专利名称：一种制备粉拟青霉素的方法及其专用菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种制备粉拟青霉素的方法及其专用菌株。
背景技术：
细菌感染一直是人类面临的重大挑战，近年来，革兰氏阳性及阴性菌的感染频率 越来越高。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是目前非常重要的5个致命耐药菌 之一，不仅造成医院大部分的感染，而且还对多种抗生素产生了耐药性[参见，TheJournal of Infectious Diseases (传染病杂志)。2008，197，1079]。此外，随着临床上高效广谱抗生 素、肾上腺皮质激素、免疫抑制剂的广泛应用，以及AIDS、器官组织移植和化疗等免疫受损 病人的逐渐增多，使得条件致病真菌感染日益严重，严重威胁人类的健康。资料显示，上述 人群中深部真菌感染发生率为11-40%，病死率为40% [参见，Molecular Immunology (分 子免疫学)。2001，38，947]，仅美国在1997-2000年间真菌性败血症就增加了 207% [参见， The New England Journal of Medicine (新英格兰医学杂志)。2003，348，1546]。目前， 临床上广泛用于治疗白色念珠菌感染的药物主要是多烯类两性霉素B、广谱三唑类药物以 及棘白菌素类卡泊芬净。两性霉素B副作用较强，能引起高热和肾毒性，所以限制了它的临 床应用；唑类药物和棘白菌素类药物虽然有较好的安全性，但持续使用会诱发耐药菌株的 出现。同时，大量使用氟康唑后会造成较严重的不良反应，其不良反应发生率高达10-16%。虽然人类与致病菌的战斗一直没有停止，但致病菌还是占了上风。新药研发周期 一般为10-12年，而致病菌2-3年即可产生耐药性。在大量抗生素应用于临床治疗的同时， 病原菌产生耐药性的现象也日益严重，但新抗生素上市的数目却逐年减少[参见，Clinical Infectious Diseases (临床传染病杂志)。2006，42，657]。因此，寻求新型、安全、高效的 抗菌药物迫在眉睫。
发明内容
本发明的一个目的是提供一株粉拟青霉。本发明所提供的粉拟青霉为粉拟青霉(Paecilomyces farinosus)6. 48，其保藏编 号为 CGMCC No. 3627。该菌株已于2010年02月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心(简称CGMCCJia 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所， 邮编100101)，保藏号为CGMCC No. 3627，分类命名为粉拟青霉(Paecilomyces farinosus), 菌株名称为6. 48。本发明的另一个目的是提供一种制备粉拟青霉素的方法。本发明所提供的制备粉拟青霉素的方法，包括如下步骤发酵粉拟青霉 (Paecilomyces farinosus)6. 48CGMCC No. 3627，得到含有粉拟青霉素的发酵液，从含有粉 拟青霉素的发酵液中提取纯化得到粉拟青霉素；所述粉拟青霉素的化学式如式I所示 上述过程中，所述发酵中使用的培养基由葡萄糖、可溶性淀粉、大豆粉、玉米粉、酵 母提取物、CaC03和水组成；葡萄糖在发酵培养基中的浓度为5g/L，可溶性淀粉在发酵培养 基中的浓度为30g/L，大豆粉在发酵培养基中的浓度为30g/L，玉米粉在发酵培养基中的浓 度为5g/L，酵母提取物在发酵培养基中的浓度为5g/L，CaC03在发酵培养基中的浓度为3g/ L0上述过程中，所述发酵培养基的pH值为6. 5。上述过程中，所述发酵的条件为温度为25°C，转速为150rpm，时间为30天，旋转 半径为12mm。上述过程中，在所述发酵后，包括如下提取步骤用不溶于水的且在25°C是液态 的有机溶剂对所述含有粉拟青霉素的发酵液进行萃取，取有机相；所述不溶于水的且在 25°C是液态的有机溶剂为氯仿、乙酸乙酯、苯、甲苯、二甲苯或乙酸乙酯。上述过程中，在所述提取后，包括用硅胶柱分离纯化的步骤；所述用硅胶柱分离纯 化包括如下洗脱步骤先用300ml混合溶液作为流动相进行洗脱(石油醚和丙酮的体积比 为25 1)，再用300ml混合溶液作为流动相进行洗脱(石油醚和丙酮的体积比为20 1)， 再用300ml混合溶液作为流动相进行洗脱(石油醚和丙酮的体积比为15 1)，再用300ml 混合溶液作为流动相进行洗脱(石油醚和丙酮的体积比为10 1)，再用360ml混合溶液作 为流动相进行洗脱(石油醚和丙酮的体积比为5 1)，再用400ml混合溶液作为流动相进 行洗脱(石油醚和丙酮的体积比为3 1)，再用400ml混合溶液作为流动相进行洗脱(石 油醚和丙酮的体积比为1 1)，收集用400ml混合溶液作为流动相进行洗脱(石油醚和丙 酮的体积比为1 1)洗脱下来的溶液；和/或，所述用硅胶柱分离纯化中，所用的填料为200-300目的硅胶；和/或，所述硅胶柱的大小为高30cm和直径3cm ；和/或，每个所述硅胶柱中装40g硅胶。