抗asic1抗体及其使用的制作方法

抗asic1抗体及其使用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了与表达酸敏感离子通道-1(ASIC1)的细胞特异性结合的抗体及其抗原结合片段。依照本发明的某些实施方案，该抗体抑制表达人ASIC1的细胞内酸诱导的ASIC1介导的离子流。本发明之抗体可用于治疗疼痛，包括与外科手术及各种疾病和失调相关的疼痛。
【专利说明】抗AS IC1抗体及其使用 发明领域
[0001] 本发明涉及对人ASIC1具有特异性的抗体及其抗原结合片段，以及其使用方法。

【背景技术】
[0002] 酸敏感离子通道（ASIC)是在中枢和外周神经系统表达的质子门控阳离子通道。 人类的ASIC家族包括ASIC1、ASIC2、ASIC3和ASIC4等亚单位，它们在神经细胞膜内排列 成同源或异源多聚体离子通道。ASICUASIC2和ASIC3显著地表达在小型和中型伤害性感 觉神经元内，该伤害性感觉神经元能够检测有害的化学刺激、热刺激以及高阈值机械刺激。 ASIC2和ASIC3也表达在大型、基本上相当于低阈值机械性刺激感受器的神经元内。
[0003] ASIC可让Na+和Ca2+离子通过，且被外部ρΗ6· 8至4.0的pH变化激活。据信ASIC 在感觉局部酸中毒过程中起重要作用。局部组织酸中毒是疼痛和炎症的特点标志，发炎的 组织经常显示出低pH值（低达约4. 7)。ASIC的阻断已被建议作为治疗各种失调和病症的 方法。ASIC1的阻断尤其被建议为治疗疼痛、神经退行性疾病以及精神疾病等各种病症的方 法。
[0004] ASIC1的药理学抑制剂包括特异性抑制ASIC1同聚体的狼蛛肽Psalmotoxin-1 (普 萨莫毒素 PcTxl)，以及小分子、非选择性ASIC抑制剂阿米洛利和A-317567。业已显示，从 海葵分离出的40种氨基酸肽毒素 APETx2能抑制ASIC3同聚体以及ASIC3/1和ASIC3/2异 聚体。
[0005] 目前，尚无已知能特异性阻断ASIC的抗体。因此，本领域需要可用于治疗ASIC信 号介导的疾病和病症的新型ASIC抑制剂，如抗ASIC1抗体。 发明概述
[0006] 本发明提供了与人ASIC1特异性结合的抗体，包括例如与细胞表面表达的ASIC1 特异性结合的抗体。依照某些实施方案，本发明之抗体抑制表达人ASIC1的细胞内酸诱导 的ASIC1介导的离子流。除其他用途之外，本发明之抗体还可用于抑制ASIC1介导的信号 以及治疗由ASIC1活性和/或信号所引起的或与其相关的疾病和失调。例如，本发明之抗 体可施予患者以治疗或减轻疼痛及相关病症。
[0007] 本发明之抗体可以是全长的（例如IgGl或IgG4抗体），或可仅包含一个抗原结合 部分（例如Fab、F(ab'） 2或scFv片段），并可加以修饰以实现其功能，例如消除残余的效 应子功能（Reddy et al.，2000, J. Immunol. 164:1925-1933)。
[0008] 本发明还提供了一种包含一个重链可变区（HCVR)的抗体或抗体的抗原结合片 段，该重链可变区含有一个选自下列一组序列的氨基酸序列：2、18、34、50、66、82、98、114、 130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、370 和 386,或一个 与其基本上相似且具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的序列。
[0009] 本发明还提供了一种包含一个轻链可变区（LCVR)的抗体或抗体的抗原结合片 段，该轻链可变区含有一个选自下列一组序列的氨基酸序列：10、26、42、58、74、90、106、 122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、378 和 394，或 一个与其基本上相似且具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的序 列。
[0010] 本发明还提供了一种抗体或其抗原结合片段，其包含一个选自下列一组序列对 的 HCVR 和 LCVR(HCVR/LCVR)序列对：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、 114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、 258/266、274/282、290/298、306/314、322/330、338/346、354/362、370/378 及 386/394。
[0011] 本发明还提供了一种抗体或抗体的抗原结合片段，其包含一个重链⑶R3(HCDR3) 结构域，该结构域含有一个选自下列一组序列的氨基酸序列：8、24、40、56、72、88、104、120、 136、152、168、184、200、216、232、248、264、280、296、312、328、344、360、376 和 392,或一个 与其基本上相似且具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的序列；以 及一个轻链CDR3(LCDR3)结构域，该结构域含有一个选自下列一组序列的氨基酸序列：16、 32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192、208、224、240、256、272、288、304、320、336、 352、368、384和400,或一个与其基本上相似且具有至少90%、至少95%、至少98%或至少 99 %序列同一性的序列。
[0012] 在某些实施方案中，该抗体或抗体的抗原结合片段包含一个选自下列一组序 列对的 HCDR3/LCDR3 氨基酸序列对：8/16、24/32、40/48、56/64、72/80、88/96、104/112、 120/128、136/144、152/160、168/176、184/192、200/208、216/224、232/240、248/256、 264/272、280/288、296/304、312/320、328/336、344/352、360/368、376/384及 392/400。
[0013] 本发明还提供了一种抗体或其片段，其进一步包含一个重链⑶Rl(HCDRl)结构 域，该结构域含有一个选自下列一组序列的氨基酸序列：4、20、36、52、68、84、100、116、132、 148、164、180、196、212、228、244、260、276、292、308、324、340、356、372 和 388,或一个与其 基本上相似且具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的序列；以及一 个重链⑶R2(HCDR2)结构域，该结构域含有一个选自下列一组序列的氨基酸序列：6、22、 38、54、70、86、102、118、134、150、166、182、198、214、230、246、262、278、294、310、326、342、 358、374和390,或一个与其基本上相似且具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99% 序列同一性的序列；以及一个轻链CDRl(LCDRl)结构域，该结构域含有一个选自下列一组 序列的氨基酸序列：12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204、220、236、252、 268、284、300、316、332、348、364、380和396，或一个与其基本上相似且具有至少90%、至少 95%、至少98%或至少99%序列同一性的序列；以及一个轻链⑶R2 0XDR2)结构域，该结构 域含有一个选自下列一组序列的氨基酸序列：14、30、46、62、78、94、110、126、142、158、174、 190、206、222、238、254、270、286、302、318、334、350、366、382 和 398,或一个与其基本上相 似且具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的序列。
[0014] 本发明之某些非限制性、典型的抗体和抗原结合片段分别包含HCDR1-H ⑶R2-HCDR3-IXDR1-IXDR2-IXDR3结构域，其含有一个选自下列一组序列的氨基 酸序列：4-6-8-12-14-16(如 H1M6712N) ;20-22-24-28-30-32(如 H1M6716N); 36-38-40-44-46-48 (如 Η1M6718N) ; 52-54-56-60 - 62 -64 (如 Η1M7101N); 68-70-72-76-78-80 (如 Η2Μ7103Ν) ；84-86-88-92-94-96 (如 Η3Μ6713Ν)； 100-102-104-108-110-112(如 Η3Μ6715Ν) ;116-118-120-124-126-128(如 Η3Μ6720Ν); 132-134-136-140-142-144(如 H3M6721N) ; 148-150-152-156-158-160(如 H3M6721N2); 164-166-168-172-174-176(如 H3M6726N) ; 180-182-184-188-190-192(如 H3M6760N); 196-198-200-204-206-208(如 H3M7102N) ;212-214-216-220-222-224(如 H3M7118N); 228-23〇-232-236- 238_240(如 H4H6362P) ;244-246-24 8-252_254-256(如 H4H6363P); 260-262-264-268-270-272(如 H4H6364P) ;276-278-280-284-286-288(如 H4H6366P); 292-294-296-300-302-304(如 H4H6372P) ;308-310-312-316-318-320(如 H4H6374P); 324-326-328-332-334-336(如 H4H6375P) ;340-342-344-348-350-352(如 H4H6379P); 356-358-360-364-366-368(如 H4H6380P) ;372-374-376-380-382-384(如 H4H6381P);以 及 388-390-392-396-398-400(如 H4H6383P)。
