一种多孔复合凝胶-纳米纤维透氧敷料及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种多孔复合凝胶-纳米纤维透氧敷料及其制备方法，采用胶原蛋白溶液通过静电纺丝方法得到胶原蛋白纳米纤维膜，然后以壳聚糖与海藻酸两种天然无毒的高分子多糖进行化学交联制备复合凝胶，再通过冷冻干燥方式制得多孔海绵-纳米纤维双层复合材料，敷料上层凝胶干燥时为海绵态，吸湿后为凝胶态，本发明在不添加任何有毒化学交联剂的情况下，制备生物创面敷料，工艺简单，安全性好，本发明制备的生物创伤敷料的特点是具有优良透氧性能，吸水性、透水性、透湿性及良好的生物相容性，能够保持创面生理湿润环境，促进创面愈合及有效止血，可防止伤口感染并加速痊愈，能够对创面进行有效修复，适用于创伤、烧伤、溃疡等多种创面。
【专利说明】一种多孔复合凝胶-纳米纤维透氧敷料及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于天然高分子材料和生物医用材料【技术领域】，涉及一种属于医用创面敷 料，特别涉及一种多孔复合凝胶-纳米纤维透氧敷料及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 封闭负压引流（Vacuum-assisted closure, VAC)技术作为一种创面治疗的新技 术，以其有效控制和减轻感染、加速创面愈合、减少医护人员工作量等显著优势已被广泛应 用于临床治疗，本科室自1998年开始VAC技术的治疗机理相关研宄并取得了一批原创性研 宄结果，我们发现：应用VAC治疗会使创面环境持续处于低氧状态，有研宄表明，尽管在创 面愈合早期过程中，缺氧环境有利于创面毛细血管生成，但是随着创面愈合的进行，增加组 织供氧可使局部细胞增殖加快，组织修复能力增强，同时可使创面毛细血管扩张，血流阻力 降低，血流速度加快，组织渗出减少，肿胀减轻，从而加快创面愈合（氧、臭氧及负压引流联 合应用对创面的治疗作用，J Trauma Surg, 2011，13(3))。为改善创面低氧环境这一现状， 我们尝试采用给氧方式进行VAC治疗，并得出局部供氧可促进创面修复的初步实验结果， 并且这一促进作用可能与改善创面组织的微循环障碍与抑制细菌生长有关。
[0003] 目前对于VAC技术使用的敷料研宄相对较少，早期研宄者尝试使用棉花、纱布等 作为医用敷料，但这些敷料存在着明显不足：传统药棉纱布在治疗皮肤伤口时存在愈合期 较长、伤口疤痕明显、换药过程造成患者痛苦的弊端，纱布会造成创面更加干燥的环境，使 创面脱水，导致结痂。而创面的结痂对创面的上皮化有明显的障碍（胶原/壳聚糖复合表皮 生长因子凝血酶海绵敷料的研制，广东药学院学报，2004, 20(5))。通常水凝胶创伤敷料具 有吸收创面渗出液，保持创面清洁湿润，减少疤痕形成，促进创面愈合等优点，但不具有抗 菌性，在防止伤口感染方面存在缺陷，这就要求经常更换敷料给患者带来极大痛苦的同时， 也增加了医务工作者的工作量，近期敷料则主要以医用复合凝胶（聚氨酯、聚乙烯醇等）为 主，VAC技术可在医用泡沫与伤口界面形成一种剪切力，这种机械应力被认为有促进肉芽组 织生长及血管生成的作用。但是，目前已有的医用复合凝胶敷料无法较好地实现这一应力 传导，因此开发兼具优良透氧性、抑菌性能与机械应力传递性能的用于皮肤创面的新型医 用敷料已成为研宄者们的迫切需求，并且这一产品的成功研发将产生巨大的科研与临床价 值。