上述过程中，在所述用硅胶柱分离纯化后，包括用凝胶色谱柱分离纯化的步骤；所 述用凝胶色谱柱分离纯化包括如下洗脱步骤用50ml甲醇进行第1次洗脱，用50ml甲醇进 行第2次洗脱，收集第2次洗脱下来的溶液；和/或，所述用凝胶色谱柱分离纯化中，所用的填料为葡聚糖凝胶S印hadex LH-20 ；和/或，所述凝胶色谱柱的大小为高50cm和直径1. 5cm ；和/或，每个所述凝胶色谱柱中装20g所述葡聚糖凝胶S印hadex LH-20。上述过程中，在所述用凝胶色谱柱分离纯化后，包括高效液相色谱分离的步骤；所 述高效液相色谱分离中，填充介质为C18键合硅胶，流动相为甲醇和水的混合溶液，以甲醇 与水的体积比为85 15的混合溶液为起始液，以甲醇为终止液，进行梯度洗脱，梯度洗脱 时间为25min，收集保留时间为14. 8min的洗脱峰。
上述过程中，所述用硅胶柱分离纯化中，是将所述含有粉拟青霉素的发酵液或所 述有机相进行分离纯化；所述用凝胶色谱柱分离纯化中，是将所述含有粉拟青霉素的发酵液、所述有机相 或所述用石油醚和丙酮的体积比为11的石油醚和丙酮混合溶液洗脱下来的溶液进行分 离纯化；所述高效液相色谱分离中，是将所述含有粉拟青霉素的发酵液、所述有机相、所述 用石油醚和丙酮的体积比为11的石油醚和丙酮混合溶液洗脱下来的溶液或所述第2次 洗脱下来的溶液进行分离。式I所示化合物在制备具有抑制白色念珠球菌(Candida sporogenes)功能的产 品中的应用也属于本发明的保护范围。式I所示化合物在制备具有抑制大肠杆菌(Escherichia coli)功能的产品中的 应用也属于本发明的保护范围。式I所示化合物在制备具有抑制肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)功能 的产品中的应用也属于本发明的保护范围。式I所示化合物在制备具有抑制酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)功能的 产品中的应用也属于本发明的保护范围。式I所示化合物在制备具有抑制金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)功能 的产品中的应用也属于本发明的保护范围。上述任一所述应用中，所述金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)为金黄 色葡萄球菌(Staphylococcus aureus CMCC 26003)；所述肺炎链球菌(Str印tococcus pneumoniae)为月市炎链球菌(Streptococcus pneumoniae CGMCC No. 1. 1692)；所述大肠杆 菌(Escherichia coli)为大肠杆菌(Escherichia coli CGMCC No. 1. 2340)；所述白色念 珠球菌(Candida sporogenes)为白色念珠球菌(Candida sporogenes CMCC 98001)；所 述酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae ATCC 18824)。上述任一所述应用中，所述产品为药物或者抑制剂。式I所示化合物在抑制白色念珠球菌(Candida sporogenes)中的应用也属于本 发明的保护范围。式I所示化合物在抑制大肠杆菌(Escherichia coli)中的应用；式I所示化合物 在抑制肺炎链球菌(Str印tococcuspneumoniae)中的应用也属于本发明的保护范围。式I所示化合物在抑制酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的应用也属于 本发明的保护范围。和/或式I所示化合物在抑制金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)中的应 用也属于本发明的保护范围。上述任一所述应用中不包括疾病的诊断和治疗方法。