双功能肽的制作方法

双功能肽的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种双功能肽，其能够激活胶原蛋白合成并且抑制基质金属蛋白酶的生成，所述肽具有包括三个肽部分A、B和C的序列：第一肽部分A，对应于重复至少三次的六肽，所述部分A能够结合到受体弹性蛋白结合蛋白，以刺激胶原蛋白合成；第二肽部分B，对应于能够用作尿激酶蛋白酶的竞争性抑制剂且被所述蛋白酶裂解的四肽；以及第三肽部分C，对应于占据所述基质金属蛋白酶的至少一个活性位以抑制所述蛋白酶的三肽。本发明进一步涉及包括所述双功能肽的化妆品和/或药物组合物。
【专利说明】双功能肽

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种肽，其将应用于化妆品和药物领域。
[0002] 本发明将主要应用于特别是受到皮肤老化影响的真皮组织的修复或再生领域。

【背景技术】
[0003] 皮肤老化或多或少是由于合成控制机制的大规模失衡以及真皮的细胞外基质的 组分的降解，而真皮则构成皮肤的最内层。由此，在皮肤老化期间，在真皮的细胞外基质中， 一方面观察到某些大分子（即，胶原蛋白和弹性蛋白）的合成减少，且另一方面观察到某些 酶（例如，基质金属蛋白酶或MMPs)的表达的增加。后者即呈现溶胶原和弹性蛋白离解活 性，并且因此导致真皮基质的大分子的降解。结果，皮肤失去色泽，表皮扩张，导致皱纹的形 成。这种现象也会被外部因素放大，例如暴露于紫外线、污染物、压力，或者烟草。
[0004] 传统上，现有技术中已知的方案针对的是减慢皱纹的形成。这些策略包括：
[0005] -去死皮（peeling)或磨皮（dermabrasion)，这是一种皮肤的侵略性疗法，以减少 其厚度；
[0006] -玻尿酸或肉毒杆菌毒素的抗皱注射，分别具有皱纹填充（wrinkle-filling)效应 和使目标肌肉麻痹作用以暂时减少皱纹；然而，这些技术昂贵且只呈现短期效果；
[0007] -表面治疗的应用，例如保湿剂、抗皱或平滑霜，可减慢皱纹的形成，但不能修正已 经形成的皱纹；
[0008] -基于自体干细胞的疗法，其仍然难以控制。
[0009] 此后几年，实验室实施了其他策略以对抗皮肤老化效应。
[0010] 具体地，欧洲专利申请EP1275372使用了例如N-酰基氨基酰胺衍生物的化合物。 更具体地，该文献公开了一种组合物，该组合物除包括上述的N-酰基氨基酰胺以外还包括 金属蛋白酶抑制蛋白，而所述金属蛋白酶则参与胶原蛋白的降解。
[0011] 然而，这样的方案不是最佳的，具体因为该方案一方面需要几种化合物的组合，且 另一方面该方案不是积极作用在胶原蛋白的合成上。
[0012] 某些肽衍生物的使用也已被开发，以预防皮肤老化症状。
[0013] 因此，例如，已知来自FR285489的包括肽衍生物的化妆品组合物， 该肽衍生物来自弹性蛋白。更具体地，该肽衍生物可具有如下序列：Rl-(AA) n-Val-Gly-Val-Ala-Pr〇-Gly-0R2,其中，
[0014] -R1对应于Η或包括2到22个碳的烷基链，
[0015] _(ΑΑ)η对应于肽链，其中，ΑΑ由任意的氨基酸或氨基酸衍生物构成，并且其中，η 在0和3之间变化，
[0016] -R2对应于Η或包括1到24个碳的烷基链。
[0017] 包括这种肽衍生物的化妆品组合物能够实现紧致以及重建的效果。
[0018] 然而，这样的肽衍生物或包括该衍生物的组合物不能抑制ΜΜΡ蛋白酶的活性和/ 或表达，ΜΜΡ蛋白酶参与胶原蛋白的降解，而胶原蛋白构成人体组织的细胞外基质的主要蛋 白，也即真皮的主要蛋白。胶原蛋白能给予组织对张力的抵抗力。由此，上述文献中描述的 肽不能防止对于保持皮肤光泽所必要的胶原蛋白的降解。
[0019] 还已知来自W0 2006053688的组合物，其包括几种肽并且在抗皱治疗中使用。具 体地，该组合中的这些肽在若干层面上参与了胶原蛋白和/或纤连蛋白的合成过程，即通 过刺激这种合成。
[0020] DE 10 2004 055 541转而公开了包括肽的组合的组合物，以刺激生长因子 TGF-β的释放，生长因子TGF-β能诱发胶原蛋白的合成。
[0021] 然而，这些专利文献中描述的肽具有如上所例举的相同的缺陷，即，事实上这些专 利文献中所建议的序列不能降低导致细胞外基质的蛋白降解的酶的表达，并且特别是不能 降低导致胶原蛋白降解的酶的表达。


【发明内容】

[0022] 本发明通过提供一种双功能肽而能够应对现有技术的各种缺陷，该双功能肽同时 具有刺激胶原蛋白的合成的性质以及抑制参与胶原蛋白的降解级联的蛋白酶的性质。
[0023] 为此，本发明涉及一种能够激活胶原蛋白合成并且抑制基质金属蛋白酶生成的双 功能肽，所述肽具有包括三个肽部分A、B和C的序列：
[0024] -第一肽部分A，对应于一重复至少三次的六肽，所述肽部分A能够结合到弹性蛋 白结合受体蛋白以刺激胶原蛋白合成；