[0004] Formhals于1934年首次研发出一种借助高压静电场激发聚合物的带电射流， 使射流固化得到超细结构的纳米纤维，通过该方法制备的纳米纤维具备超细纤维直径、较 大比表面积和三维立体结构等独特优势，这使其逐渐成为皮肤创面修复领域的研宄热点， 其原因在于：首先，静电纺丝技术所构建的组织工程支架在结构上具有模拟细胞外基质 (extracellular matrix, ECM)的作用，可以促进成纤维细胞与角质形成细胞的粘附、增 殖与迀移；其次，本发明的静电纺丝溶液中以具有良好生物相容性的胶原蛋白为原料，这 种纳米纤维支架可显著加速创面愈合。第三、海藻酸敷料是目前比较成熟的一类创面敷 料药物，即海藻酸盐通过与创面渗液接触时发生离子交换从而形成具有凝胶状的海藻酸 敷料。由于该敷料具有创造创面愈合所需的湿润环境、与创面贴合性良好等优势，成为一 类性能良好的生物医用材料（海藻酸盐敷料应用现状与研宄进展，中国修复重建外科杂 志，2014, 28 (2))。本发明在此基础上，以海藻酸和壳聚糖等天然高分子物质为原料，在Ca2+ 的离子交换作用下形成具有微纳结构的复合多孔凝胶，不仅能起到与外界隔离的屏障作 用，而且还能诱导血小板活化、促进创面止血以及协同抑菌作用。
[0005] 尽管目前有很多研宄者研制开发了多种医用创面敷料，目前并没有任何通过纯天 然高聚物来制备纳米纤维膜与多孔凝胶作为VAC敷料并应用于创面修复领域的相关文献， 申请号为"CN201010190222. 6"的专利报道了纳米纤维固定化β-D-半乳糖苷酶的制备方 法，但并没有进行生物医学领域的相关研宄。申请号为"CN103705970A"与"CN101224310B" 的专利分别报道了一种丝素基生物创伤敷料与一种载有抗菌药物纳米微粒的医用创伤敷 料的制备方法，但并无显著改善医用创面敷料的透氧性能与微纳结构复合敷料的相关研 宄。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于解决上述问题，提供一种具有优良透氧性能、抑菌能力和促愈 功能的多孔复合凝胶-纳米纤维透氧敷料及其制备方法，该透氧敷料结合了形貌结构可 控、凝胶快速成型、静电纺丝成膜等特点，具有优良透氧性能、吸水性、抑菌能力与促愈效 果，可保持创面生理湿润环境、促进伤口愈合及止血，可防止伤口感染并加速痊愈，适用于 创伤、烧伤、溃疡等多种创面。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案得以实现：
[0008] 一种多孔复合凝胶-纳米纤维透氧敷料，包括上层的复合凝胶和下层的纳米纤维 膜；复合凝胶和纳米纤维膜上均负载有抗菌药物；复合凝胶在干燥时为海绵态，吸湿后为 凝胶态；复合凝胶由质量比为1:3的壳聚糖和海藻酸钠制成，纳米纤维膜由胶原蛋白制成。
[0009] 所述上层复合凝胶的海绵孔隙率50?85%，下层纳米纤维膜的直径为200? 600nm ;制得的敷料透氧率为50?60%，吸水率为1000?2500%。
[0010] 一种多孔复合凝胶-纳米纤维透氧敷料的制备方法，包括以下步骤：
[0011] 1)将胶原蛋白置于质量分数为0. 5?2mol/L的醋酸溶液中，配制成质量浓度为 4?12%的胶原蛋白溶液；
[0012] 2)将步骤1)中获得的胶原蛋白溶液通过静电纺丝制备成胶原蛋白纳米纤维膜；
[0013] 3)将步骤2)中制得的纳米纤维膜进行干燥处理以去除残留溶剂；随后在体积浓 度为0. 5?5%的交联剂蒸汽中进行交联；
[0014] 4)将壳聚糖溶解于质量浓度为2%醋酸中配制成壳聚糖溶液，然后向其中加入氯 化隹?水溶液，然后在25?60°C水浴中继续搅拌5h，接着调节pH值至5,并于室温下搅拌至 完全溶解，静置过夜，得到壳聚糖和氯化钙的混合溶液；其中，混合溶液中氯化钙与壳聚糖 的质量比为1:2?2:1 ;