[0015] 在一个相关的实施方案中，本发明包括一种与ASIC1 (例如细胞表面表达的 ASIC1)特异性结合的抗体或抗体的抗原结合片段，其中该抗体或抗体片段包含重链和轻 链⑶R区，该重链和轻链⑶R区位于选自下列一组序列的重链和轻链可变区（HCVR/LCVR) 序列内：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、 162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、 306/314、322/330、338/346、354/362、370/378 及 386/394。鉴定 HCVR/LCVR 氨基酸序列内 CDR区的方法和技术是本领域内众所周知的，并可用于鉴定本文所公开的特定HCVR和/或 LCVR氨基酸序列内的⑶R区。可用于鉴定⑶R区边界的典型的规则包括例如Kabat定义、 Chothia定义以及AbM定义。总的来说，Kabat定义是基于序列可变性，Chothia定义是基 于结构环区的位置，AbM定义则是Kabat定义与Chothia定义两者之间的折衷。参阅例如 Kabat,''Sequences of Proteins of Immunological Interest"，National Institutes of Health, Bethesda，Md. (1991) ;A1-Lazikani et al.，J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997);以 及 Martin et al.，Proc. Natl. Acad. Sci.USA86:9268-9272 (1989)。公共数据库也可供利 用，以鉴定抗体内的⑶R序列。
[0016] 在另一方面，本发明提供了编码抗ASIC1抗体或其片段的核酸分子。本发明还包 括载有本发明之核酸的重组表达载体以及引入这类载体的宿主细胞，并包括一些生产抗体 的方法，通过在允许生产抗体的条件下培养宿主细胞，以及回收所生产的抗体。
[0017] 在一个实施方案中，本发明提供了一种抗体或其片段，其包含一个由选自下列一 组序列的核酸序列编码的 HCVR :1、17、33、49、65、81、97、113、129、145、161、177、193、209、 225、241、257、273、289、305、321、337、353、369和385,或一个与其基本上相同且具有至少 90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性的序列。
[0018] 本发明还提供了一种抗体或其片段，其包含一个由选自下列一组序列的核酸序列 编码的 LCVR :9、25、41、57、73、89、105、121、137、153、169、185、201、217、233、249、265、281、 297、313、329、345、361、377和393,或一个与其基本上相同且具有至少90%、至少95%、至 少98 %或至少99 %同源性的序列。
[0019] 本发明还提供了一种抗体或抗体的抗原结合片段，其包含一个由一个选自下列 一组序列的核苷酸序列编码的 HCDR3 区：7、23、39、55、71、87、103、119、135、151、167、183、 199、215、231、247、263、279、295、311、327、343、359、375 和 391，或一种与其基本上相同且 具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性的序列；以及一个由一个选自下列 一组序列的核苷酸序列编码的 LCDR3 区：15、31、47、63、79、95、111、127、143、159、175、191、 207、223、239、255、271、287、303、319、335、351、367、383 和 399,或一个与其基本上相同且 具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性的序列。
[0020] 本发明还提供了一种抗体或其片段，其进一步包含一个由选自下列一组序列的核 苷酸序列编码的 HCDR1 区：3、19、35、51、67、83、99、115、131、147、163、179、195、211、227、 243、259、275、291、307、323、339、355、371和387,或一种与其基本上相同且具有至少90%、 至少95%、至少98%或至少99%同源性的序列；以及一个由一个选自下列一组序列的核 苷酸序列编码的 HCDR2 区：5、21、37、53、69、85、101、117、133、149、165、181、197、213、229、 245、261、277、293、309、325、341、357、373和389,或一种与其基本上相同且具有至少90%、 至少95%、至少98%或至少99%同源性的序列；以及一个由一个选自下列一组序列的核 苷酸序列编码的 LCDR1 区：11、27、43、59、75、91、107、123、139、155、171、187、203、219、235、 251、267、283、299、315、331、347、363、379和395,或一种与其基本上相同且具有至少90%、 至少95%、至少98%或至少99%同源性的序列；以及一个由一个选自下列一组序列的核 苷酸序列编码的 LCDR2 区：13、29、45、61、77、93、109、125、141、157、173、189、205、221、237、 253、269、285、301、317、333、349、365、381和397,或一个与其基本上相同且具有至少90%、 至少95%、至少98%或至少99%同源性的序列。
[0021] 依照某些实施方案，抗体或其片段包含由如下核酸序列编码的重链和轻链CDR序 列：1 和 9(如 H1M6712N)、17 和 25(如 H1M6716N)、33 和 41(如 H1M6718N)、49 和 57(如 H1M7101N)、65 和 73(如 H2M7103N)、81 和 89(如 H3M6713N)、97 和 105(如 H3M6715N)、113 和 121 (如 H3M6720N)、129 和 137 (如 H3M6721N)、145 和 153 (如 H3M6721N2)、161 和 169 (如 H3M6726N)、177 和 185 (如 H3M6760N)、193 和 201 (如 H3M7102N)、209 和 217 (如 H3M7118N)、 225 和 233(如 H4H6362P)、241 和 249(如 H4H6363P)、257 和 265(如 H4H6364P)、273 和 281 (如 H4H6366P)、289 和 297 (如 H4H6372P)、305 和 313 (如 H4H6374P)、321 和 329 (如 H4H6375P)、337 和 345 (如 H4H6379P)、353 和 361 (如 H4H6380P)、369 和 377 (如 H4H6381P)、 385 和 393 (如 H4H6383P)。
[0022] 本发明包括具有一种经修饰的糖基化模式的抗ASIC1抗体。在某些应用中，为除 去不合乎需要的糖基化位点所进行的修饰，或寡糖链上缺乏岩藻糖基的抗体，也许是有益 的。
[0023] 在另一方面，本发明提供了一种由与ASIC1(例如细胞表面表达的ASIC1)特异性 结合的重组人源抗体或其片段以及一种药学上可接受载体组成的医药组合物。在一个相关 的方面，本发明之特点是一种抗ASIC1抗体和第二种治疗剂结合的医药组合物。在一个实 施方案中，上述第二种治疗剂是可与一种抗ASIC1抗体有益地结合的任何药剂。可与一种 抗ASIC1抗体有益地结合的典型的药剂包括，但不限于，抑制ASIC1活性的其他药剂（包括 其他抗体或其抗原结合片段、肽抑制剂、小分子拮抗剂等）和/或一些不直接与ASIC1结合 但干扰、阻断或减弱细胞内ASIC1介导的离子流的药剂。
[0024] 在另一个方面，本发明提供了一些用本发明之抗ASIC1抗体或抗体的抗原结合片 段抑制ASIC1介导的离子流的方法，其中该治疗方法包括施用一种治疗有效量的含有本发 明之抗体或抗体的抗原结合片段的医药组合物。所治疗的失调是通过除去、抑制或降低 ASIC1介导的离子流而得到改善、减轻、抑制或预防的任何疾病或病症。本发明之抗ASIC1 抗体或抗体片段可以阻断酸诱导的ASIC1介导的离子流，或抑制ASIC1的信号活性。
[0025] 本发明还包括将本发明之抗ASIC1抗体或抗体的抗原结合片段用于制造一种药 物，以治疗患者与ASIC1介导的离子流相关或由其引起的疾病或失调。
[0026] 在审阅随后的详细说明的过程中，其它实施方案将变得明显。 附图简要说明
[0027] 图1描绘了用抗ASIC1抗体（H1M6718N)或同型对照抗体处理的小鼠，当其尾巴 (亚图A)或腓肠肌（亚图B)被器械钳夹之后的退缩阈值。其结果以钳夹后的退缩阈值表 示，以克为单位（每组小鼠的平均值土SEM)。
[0028] 图2显示了在以抗ASIC1抗体（H1M6718N)或同型对照抗体处理的小鼠中，以酸性 盐水诱导的肌肉痛敏反应的退缩阈值从基线的百分比变化。
[0029] 图3(亚图A和B)显示了在以抗ASIC1抗体（H1M6718N，10或40mg/kg-亚图A; 或H4H6721N210或30mg/kg-亚图B)或同型对照抗体处理的小鼠中，以角叉胶聚糖诱导的 肌肉痛敏反应的退缩阈值从基线的百分比变化。