[0025] -第二肽部分B，对应于能够用作尿激酶蛋白酶的竞争性抑制剂且能够被所述蛋 白酶裂解的四肽；以及
[0026] -第三肽部分C，对应于占据基质金属蛋白酶的至少一个活性位点的三肽，从而抑 制所述蛋白酶。
[0027] 有利地，刺激胶原蛋白合成的第一肽部分A具有Xl-Gly-X2-X3-Pr〇-Gly序列，该 序列重复至少三次，其中：
[0028] -XI对应于任意的氨基酸，
[0029] -X2对应于选自Val、Thr、Gin、Ala和Leu的氨基酸，
[0030] -X3对应于选自Ala、Leu和lie的氨基酸。
[0031] 更有利地，所述肽的第一肽部分A具有Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly序列。
[0032] 优选地，可被蛋白酶裂解的第二肽部分B具有Arg-Yl-Arg-Y2序列，其中，Y1和Y2 中的每一个对应于选自Ser、Tyr、Gly、Ala、Arg、Val和Leu的氨基酸。
[0033] 更优选地，所述肽的第二肽部分B具有Arg-Val-Arg-Leu序列。
[0034] 根据一个令人关注的实施方案，抑制基质金属蛋白酶的第三部分C具有 Zl-ile-Z2序列，其中：
[0035] -Z1对应于选自Gly、lie和Leu的氨基酸，且
[0036] -Z2对应于选自Leu、Phe、Ala、lie和Val的氨基酸。
[0037] 甚至更有利地，所述肽的第三肽部分C具有Gly-Ile-Leu序列。
[0038] 根据优选的实施方案，本发明的肽具有对应于序列SEQ ID No. 1的如下序列S1 :
[0039] SI ：N- (Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly)n-Arg-Val-Arg-Leu-Gly-Ile-Leu-〇H,
[0040] 其中，N和0H分别对应于所述肽的N-末端和C-末端，并且
[0041] 其中，η = 3。
[0042] 然而，本发明双功能肽的序列还可对应于序列SEQ ID No. 2至SEQ ID No. 26中的 一个。
[0043] 优选地，本发明的双功能肽通过化学合成获得。此外，所述肽可有利地以冻干形式 保存。
[0044] 有利地，本发明的双功能肽可用于慢性疤痕疾病的治疗，即压疮或溃疡的治疗。
[0045] 本发明的双功能肽还可用于真皮组织的修复和/或再生，即用于皮肤老化的治 疗。
[0046] 本发明还涉及包括本发明双功能肽的化妆品和/或药物组合物。
[0047] 优选地，所述化妆品组合物中的双功能肽的浓度在10 μ g/mL到lmg/mL之间，并且 优选地基本上等于100 μ g/mL。
[0048] 本发明的双功能肽具有许多优势。一方面，它可刺激胶原蛋白，即，I型和III型 胶原蛋白的合成。III型胶原蛋白生产的增长是尤其令人关注的；事实上，这种类型的胶原 蛋白被称为"胎儿（fetal)"型胶原蛋白，因为它主要在胎儿阶段和童年时期合成。这种类 型的胶原蛋白允许特别优化的组织治愈，被称为"完美"治愈。另一方面，所述肽可降低由 蛋白酶造成的胶原溶解。此外，同时获得对胶原蛋白合成的刺激和对金属蛋白酶的抑制分 别取决于双功能肽的肽部分A和C，双功能肽还包括肽部分B，其连接其他两个部分且能够 被尿激酶裂解。由此，本发明肽可具有约25个氨基酸的短序列，这容易进行化学合成。

【专利附图】

【附图说明】
[0049] 本发明进一步的特点和优势将从以下参考附图的本发明的非限制性实施方案的 详细描述中变得清楚，其中：
[0050] -图1是本发明肽的作用机制的示意图。
[0051] -图2是纤溶酶原/纤溶酶系统的酶级联的示意图。
[0052] -图3A和3B是柱状图，分别示出I型和III型胶原蛋白的合成，所述合成通过由 浓度为1〇〇 μ g/ml的本发明肽或相同肽的片段处理过的成纤维细胞进行。
[0053] -图4以柱状图的形式示出C0L1A1和C0L3A1基因的基因表达，C0L1A1和C0L3A1 基因分别编码I型和III型胶原蛋白，所述I型和III型胶原蛋白培养自由本发明肽或相 同肽的片段处理过的真皮成纤维细胞。
[0054] -图5示出，取决于患者的年龄（35、42和53岁），本发明双功能肽分别对I型和 III型胶原蛋白的蛋白表达的效果，I型和III型胶原蛋白来自这些患者的真皮成纤维细 胞。
[0055] -图6A和6B示出相对于合成底物（synthetic substrate)，双功能肽对尿激酶活 性的效果。
[0056] -图7A和7B示出相对于合成底物，双功能肽对MMP-1活性的效果。
[0057] -图8A和8B分别示出未经尿激酶处理过和经由尿激酶处理过的本发明肽的洗脱 图。

【具体实施方式】