[0015] 5)将混合溶液直接滴入海藻酸钠溶液中，得到含有壳聚糖沉积层、壳聚糖/海藻 酸钠络合层和海藻酸钙凝聚层的三层结构，且内部是液态的微胶囊凝胶；将微胶囊凝胶取 出冲洗表面至pH值为6,并干燥处理至湿度为15%;然后，再向其中加入占微胶囊凝胶质量 0. 1?0. 5%的增塑剂；其中，混合溶液中壳聚糖和氯化钙的总质量与海藻酸钠的质量之比 为 1:5 ?5:1 ;
[0016] 6)将步骤3)中制备得到的纳米纤维置于IOX IOcm2的模具内，将步骤5)中获得的 添加有增塑剂的微胶囊凝胶置于该模具中摊开，通过冷冻干燥或真空干燥方法制得成型双 层复合材料；纤维与壳聚糖/海藻酸凝胶质量比例为1:40?1:20,干燥时间为6?120h。
[0017] 所述步骤2)中，具体静电纺丝是将步骤1)中获得的胶原蛋白溶液灌注入IOmL注 射器内，控制流速为0. 5?2mL/h，静电纺丝的电压为10?35kV，接收距离为5?20cm，电 纺丝的时间为6?96h，静电纺丝的温度和相对湿度分别为5?35°C和20?80%。
[0018] 所述步骤3)中，干燥处理是在温度为25?35°C的真空干燥箱中进行的，干燥时间 为1?48h。
[0019] 所述步骤3)中，交联剂采用戊二醛或环氧乙烷，且交联反应的时间为4?24h。
[0020] 所述步骤4)中，壳聚糖溶液的质量浓度为0. 1?10%，每毫升氯化钙水溶液中含 有0· 5?5mg的氯化钙。
[0021] 所述步骤5)中，将微胶囊凝胶取出用蒸馏水冲洗表面；干燥处理是用滤纸吸干水 份，然后风干。
[0022] 所述步骤5)中，海藻酸钠水溶液的质量浓度为1?5%，增塑剂采用甘油、聚乙二 醇、山梨醇或乙二醇。
[0023] 所述步骤5)中，混合溶液与海藻酸钠溶液的反应时间为4?24h，反应温度为 25 ?40°C。
[0024] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0025] 本发明多孔复合凝胶-纳米纤维透氧敷料，下层为与创面接触的静电纺丝纳米纤 维，它可以吸收创面的渗出液并负载抑菌药物；上层为由天然安全无毒且具有生物降解性 的壳聚糖与海藻酸交联形成的多孔复合凝胶，其力学性能能满足敷料的使用要求，并具有 优良的透氧性能、透湿和隔菌功能，以期达到缩短创面愈合时间，大幅度降低创面感染率的 目的。
[0026] 本发明多孔复合凝胶-纳米纤维透氧敷料的制备方法，原料成本低，对人体以 及环境不会造成有害影响，整个工艺过程操作简单，易于大规模生产，所得的多孔复合凝 胶-纳米纤维复合敷料不仅具有极好的透氧性能、抗菌性与生物相容性，与创面处的血液、 组织与周围皮肤接触后可形成凝胶，具有止血与成膜性能，不仅可吸收渗液，保持创伤周围 湿润环境，而且可长时间持续释放抗菌药物，从而防止伤口感染。在创面修复领域也有较好 的应用。
[0027] 本发明利用静电纺丝技术制备胶原蛋白纳米纤维膜，随后将壳聚糖和氯化钙的混 合溶液直接滴入海藻酸钠溶液中反应形成微胶囊，最终得到了含有壳聚糖沉积层、壳聚糖/ 海藻酸钠络合层和海藻酸钙凝聚层共三层，内部是液态的微胶囊的凝胶，随后采用冷冻干 燥法制备纤维-壳聚糖/海藻酸凝胶复合凝胶双层复合物。本发明提供了一种新型生物创 面敷料及其制备方法，制备工艺简单，条件温和，获得的生物创面敷料透氧性能优良，透氧 率高达50-60 %，制备的复合敷料具有良好的透氧性能与抗菌性能，可以提高伤口愈合的效 率并防止伤口感染，同时可显著促进创面愈合。因此，本发明制备的改性微纳结构复合材料 可以作为一种良好的VAC敷料材料应用于生物医学领域。
【专利附图】
【附图说明】
[0028] 图1为本发明多孔复合凝胶-纳米纤维透氧敷料的结构示意图；