[0030] 图4显示了在分别用30mg/kg(皮下）同型对照抗体、30mg/kg(皮下）H1M6718N, 或100mg/kg(皮下）加巴喷丁治疗的经紫杉醇处理的小鼠中，紫杉醇诱导的触诱发痛反应 随时间的变化。以用Von Frey纤维测量的退缩阈值（g)表示结果（如实施例10所述）。 详细说明
[0031] 在说明本发明之前先要声明，应该理解，本发明并不局限于所说明的具体方法和 实验条件，因为这些方法和条件是可以改变的。还应理解，本文所用的术语仅出于说明具体 实施方案之目的，并非意在限制本发明，因为本发明之范围仅受所附权利要求书的限制。
[0032] 除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语均将具有与本发明所属领域专业 人士通常理解的相同含义。本文所用的术语"大约"，当用于列出的某一具体数值时，意为该 数值可能在与所列数值相差不大于1%的范围内变化。例如，本文所用的措词"大约100"， 包括99和101以及这两者之间的所有数值（例如99. 1、99. 2、99. 3、99. 4等）。
[0033] 尽管与本文所述之方法和材料类似或相当的任何方法和材料都可用于本发明之 实施或试验，但现在描述的是首选的方法和材料。 定义
[0034] 本文所用的措词"ASIC1"和"ASIC1片段〃是指人ASIC1蛋白或片段，除非说明是 源自非人类物种（例如〃小鼠 ASIC1"、〃小鼠 ASIC1片段〃、〃猴ASIC1"、〃猴ASIC1片段〃 等）。人ASIC1含有如401号序列所示的氨基酸。本文所用的措词"ASIC1"包括ASIC1胞 外域的可溶性片段（例如，包含存在于401号序列的第63至第424个氨基酸内至少30个 相邻氨基酸或由其构成的肽），以及细胞表面表达的ASIC1 (如下文所定义的术语）。
[0035] 本文所用的术语"与ASIC1结合的抗体"或"抗ASIC1抗体"包括与一个ASIC1蛋 白的可溶性片段（例如ASIC1胞外域的一部分）和/或细胞表面表达的ASIC1结合的抗体 及其抗原结合片段。"细胞表面表达的ASIC1"这一措词意为在体外或体内被表达在细胞表 面的一个或多个ASIC1蛋白，使得该ASIC1蛋白的至少一部分（例如401号序列中第63至 第424个氨基酸）暴露于细胞膜的胞外侧且让抗体的抗原结合部分易于触及。"细胞表面 表达的ASIC1"包括在细胞膜内功能性ASIC1离子通道的情況下所包含的ASIC1蛋白。在 某些情况下，"细胞表面表达的ASIC1"是一种作为异源多聚体的一部分表达在细胞表面的 ASIC1蛋白（例如ASICl/2、ASICl/3或ASIC1/4异源多聚体）。在另一些情况下，"细胞表 面表达的ASIC1"是一种作为同源多聚体的一部分表达在细胞表面的ASIC1蛋白。此外，"细 胞表面表达的ASIC1"可包含通常表达ASIC1蛋白的细胞表面上所表达的ASIC1蛋白，或由 其构成。或者，"细胞表面表达的ASIC1"可包含通常不表达其表面人ASIC1蛋白的细胞之 表面所表达的ASIC1蛋白，但经人为工程改造表达其表面的ASIC1蛋白，或由这样的ASIC1 蛋白构成。
[0036] 本文所用的术语"抗体"意为包含至少一个互补决定区（⑶R)的任何抗原结合分 子或分子复合体，该互补决定区与一个特定的抗原（如ASIC1)特异性地结合或与其相互作 用。术语"抗体"包括由四条多肽链，即两条重（H)链和两条轻（L)链，以二硫键相互连接 而组成的免疫球蛋白分子，及其多聚体（例如IgM)。每条重链均包含一个重链可变区（本 文中缩写为HCVR或V H)和一个重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域，CH1、Ch2和Ch3。 每条轻链均包含一个轻链可变区（本文中缩写为LCVR或')和一个轻链恒定区。该轻链恒 定区包含一个结构域（Ql)。V!^P'区可进一步分为被称为互补决定区（CDR)的高变区， 其中散布着较保守的称为框架区（FR)的区域。每个'均由三个CDR和四个FR组成， 从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。在本发明的不 同实施方案中，抗ASIC1抗体（或其抗原结合部分）的FR可能与人类种系序列相同，或可 能经过天然或人工的修饰。一个氨基酸共有序列可根据两个或两个以上CDR的并排分析而 定义。
[0037] 本文所用的术语"抗体"还包括整个抗体分子的抗原结合片段。本文所用的抗体 的"抗原结合部分"、抗体的"抗原结合片段"等术语，包括与一个抗原特异性结合而形成复 合体的任何天然产生的、可以酶促方式获得的、合成的或基因改造的多肽或糖蛋白。抗体的 抗原结合片段可以利用任何适宜的标准技术，例如蛋白水解消化或涉及编码抗体可变区和 恒定区（可选）的DNA之操纵和表达的重组基因改造技术，从例如完整的抗体分子衍生。 这样的DNA是已知的及/或很容易从例如市售来源、DNA库（包括例如噬菌体-抗体库） 获得，或可以合成。该DNA可以测序且以化学方法或分子生物学技术加以操纵，例如将一个 或多个可变区和/或恒定区排列成一种适宜的构型，或引入密码子、产生半胱氨酸残基、修 饰、添加或删除氨基酸等。
[0038] 抗原结合片段的非限制性实例包括：（i)Fab片段；（ii)F(ab'）2片段；（iii)Fd片 段；（iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；以及（vii)由模拟该抗体高变区 (例如一个孤立的互补决定区⑶R，如⑶R3肽）或一个FR3-⑶R3-FR4构型约束肽的氨基酸 残基组成的最小识别单位。本文所用的"抗原结合片段"这一表达还包括其它工程改造的 分子，如结构域特异性抗体、单域抗体、结构域删除的抗体、嵌合抗体、CDR嫁接的抗体、双抗 体、三聚抗体、四聚抗体、微型抗体、纳米抗体（例如单价纳米抗体、二价纳米抗体等）、小模 块免疫药物（SMIP)，以及鲨鱼可变IgNAR域。
[0039] -个抗体的抗原结合片段通常会包含至少一个可变区。可变域可以是任何大小或 具有任何氨基酸组成，且通常会包含至少一个邻近一个或多个框架序列或位于其中的⑶R。 在含有与 '区相关联之VH区的抗原结合片段中，该VH区和' 区的相对位置可为任何适宜 的排列。例如，该可变区可以是二聚化的且含有vH-vH、v H-'或二聚体。或者，抗体的 抗原结合片段可含有一个单一的VH区或 '区。
[0040] 在某些实施方案中，一个抗体的抗原结合片段可含有与至少一个恒定区共价 连接的至少一个可变区。在本发明之抗体的抗原结合片段内可发现的可变区和恒定区 的非限制性典型的构型包括：（i) VH_CH1 ; (ii) VH-CH2 ; (iii) VH-CH3 ; (iv) VH-CH1-CH2 ; (v) Vh-Ch1-Ch2-Ch3 ； (vi)VH-CH2-CH3 ； (vii)VH-CL ； (viii)VL-CHl ； (ix)VL-CH2 ； (x) VL-CH3 ； (xi) VL-CH1-CH2 ;(xii)VL-CHl-CH2-CH3 ;(xiii)VL-CH2-CH3 ;以及（xiv)VL-CL。在可变区和恒定区的 任何构型中，包括上述任何典型的构型中，该可变区和恒定区可直接相互连接或可通过一 个完整或部分的铰链区或连接区连接。一个铰链区可含有至少2个（例如5、10、15、20、40、 60个或以上）氨基酸，其在一个单一肽分子中相邻的可变区和/或恒定区之间形成一种柔 性或半柔性连接。此外，本发明之抗体的抗原结合片段可包含上述可变区和恒定区任何构 型的同二聚体或异二聚体（或其它多聚体），该可变区和恒定区以非共价键相互连接和/或 与一个或多个单一 VH区或 '区（例如通过二硫键）连接。
[0041] 如同完整的抗体分子，抗原结合片段可以是单特异性或多特异性（例如双特异 性）。一个抗体的多特异性抗原结合片段通常包含至少两个不同的可变区，其中每个可变区 都能够特异性地与另一个抗原或同一抗原的不同表位结合。对于任何多特异性抗体形式， 包括本文所公开的典型的双特异性抗体形式，均可利用本领域内可利用的常规技术，使其 适应于涉及本发明之抗体的抗原结合片段的用途。
[0042] 本文所用的术语"人源抗体"意在包括含有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变 区和恒定区的抗体。本发明之人源抗体可包括非由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残 基（例如通过体外随机诱变或位点特异性诱变，或通过体内体细胞突变所引入的突变），例 如可在CDR中尤其是在CDR3中包括上述氨基酸残基。但是，本文所用的术语"人源抗体"并 不意图包括这样的抗体，其中衍生自另一哺乳动物物种如小鼠的CDR序列被嫁接到人类框 架序列上。
[0043] 本文所用的术语"重组人源抗体"意在包括所有以重组方法制备、表达、产生或分 离的人源抗体，例如用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体（将在下文中进一步 说明），从重组的、组合人源抗体库分离的抗体（将在下文中进一步说明），从人类免疫球蛋 白基因转基因动物（例如小鼠）分离的抗体（参阅例如Taylor et al. (1992)Nucl. Acids Res. 20:6287-6295)，或者以任何其他涉及将人类免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序 列的方法所制备、表达、产生或分离的抗体。这类重组人源抗体含有衍生自人类种系免疫球 蛋白序列的可变区和恒定区。但是，在某些实施方案中，这类重组人源抗体经受体外诱变 (或者，当使用人类Ig序列转基因动物时，经受体内体细胞诱变），从而使得该重组抗体的 VH区和 '区的氨基酸序列成为这样的序列：它们虽然衍生自人类种系VH序列和 '序列并 与它们相关，但也许并不天然地以活体状态存在于人源抗体种系之中。