[0058] 作为初步准备和信息性说明，本说明书使用国际上的三字母码来命名氨基酸。由 此，Ala对应于丙氨酸（A)、Cys对应于半胱氨酸（C)、Asp对应于天冬氨酸（D)、Glu对应于 谷氨酸（E)、Phe对应于苯丙氨酸（F)、Gly对应于甘氨酸（G)、His对应于组氨酸（H)、Ile对 应于异亮氨酸（I)、Lys对应于赖氨酸（K)、Leu对应于亮氨酸（L)、Met对应于蛋氨酸（M)、 Asn对应于天冬酰胺（N)、Pro对应于脯氨酸（P)、Gln对应于谷氨酰胺（Q)、Arg对应于精氨 酸（R)、Ser对应于丝氨酸⑶、Thr对应于苏氨酸⑴、Val对应于缬氨酸（V)、Trp对应于 色氨酸（W)，以及Tyr对应于酪氨酸（Y)。
[0059] 皮肤老化和由此导致的皱纹形成在细胞和分子水平上以对进入细胞外基质的成 分中的大分子合成相关的基因表达的降低为特征，例如胶原蛋白或弹性蛋白。另外，这些 基质蛋白的生成的降低通常伴随着与基质蛋白降解相关的酶的过度表达；由此，真皮层面 上的光泽降低、表皮的扩张以及最后皱纹的形成，部分是因为这些酶（基质金属蛋白酶或 MMPs)〇
[0060] 胶原蛋白是构成人体组织的细胞外基质的主要蛋白。具体地，胶原蛋白在真皮层 面上占约90 %，真皮构成皮肤的固体支撑并且起着营养物和温度控制的作用，并起抵御病 原微生物的作用。真皮主要由所谓的成纤维细胞形成，成纤维细胞参与胶原蛋白的合成以 及细胞外基质的组织（organization)。
[0061] 由此，细胞外基质的框架由胶原蛋白形成，但也由弹性蛋白，结构糖蛋白和蛋白聚 糖，形成。更具体地，真皮基质包括I型和III型胶原蛋白原纤维和V型胶原蛋白核心。
[0062] V型胶原蛋白有可能被所谓的MMP蛋白降解，MMP蛋白家族包括不少于26个成员。 更具体地，这些蛋白对应于内肽酶，即，其破坏蛋白内的肽键。
[0063] 科学家们（Voorhes等、Hornebeck等，2009)进行的研究已经表明皮肤细胞、成纤 维细胞的衰老以这些内肽酶（即MMP-1)的表达增加为特征。MMP-1属于间质胶原酶组，并且 是I型和III型胶原蛋白裂解的原因。无论是随时间顺序的还是光诱发的皮肤老化，MMP-1 被认为是参与皮肤老化的主要胶原酶。
[0064] 由此，与降解酶（即，MMP-1)的增加相关联的真皮基质蛋白，也即胶原蛋白的减少 是皮肤老化的重要因素，其导致皮肤光泽的减少以及可见皱纹的形成。
[0065] 由此，本发明人创造性地研发出一种肽，其具有多种功能并且既允许在胶原蛋白 分子的合成过程的层面上作用，也允许在这些分子的降解级联的不同层面上作用。
[0066] 并且，特别有利地，本发明的双功能肽具有促进恢复细胞外（即真皮）基质的合成 代谢（合成）和分解代谢（分解）过程之间的平衡的特性。
[0067] 特别优选地，本发明肽是双功能的且包括可被划分为以下三个部分的序列：
[0068]-第一肽部分，被称为部分A，有利地具有增加胶原蛋白合成的功能；
[0069]-第二肽部分，被称为部分B，优选地具有被蛋白酶，尿激酶，所识别的序列，从而 所述肽部分B能够被该蛋白酶裂解；
[0070] -第三肽部分，被称为部分C，部分C能够抑制MMPs。
[0071] 由此，本发明的肽一方面允许刺激胶原蛋白合成，并且另一方面允许通过抑制尿 激酶和MMP蛋白酶（即，MMP-1)来降低所述胶原蛋白的降解。
[0072] 更具体地，允许增加胶原蛋白合成的肽部分A由六肽组成，即一系列的6氨基酸残 基。有利地，该六肽在本发明的双功能肽内重复至少3次。
[0073] 更优选地，双功能肽的肽部分A具有如下序列：Xl-Gly-X2-X3-Pr〇-Gly，其中XI、 X2和X3对应于氨基酸。如上所述，该六肽序列)(l-Gly-X2-X3-Pr〇-Gly在本发明的肽内重 复至少三次。事实上，一些研究表明重复三次所述序列在序列活性方面提供不同的、甚至更 引人关注的结果（Alix2001)。
[0074] 根据一令人关注的实施方案，肽部分A的XI残基对应任意的氨基酸。而残基X2 有利地对应于选自Val、Thr、Gin、Ala和Leu的氨基酸。最后，X3残基优选地对应于选自 Ala、Leu和lie的氨基酸。
[0075] 还有更优选地，XI和X2对应于Val，且X3对应于Ala。由此，对应于双功能肽的 部分A的六肽优选地具有序列Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly。
[0076] 如在所附的图3A和3B中以及以下的实施例1中说明和解释的，重复至少三次且 与肽部分B和C相关联的上述序列对胶原蛋白（即，III型胶原蛋白）的蛋白表达有显著 刺激。
[0077] 如图4所说明的，本发明的肽还允许分别编码I型胶原蛋白和III型胶原蛋白的 C0L1A1和C0L3A1基因的基因表达的增加。双功能肽在III型胶原蛋白合成上的作用尤其 令人关注；事实上，已知III型胶原蛋白在胎儿水平为占多数的胶原蛋白，而其生成在童年 期逐渐减少，直到在成年时其生成达到一个非常低的水平。举例来说，成人的III型胶原蛋 白为I型胶原蛋白的六分之一（Melissopoulosl998 ;Herbage，1997)。在治疗期间，III型 胶原蛋白主要由肌成纤维细胞合成，以替换受损组织。在胎儿水平，III型胶原蛋白允许所 谓的"完美"治愈（Lorena 等，2002. Ferguson&0' Kane, 2004)。