上述任一所述应用中，所述金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)为金黄 色葡萄球菌(Staphylococcus aureus CMCC 26003)；所述肺炎链球菌(Str印tococcus pneumoniae)为月市炎链球菌(Streptococcus pneumoniae CGMCC No. 1. 1692)；所述大肠杆 菌(Escherichia coli)为大肠杆菌(Escherichia coli CGMCC No. 1. 2340)；所述白色念 珠球菌(Candida sporogenes)为白色念珠球菌(Candida sporogenes CMCC 98001)；所述酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae ATCC 18824)。 上述任一所述应用中，所述式I所示化合物如下 本发明的菌株粉拟青霉(Paecilomyces farinosus) CGMCC No. 3627具有产生粉拟 青霉素的功能。本发明制备粉拟青霉素的方法，产率高，产率可达10mg/g菌体，其中纯化方 法的提取率高，提取率可达1%，由本发明方法制备得到的粉拟青霉素的纯度可达99%，而 且本发明方法操作简单、成本低廉、省时省力。本发明中，粉拟青霉素具有广谱抗细菌和抗真菌活性，具体的说具有抑制金黄 色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、月市炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、 大肠杆菌(Escherichia coli)、白色念珠球菌(Candida sporogenes)及酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)的功能，这在现有技术中是未曾发现的，并且粉拟青霉素对白 色念珠球菌(C. sporogenes CMCC 98001)的抑制活性强于阳性对照两性霉素B，对大肠杆 菌(E.coliCGMCC 1.2340)的抑制作用与庆大霉素相当。由此可知，可将粉拟青霉素进一 步用于治疗上述菌引起的一系列疾病，也可将粉拟青霉素用于制备具有广谱抗菌活性的药 物。综上所述，本发明菌株、粉拟青霉素的制备方法及粉拟青霉素的新用途在粉拟青 霉素的制备与应用领域将有广阔的应用前景。
图1为粉拟青霉素的制备高效液相图。图2为纯化后的粉拟青霉素的高效液相色谱图。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、菌株的分离及鉴定一、菌株的分离分离方法取北京东灵山的土壤样品，土壤样品过2mm筛，去除石块及植物组织， 混合均勻后装入事先灭菌的50ml离心管(如必要，先用无菌水湿润)，高度距顶部约1cm。 每土样装3支离心管。诱集使用3-4龄大蜡螟幼虫(28°C条件下，孵化后培养约30d)。每离心管中放入 5头幼虫，盖上离心管盖，室温下黑暗培养。实验的前4d，每天颠倒并摇动离心管，以促使大 蜡螟幼虫在土壤中充分活动。处理9 14d后检查大蜡螟被侵染情况。僵死的大蜡螟幼虫用3%次氯酸钠溶液(有效氯)表面消毒3min，然后用无菌水冲洗2次后，置于加有抗生素 (链霉素，0. lg/L;四环素，0.05g/L)的PDA平板上，置室温下黑暗培养。形成菌落后进行分 离纯化，相同离心管中分离得到的同种昆虫相关菌物认为是同一菌株。最后分离得到一株侵染大蜡螟幼虫效果好的菌株，将该菌株命名为6. 48。二、菌株的鉴定(一 )形态方法将菌株接种到PDA平板上，25°C条件下黑暗培养7d,测量菌落直径并记录菌 落颜色。从平板上切下5mm的方形带菌培养基块，置于灭菌载玻片上，加盖玻片，在50ml离 心管或培养皿中培养一周，取下盖玻片制普通玻片进行观察。结果PDA培养基上菌落白色，25°C黑暗条件下14d菌落直径40_45mm，质地絮状， 隆起，稀疏；背面黄色。未见分生孢子梗束。菌丝多分隔，1. 5-2. 0 ii m宽；分生孢子梗产生于气生菌丝上，短，11. 0-57. 7 u m， 宽1. 7-2. 5 u m ；瓶梗披针形或细烧瓶状，多数2-5个簇生于分生孢子梗其分枝上，也可单生 于菌丝上，长6-10 ii m，宽1. 5-2. 3um ；分生孢子椭圆形，无色，2. 0-3. 4X1. 4-1. 9 y m。(二)rDNA-ITS 序列方法真菌总DNA提取步骤平板培养5d菌落用解剖刀刮取菌丝，置1. 5ml离心管 中，加200iil CTAB提取缓冲液、少量石英砂，用玻棒研磨，然后再加入400 ill CTAB，65°C水 浴lh，12000rpm离心lOmin，取上清，饱和酚和氯仿异戊醇分别抽提，最后用无水乙醇沉淀， 12000rpm离心，倒出乙醇溶液，晾干。