[0044] 人源抗体可以两种与铰链异质性相关的形式存在。在第一种形式中，一个免疫球 蛋白分子包含一个分子量约为150_160kDa的稳定的四链构建物，其中二聚体由一根链间 重链二硫键连接在一起。在第二种形式中，该二聚体不是由链间二硫键连接在一起，而是一 个由共价偶联的轻链和重链（半抗体）组成的分子量约为75-80kDa的分子。这些形式的 分离一直极为困难，甚至在亲和纯化之后也是如此。
[0045] 第二种形式在各种完整IgG同型中的出现频率，是由于但不限于与抗体的铰链区 同型相关的结构差异。人类IgG4铰链的铰链区内单个氨基酸替换可将第二种形式（Angal et al. (1993)Molecular Immunology30:105)的出现频率显著地降低到利用人类IgGl铰 链时通常观察到的水平。本发明包括在铰链区、C H2区或CH3区中含有一个或多个突变的抗 体；所述突变可能是合乎需要的，例如在生产中用于提高所需抗体形式的产率。
[0046] 本文所用的"分离的抗体"意为从其自然环境的至少一个组分中识别、分离和/或 回收的抗体。例如，从一个生物体的至少一个组成部分或从抗体自然存在或自然产生的一 种组织或细胞分离或移除的抗体，就是一种符合本发明目的之"分离的抗体"。"分离的抗 体"也包括重组细胞内的原位抗体。分离的抗体是经过至少一个纯化或分离步骤的抗体。 依照某些实施方案，分离的抗体可以基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。
[0047] 本文所用的"中和"或"阻断"抗体意指其与ASIC1的结合减少或可检测地抑制酸 诱导的ASIC1介导的离子流的抗体。ASIC1中和或阻断抗体所造成的抑制不必是完全的抑 制，只要它是用适当分析方法可检测的抑制即可。本文其他部分叙述了典型的检测ASIC1 抑制作用的检测方法。
[0048] 本文公开的抗ASIC1抗体与衍生该抗体的相应种系序列相比，在重链和轻链可变 区的框架区和/或CDR区可包含一个或多个氨基酸的替换、插入和/或删除。通过将本文 所公开的氨基酸序列与从例如公共抗体序列数据库可获得的种系序列相比，可以容易地证 实这类突变。本发明包括衍生自本文所公开的任何氨基酸序列的抗体及其抗原结合片段， 其中一个或多个框架区和/或CDR区内的一个或多个氨基酸突变为衍生该抗体的种系序列 的相应残基，或突变为另一个人类种系序列的相应残基，或突变为相应的种系序列残基的 保守氨基酸替换（这类序列变化在本文中统称为"种系突变"）。本领域专业人士从本文公 开的重链和轻链可变区序列开始，能够容易地产生许多包含一个或多个单个种系突变或其 组合的抗体及其抗原结合片段。在某些实施方案中，上述V H和/或'区内的所有框架和/ 或CDR残基均回复突变为在衍生该抗体的原始种系序列中发现的残基。在其它一些实施方 案中，只有某些残基被回复突变为原始种系序列，例如，仅在FR1的前8个氨基酸或FR4的 后8个氨基酸中发现的突变残基，或仅在CDR1、CDR2或CDR3中发现的突变残基，被回复突 变为原始种系序列。在其他一些实施方案中，一个或多个框架和/或CDR残基突变为一个不 同种系序列（即一个不同于最初衍生该抗体的种系序列的种系序列）的相应残基。此外， 本发明之抗体可在框架区和/或CDR区内含有两个或多个种系突变的任何组合，例如，其中 某些残基分别突变为一个特定种系序列的相应残基，而其他某些不同于原始种系序列的残 基则保持不变或突变为一个不同种系序列的相应残基。获得含有一个或多个种系突变的抗 体和抗原结合片段之后，就很容易测试其一种或多种所需的特性，例如结合特异性改善、结 合亲和力提高、拮抗或对抗的生物学特性改善或增强（视情况而定）、免疫原性下降等。以 此一般方式获得的抗体和抗原结合片段均包括在本发明的范围内。
[0049] 本发明还包括含有本文所公开的任何HCVR、LCVR和/或⑶R氨基酸序列之变异 体的抗ASIC1抗体，该变异体含有一个或多个保守的氨基酸替换。例如，本发明包括含有 HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的抗ASIC1抗体，该氨基酸序列相对于本文所公开的任 何HCVR、LCVR和/或⑶R氨基酸序列，含有例如10个或以下、8个或以下、6个或以下、4个 或以下等保守的氨基酸替换。
[0050] 术语"表位"是指一个抗原决定位，其与抗体分子可变区中称为抗原互补位的一个 特异性抗原结合位点相互作用。单个抗原可以有一个以上的表位。因此，不同的抗体可与一 个抗原的不同区域结合并可产生不同的生物学效应。表位可为构象的，也可为线性的。构 象性表位是从线性多肽链不同片段上空间并列的氨基酸产生的。线性表位是由多肽链上邻 近的氨基酸残基形成的。在某些情况下，一个表位可包括抗原上的糖基、磷酰基，或磺酰基 等基团。
[0051] 术语"基本的相同性"或"基本上相同"，当指一个核酸或其片段时，表示当以适当 的核苷酸插入或删除与另一个核酸（或其互补链）进行最佳比对时，以下述任何众所周知 的序列同一性算法如FASTA、BLAST或Gap测量，至少有95%的核苷酸序列同一性，首选的 是至少有96 %、97 %、98 %或99 %的核苷酸碱基相同性。在某些情况下，一个与参照核酸分 子基本上相同的核酸分子，可编码一个含有与该参照核酸分子编码的多肽相同或基本上类 似的氨基酸系列的多肽。
[0052] 当应用于多肽时，术语"基本的相似性"或"基本上相似"意为两个肽序列用诸如 GAP或BESTFIT等程序的预设间隙重量排列达到最佳比对时，两者至少有95%的序列同一 性，首选的是至少有98%或99%的序列同一性。首选的是，不相同的残基位置其差别仅在 于保守的氨基酸替换。"保守的氨基酸替换"是指这样一种替换，即一个氨基酸残基被另一 个含有相似化学性质（例如电荷或疏水性）的侧链（R基）的氨基酸残基所替换。一般而 言，保守的氨基酸替换不会在实质上改变蛋白质的功能性质。在两个或更多的氨基酸序列 相互之间的差别仅在于某些保守的替换情况下，可将序列同一性百分比或相似性程度向上 调整，以校正所述替换的保守特性。进行这种调整的方法是本领域专业人士众所周知的。参 阅例如Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-331。含有化学性质相似侧链的几类氨基 酸的实例包括：（1)脂族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、白氨酸和异白氨酸；（2)脂族羟基侧 链：丝氨酸和苏氨酸；（3)含酰胺侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳族侧链：苯丙氨酸、酪 氨酸和色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酰 胺，以及（7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。首选的保守氨基酸取代基是：缬氨酸-亮氨 酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸，以 及天冬酰胺-谷氨酰胺。或者，保守的取代是Gonnet et al. (1992)Science256:144345中 所公开的PAM250对数似然矩阵（PAM2501og-likelihood matrix)中任何正值的变化。"中 度保守的"取代是PAM250对数似然矩阵中非负值的任何变化。
[0053] 多肽的序列相似性，也称为序列同一性，通常是用序列分析软件测量的。蛋白质 分析软件用指定给各种替换（包括保守氨基酸替换）、删除和其它修饰的相似性程度对相 似的序列进行比对。例如，GCG软件含有诸如Gap和Bestfit程序，可在默认参数情况下使 用这些程序，以确定紧密相关的多肽（例如来自不同生物物种的同源多肽）之间的序列同 源性或序列同一性，或者野生型蛋白质与其突变后形成的蛋白质之间的序列同源性或序列 同一性。参阅例如GCG6. 1版。也可以用FASTA及默认参数或推荐参数、GCG6. 1版程序来 比较多肽序列。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)能提供所查询序列和所搜索序列之间的 最佳重叠区域的比对和序列同一性百分比（Pearson(2000)，出处同上）。当将本发明之序 列与含有大量源自不同生物之序列的数据库进行比较时，另一首选的算法是BLAST电脑程 序，尤其是BLASTP或TBLASTN，使用默认参数。参阅例如Altschul et al. (1990)J.M〇1. Biol.215:403-410 及 Altschul et al. (1997)Nucleic Acids Res. 25:3389-402。 抗体的生物学特征
[0054] 本发明提供了与细胞表面表达的ASIC1特异性结合的抗体。如本文所用，如果一 种抗体显示出与一种天然地或人工地表达ASIC1的细胞可检测的结合，但未显示出与不表 达ASIC1的相当细胞可检测的结合，则该抗体与细胞表面表达的ASIC1特异性结合。一种 可用于确定一种抗体是否与细胞表面表达的ASIC1特异性结合的典型的检测方式是荧光 激活细胞分类术（FACS)，如本文实施例3所述。如表2所示，抗体与表达ASIC1的细胞的 定性阳性FACS结合，可用于将某抗体鉴定为与细胞表面表达的ASIC1特异性结合的抗体。 FACS也可用于以EC5(I值定量地评估与表达ASIC1的细胞结合的抗体，如实施例3之表3所 示。因此，依照本发明的某些实施方案，当以实施例3的FACS检测方式或一种基本相似的检 测方式测试时，如果一种抗体显示出约5nM或以下的EC 5(I值（例如约5. 0nM、4. 5nM、4. OnM、 3· 5ηΜ、3· 0ηΜ、2· 5ηΜ、2· 0ηΜ、1· 5ηΜ、1· 4ηΜ、1· 3ηΜ、1· 2ηΜ、1· 1ηΜ、1· 0nM、900pM、800pM、 700pM、600pM、500pM、400pM、300pM、200pM、100pM、90pM、85pM、80pM、75pM、70pM，*#T)JlJ 该抗体就是"与细胞表面表达的ASIC1特异性结合"。