[0078] 本发明双功能肽的Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly序列的构思来自由弹性纤维的 降解得到的弹性蛋白肽或弹性蛋白衍生肽（6lastokines)。由于脯氨酸和甘氨酸在所述 Xl-Gly-X2-X3-Pr〇-Gly序列内的存在，这样的序列采取VIII型β-肘形（Floquet等， 2004)。这种结构模式被弹性蛋白受体蛋白识别，弹性蛋白受体蛋白传统上以其英文名弹性 蛋白结合蛋白（Elastin Binding Protein)被引用，并且简称为EBP。EBP被固定化在细胞 表面上，与另外两个亚单位相关联：结合到细胞膜上的保护蛋白或组织蛋白酶A(PPCA)和 神经氨酸酶（Neu-Ι)。图1中示出双功能肽的肽部分A占据EBP受体蛋白导致分子单元的 激活，即导致I型和III型胶原蛋白的合成。
[0079] 分子单元的这种激活也可作用在成纤维细胞的趋化、增殖、粘附和存活上，并且还 可作用在血管生成上，血管生成在慢性创面（例如压疮或溃疡）的血管再生过程中是必要 的。
[0080] 关于肽部分B，其优选地由四肽组成，即包括4氨基酸的序列。
[0081] 更具体地，该四肽代表一作为底物或竞争性抑制剂与丝氨酸蛋白酶（尿激酶）相 互作用的部门。由此，这允许在细胞附近释放其他两个肽部分A和C。
[0082] 尿激酶优选地裂解具有两个精氨酸的序列。因此，有利地，肽部分B具有序列 Arg-Yl-Arg-Y2,其中Y1和Y2对应于氨基酸。
[0083] 根据一特定的示例性实施方案，Y1和Y2中的每一个对应于选自Ser、Tyr、Gly、 Ala、Arg、Leu和Val的氨基酸。这些氨基酸与可断裂的Arg位点相联，优选地被尿激酶蛋 白酶裂解。
[0084] 甚至更优选地，本发明双功能肽的肽部分B包括Arg-Val-Leu-Arg序列。
[0085] 尿激酶蛋白酶是纤溶酶原-纤溶酶系统的激活剂之一。纤溶酶原是尿激酶的生理 底物，尿激酶能以纤溶酶的形式将纤溶酶原激活。这种激活引发蛋白水解级联，最终激活 MMP-1和MMP-3。由尿激酶蛋白酶引发的纤溶酶原/纤溶酶系统的酶级联在所附的图2中 显不。
[0086] 由此，尿激酶对纤溶酶原的活性是胶原蛋白，也即I型和III型胶原蛋白，降解的 间接原因。因此，肽部分B在本发明双功能肽中的存在将用作尿激酶的底物或竞争性抑制 齐IJ。结果，尿激酶将断裂存在于肽部分B上Arg位点，因此将只有更少量的尿激酶被提供从 而造成对纤溶酶中的纤溶酶原的抑制；胶原蛋白大分子的降解也将由此减少。图6A和图6B 说明了本发明的肽对尿激酶活性的作用。
[0087] 现在来看双功能肽的肽部分C，其有利地由三肽组成，三肽是包括3氨基酸的序 列。
[0088] 优选地，肽部分C具有Zl-Ile_Z2序列，其中Z1和Z2中的每一个对应于氨基酸残 基。
[0089] 根据一个令人关注的示例性实施方案，Z1是选自Gly、Leu和lie的氨基酸，而Z2 则选自 Leu、Phe、Ala、lie 和 Val。
[0090] 更优选地，Z1对应于Gly且Z2对应于Leu。由此，双功能肽的肽部分C有利地具 有Gly-Ile-Leu序列。该三肽Gly-Ile-Leu确实易于占据MMP-1的活性位点的一部分，且 用作该酶的竞争性抑制剂。
[0091] 事实上，这些氨基酸是尤其令人关注的，因为它们可能具有I型MMP的三个袋 (p〇Cket)-P' 1、P' 2和P' 3袋。结果，I型胶原酶的活性位点不再能与Zn2+离子结合成螯合 物，而Zn2+离子对于所述胶原酶的活性是必要的。由此，由于本发明的双功能肽，MMP-1对 胶原蛋白大分子的降解被降低。所附的图7A和7B具体说明这一点。
[0092] 因此，根据在胶原蛋白合成和MMPs(特别是MMP-1)的抑制方面获得令人关注的结 果的优选实施方案，本发明的双功能肽具有如下序列，其被命名为序列S1且对应于SEQ ID No. 1 ：
[0093] SI:N_(Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly)n-Arg-Val-Arg-Leu-Gly-Ile-Leu-〇H。
[0094] 优选地，Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly序列重复3次；换句话说，n优选等于3。然 而，该序列也可以重复大于3的次数。
[0095] 根据本发明的肽也可以具有，例如，被确定为SEQ ID No. 2到SEQ ID No. 26的序 列。