[0029] 图2为本发明多孔复合凝胶-纳米纤维透氧敷料的微观结构图，其中图2-1为上 层复合凝胶的微观结构示意图，图2-2为下层纳米纤维膜的微观结构示意图；
[0030] 图3为本发明多孔复合凝胶-纳米纤维透氧敷料的透氧性能测试结果图；
[0031] 图4为本发明多孔复合凝胶-纳米纤维透氧敷料的抑菌性能试验结果图；其中，图 4-1为大肠杆菌抑菌效果图，图4-2为金黄色葡萄球菌抑菌效果图；
[0032] 图5为本发明多孔复合凝胶-纳米纤维透氧敷料的体内降解HE染色结果图；其 中，a为胶原蛋白纳米纤维膜，b为壳聚糖/海藻酸钠复合复合凝胶，c多孔复合凝胶-纳米 纤维透氧敷料；
[0033] 图6为不同敷料的创面愈合试验结果，其中，A为胶原蛋白纳米纤维膜，B为壳聚糖 /海藻酸钠复合复合凝胶，C多孔复合凝胶-纳米纤维透氧敷料。
【具体实施方式】
[0034] 下面通过具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明，其目的在于帮助更好的 理解本发明的内容，但这些具体实施方案不以任何方式限制本发明的保护范围。
[0035] 参见图1，本发明多孔复合凝胶-纳米纤维透氧敷料，包括上层的复合凝胶1和下 层的纳米纤维膜2 ;复合凝胶和纳米纤维膜上均负载有抗菌药物；如图2所示，复合凝胶在 干燥时为海绵态，吸湿后卫凝胶态；复合凝胶由质量比为1:3的壳聚糖和海藻酸钠制成，纳 米纤维膜由胶原蛋白制成。上层复合凝胶的海绵孔隙率50?85%，下层纳米纤维膜的直径 为200?600nm ;制得的敷料透氧率为50?60%，吸水率为1000?2500%。
[0036] 实施例1
[0037] (1)将胶原蛋白置于质量分数为lmol/L的醋酸溶液中，配制成质量浓度为8% (w/ w)的胶原蛋白溶液；
[0038] (2)将步骤⑴中获得的胶原蛋白溶液灌注入IOmL注射器内，控制流速为lmL/h， 静电纺丝的电压为30kV，接收距离为15cm，电纺丝的时间为24h。采用静电纺丝制备胶原蛋 白纳米纤维，静电纺丝的温度和相对湿度分别为25 °C和45% ;
[0039] (3)将步骤⑵中制得的纳米纤维膜置于真空干燥箱中，并于30°C下干燥6h以去 除残留溶剂；随后在戊二醛蒸汽中交联，戊二醛的体积浓度为1%，交联时间为6h ;
[0040] (4)将壳聚糖溶解于质量浓度为2%冰醋酸水溶液中配制成质量浓度为2%的壳 聚糖溶液，将制备的lmg/mL氯化钙水溶液，超声5min后，缓慢加入至上述制备好的壳聚糖 溶液中，60 °C水浴中继续搅拌5h，其中CaCl^ CS的质量百分浓度比为1:2。调节pH至5， 室温下搅拌至完全溶解，静置过夜。海藻酸在超纯水溶解配制质量百分浓度为2 %的海藻酸 钠溶液，搅拌后离心，去除沉淀。
[0041] (5)将壳聚糖和氯化钙的混合溶液直接滴入海藻酸钠溶液中反应形成微胶囊，最 终得到了含有壳聚糖沉积层、壳聚糖/海藻酸钠络合层和海藻酸钙凝聚层共三层，内部是 液态的微胶囊的凝胶，取出用蒸馏水冲洗表面至PH值约为6,用滤纸吸干水份，风干至湿度 约为15%，其中壳聚糖/氯化钙与海藻酸钠质量比为1:3,在所配制的溶液中加入重量比为 0. 1 %的甘油作为增塑剂，反应时间为12h，反应温度为25°C。
[0042] (6)将步骤⑶中制备得到的纳米纤维置于IOXlOcm2的自制模具内，将步骤（5) 中获得的添加有甘油的微胶囊的凝胶置于该模具中摊开，通过冷冻干燥法制得成型双层复 合材料；纤维与壳聚糖/海藻酸凝胶质量比例为1:30,冻干时间为48h。
[0043] 实施例2
[0044] (1)将胶原蛋白置于质量分数为lmol/L的醋酸溶液中，配制成质量浓度为8% (w/ w)的胶原蛋白溶液；