[0055] 依照某些实施方案，本发明之抗体也可（或作为一种选择）对表达人ASIC1的细 胞内酸诱导的ASIC1介导的离子流起抑制作用。本文所用的措词"抑制酸诱导的、ASIC1介 导的离子流"意为在可检测和/或定量测定酸诱导的细胞离子流或通量的检测方法中，与 抗体不存在条件下（例如在一种非特异性阴性对照抗体存在条件下）所观察到的离子流相 t匕，添加本发明之抗体将在可检测的程度上减少或抑制酸诱导的离子流。一种可用于确定 某种抗体是否"抑制酸诱导的、ASIC1介导的离子流"的非限制性典型的检测方法如本文实 施例4所述。在此实施例中，低pH激活的钙通量是在表达ASIC1的细胞中在抗ASIC1抗体 存在条件下测定的（"FLIPR检测法")。通过改变此检测方式中所用的抗体量，可以IC 5Q值 来计算和表达阻断50%低pH诱导的离子通量所需的抗体量（见例如实施例4之表5)。本 发明包括这样一些抗ASIC1抗体，当以如上所述的FLIPR检测法或基本相似的检测法在pH 值为约 5. 0 至约 6. 0(例如 pH 值为 5· 0、5· 1、5· 2、5· 3、5· 4、5· 5、5· 6、5· 7、5· 8、5· 9 或 6. 0) 的条件下检测时，这些抗体抑制酸诱导的、ASIC1介导的离子流，其IC5(I值低于约ΙΟηΜ。例 如，本发明包括这样一些抗ASIC1抗体，当以如上所述的FLIPR检测法或基本相似的检测法 在pH值为5. 5的条件下检测时，这些抗体显示低于约9ηΜ、8ηΜ、7ηΜ、6ηΜ、5ηΜ、4ηΜ、3ηΜ、2ηΜ、 1ηΜ、0· 9ηΜ、0· 8ηΜ、0· 7ηΜ、0· 6ηΜ、0· 5ηΜ、0· 4ηΜ、0· 3ηΜ、0· 2ηΜ、0· ΙηΜ，或以下的 IC5(I 值。
[0056] 可用于确定某种抗体是否"抑制酸诱导的、ASIC1介导的离子流"的其他典型的检 测方式如本文实施例5和6所述。在这些实施例中，使用自动电压钳、膜片钳检测法来测量 和/或评估在酸性pH值和抗ASIC1抗体存在条件下，对表达ASIC1的细胞中离子流通量的 抑制，并与在相当情况下和抗体不存在条件下（例如在一种非特异性阴性对照抗体存在条 件下）所观察到的离子流通量相比。如果一种抗体，当以自动电压钳、膜片钳检测法在约 InM至约ΙΟΟηΜ的抗体浓度下，于约5.0至约6.0的pH值（例如于5·0、5· 1、5.2、5.3、5.4、 5. 5、5. 6、5. 7、5. 8、5. 9或6. 0的pH值）条件下检测时，导致至少10%离子流的抑制（例如 至少约 10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、 80%、85%、90%、95%或以上的离子流通量的抑制；见例如实施例5之表6)，则该抗体就被 认为是"抑制酸诱导的、ASIC1介导的离子流"。在某些情况下，当以上述膜片钳检测方式或 基本相似的检测方式检测时，本发明之抗体在1〇ηΜ或更高（例如ΙΟΟηΜ)浓度下，完全抑制 离子流通量（即100%抑制）。
[0057] 本发明还包括在各种动物疼痛模型中抑制或降低疼痛反应的抗体。可用于鉴定本 发明之抗ASIC1抗体的典型的动物疼痛模型如本文实施例7至9所述。例如，本发明包括 一些抗ASIC1抗体，该抗体能减轻或抑制小鼠模型对酸诱导的内脏疼痛的疼痛反应。（见例 如实施例7)。尤其是，本发明包括这样一些抗ASIC1抗体，当以约1或10mg/kg的剂量施予 如实施例7所示的小鼠模型或基本相似的模型时，显示出对内脏疼痛反应（例如对腹腔内 注射0. 6%乙酸的腹部收缩反应）至少20%的抑制。在某些情况下，当在实施例7所述的 小鼠动物模型或基本相似的模型中试验时，因施用本发明之抗体而对疼痛反应抑制的百分 t匕，可以高达约30%、35%、40%、45%、50%或以上。可用于鉴定本发明之抗ASIC抗体的 其他动物疼痛模型包括，例如，实施例8所述的机械伤害疼痛反应模型，实施例9所述的肌 肉疼痛模型，以及本【技术领域】内可供利用的其他类似动物模型。因此，本发明包括这样一些 抗ASIC1抗体，该抗体能减轻或抑制如本文例示的适当动物模型所显示的对有害机械刺激 (见例如实施例8)的疼痛反应；及/或酸性盐水或角叉胶聚糖诱导的肌肉痛敏反应（见例 如实施例9)。 表位作图和相关技术
[0058] 本发明包括与人ASIC1胞外域（401号序列的第63至第424个氨基酸）内一个或 多个氨基酸相互作用的抗ASIC1抗体。抗体与之结合的表位可由一个位于ASIC1胞外域内 3 个或 3 个以上（例如 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 个或更多）氨 基酸组成的单一的毗连序列组成。或者，该表位可由位于ASIC1胞外域内多个非毗连的氨 基酸（或氨基酸序列）组成。
[0059] 本领域专业人士周知的各种技术可用于确定一个抗体是否与一个多肽或蛋白 内的"一个或多个氨基酸相互作用"。典型的抟术何括，例如，Antibodies, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb·，NY)中所述的常规交叉阻断分析、丙 氨酸扫描突变分析、肽印迹分析（Reineke，2004, Methods Mol Biol248:443-463),以及肽 切割分析。另外，还可采用诸如抗原的表位切除、表位提取和化学修饰的方法（Tomer (2000) Protein Science9:487-496)。可用于鉴定与抗体相互作用的多肽内氨基酸的另一方法是 用质谱检测的氢/氘交换。总的说来，氢/氘交换法涉及用氘标记的感兴趣蛋白，随后使抗 体与氘标记的蛋白结合。然后，将该蛋白/抗体复合物转移至水中，除了受抗体保护的残基 (其维持氘标记状态），让所有残基均发生氢-氘交换。在抗体解离后，进行标靶蛋白的蛋白 酶裂解和质谱分析，从而揭示与抗体相互作用的特定氨基酸对应的那些氘标记的残基。参 阅例如Ehring(1999)Analytical Biochemistry267(2) :252-259 ;Engen and Smith(2001) Anal. Chem. 73:256A_265A。
[0060] 本发明进一步包括与本文所述的任何特定的典型抗体在同一表位上结合的 抗 ASIC1 抗体（例如，H1M6712N、H1M6716N、H1M6718N、H1M7101N、H2M7103N、H3M6713N、 H3M6715N、H3M6720N、H3M6721N、H3M6721N2、H3M6726N、H3M6760N、H3M7102N、H3M7118N、 H4H6362P、H4H6363P、H4H6364P、H4H6366P、H4H6372P、H4H6374P、H4H6375P、H4H6379P、 H4H6380P、H4H6381P、H4H6383P等）。同样，本发明还包括在与ASIC1或细胞表面表达 的ASIC1结合过程中与本文所述的任何特定的典型抗体竞争的抗ASIC1抗体（例如， H1M6712N、H1M6716N、H1M6718N、H1M7101N、H2M7103N、H3M6713N、H3M6715N、H3M6720N、 H3M6721N、H3M6721N2、H3M6726N、H3M6760N、H3M7102N、H3M7118N、H4H6362P、H4H6363P、 H4H6364P、H4H6366P、H4H6372P、H4H6374P、H4H6375P、H4H6379P、H4H6380P、H4H6381P、 H4H6383P 等）。
[0061] 使用本领域内已知的常规方法，可以容易地确定一种抗体是否与本发明之参照抗 ASIC1抗体一样与同一表位结合，或在结合过程中竞争。例如，为了确定一种试验抗体是否 与本发明之参照抗ASIC1抗体一样与同一表位结合，就让该参照抗体与ASIC1蛋白（例如 细胞表面表达的ASIC1)结合。然后，评估试验抗体与该ASIC1分子结合的能力。如果该试 验抗体在与参照抗ASIC1抗体饱和结合之后能够与ASIC1结合，就可得出结论，该试验抗体 和参照抗ASIC1抗体与不同的表位结合。反之，如果该试验抗体在与参照抗ASIC1抗体饱和 结合之后不能与ASIC1分子结合，那么该试验抗体就可与本发明之参照抗ASIC1抗体所结 合的同一表位结合。然后可进行其它常规的实验（例如肽突变和结合分析），以证实是否所 观察到的试验抗体的结合不足在实际上是由于其与参照抗体所结合的同一表位结合，或是 否空间位阻（或另一种现象）是所观察到的结合不足的原因。这类实验可采用ELISA、RIA、 Biacore、流式细胞计数法或本领域内可供利用的任何其他定量或定性的抗体结合检测法 来完成。依照本发明之某些实施方案，如果例如一种1倍、5倍、10倍、20倍或100倍过量的 抗体对另一抗体结合的抑制作用达至少50%，但首选的是75%、90%或甚至99% (如竞争 结合检测法所测量），则两种抗体就是与同一个（或重叠的）表位结合（参阅例如Junghans et al.，Cancer Res. 1990:50:1495-1502)。或者，如果抗原中减弱或消除一个抗体结合的 几乎所有氨基酸突变都能减弱或消除另一个抗体的结合，则两个抗体就被认为与相同的表 位结合。只要能减弱或消除一个抗体的结合的一个氨基酸突变亚群能减弱或消除另一个抗 体的结合，则两个抗体就被认为具有"重叠的表位"。
[0062] 为了确定一种抗体是否与参照抗ASIC1抗体在结合过程中竞争，就在两个方向实 施上述结合方法：在第一个方向，让参照抗体在饱和条件下与ASIC1分子（例如细胞表面表 达的ASIC1)结合，然后评估试验抗体与该ASIC1分子的结合。在第二个方向，让试验抗体 在饱和条件下与ASIC1分子结合，然后评估参照抗体与该ASIC1分子的结合。如果在这两 个方向只有第一个（饱和）抗体能够与ASIC1分子结合，那就可以得出结论，该试验抗体与 参照抗体在与ASIC1结合的过程中竞争。如同本领域专业人士所能理解的，与参照抗体在 结合过程中竞争的抗体未必与参照抗体所结合的同一表位结合，但可与一个重叠或邻近的 表位结合而在空间上阻断该参照抗体的结合。 人源抗体的制备
[0063] 产生单克隆抗体包括完全人源单克隆抗体的方法是本领域内周知的。任何这类已 知的方法均可在本发明之背景下用于制造与人ASIC1特异性结合的人源抗体。