[0096] 然而，该序列的列表不是穷尽的，因此本发明并不受限于此。
[0097] SP，序列SEQ ID No. 1到26的氨基酸可以被化学上等价（SP，具有等价的物理和 化学性质）的氨基酸替换；等价氨基酸之间的替换在例如非极性脂肪族氨基酸Ala、Val、 lie、Leu之间进行，或在携带羟基的极性氨基酸Ser和Thr之间、氨基酸Asn和Gin之间、 携带两个酸官能团的氨基酸Asp和Glu之间等进行。该信息列在Merops (http://merops. sanger.ac.uk/)的蛋白酶数据库中。
[0098] 本发明的双功能肽优选地通过化学合成获得。
[0099] 有利地，实施莉甲氧羰基技术（Fmoc)/叔丁基（tBu)以在Fmoc-Leu-Wang PS树脂 上获得肽链的延伸。
[0100] 然而，本发明并不限于这样的实施方案，并且双功能肽的化学合成可通过任何其 他合适的用于该目的且被本领域技术人员知晓的技术获得。
[0101] 有利地，本发明肽是冻干的，以保证最佳的保存。
[0102] 本发明双功能肽在制造针对促进皮肤组织的修复和/或再生的化妆品组合物中 的使用是特别令人关注的。所述肽确实通过其在胶原蛋白的生成上的作用限制皱纹的形 成。
[0103] 另外，发明人已经证明本发明的双功能肽在胶原蛋白的生成上的效果看起来依赖 于患者的年龄。事实上，联系图5,实施例3中示出的结果显示I型胶原蛋白的表达以及尤 其是III型胶原蛋白的表达在较年长的患者中更多。由此，这样的结果确定了在用于对抗 皮肤老化的化妆品组合物中使用所述肽是有益的。
[0104] 然而，本发明不限于这样的实施方案。例如，本发明双功能肽还可用于药物组合物 的制备。
[0105] 事实上，基质蛋白（例如胶原蛋白）的合成和这些相同蛋白的降解之间的平衡被 打破会导致慢性创面（也被称为慢性疤痕疾病）的发展，例如压疮、溃疡或严重烧伤的人。 具体地，这些疾病表现为基质蛋白酶MMPs的过度表达，并且一般与例如糖尿病或血管疾病 之类的疾病相关联。
[0106] 这些慢性疤痕疾病在发达国家正在稳定增长，主要是由于人口老龄化。因此，这些 疾病的治疗和管理表现出不可忽视的成本。
[0107] 在细胞水平上已显示出大量的蛋白酶且即MMP-1型金属蛋白酶在压疮型慢性创 面附近被释放。研究也提供了 I型胶原酶或MMP-1的活性在慢性伤口的分泌物中显著增长 的证据。这种增长是所述创面附近I型和III型胶原蛋白大分子降解的原因（Barone等， 1998. Shi 等，2006)。
[0108] 现在，具体地来看溃疡，也已证明大量的蛋白酶在这些伤口附近出现。具体地，研 究鉴定出的MMP-1的比率是平常的65倍高，这些MMP接着造成细胞外基质的蛋白的降解 过多且被延长，以及也造成生长因子蛋白的降解过多和延长，导致治愈被延迟（Fischer等 2009)。
[0109] 最后，已经证明，如图2中可见，作为纤溶酶原/纤溶酶系统以及作为某些MMPs 被激活的间接原因的尿激酶激活剂，其浓度在腿部溃疡以及压疮层面中极大地增加 (Werckroth 等 2004)。
[0110] 由此，能够使得MMP蛋白酶活性降低并且使得基质蛋白的合成增加的本发明的肽 将促进这些慢性伤口的治疗并且将替代当前繁重、昂贵且低效的药物治疗。
[0111] 根据特定实施方案，本发明的双功能肽被加入粘附于受到慢性创面影响的人体部 位的贴片中。
[0112] 然而，本发明绝不限于这样的实施方案，并且可容易地预期本发明的双功能肽可 加入可涂敷到要被治疗的创面上的例如霜、膏、凝胶等制剂中。
[0113] 根据一个实施方案，双功能肽优选地以基本上在约10 μ g/ml到lmg/ml之间的浓 度被使用。在用浓度达到lmg/ml的肽处理过的真皮成纤维细胞上确实没有观察到本发明 的肽的毒性。另外，用以通过SAM(微阵列显著性分析）统计法寻找毒性基因而进行的研究 已经显示只有高浓度的双功能肽（大于lmg/ml)可引发细胞死亡、结膜组织（conjunctive tissue)的破坏和肿瘤入侵。
[0114] 还有更优选地，在药物和/或化妆品组合物中使用所述肽的推荐浓度是基本上等 于 100 μ g/ml。
[0115] 本发明进一步的特点和优势通过阅读以下实施例是清楚的，给出的实施例是说明 性而非限制性的。
[0116] 实施例1 :双功能肽对胶原蛋白合成的效果-蛋白分析
[0117] 从为年龄在35到75之间的健康患者实施外科手术期间获得的腹部皮肤活组织标 本中分离出真皮成纤维细胞。
[0118] 在移除表皮之后，成纤维细胞通过酶消化法回收，接着在37°C下在补充有10%胎 牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM(Dulbecco的改良Eagle培养基）培养基中培养。
[0119] 接着，用浓度为1〇〇μ g/ml、具有S1序列或该序列的各片段的肽处理成纤维细胞。 所测试的各种片段如下：