[0045] (2)将步骤⑴中获得的胶原蛋白溶液灌注入IOmL注射器内，控制流速为lmL/h， 静电纺丝的电压为30kV，接收距离为15cm，电纺丝的时间为48h。采用静电纺丝制备胶原蛋 白纳米纤维，静电纺丝的温度和相对湿度分别为25 °C和45% ;
[0046] (3)将步骤⑵中制得的纳米纤维膜置于真空干燥箱中，并于30°C下干燥12h以 去除残留溶剂；随后在戊二醛蒸汽中交联，戊二醛的体积浓度为2%，交联时间为12h ;
[0047] (4)将壳聚糖溶解于质量浓度为2%冰醋酸水溶液中配制成质量浓度为2%的壳 聚糖溶液，将制备的lmg/mL氯化钙水溶液，超声5min后，缓慢加入至上述制备好的壳聚糖 溶液中，60°C水浴中继续搅拌5h，其中0 &(：12与CS的质量百分浓度比为1: 1。调节pH至5， 室温下搅拌至完全溶解，静置过夜。海藻酸在超纯水溶解配制质量百分浓度为2 %的海藻酸 钠溶液，搅拌后离心，去除沉淀。
[0048] (5)将壳聚糖和氯化钙的混合溶液直接滴入海藻酸钠溶液中反应形成微胶囊，最 终得到了含有壳聚糖沉积层、壳聚糖/海藻酸钠络合层和海藻酸钙凝聚层共三层，内部是 液态的微胶囊的凝胶，取出用蒸馏水冲洗表面至PH值约为6,用滤纸吸干水份，风干至湿度 约为15%，其中壳聚糖/氯化钙与海藻酸钠质量比为1:2,在所配制的溶液中加入重量比为 0. 2%的甘油作为增塑剂，反应时间为24h，反应温度为25°C。
[0049] (6)将步骤⑶中制备得到的纳米纤维置于IOXlOcm2的自制模具内，将步骤（5) 中获得的添加有甘油的微胶囊的凝胶置于该模具中摊开，通过冷冻干燥法制得成型双层复 合材料；纤维与壳聚糖/海藻酸凝胶质量比例为1:30,冻干时间为48h。
[0050] 实施例3
[0051] (1)将胶原蛋白置于质量分数为lmol/L的醋酸溶液中，配制成质量浓度为8% (w/ w)的胶原蛋白溶液；
[0052] (2)将步骤⑴中获得的胶原蛋白溶液灌注入IOmL注射器内，控制流速为lmL/h， 静电纺丝的电压为30kV，接收距离为15cm，电纺丝的时间为24h。采用静电纺丝制备胶原蛋 白纳米纤维，静电纺丝的温度和相对湿度分别为25 °C和45% ;
[0053] (3)将步骤⑵中制得的纳米纤维膜置于真空干燥箱中，并于30°C下干燥6h以去 除残留溶剂；随后在戊二醛蒸汽中交联，戊二醛的体积浓度为1%，交联时间为6h ;
[0054] (4)将壳聚糖溶解于质量浓度为2%冰醋酸水溶液中配制成质量浓度为2%的壳 聚糖溶液，将制备的lmg/mL氯化钙水溶液，超声5min后，缓慢加入至上述制备好的壳聚糖 溶液中，60 °C水浴中继续搅拌5h，其中CaCl^ CS的质量百分浓度比为1:2。调节pH至5， 室温下搅拌至完全溶解，静置过夜。海藻酸在超纯水溶解配制质量百分浓度为2 %的海藻酸 钠溶液，搅拌后离心，去除沉淀。
[0055] (5)将壳聚糖和氯化钙的混合溶液直接滴入海藻酸钠溶液中反应形成微胶囊，最 终得到了含有壳聚糖沉积层、壳聚糖/海藻酸钠络合层和海藻酸钙凝聚层共三层，内部是 液态的微胶囊的凝胶，取出用蒸馏水冲洗表面至pH值约为6,用滤纸吸干水份，风干至湿度 约为15%，其中壳聚糖/氯化钙与海藻酸钠质量比为1: 1，在所配制的溶液中加入重量比为 0. 5%的甘油作为增塑剂，反应时间为20h，反应温度为25°C。
[0056] (6)将步骤（3)中制备得到的纳米纤维置于IOXlOcm2的自制模具内，将步骤（5) 中获得的添加有甘油的微胶囊的凝胶置于该模具中摊开，通过冷冻干燥法制得成型双层复 合材料；纤维与壳聚糖/海藻酸凝胶质量比例为1:35,冻干时间为72h。