[0064] 采用VEL0CIMMUNE?技术或任何其它产生单克隆抗体的已知技术，初步分离出对 ASIC1具有高亲和力的含有一个人类可变区和一个小鼠恒定区的嵌合抗体。如以下实验部 分所述，根据所需的特点包括亲和力、选择性、表位等特点鉴定和选择抗体。用合乎需要的 人类恒定区取代小鼠恒定区，以产生本发明之完全人源抗体，例如野生型或经修饰的IgGl 或IgG4。所选择的恒定区可根据特定的用途而改变，而高亲和力抗原结合特性和靶标特异 性特征则留存于可变区中。 生物等效物
[0065] 本发明之抗ASIC1抗体和抗体片段包括某些蛋白，这些蛋白含有不同于所述抗体 氨基酸序列的氨基酸序列，但保留了与人ASIC1结合的能力。当与母体序列比较时，这类 变异的抗体和抗体片段包含一个或多个氨基酸的添加、删除或替换，但显示了与所述抗体 的生物活性基本上相当的生物活性。类似地，当与所公开的序列比较时，本发明之编码抗 ASIC1抗体的DNA序列含有的序列包含一个或多个核苷酸的添加、删除或替换，但可编码与 本发明之抗ASIC1抗体或抗体片段基本上生物等效的抗ASIC1抗体或抗体片段。这类变异 氨基酸和DNA序列的实例已在上面讨论过。
[0066] 如果两种抗原结合蛋白或抗体是医药等效物或医药替换物，当在相似实验条件下 无论以单剂或以多剂方式以相同摩尔剂量给药时，其吸收速率和程度均未显示显著差异， 则它们就被认为是生物等效的。如果某些抗体的吸收程度相当但吸收速率不相当，它们将 被认为是等效物或医药替换物，并仍可被认为是生物等效的，因为这种吸收速率的差异是 有意设计的并反映在标记上，这种差异对于达到有效的体内药物浓度是非关键性的（例如 对于慢性用途），并被认为对于所研究的特定医药产品在医学上是无关重要的。
[0067] 在一个实施方案中，如果两种抗原结合蛋白在安全性、纯度和药效方面没有临床 意义上的差异，则它们是生物等效的。
[0068] 在一个实施方案中，如果一名患者可以在参照产品和生物产品之间转换一次或多 次而不良反应的预期风险不会增加，包括与继续没有这种转换的治疗相比在免疫原性方面 无临床意义的变化或有效性的降低，则两种抗原结合蛋白就是生物等效的。
[0069] 在一个实施方案中，如果两种抗原结合蛋白在使用条件下都以一种或多种共同的 作用机制起作用，且这类机制是周知的，则它们就是生物等效的。
[0070] 生物等效性可以体内和体外的方法演示。生物等效性的测量包括，例如，（a) -种 在人类或其他哺乳类动物体内的试验，其中血液、血浆、血清或其他生物体液中抗体或其代 谢物的浓度是作为时间的函数测定的；(b) -种体外试验，该试验已与人的体内试验生物 利用率数据建立相关联系并可根据该数据合理预测；(c) 一种人类或其他哺乳类动物的体 内试验，其中抗体（或其靶标）的适宜的急性药理作用是作为时间的函数测定的；以及（d) 一项有良好对照的临床试验，该试验确定抗体的安全性、有效性，或生物利用率或生物等效 性。
[0071] 本发明抗ASIC1抗体的生物等效变异体可通过例如替换生物活性不需要的各种 残基或序列或删除生物活性不需要的端部或内部残基或序列而构建。例如，对于生物活性 无关紧要的半胱氨酸残基可被删除或被其它氨基酸取代，以防在复原时形成不必要或不正 确的分子内二硫化物桥。在其他情况下，生物等效的抗体可能包括抗ASIC1抗体变异体，该 变异体包含修饰抗体的糖基化特征的氨基酸变化，例如消除或除去糖基化的突变。 物种选择性和物种交叉反应性
[0072] 依照本发明之某些实施方案，抗ASIC1抗体与人ASIC1结合但不与其他物种的 ASIC1结合。本发明还包括与人ASIC1结合并与一种或多种非人ASIC1结合的抗ASIC1抗 体。例如，本发明之抗ASIC1抗体可与人ASIC1结合，但未必与一个或多个下列物种的ASIC1 结合（视情况而定）：小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、猪、猫、狗、兔、山羊、绵羊、牛、马、骆驼、 猕猴、狨猴、恒河猴或黑猩猩。本发明还包括通过人ASIC1通道（但并非通过非人ASIC1通 道）选择性抑制酸诱导的离子流的抗ASIC1抗体。或者，依照某些实施方案，提供了通过 人ASIC1通道以及通过非人类（例如小鼠、大鼠等）ASIC1通道抑制酸诱导的离子流的抗 ASIC1抗体（例如见下文实施例5)。 免疫偶联物
[0073] 本发明包括与治疗基团（"免疫偶联物"）如细胞毒素、化疗药物、免疫抑制剂或放 射性同位素等偶联的抗ASIC1单克隆抗体。细胞毒剂包括任何损害细胞的试剂。适宜于形 成免疫偶联物的细胞毒剂和化疗药剂的例子是本领域内周知的（参阅如W0 05/103081专 利）。 多特异性抗体
[0074] 本发明之抗体可以是单特异性、双特异性，或多特异性。多特异性抗体可以针对同 一靶标多肽的不同表位，或可含有针对一个以上靶标多肽的抗原结合域。参阅例如Tutt et al.，1991，J. Immunol. 147:60-69 ;Kufer et al.，2004, Trends Biotechnol. 22:238-244。 本发明之抗ASICl抗体可与另一个功能分子例如另一个肽或蛋白连接或共表达。例如，一 个抗体或其片段可与一个或多个其他分子实体，如另一个抗体或抗体片段实现功能性（例 如以化学偶联、基因融合、非共价键连接或其他方式）连接，以产生具有第二种结合特异性 的双特异性或多特异性抗体。例如，本发明包括双特异性抗体，其中免疫球蛋白的一臂对人 ASIC1或其片段具有特异性，而免疫球蛋白的另一臂则对第二种治疗靶标具有特异性或与 一个治疗基团偶联。
[0075] 可用于本发明的典型的双特异性抗体形式涉及使用第一个免疫球蛋白（Ig)CH3结 构域和第二个Ig CH3结构域，其中第一个和第二个Ig CH3结构域相互之间相差至少一个氨 基酸，且与无氨基酸差别的双特异性抗体相比，其中至少一个氨基酸的差异减弱了双特异 性抗体与蛋白A的结合力。在一个实施方案中，第一个Ig Ch3结构域与蛋白A结合，第二个 Ig CH3结构域含有一个减弱或消除与蛋白A结合的突变，例如一个H95R修饰（系按照IMGT 外显子编号法；按照欧盟编号法则为H435R)。第二个CH3结构域可进一步包含一个Y96F修 饰（系按照頂GT编号法；按照欧盟编号法则为Y436F)。可在第二个C H3结构域内发现的其 它修饰包括：在IgGl抗体的情况下为D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I (系按照MGT 编号法；按照欧盟编号法则为D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I);在IgG2抗体 的情况下为N44S、K52N和V82I (系按照MGT编号法；按照欧盟编号法则为N384S、K392N和 V422I);以及在 IgG4 抗体的情况下为 Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q 和 V82I (系按照 MGT 编号法；按照欧盟编号法则为 Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q 和 V422I)。 上述双特异性抗体的各种变化形式均被认为属于本发明之范围。 治疗药剂和给药
[0076] 本发明提供了一些含有本发明之抗ASIC1抗体或其抗原结合片段的医药组合 物。本发明之医药组合物是与适宜的载体、赋形剂以及改善转移、递送、耐受性等性质的 其他试剂一起配制的。在以下这本所有药剂化学师都知道的处方集里可以找到许多适 宜的配方：雷明登药学大全（Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA.)。这些配方包括，如粉剂、糊剂、油膏、凝胶、錯剂、油剂、脂类、阳离子 或阴离子脂质囊泡（如 LIPOFECTIN?, Life Technologies, Carlsbad, CA)、DNA 偶联物、无水 吸收性糊剂、水包油或油包水乳剂、乳胶状碳蜡（各种分子量的聚乙二醇）、半固体状凝胶 以及含有碳錯的半固体状混合物。还可参阅Powell et al· "Compendium of excipients for parenteral formulations"，PDA(1998)J Pharm Sci Technol52:238_311。
[0077] 给患者施用的抗体剂量可根据患者的年龄和体形大小、靶标疾病、病症、给药途径 等因素而改变。首选的剂量通常是按照体重或体表面积计算的。当本发明之抗体用于治疗 成人患者的与ASIC1活性相关的某种病症和疾病时，将本发明之抗体经由静脉输入也许是 有利的，通常是单剂量按体重计约0. 01至约20mg/kg的剂量给药，首选的为约0. 02至约7、 约0. 03至约5,或约0. 05至约3mg/kg的剂量。取决于病症的严重性，治疗的频率和持续时 间可以调整。抗ASIC1抗体给药的有效剂量和时间表可根据经验确定；例如，可通过定期评 估来监控患者病情的发展并相应地调整剂量。而且，可以使用本领域内众所周知的方法进 行物种间剂量推算（例如 Mordenti et al.，1991，Pharmaceut. Res. 8:1351)。
[0078] 已知有各种药物递送系统可用于本发明之医药组合物的给药，例如脂质体封装、 微颗粒、微胶囊、能表达突变病毒的重组细胞、受体介导的胞吞作用（参阅如mi et al.， 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432)。给药方法包括但不限于皮内、肌内、腹腔内、静脉内、 皮下、经鼻、硬膜外以及经口给药。该组合物可经由任何方便的途径给药，例如，输注或大剂 量注射，经上皮或粘膜（例如口腔粘膜、直肠和肠道粘膜等）吸收，并可与其他生物活性药 剂一起给药。给药方式可为全身性或局部性。