最后，复溶于50 yl纯水备用。PCR 扩增通用引物ITS5 :5，-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3，ITS4 :5，-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’扩增体系(25ill 体系)纯水15 ill ；Buffer 2. 5u 1 ；Mg 2+ 1. 5u 1 ； dNTP 1 P 1 ；引物各 1 P 1 ；DNA 聚合酶2 u 1 (2U)；模板1扩增程序3minat 95°C, lmin at 94°C，40s at 54°C, lmin at 72°C, after 30cycles,then hold at 72°C for lOmin。仪器050-801TGradient96 型 PCR 仪扩增产物的纯化申能博彩生物科技有限公司3S PCR扩增产物纯化试剂盒。测序北京诺赛基因组研究中心有限公司测序仪ABI 3730x1型测序仪。测序引物ITS4。结果得到的序列如序列表中序列1所示，包括18S rRNA片段，ITS1、5. 8S rRNA、 ITS2的全序列及28S区序列片断。证明本发明菌株属于拟青霉属粉拟青霉(Paecilomyces farinosus (Holmsk.) A. H. S. Br. &G. Sm.)。该菌株6. 48已于2010年02月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国 科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No. 3627，分类命名为粉拟青霉 (Paecilomycesfarinosus)0实施例2 化合物粉拟青霉素的制备一、菌发酵
1、菌活化挑取粉拟青霉Paecilomyces farinosus CGMCC No. 3627菌丝体接种于PDA平板 上，25°C培养5d ；PDA培养基的组成由马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g和蒸馏水1L组成，121°C 高压蒸汽灭菌30min，制成PDA平板。2、种子培养方法待菌长满平板后，将5个1cm2大小的菌块连同培养基接种到含有50mL种子 培养基的250mL三角瓶中并在摇床上培养5d(培养温度25°C ；转速200rpm)后作为种子 培养液。得到的种子培养液中孢子的浓度为106个/mL。种子培养基的配方葡萄糖4g、麦芽提取物10g、酵母提取物4g、蒸馏水1L，灭菌前 将pH调节到6. 5。每个250mL三角瓶中加入50mL培养基并在121°C灭菌30min。麦芽提取物购自英国Oxoid公司。3、发酵将5mL种子培养液接种于1. 5L发酵培养基上，摇床培养30d，培养温度为25°C，转 速为150rpm(旋转半径为12mm)，得到发酵液。发酵培养基的组成由葡萄糖、可溶性淀粉、大豆粉、玉米粉、酵母提取物、&0)3和 水组成，葡萄糖在发酵培养基中的浓度为5g/L，可溶性淀粉在发酵培养基中的浓度为30g/ L，大豆粉在发酵培养基中的浓度为30g/L，玉米粉在发酵培养基中的浓度为5g/L，酵母提 取物在发酵培养基中的浓度为5g/L，CaC03在发酵培养基中的浓度为3g/L。调节发酵培养 基的pH值至6. 5。发酵培养基121°C高压蒸汽灭菌30min，冷却待用。可溶性淀粉购自北京现代东方精细化学品有限公司；大豆粉购自中国农业科学 院；玉米粉购自超市；酵母提取物购自英国Oxoid公司；二、从发酵液中提取粉拟青霉素1、粗提将乙酸乙酯加入步骤一得到的发酵液中，乙酸乙酯和发酵液的体积比为1 1;混 勻，静置，分别取有机相和残渣，将有机相记作粗提液I，将残渣记作残渣I ；将乙酸乙酯加入到残渣I中，乙酸乙酯和残渣I的体积比为1 1 ；混勻，静置，分 别取有机相和残渣，将有机相记作粗提液II，将残渣记作残渣II ；将乙酸乙酯加入到残渣II中，乙酸乙酯和残渣II的体积比为1 1 ；混勻，静置， 分别取有机相和残渣，将有机相记作粗提液III，将残渣记作残渣III ；合并粗提液I、粗提液II和粗提液III，记作粉拟青霉素粗提液。将粉拟青霉素粗提液减压蒸馏至干燥，得到0. 6g粉拟青霉素粗提物；2、用硅胶柱进行分离纯化硅胶柱(30cmX直径3cm)购自北京玻璃集团公司；所用的硅胶为200-300目柱层 析硅胶，购自青岛海洋化工有限公司。每个柱子中装40g硅胶。将粉拟青霉素粗提物用石油醚和丙酮的混合溶液依次进行如下硅胶柱层析装 柱、压实、上样后进行如下洗脱步骤先用300ml混合溶液作为流动相进行洗脱(石油醚 和丙酮的体积比为25 1)，再用300ml混合溶液作为流动相进行洗脱(石油醚和丙酮的