[0057] 实施例4
[0058] (1)将胶原蛋白置于质量分数为lmol/L的醋酸溶液中，配制成质量浓度为8% (w/ w)的胶原蛋白溶液；
[0059] (2)将步骤⑴中获得的胶原蛋白溶液灌注入IOmL注射器内，控制流速为lmL/h， 静电纺丝的电压为30kV，接收距离为15cm，电纺丝的时间为24h。采用静电纺丝制备胶原蛋 白纳米纤维，静电纺丝的温度和相对湿度分别为25 °C和45% ;
[0060] (3)将步骤⑵中制得的纳米纤维膜置于真空干燥箱中，并于30°C下干燥6h以去 除残留溶剂；随后在戊二醛蒸汽中交联，戊二醛的体积浓度为1%，交联时间为6h ;
[0061] (4)将壳聚糖溶解于质量浓度为2%冰醋酸水溶液中配制成质量浓度为4%的壳 聚糖溶液，将制备的lmg/mL氯化钙水溶液，超声5min后，缓慢加入至上述制备好的壳聚糖 溶液中，60 °C水浴中继续搅拌5h，其中CaCl^ CS的质量百分浓度比为1:2。调节pH至5， 室温下搅拌至完全溶解，静置过夜。海藻酸在超纯水溶解配制质量百分浓度为4%的海藻酸 钠溶液，搅拌后离心，去除沉淀。
[0062] (5)将壳聚糖和氯化钙的混合溶液直接滴入海藻酸钠溶液中反应形成微胶囊，最 终得到了含有壳聚糖沉积层、壳聚糖/海藻酸钠络合层和海藻酸钙凝聚层共三层，内部是 液态的微胶囊的凝胶，取出用蒸馏水冲洗表面至PH值约为6,用滤纸吸干水份，风干至湿度 约为15%，其中壳聚糖/氯化钙与海藻酸钠质量比为1:2,在所配制的溶液中加入重量比为 0. 2%的甘油作为增塑剂，反应时间为24h，反应温度为30°C。
[0063] (6)将步骤（3)中制备得到的纳米纤维置于IOXlOcm2的自制模具内，将步骤（5) 中获得的添加有甘油的微胶囊的凝胶置于该模具中摊开，通过冷冻干燥法制得成型双层复 合材料；纤维与壳聚糖/海藻酸凝胶质量比例为1:35,冻干时间为72h。
[0064] 实施例5
[0065] (1)将胶原蛋白置于质量分数为lmol/L的醋酸溶液中，配制成质量浓度为8% (w/ w)的胶原蛋白溶液；
[0066] (2)将步骤⑴中获得的胶原蛋白溶液灌注入IOmL注射器内，控制流速为lmL/h， 静电纺丝的电压为30kV，接收距离为15cm，电纺丝的时间为24h。采用静电纺丝制备胶原蛋 白纳米纤维，静电纺丝的温度和相对湿度分别为25 °C和45% ;
[0067] (3)将步骤⑵中制得的纳米纤维膜置于真空干燥箱中，并于30°C下干燥6h以去 除残留溶剂；随后在戊二醛蒸汽中交联，戊二醛的体积浓度为1%，交联时间为6h ;
[0068] (4)将壳聚糖溶解于质量浓度为2%冰醋酸水溶液中配制成质量浓度为3%的壳 聚糖溶液，将制备的lmg/mL氯化钙水溶液，超声5min后，缓慢加入至上述制备好的壳聚糖 溶液中，60°C水浴中继续搅拌5h，其中0 &(：12与CS的质量百分浓度比为1: 1。调节pH至5， 室温下搅拌至完全溶解，静置过夜。海藻酸在超纯水溶解配制质量百分浓度为3 %的海藻酸 钠溶液，搅拌后离心，去除沉淀。
[0069] (5)将壳聚糖和氯化钙的混合溶液直接滴入海藻酸钠溶液中反应形成微胶囊，最 终得到了含有壳聚糖沉积层、壳聚糖/海藻酸钠络合层和海藻酸钙凝聚层共三层，内部是 液态的微胶囊的凝胶，取出用蒸馏水冲洗表面至PH值约为6,用滤纸吸干水份，风干至湿度 约为15%，其中壳聚糖/氯化钙与海藻酸钠质量比为1:2,在所配制的溶液中加入重量比为 0. 1 %的甘油作为增塑剂，反应时间为24h，反应温度为25°C。