[0079] 本发明之医药组合物可用标准的针头和注射器经皮下或静脉给药。此外，对于皮 下给药，一种笔型给药装置可方便地用于本发明之医药组合物的给药。这种笔型给药装置 可以是可重复使用型或一次性使用型。可重复使用的笔型给药装置一般采用一种可更换的 含医药组合物的药筒。一旦药筒内所有医药组合物均已输出、药筒变空，则可方便地丢弃空 药筒，并用一个含有医药组合物的新药筒取代。然后，该笔型给药装置即可重复使用。在一 次性使用的笔型给药装置中，没有可更换的药筒。而是，该一次性使用的笔型给药装置具有 一个预先灌满医药组合物的贮液器。一旦该贮液器内医药组合物用完，整个装置则被丢弃。
[0080] 许多可重复使用的笔型和自动注射给药装置已用于本发明之医药组合物的皮下 给药。其实例包括但不限于 AUTOPEN?(Owen Mumford, Inc.，Woodstock, UK)、DISETR0NIC? 笔（Disetronic Medical Systems, Bergdorf，Switzerland)、HUMAL0G MIX75/25? 笔、 HUMAL0G? 笔、HUMALIN70/30? 笔（Eli Lilly and Co.，Indianapolis, IN)、N0V0PEN?I、 II 和 III 型（Novo Nordisk，Copenhagen, Denmark)、N0V0PEN JUNI0R?(Novo Nordisk， Copenhagen, Denmark)、BD? 笔(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)、0ΡΤΙΡΕΝ?、 0ΡΤΙΡΕΝ PR0?、0PTIPEN STARLET?，以及 OPTICLIK?(sanofi-aventis，Frankfurt，Germany)， 此处仅举几例而已。用于皮下注射本发明之医药组合物的一次性使用的笔型给药装 置的实例包括但不限于 S0L0STAR? 笔（sanofi-aventis)、FLEXPEN?(Novo Nordisk)、 KWIKPEN?(Eli Lilly)、SURECLICK? 自动注射器（Amgen, Thousand Oaks, CA)、 PENLETTM(Haselmeier，Stuttgart，Germany)、EPIPEN(Dey, L. P.)，以及 HUMIRA? 笔（Abbott Labs, Abbott Park IL)，此处仅举几例。
[0081] 在某些情况下，该医药组合物可用一种控释系统给药。在一个实施方案中，可使 用一种泵（参阅 Langer，出处同上；Sefton，1987，CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201)。 在另一个实施方案中，可采用聚合材料；参阅Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise(eds. )，1974, CRC Pres. , Boca Raton, Florida。在又一个 实施方案中，可将一种控释系统置于该组合物靶标附近，从而只需要使用全身性剂量 的一小部分（参阅例如，Goodson, 1984, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138)。在 Langer，1990, Science249:1527-1533 的综述中讨 论了其他控释系统。
[0082] 注射用制剂可包括静脉注射、皮下、皮内和肌内注射、滴注输液等剂型。这些注射 用制剂可以公知的方法制备。例如，可以将上述抗体或其盐溶解、悬浮或乳化在常规用于注 射的无菌水性介质或油性介质中，以制备该注射用制剂。作为注射用的水性介质有例如生 理盐水、含葡萄糖和其他助剂的等渗溶液等，可结合使用适当的增溶剂，如醇（如乙醇）、多 元醇（如丙二醇、聚乙二醇），非离子型表面活性剂[例如聚山梨醇酯80、HC0-50 (氢化蓖 麻油的聚氧乙烯（50摩尔）加合物）]等。作为油性介质，可采用例如芝麻油、豆油等，可结 合使用增溶剂，如苯甲酸苯甲酯、苯甲醇等。如此制备的注射液最好是装入一种适当的安瓿 瓶中。
[0083] 有利的是，上述口服或胃肠外使用的医药组合物是制备成单位剂量的剂型，以容 纳一次剂量的活性成分。这种单位剂量的剂型包括例如片剂、丸剂、胶囊、注射液（安瓿）、 栓剂等。单位剂量的上述抗体含量一般为每剂约5至约500mg ;尤其是注射剂型，首选的是 上述抗体含量为约5至约100mg，其他剂型中抗体含量为约10至约250mg。 抗体的治疗用途
[0084] 除其他用途之外，本发明之抗体还可用于治疗、预防和/或减轻与ASIC1活性相 关或由ASIC1活性介导的、或可通过阻断或减弱患者神经元细胞中酸诱导的ASIC1介导的 离子流而治疗的任何疾病或失调。可用本发明之抗ASIC1抗体治疗的典型的疾病和失调， 包括疼痛症状，如伤害性疼痛和内脏疼痛（例如因炎症性肠病/肠易激综合征、间质性膀胱 炎、胰腺炎、子宫内膜异位症、慢性骨盆疼痛综合征等引起的疼痛）、以及与下列病症相关的 疼痛：炎症（例如炎症性肌肉疼痛）、多发性肌炎、手术后切口（例如手术后疼痛）、神经病 变（例如糖尿病神经病变）、坐骨神经痛、带状疱疹后神经痛、肌筋膜痛综合征（例如慢性 肌筋膜痛）、关节炎、镰状细胞、肠神经缺血、跛行疼痛、骨折、烧伤、骨质疏松性骨折、痛风、 偏头痛、纤维肌痛、复杂区域疼痛综合征、急性疱疹性疼痛等。本发明之抗体还可用于治疗、 预防和/或减轻例如神经退行性疾病（例如脱髓鞘疾病，如多发性硬化症、肌萎缩性侧索硬 化症等）、脑损伤（例如中风、创伤性脑损伤、脑性酸中毒）、神经系统疾病（例如抽搐、癫痫 症），以及精神疾病（例如抑郁症、焦虑症、创伤后应激症、恐慌症等）。
[0085] 本发明之抗ASIC1抗体还可用于治疗或预防与癌症相关的疼痛。"与癌症相关的 疼痛"包括例如骨癌痛，其包括已转移至骨骼的癌症所引起的疼痛（例如乳腺癌、前列腺癌、 肺癌、肉瘤、肾癌、多发性骨髓瘤等）。"与癌症相关的疼痛"还包括通常与下列癌症更相关 的疼痛：例如肾细胞癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈部癌、前列腺癌、恶性神经胶质瘤、骨肉瘤、结 直肠癌、胃癌、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、滑膜肉瘤、 甲状腺癌，或黑色素瘤。本发明之抗ASIC1抗体还可用于治疗或预防由癌症治疗或抗癌药 物治疗引起的或与其相关的疼痛，例如化疗引起的神经性疼痛，如用下列药物治疗引起或 与其相关的疼痛：紫杉醇（Taxol?)、多西他赛（Taxotere丸）；亚硝基脲、环磷酰胺、阿霉 素、表阿霉素、5-氟尿嘧啶、拓扑替康、伊立替康、卡莫司汀、雌莫司汀，以及以钼为基础的化 疗化合物，如顺钼、卡钼及异丙钼。 联合治疗
[0086] 本发明包括将本发明之一种抗ASIC1抗体与至少另一种治疗活性成分联合给药 的治疗给药方案。这类其他的治疗活性组分的非限制性实例包括其他ASIC抑制剂，例如第 二种抗ASIC1抗体、一种针对不同ASIC组分的抗体（例如抗ASIC2抗体、抗ASIC3抗体、抗 ASIC4抗体等）、一种肽ASIC抑制剂（例如，psalmotoxin-l [PcTxl，普萨莫毒素]、APETx2 等），及/或一种小分子ASIC抑制剂（例如，阿米洛利、A-317567等）。
[0087] 可与本发明之抗ASIC1抗体有效地联合给药的其它药剂包括细胞因子抑制剂（包 括小分子细胞因子抑制剂及与细胞因子如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、 IL-11、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18结合的抗体，或与其各自受体结合的抗体）、抗病毒素、 抗生素、止痛药、皮质类固醇和/或非类固醇抗炎药（NSAID)。
[0088] 上述其他的治疗活性成分可在本发明之抗ASIC1抗体给药之前、同时或之后给 药；（出于本公开书之目的，此类给药方案被认为是一种抗ASIC1抗体与另一种治疗活性成 分的"联合"给药）。 抗体的诊断用途
[0089] 本发明之抗ASIC1抗体还可用于检测和/或测量试样中的ASIC1或表达ASIC1的 细胞，例如用于诊断目的。例如，抗ASIC1抗体或其片段可用于诊断特征为ASIC1异常表达 (例如过度表达、表达不足、缺乏表达等）的病症或疾病。典型的ASIC1诊断检测法可包括 例如用一种本发明之抗ASIC1抗体与获自患者的试样接触，其中该抗ASIC1抗体以一种可 检测的标记或报告分子标记。或者，在诊断应用中也可以将一种未标记的抗ASIC1抗体与 本身具有可检测标记的第二种抗体结合使用。该可检测标记或报告分子可以是一种放射性 同位素，如 311、14(：、3午、355或1251 ;-种荧光或化学发光基团，如异硫氰酸荧光素，或罗丹明； 或一种酶如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶，或荧光素酶。可用于检测或测 量试样中ASIC1的特别的典型测定法包括酶联免疫吸附检测法（ELISA)、放射免疫检测法 (RIA)，以及荧光激活细胞分类术（FACS)。
[0090] 可依照本发明用于ASIC1诊断分析的试样，包括获自患者的在正常或病理条件下 含有可检测量ASIC1蛋白或其片段的任何组织或体液试样。一般而言，先从一位健康患者 (例如未患与ASIC1异常水平或活性相关的疾病或病症的患者）获得特定的试样并测量其 ASIC1表达水平，以建立ASIC1水平的基线或标准。然后，可将这一 ASIC1基线水平与从获 自疑为患有ASIC1相关性疾病或病症的人员的试样测得的ASIC1表达水平进行比较。 实施例
[0091] 举出以下实例是为了向本发明所属领域专业人士就如何利用本发明之方法和组 合物提供一个完整的公开和说明，并非是为了限制本发明人视为其发明的范围。业已作出 努力以确保所用数据（例如剂量、温度等）的准确性，但也应考虑到某些实验误差和偏差。 除非另有说明，份数是指重量份数，分子量是指平均分子量，温度是指摄氏度，压强是指大 气压或接近大气压。 实施例1 :抗人ASIC1的人源抗体的产生