10体积比为20 1)，再用300ml混合溶液作为流动相进行洗脱(石油醚和丙酮的体积比为 15 1)，再用300ml混合溶液作为流动相进行洗脱(石油醚和丙酮的体积比为10 1)，再 用360ml混合溶液作为流动相进行洗脱(石油醚和丙酮的体积比为5 1)，再用400ml混 合溶液作为流动相进行洗脱(石油醚和丙酮的体积比为3 1)，再用400ml混合溶液作为 流动相进行洗脱(石油醚和丙酮的体积比为1 1)，收集用400ml混合溶液作为流动相进 行洗脱(石油醚和丙酮的体积比为1 1)洗脱下来的溶液，记作活性洗脱液，将活性洗脱 液减压蒸馏至干燥，共得到170mg固形物。3、用凝胶色谱柱S印hadex LH-20进行分离纯化凝胶色谱柱(50cmX直径1. 5cm)购自北京玻璃集团公司；凝胶填料为葡聚糖凝胶 S印hadex LH-20。每个凝胶色谱柱中装20g葡聚糖凝胶S印hadex LH-20。将活性洗脱液通过凝胶色谱S印hadex LH-20分离，装柱、上样后进行如下洗脱步 骤流动相是甲醇，用50ml甲醇进行第1次洗脱，用50ml甲醇进行第2次洗脱，收集第2次 洗脱下来的溶液，减压蒸馏至干燥，共得到lOOmg固形物。4、HPLC 检测Agilent 1100型半制备高压液相色谱仪，色谱柱为Agilent C18反相半制备色谱柱(10 y m ;10X250mm)，填充介质为C18键 合硅胶，粒径5um;柱温25°C ；自动进样器进样，进样量20ul ；流动相的组成为流动相为甲醇和水的混合溶液；流速为2. Oml/min ；以甲醇与水 的体积比为85 15的混合溶液为起始液，以甲醇为终止液，进行线性梯度洗脱，梯度洗脱 时间为25min ；检测器为多波长紫外检测器；收集保留时间为14. 8min的洗脱峰，得到粉拟青霉素，并记录峰面积值。结果如图1所示，得到6. Omg化合物粉拟青霉素。5、将步骤4得到的6. Omg化合物粉拟青霉素进行HPLC检测方法Agilent 1100型半制备高压液相色谱仪；色谱柱为Kromasil C18反相分析色谱柱(5 y m ； 150X4. 6mm)，填充介质为C18键 合硅胶，粒径5um;柱温25°C ；自动进样器进样，进样量5ul ；流动相的组成为流动相为甲醇和水的混合溶液；流速为1. Oml/min ；梯度洗脱步骤如下时间(min)甲醇(％ )水(％ )0208022080181000251000结论结果如图2所示。表明本发明中的活性化合物粉拟青霉素纯度高，可达 99%。三、粉拟青霉素的确认
将上述方法制备的粉拟青霉素进行红外光谱和核磁共振谱分析。红外光谱实验中测试仪器型号为Nicolet Magna-IR 750 ；核磁共振谱实验方法中测试仪器型号为Varian Mercury-500。本发明制备的粉拟青霉素的物化常数、氢谱和碳谱数据分别见表1和2。表1.化合物粉拟青霉素的物化常数 制备得到的粉拟青霉素的化学式如式I所示。 与文献“Journalof Natural Products (天然产物杂志).2005，68，810-811 ” 中 所报道的数据相比，证实得到的产物是粉拟青霉素。综上，0.6g粗提物经过分离纯化而得到6. Omg纯化合物粉拟青霉素，其纯度为 99%，收率为1%，产率为10mg/g菌体。实施例3、粉拟青霉素的抑菌活性检测采用Alamar Blue荧光检测法检测粉拟青霉素对于金黄色葡萄球 菌(Staphylococcus aureus)、月市炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、大肠 杆菌(Escherichia coli)、白色念珠球菌(Candida sporogenes)和酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)的抑制活性。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具体为金黄色葡萄球菌 (Staphylococcusaureus CMCC 26003)购自 CMCC 或 CGMCC ；肺炎链球菌(Str印tococcus pneumoniae)具体为肺炎链球菌 (Streptococcuspneumoniae CGMCC No. 1. 1692)购自 CGMCC ；大肠杆菌(Escherichiacoli)具体为大肠杆菌(Escherichia coli CGMCC No. 1. 2340)购自 CGMCC ；白色念珠球菌(Candida sporogenes)具体为白色念珠球菌(Candida sporogenesCMCC 98001)购自 CMCC 或 CGMCC ；