[0120] -肽l(p印tl):具有S1序列的肽
[0121] -肤 2 (pept2):序列 N-(Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly) 3Arg-Val-Arg-Leu-〇H
[0122] -肤 3 (pept3) :N_ (Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly) 3-〇H
[0123] -肤 4 (pept4) :N-Arg_Val-Arg-Leu-Gly-Ile-Leu-〇H
[0124] -肤 5 (pept5) :N-Gly-Ile_Leu-〇H
[0125] 接着，I型胶原蛋白和III型胶原蛋白的蛋白表达通过蛋白印迹法示出且通过过 氧系数（ImageJ)量化。结果分别示于所附的图3A和3B。对照（Ctrl)对应于未经肽处理 的I型和III型胶原蛋白在细胞水平的表达。实验以一式三份进行。
[0126] 图3A中可见的结果示出包括对应于本发明肽部分A的Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly 序列的本发明的肽（peptl)以及片段（pept2和pept3)刺激I型胶原蛋白的蛋白表达增长 30%。不包括本发明肽部分A的肽片段（pept4和p印t5)不刺激I型胶原蛋白的合成；相 比之下，当成纤维细胞与pept4和pept5接触时合成的胶原蛋白的比例看起来变小了。因 此，Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly序列确实是刺激I型胶原蛋白合成的原因。
[0127] 图3B示出本发明具有S1序列的肽允许增加 III型胶原蛋白的合成；事实上，如在 柱状图中可看到的，当成纤维细胞经由具有S1序列的肽处理时，产生大于两倍的III型胶 原蛋白。
[0128] 还令人关注的是，注意到与经由仅具有（Val-Gly-Val-Ala-Pr〇-Gly)3序列 (pept3)的肽处理的成纤维细胞相比，具有S1序列（peptl)的肽对成纤维细胞的处理使 III型胶原蛋白的合成增长36%。因此，本发明肽的其他部分也在III型胶原蛋白的合成 增长中起作用。
[0129] 由此，本发明肽是特别令人关注的；除允许I型胶原蛋白的合成增长以外，本发明 肽确实也促进III型胶原蛋白的生成。
[0130] 实施例2 :双功能肽对胶原蛋白合成的效果-基因表达分析
[0131] 在浓度为100 μ g/ml的不同肽（peptl至pept5)存在的情况下，测试了成纤维细 胞培养中I型和III型胶原蛋白的基因表达。
[0132] 在经由不同肽处理24小时之后，使用RNeasy'?试剂盒（QIAGEN)将RNAs从培 养物中提取出来，接着使用来自SABiosciences?的RT2第一链试剂盒（RT2First Strand Kit)将RNAs再转录为互补DNAs (cDNAs)。
[0133] 接着，使用来自Stratagene公司的Mx3000p热循环仪在96孔板中进行实时PCR 分析。每个样品重复分析三次。CDNAs在包含RT2 SYBR? Green/ROX? qPCR Master Mix 试剂（SABiosciences?)以及特定用于要扩增的基因的正义和反义引物的反应混合物中用 作基质。在每一循环结束时读出突光，且通过MxPro软件（Stratagene)分析读数。通过借 助"国内（domestic)"基因（在这种情况下，编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH)的基因 的RNA)扩增而来的DNA的量使用于扩增被研究基因的产品的量标准化，来获得编码I型和 III型胶原蛋白的有益C0L1A1和C0L3A1基因的相对表达。从对应于100%有效的扩增的 循环数起，使用2^^法（Livak&Schmittgen，2001)计算所研究的cDNAs的相对数量。
[0134] 图4中的可见结果确认了在蛋白表达研究中获得的结果。包括 (Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly) 3序列的本发明双功能肽以及肽片段p印t2和？印七3刺激I型 和III型胶原蛋白的基因表达。相对于用仅包含（％1-61 7，&141&-?1*〇-617) 3序列的肽3 存在的情况下处理的细胞，当成纤维细胞由具有S1序列（p印tl)的肽处理时也观察到III 型胶原蛋白的合成增长。
[0135] 包含Gly-Ile-Leu序列的衍生物肽pept4和pept5对于编码I型和III型胶原蛋 白的基因的表达没有效果。
[0136] 对照（Ctrl)对应于在成纤维细胞未经处理时，编码两种类型胶原蛋白的基因的 表达。
[0137] 实施例3 :双功能肽对胶原蛋白合成的效果-依据患者年龄的蛋白和基因表达测 试