[0092] 为了产生抗人ASIC1抗体，采用了一种DNA免疫过程，其中将一种编码全长人 ASIC1的DNA质粒与另一种编码佐剂的质粒一起皮内注入/f:L(X：丨MMUIVE?小鼠 (Regeneron Pharmaceuticals, Inc.，Tarrytown, NY)。然后，将注射部位电穿孔以诱导上 述质粒的宿主细胞转染。用于免疫的VELOGIMMUNE?小鼠包含编码人类免疫球蛋 白重链和K轻链可变区的DNA并缺乏内源性小鼠 asicla基因。使用经工程改造可表达 人ASIC1的细胞，通过细胞结合检测法监控抗体免疫反应。当达到所需的免疫反应时，收 集脾细胞并使其与小鼠骨髓瘤细胞融合，以保存其活力并形成杂交瘤细胞系。筛选该杂交 瘤细胞系，以鉴别能产生ASIC1特异性抗体的细胞系。采用这一技术，获得了数种抗ASIC1 嵌合抗体（即含有人类可变区和小鼠恒定区的抗体）；将以此方式产生的典型抗体命名如 下：H1M6712N、H1M6716N、H1M6718N、H1M7101N、H2M7103N、H3M6713N、H3M6715N、H3M6720N、 H3M6721N、H3M6721N2、H3M6726N、H3M6760N、H3M7102N 和 H3M7118N。
[0093] 如美国专利2007/0280945A1中所述，抗ASIC1抗体还可从抗原阳性B细胞直接 分离而不与骨髓瘤细胞融合。采用这一方法，获得了数种完全人源的抗ASIC1抗体（即 含有人类可变区和人类恒定区的抗体）；将以此方式产生的典型抗体命名如下：H4H6362P、 H4H6363P、H4H6364P、H4H6366P、H4H6372P、H4H6374P、H4H6375P、H4H6379P、H4H6380P、 H4H6381P 和 H4H6383P。
[0094] 按照此实例的方法产生的典型抗ASIC1抗体的某些生物学特性将在下述诸实例 中详细描述。 实施例2 :重链和轻链可变区氨基酸序列
[0095] 表1列出了选定的抗ASIC1抗体的重链和轻链可变区的氨基酸序列对，及其相应 的抗体识别号。 表1

【权利要求】
1. 与细胞表面表达的ASIC1(序列号401)特异性结合的分离的抗体或其抗原结合片 段。
2. 如权利要求第1项所述之抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段与 细胞表面表达的ASIC1特异性结合，以FACS (荧光激活细胞分类术）测量的EC5(I值为InM 或以下。
3. 如权利要求第1项或第2项所述之抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结 合片段抑制表达人ASIC1的细胞内酸诱导的ASIC1介导的离子流。
4. 如权利要求第3项所述之抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段于 约5. 0至约6. 0的pH值在表达ASIC1的细胞内抑制酸诱导的细胞内钙通量，以FLIPR检测 法测量的IC5Q值为6nM或以下。
5. 如权利要求第3项所述之抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段于 约5. 0至约6. 0的pH值抑制酸诱导的离子流，以膜片钳分析法测量的IC5(I值为10nM或以 下。
6. 分离的抗体或其抗原结合片段，其在与细胞表面表达的ASIC1结合过程中与包 含HCVR/LCVR序列对的参照抗体竞争，该序列对选自如下序列对组：2/10 ;34/42 ;50/58 ; 66/74 ;114/122 ;130/138 ;146/154 ;162/170 ;194/202 ;210/218 ;242/250 ;258/266 ;以及 274/282。
7. 如权利要求第6项所述之抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段抑 制表达人ASIC1的细胞内酸诱导的ASIC1介导的离子流。
8. 与细胞表面表达的ASIC1(序列号401)特异性结合的分离的抗体或其抗原结合片 段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：(a)重链可变区（HCVR)的互补决定区（CDR)，该 重链可变区含有选自下列序列组的氨基酸序列：2、34、50、66、114、130、146、162、194、210、 242、258和274;以及（b)轻链可变区（LCVR)的CDR，该轻链可变区含有选自下列序列组的 氨基酸序列：10、42、58、74、122、138、154、170、202、218、250、266 以及 282。
9. 如权利要求第8项所述之分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原 结合片段包含选自下列序列对组的HCVR/LCVR氨基酸序列对的重链和轻链CDR :2/10 ; 34/42 ；50/58 ；66/74 ；114/122 ；130/138 ；146/154 ；162/170 ；194/202 ；210/218 ；242/250 ； 258/266 ;以及 274/282。
10. 如权利要求第8项所述之分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结 合片段分别包含 HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 结构域，其选自下列序列组： 4-6-8-12-14-16 ;36-38-40-44-46-48 ;52-54-56-60-62-64 ; 68-70-72-76-78-80 ;116-118-120-124-126-128 ;132-134-136-140-142-144 ; 148-150-152-156-158-160 ； 164-166-168-172-174-176 ； 196-198-200-204-206-208 ;212-214-216-220-222-224 ; 244-246-248-252-254-256 ;260-262-264-268-270-272 ;以及 276-278-280-284-286-288。
11. 一种与细胞表面表达的ASIC1(序列号401)特异性结合的分离的抗体或其抗原结 合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：(a)重链可变区（HCVR)，其含有选自下列序列 组的氨基酸序列：2、34、50、66、114、130、146、162、194、210、242、258 和 274 ;以及（b)轻链 可变区（LCVR)，其含有选自下列序列的氨基酸序列：10、42、58、74、122、138、154、170、202、 218、250、266 以及 282。
12. 如权利要求第11项所述之分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗 原结合片段包含选自下列序列对组的HCVR/LCVR氨基酸序列对：2/10 ; 34/42 ; 50/58 ; 66/74 ;114/122 ;130/138 ;146/154 ;162/170 ;194/202 ;210/218 ;242/250 ;258/266 ;以及 274/282。
13. 含有如权利要求第1至12项中任何一项所述之抗体或抗原结合片段以及药学上可 接受载体或稀释剂的医药组合物。
14. 含有如权利要求第1至12项中任何一项所述之抗体或抗原结合片段的医药组合 物，用于治疗或减轻人类患者的疼痛。
15. 如权利要求第14项所述之医药组合物，其中所述的疼痛是伤害性疼痛或内脏疼 痛。
16. 如权利要求第15项所述之药物组合物，其中所述之疼痛与选自一组包括炎症、手 术后切口、神经病变、骨折、烧伤、骨质疏松性骨折、骨癌、痛风、偏头痛和纤维肌痛等病症相 关。
17. 如权利要求第14项所述之医药组合物，其中所述的疼痛是与癌症相关的疼痛或化 疗引起的疼痛。
18. -种治疗或减轻疼痛的方法，该方法包括给需要治疗的患者施用一种与细胞表面 表达的ASIC1 (序列号401)特异性结合的抗体或其抗原结合片段。
19. 如权利要求第18项所述之方法，其中该抗体或其抗原结合片段包含选自下列序列 对组的HCVR/LCVR氨基酸序列对的重链和轻链CDR :2/10 ;34/42 ;50/58 ;66/74 ;114/122 ; 130/138 ;146/154 ;162/170 ;194/202 ;210/218 ;242/250 ;258/266 ;以及 274/282。
20. 如权利要求第19项所述之方法，其中该抗体或其抗原结合片段分别包含HC DR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 结构域，其选自下列序列组：4-6-8-12-14-16 ; 36-38-40-44-46-48 ; 52-54-56-60-62-64 ; 68-70-72-76-78-80 ;116-118-120-124-126-128 ;132-134-136-140-142-144 ; 148-150-152-156-158-160 ； 164-166-168-172-174-176 ； 196-198-200-204-206-208 ;212-214-216-220-222-224 ; 244-246-248-252-254-256 ;260-262-264-268-270-272 ;以及 276-278-280-284-286-288。
【文档编号】A61K39/395GK104093738SQ201380007553
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2013年1月30日 优先权日:2012年1月31日
【发明者】L·麦克唐纳, M·高, M·R·莫拉, N·M·阿莱桑德里-哈贝尔, M·L·拉克鲁瓦-福拉丽什 申请人:瑞泽恩制药公司