II M # # (Saccharomyces cerevisiae) ^ # ^J II M # # (Saccharomyces cerevisiaeATCC 18824)购自 ATCC 或 CGMCC。1.试验用试剂将本发明制备的粉拟青霉素用二甲亚砜(DMS0)作为溶剂分别配制成浓度为4、2、 1、0. 5,0. 2,0. 1,0. 05,0. 02,0. 01,0. 005及0. 002mg/mL的待测溶液；将阳性对照物氨苄青 霉素、庆大霉素和两性霉素B(购于北京欣经科生物技术有限公司)用DMS0分别配制成浓 度为4mg/mL的溶液；2.金黄色葡萄球菌(S. aureus)、肺炎链球菌(S. pneumoniae)、大肠杆菌 (E. coli)、白色念珠球菌(C. sporogenes)和酿酒酵母(S. cerevisiae)的培养将金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus CMCC 26003)、肺炎链球 菌(Streptococcus pneumoniae CGMCC No. 1. 1692) > 大肠杆菌(Escherichia coli CGMCCNo. 1. 2340)分别接种在PDB培养基(淀粉40g/L，葡萄糖20g/L)上，在37°C摇床培养 Id后并在显微镜下计数，调整培养液中菌浓度为105个/mL。将白色念珠球菌(Candida sporogenes CMCC 98001)禾P酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae ATCC 18824)分别接种在 PDB 培养基(淀粉 40g/L，葡萄糖 20g/L)上，在28°C摇床培养2d后并在显微镜下计数，调整培养液中菌浓度为105个/mL。3.试验方法试验条件如表3，表4和表5所示。表3.活性测试所需体积 按表3所示方法，取190 iiL PDB培养基和10 iiL Alamar Blue染液加到96孔板中 配成阴性对照组；取190 P L金黄色葡萄球菌或肺炎链球菌培养液和10 y L Alamar Blue染 液加到96孔板中配成空白对照组；取190 y L金黄色葡萄球菌或肺炎链球菌培养液、10 y L Alamar Blue染液和1 y L 4mg/mL的氨苄青霉素加到96孔板中配成阳性对照组；取1 P L 本发明制备的粉拟青霉素溶液(浓度分别为4、2、1、0. 5,0. 2,0. 1,0. 05,0. 02,0. 01,0. 005 及0.002mg/mL)分别加到96孔板中，再分别加入190 y L金黄色葡萄球菌或肺炎链球菌培 养液，10iiL Alamar Blue染液，使粉拟青霉素在孔中的最终浓度分别为20、10、5、2. 5、1. 0、 0. 5,0. 25,0. 1,0. 05,0. 025和0. 01 u g/mL。待药液和菌悬液混和均勻，在37°C及黑暗条件
16下培养24h。表4.活性测试所需体积 按表4所示方法，取190 u L PDB培养基和10 u L Alamar Blue染液加到96孔板 中配成阴性对照组；取190 u L大肠杆菌培养液和10 ii L Alamar Blue染液加到96孔板中 配成空白对照组；取190 u L大肠杆菌培养液、10 u L Alamar Blue染液和1 y L 4mg/mL的 庆大霉素加到96孔板中配成阳性对照组；取1 P L本发明制备的粉拟青霉素溶液(浓度分 别为 4、2、1、0. 5,0. 2,0. 1,0. 05,0. 02,0. 01,0. 005 及 0. 002mg/mL)分别加到 96 孔板中，再 分别加入190 u L大肠杆菌培养液，10 uL Alamar Blue染液，使粉拟青霉素在孔中的最终浓 度分别为 20、10、5、2. 5、1. 0、0. 5、0. 25、0. 1、0. 05、0. 025 和 0. 01 ii g/mL。待药液和菌悬液混 和均勻，在37°C及黑暗条件下培养24h。表5.活性测试所需体积 按表5所示方法，取190 ii L PDB培养基和10 u LAlamar Blue染液加到96孔板中 配成阴性对照组；取190 u L白色念珠球菌或酿酒酵母培养液和10 ii L Alamar Blue染液 加到96孔板中配成空白对照组；取190 u L白色念珠球菌或酿酒酵母培养液，10 u LAlamar Blue染液和liiL 4mg/mL的两性霉素B加到96孔板中配成阳性对照组；取liiL本发 明制备的粉拟青霉素溶液(浓度分别为4、2、1、0. 