[0138] 培养来自较年轻或较年长的患者（35、42和53岁）的真皮成纤维细胞，并且针对I 型和III型胶原蛋白的蛋白和基因表达测试了本发明具有S1序列的肽。图5可见所获得 的针对两种类型胶原蛋白的蛋白表达的结果。可见，在成纤维细胞来自较年长患者时，本发 明肽在胶原蛋白的合成上的作用是更大的。
[0139] 实施例4 :双功能肽对尿激酶的竞争性抑制
[0140] 评价了本发明双功能肽对尿激酶（MMP-1蛋白酶的激活级联的上游酶）的作用。
[0141] 在不同浓度的本发明肽存在以及不存的情况下测试了尿激酶对其合成底物 (D-Glu-Gly-Arg+NHPhN02 (S2444))的活性。
[0142] 结果示于所附的图6A和6B中。
[0143] 尿激酶（9. 25*10_6mM)对底物S2444(0. 3nM)的水解动力学测定在具有S1序列且 浓度在10'ΚΓ4和10,的双功能肽存在下进行1小时。对照对应于不存在肽的情况下的 动力学。通过在35分钟内每5分钟测量405nm的吸收率（D0)来评价酶活性。结果示于图 6A中。
[0144] 图6B图示在使用双功能肽15分钟时，尿激酶的活性和双功能肽浓度之间的剂 /效关系。图中虚线确定了 IC50,即降低尿激酶活性50%需要的肽浓度。IC50对应于 0. 83*10_5M的肽，即质量浓度为19 μ g/ml的肽。
[0145] 因此，可见，本发明的双功能肽表现为尿激酶的竞争性抑制剂。
[0146] 实施例5 :双功能肽对MMP-1蛋白酶活性的效果
[0147] 接着评价了本发明双功能肽直接作用在MMP-1活性上的效果，MMP-1是被尿激酶 激活的级联的下游酶。
[0148] 在所述肽存在的情况下被用于测试MMP-1活性的MMP-1底物是合成底物：DNP-Pr o-Cha-Gly-Cys(Me)-His-Ala-Lys(N-Me-Abz) - NH2。
[0149] 在不存在双功能肽或在双功能肽以浓度为10'1(T4和1(T5M存在的情况下，浓度 为80ng/l·! 1的MMP-1被引入0.4ng/l·! 1的合成底物中达1小时。结果在图7A和7B中显 /_J、1 〇
[0150] 更具体地，图7A代表在不同浓度的肽存在或不存在（对照）的情况下，MMP-1的 合成底物的水解动力学。通过在35分钟内每5分钟测量465nm吸收率（D0)来评价MMP-1 的酶活性。
[0151] 图7B图示在使用双功能肽15分钟时，MMP-1的活性和双功能肽的浓度之间的剂 量-效果关系。图中虚线确定IC50,其在这里对应于0. 4*1(Γ4Μ，即双功能肽的浓度等于 91 μ g/ml〇
[0152] 还在MMP-1的天然底物（即，人体皮肤的胶原纤维）存在的情况下测试了本发明 肽对MMP-1活性的效果。
[0153] 为此，MMP-1此前已被浓度为20mM的APMA(4-氨基苯汞乙酸）在37°C激活1小时 30分。接着，由此激活的MMP-1在本发明的肽存在（100 μ g/ml)或不存在的情况下沉积在 厚度为5 μ的皮肤切口（cuts of skin)上。3小时之后，皮肤切口被免疫标记，用以揭露I 型和III型胶原蛋白的存在，接着通过共聚焦显微镜观察。结果（未示出）显示在未经所 述肽处理的切口层面上未观察到胶原蛋白I和III，说明胶原蛋白I和III完全被MMP-1降 解。另一方面，在双功能肽存在的情况下，MMP-1的作用被抑制；确实检测到胶原蛋白I和 III。
[0154] 本发明的双功能肽通过原位抑制MMP-1活性来抑制胶原蛋白的降解。
[0155] 实施例6 :双功能肽被尿激酶裂解
[0156] 在细胞外周层面观察到约1(Γ4Μ的过量尿激酶。由此，所述肽可能被尿激酶裂解， 尿激酶具体在本发明肽的部分Β的精氨酸残基（Arg)处作用。
[0157] 通过高效液相色谱法（HPLC)在 Chromolith Jupiter C18 柱（50x4. 6mm)上进行了 研究，并且在100分钟内在0. 1 % TFA水溶液中以线性梯度从0到100%施加的0. 1 % TFA 乙腈溶液。结果显示图谱峰值出现在11. 75分钟，这是双功能肽的特征（图8A)。然而，在 过量尿激酶作用在双功能肽（〇.45mM)上之后，图谱峰值是不同的；事实上，新的洗脱峰值 在20分钟，由此表征双功能肽被尿激酶裂解（图8B)。
[0158] 由此，在皮肤老化条件下，在大量尿激酶存在时，本发明双功能肽被裂解，由此释 放包括Gly-Ile-Leu序列的所述肽的C端。
[0159] 实施例7 :Gly_Ile_Leu序列对MMP-1活性的效果
[0160] 发明人选择Gly-Ile-Leu序列是因为其能够占据I型胶原蛋白酶（MMP-1)的P' 1、 P'2和P'3袋。在具有Gly-Ile-Leu序列的肽5不存在或以浓度为1(Γ5、1(Γ4和1(Γ 3Μ存在 的情况下，在合成底物（DNP-Pro-Cha-Gly-Cys (Me) -His-Ala-Lys (N-Me-Abz) -ΝΗ2)上测试 了 MMP-1的活性。
