U251细胞株，调整至5X 104/mL浓度的细胞，每孔100 μ L，培养于96孔板，过夜贴壁；
[0040]2、实验组加入格瑞克霉素系列化合物(其终浓度分别为8，4，2，1，0.5和0.25 μ Μ)(格瑞克霉素系列化合物母液浓度IOmM,溶解于二甲基亚砜(DMSO) (Amresco,货号:D8370)，-20°C保存)，对照组为终浓度0.05%(v/v)DMS0的培养液，空白组只加入等量培养基未加细胞，每组设置3个重复实验孔；
[0041]3、放置于37 °C> CO2气体体积分数为5%培养箱中培养,48小时后，每孔加CCK810 μ L，培养2小时后，再用酶标仪(Thermo公司)测定450nm波长的吸光度(0D值)。
[0042]抑制率的计算公式如下:
[0043]抑制率=(对 照组OD值-处理组OD值-2 X空白组OD值)/ (对照组OD值-空白组 OD 值)X 100%
[0044]用药物抑制浓度计算软件1.0.0版(L0GIT法)软件获得格瑞克霉素系列化合物对恶性胶质瘤细胞株半数抑制浓度(IC5tl)，结果如表1。
[0045]表1格瑞克霉素(GCN)系列化合物抑制胶质瘤细胞及脐静脉内皮细胞HUVECs-12的IC5tl值
【权利要求】
1.格瑞克霉素B在制备治疗I父质瘤的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述胶质瘤为恶性胶质瘤。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述治疗胶质瘤的药物为抗胶质瘤干细胞的药物。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述治疗胶质瘤的药物为诱导胶质瘤细胞和/或胶质瘤干细胞凋亡 的药物。
5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述治疗胶质瘤的药物为阻滞胶质瘤细胞和/或胶质瘤干细胞细胞分裂周期的药物。
6.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述治疗胶质瘤的药物为抑制胶质瘤克隆形成的药物。
7.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述治疗胶质瘤的药物为抑制胶质瘤干细胞形成的药物。
8.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述治疗胶质瘤的药物为抑制胶质瘤干细胞干性基因表达的药物。
9.格瑞克霉素B在制备抗肿瘤的药物中的应用，其特征在于，所述抗肿瘤的药物为抗肿瘤干细胞的药物。
【文档编号】A61K31/7032GK103550231SQ201310582666
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月18日 优先权日:2013年11月18日
【发明者】姚月良, 平轶芳, 卞修武 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院