5,0. 2,0. 1,0. 05,0. 02,0. 01,0. 005及0. 002mg/mL)分别加到96孔板中，再分别加入190 u L白色念珠球菌或酿酒酵母培养液， 10 uL Alamar Blue染液，使粉拟青霉素在孔中的最终浓度分别为20、10、5、2. 5,1. 0,0. 5、 0. 25,0. 1,0. 05,0. 025和0. 01 u g/mL。待药液和菌悬液混和均勻，在28°C及黑暗条件下培 养 48h。用酶标仪(Tecan公司的GENios Plus)在590nm下测试96孔板中每个测试孔的 荧光吸收值(0D值)。计算抑制率1%= [1_(0D测试赚-0D空白对照)/(0D阴性对照-0D空白对照)]X100%计算IC50 值IC50 = [CL (Ih-50) +Ch (50-Il) ] / (IH_IL)CL 最低浓度值；CH 最高浓度值；IH 最高浓度下的最低浓度下的1%。4.试验结果本发明制备的粉拟青霉素具有显著的广谱抗细菌和抗真菌活性(如表6所示)，其 中粉拟青霉素对白色念珠球菌(C. sporogenes CMCC 98001)的抑制活性强于阳性对照两性 霉素B的抑制活性，对大肠杆菌(E.coli CGMCC 1.2340)的抑制作用与庆大霉素的抑制活 性相当。表6.粉拟青霉素的抗菌活性
权利要求
粉拟青霉(Paecilomyces farinosus)6.48，其保藏编号为CGMCC No.3627。
2.一种制备粉拟青霉素的方法，包括如下步骤发酵粉拟青霉(Paecilomycesfarino sus)6. 48CGMCC No. 3627，得到含有粉拟青霉素的发酵液，从所述含有粉拟青霉素的发酵液 中提取纯化得到粉拟青霉素；所述粉拟青霉素的化学式如式I所示
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述发酵中使用的培养基由葡萄糖、可溶 性淀粉、大豆粉、玉米粉、酵母提取物、CaCOjP水组成；葡萄糖在培养基中的浓度为5g/L，可 溶性淀粉在培养基中的浓度为30g/L，大豆粉在培养基中的浓度为30g/L，玉米粉在培养基 中的浓度为5g/L，酵母提取物在培养基中的浓度为5g/L，CaCO3在培养基中的浓度为3g/L ； 所述培养基的PH值为6.5;和/或，所述发酵的条件为温度为25°C，转速为150rpm，旋转半径为12mm，时间为30天，。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述发酵后，包括如 下提取步骤用不溶于水的且在25°C是液态的有机溶剂对所述含有粉拟青霉素的发酵液 进行萃取，取有机相；所述不溶于水的且在25°C是液态的有机溶剂为氯仿、乙酸乙酯、苯、甲苯、二甲苯或乙酸乙酯。
5.根据权利要求2、3或4所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述提取后，包括 用硅胶柱分离纯化的步骤；所述用硅胶柱分离纯化包括如下洗脱步骤先用300ml石油醚 体积丙酮体积为25 1的石油醚和丙酮的混合溶液作为流动相进行洗脱，再用300ml 石油醚体积丙酮体积为20 1的石油醚和丙酮的混合溶液作为流动相进行洗脱，再用 300ml石油醚体积丙酮体积为15 1的石油醚和丙酮的混合溶液作为流动相进行洗脱， 再用300ml石油醚体积丙酮体积为10 1的石油醚和丙酮的混合溶液作为流动相进行 洗脱，再用360ml石油醚体积丙酮体积为5 1的石油醚和丙酮的混合溶液作为流动相 进行洗脱，再用400ml石油醚体积丙酮体积为3 1的石油醚和丙酮的混合溶液作为流 动相进行洗脱，再用400ml石油醚体积丙酮体积为1 1的石油醚和丙酮的混合溶液作 为流动相进行洗脱，收集所述用400ml石油醚体积丙酮体积为1 1的石油醚和丙酮的 混合溶液作为流动相洗脱下来的溶液；和/或，所述用硅胶柱分离纯化中，所用的填料为200-300目的硅胶；和/或，所述硅胶柱的大小为高30cm和直径3cm ；和/或，每个所述硅胶柱中装40g硅胶。
6.根据权利要求2-5中任一所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述用硅胶柱分 离纯化后，包括用凝胶色谱柱分离纯化的步骤；所述用凝胶色谱柱分离纯化包括如下洗脱步骤用50ml甲醇进行第1次洗脱，用50ml甲醇进行第2次洗脱，收集第2次洗脱下来的 溶液；和/或，所述用凝胶色谱柱分离纯化中，所用的填料为葡聚糖凝胶S印hadex LH-20 ；和/或，所述凝胶色谱柱的大小为高50cm和直径1. 5cm ；和/或，每个所述凝胶色谱柱中装20g所述葡聚糖凝胶S印hadex LH-20。