[0161] 结果（未示出）表明肽5以取决于剂量的方式降低MMP-1对其合成底物的活性。 测量了 Gly-Ile-Leu 肽的 IC50 ;为 0· 71*10_4M，g卩，浓度为 21. 3μ g/ml 的肽。
[0162] 由此，本发明双功能肽的端部C(Gly-Ile-Leu)能在过量尿激酶发生时生成并且 导致对MMP-1的活性的抑制。这些数据确认了所述肽在对抗皮肤老化和/或治愈慢性伤口 方面的重要性。
[0163] 还在更综合性研究的模型上进行了研究：取自体外（ex vivo)的皮肤模型能模仿 皮肤老化和一些相关病理学。获得的结果未示出，但其确认了在上述体外结果。
[0164] 当然，本发明不限于以上示出和描述的实施例，所述实施例可以在不脱离本发明 范围的条件下具有各种变形和修改。
[0165] 参考f献
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【权利要求】
1. 一种双功能肽，所述双功能肽能够激活胶原蛋白的合成并且抑制基质金属蛋白酶的 生成，其中，所述双功能肽具有一序列，所述序列具有三个肽部分A、B和C : -第一肽部分A，对应于重复至少三次的六肽，所述部分A能够结合到弹性蛋白结合受 体蛋白以刺激胶原蛋白合成， -第二肽部分B，对应于能够用作尿激酶蛋白酶的竞争性抑制剂并且被所述蛋白酶裂 解的四肽，以及 -第三肽部分C，对应于占据基质金属蛋白酶的至少一个活性位点的三肽，从而抑制所 述蛋白酶。
2. 如权利要求1所述的双功能肽，其中，刺激胶原蛋白合成的所述第一肽部分A具有 Xl-Gly-X2-X3-Pr〇-Gly序列，该序列重复至少三次，其中： -XI对应于任何氨基酸， -X2对应于选自Val、Thr、Gin、Ala和Leu的氨基酸， -X3对应于选自Ala、Leu和lie的氨基酸。
3. 如权利要求2所述的双功能肽，其中，所述肽的所述第一肽部分A具有 Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly 序列。
4. 如权利要求1-3中任一项所述的双功能肽，其中，可被蛋白酶裂解的所述第二肽部 分B具有Arg-Yl-Arg-Y2序列，其中，Y1和Y2中的每一个对应于选自Ser、Tyr、Gly、Ala、 Arg、Val和Leu的氨基酸。
5. 如权利要求4所述的双功能肽，其中，所述肽的所述第二肽部分B具有 Arg-Val-Arg-Leu 序列。
6. 如权利要求1-5中任一项所述的双功能肽，其中，抑制基质金属蛋白酶的所述第三 部分C具有Zl-Ile-Z2序列，其中： -Z1对应于选自Gly、lie和Leu的氨基酸，并且 -Z2对应于选自Leu、Phe、Ala、lie和Val的氨基酸。
7. 如权利要求6所述的双功能肽，其中，所述肽的所述第三肽部分C具有Gly-Ile-Leu 序列。
8. 如权利要求1-7中任一项所述的双功能肽，其中，所述双功能肽具有如下的S1序列， 所述S1序列对应于序列SEQ ID No. 1 : SI：N-(Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly)n-Arg-Val-Arg-Leu-Gly-Ile-Leu-〇H, 其中，N和OH分别对应于所述肽的N-末端和C-末端，并且 其中，η = 3。
9. 如权利要求1-7中任一项所述的双功能肽，其中，所述双功能肽对应于序列SEQ ID No. 2 至 SEQ ID No. 26 中的一个。
10. 如权利要求1-9中任一项所述的双功能肽，其中，通过化学合成获得所述双功能 肽。
11. 如权利要求1-10中任一项所述的双功能肽，其中，所述双功能肽以冻干形式保存。
12. 如权利要求1-11中任一项所述的双功能肽，其用于慢性疤痕疾病的治疗。
13. 如权利要求12所述的双功能肽，其用于压疮或溃疡的治疗。
14. 如权利要求1-11中任一项所述的双功能肽，其用于真皮组织的修复和/或再生。
15. 如权利要求14所述的双功能肽，其用于皮肤老化的治疗。
16. -种化妆品和/或药物组合物，包括根据权利要求1-11中任一项所述的双功能肽。
17. 如权利要求16所述的化妆品和/或药物组合物，其中，所述双功能肽的浓度在 10 μ g/mL和lmg/mL之间变化，并且优选地基本上等于100 μ g/mL。
【文档编号】A61K38/55GK104159599SQ201380012956
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2013年1月31日 优先权日:2012年2月1日
【发明者】威廉·霍恩贝克, 琼·阿蒂亚, 桑德里纳·洛里默, 弗兰克·安东尼斯利 申请人:瑞吉恩提斯国际贸易有限公司, 兰斯大学, 国家科学研究中心