7.根据权利要求2-6中任一所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述用凝胶色谱 柱分离纯化后，包括高效液相色谱分离的步骤；所述高效液相色谱分离中，填充介质为C18 键合硅胶，流动相为甲醇和水的混合溶液，以甲醇与水的体积比为85 15的混合溶液为 起始液，以甲醇为终止液，进行线性梯度洗脱，线性梯度洗脱时间为25min，收集保留时间为 14. 8min的洗脱峰。
8.根据权利要求2-7中任一所述的方法，其特征在于所述用硅胶柱分离纯化中，是将 所述含有粉拟青霉素的发酵液或所述有机相进行分离纯化；所述用凝胶色谱柱分离纯化中，是将所述含有粉拟青霉素的发酵液、所述有机相或所 述用石油醚体积丙酮体积为11的石油醚和丙酮的混合溶液洗脱下来的溶液进行分离 纯化；所述高效液相色谱分离中，是将所述含有粉拟青霉素的发酵液、所述有机相、所述用石 油醚体积丙酮体积为11的石油醚和丙酮的混合溶液洗脱下来的溶液或所述第2次洗 脱下来的溶液进行分离。
9.式I所示化合物在制备具有抑制白色念珠球菌(Candidasporogenes)功能的产品 中的应用；式I所示化合物在制备具有抑制大肠杆菌(Escherichia coli)功能的产品中的 应用；式I所示化合物在制备具有抑制肺炎链球菌(Str印tococcus pneumoniae)功能的产 品中的应用；式I所示化合物在制备具有抑制酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)功能 的产品中的应用；和/或式I所示化合物在制备具有抑制金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)功能的产品中的应用；式I所示化合物在抑制白色念珠球菌(Candida sporogenes)中的应用；式I所 示化合物在抑制大肠杆菌(Escherichia coli)中的应用；式I所示化合物在抑制肺 炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)中的应用；式I所示化合物在抑制酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)中的应用；和/或式I所示化合物在抑制金黄色葡萄球菌 (Stapylococcusaureus)中的应用；所述应用中不包括疾病的诊断或治疗方法；
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述金黄色葡萄球菌 (Staphylococcusaureus)为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus CMCC 26003)，所 $月市H连5求 (Streptococcus pneumoniae)为月市 连王求 (Streptococcuspneumoniae CGMCC 1. 1692)，所述大肠杆菌(Escherichia coli)为大肠杆菌(Escherichia coli CGMCC 1. 2340)，所述白色念珠球菌(Candida sporogenes)为白色念珠球菌(Candida sporogenes CMCC 98001),(Saccharomyces cerevisiae)(Saccharomycescerevisiae ATCC18824)；和/或，所述产品为药物或者抑制剂。
全文摘要
本发明公开了一种制备粉拟青霉素的方法及其专用菌株。该菌株为粉拟青霉(Paecilomyces farinosus)6.48，其保藏编号为CGMCC No.3627。本发明的菌株粉拟青霉(Paecilomyces farinosus)6.48 CGMCC No.3627具有产生粉拟青霉素的功能。本发明制备粉拟青霉素的方法，产率高，产率可达10mg/g菌体，其中纯化方法的提取率高，提取率可达1％，由本发明方法制备得到的粉拟青霉素的纯度可达99％，而且本发明方法操作简单、成本低廉、省时省力。本发明还提供了粉拟青霉素在制备抗细菌和抗真菌活性的药物中的用途。
文档编号A61P31/10GK101864367SQ20101012506
公开日2010年10月20日 申请日期2010年3月12日 优先权日2010年3月12日
发明者刘杏忠, 刘述春, 孙炳达, 车永胜, 邹先伟 申请人:中国科学院微生物研究所