[0070] (6)将步骤⑶中制备得到的纳米纤维置于IOXlOcm2的自制模具内，将步骤（5) 中获得的添加有甘油的微胶囊的凝胶置于该模具中摊开，通过冷冻干燥法制得成型双层复 合材料；纤维与壳聚糖/海藻酸凝胶质量比例为1:30,冻干时间为48h。
[0071] 实施例6
[0072] (1)将胶原蛋白置于质量分数为lmol/L的醋酸溶液中，配制成质量浓度为8% (w/ w)的胶原蛋白溶液；
[0073] (2)将步骤⑴中获得的胶原蛋白溶液灌注入IOmL注射器内，控制流速为lmL/h， 静电纺丝的电压为30kV，接收距离为15cm，电纺丝的时间为24h。采用静电纺丝制备胶原蛋 白纳米纤维，静电纺丝的温度和相对湿度分别为25 °C和45% ;
[0074] (3)将步骤⑵中制得的纳米纤维膜置于真空干燥箱中，并于30°C下干燥6h以去 除残留溶剂；随后在戊二醛蒸汽中交联，戊二醛的体积浓度为1%，交联时间为6h ;
[0075] (4)将壳聚糖溶解于质量浓度为2%冰醋酸水溶液中配制成质量浓度为2%的壳 聚糖溶液，将制备的lmg/mL氯化钙水溶液，超声5min后，缓慢加入至上述制备好的壳聚糖 溶液中，60 °C水浴中继续搅拌5h，其中CaCl^ CS的质量百分浓度比为1:2。调节pH至5， 室温下搅拌至完全溶解，静置过夜。海藻酸在超纯水溶解配制质量百分浓度为2 %的海藻酸 钠溶液，搅拌后离心，去除沉淀。
[0076] (5)将壳聚糖和氯化钙的混合溶液直接滴入海藻酸钠溶液中反应形成微胶囊，最 终得到了含有壳聚糖沉积层、壳聚糖/海藻酸钠络合层和海藻酸钙凝聚层共三层，内部是 液态的微胶囊的凝胶，取出用蒸馏水冲洗表面至PH值约为6,用滤纸吸干水份，风干至湿度 约为15%，其中壳聚糖/氯化钙与海藻酸钠质量比为1:3,在所配制的溶液中加入重量比为 0. 2%的甘油作为增塑剂，反应时间为12h，反应温度为25°C。
[0077] (6)将步骤（3)中制备得到的纳米纤维置于IOXlOcm2的自制模具内，将步骤（5) 中获得的添加有甘油的微胶囊的凝胶置于该模具中摊开，通过冷冻干燥法制得成型双层复 合材料；纤维与壳聚糖/海藻酸凝胶质量比例为1:40,冻干时间为96h。
[0078] 实施例7
[0079] (1)将胶原蛋白置于质量分数为0. 5mol/L的醋酸溶液中，配制成质量浓度为4% (w/w)的胶原蛋白溶液；
[0080] (2)将步骤⑴中获得的胶原蛋白溶液灌注入IOmL注射器内，控制流速为0. 5mL/ h，静电纺丝的电压为10kV，接收距离为5cm，电纺丝的时间为6h。采用静电纺丝制备胶原蛋 白纳米纤维，静电纺丝的温度和相对湿度分别为5 °C和20% ;
[0081] (3)将步骤（2)中制得的纳米纤维膜置于真空干燥箱中，并于25°C下干燥Ih以去 除残留溶剂；随后在环氧乙烷蒸汽中交联，环氧乙烷的体积浓度为0. 5%，交联时间为4h ;
[0082] (4)将壳聚糖溶解于质量浓度为2%冰醋酸水溶液中配制成质量浓度为0. 1%的 壳聚糖溶液，将制备的0. 5mg/mL氯化1?水溶液，超声5min后，缓慢加入至上述制备好的壳 聚糖溶液中，25°C水浴中继续搅拌5h，其中0&(：12与CS的质量百分浓度比为2:1。调节pH 至5,室温下搅拌至完全溶解，静置过夜。海藻酸在超纯水溶解配制质量百分浓度为1%的 海藻酸钠溶液，搅拌后离心，去除沉淀。
[0083] (5)将壳聚糖和氯化钙的混合溶液直接滴入海藻酸钠溶液中反应形成微胶囊，最 终得到了含有壳聚糖沉积层、壳聚糖/海藻酸钠络合层和海藻酸钙凝聚层共三层，内部是 液态的微胶囊的凝胶，取出用蒸馏水冲洗表面至PH值约为6,用滤纸吸干水份，风干至湿度 约为15%，其中壳聚糖/氯化钙与海藻酸钠质量比为5:1，在所配制的溶液中加入重量比为 0. 3%的聚乙二醇作为增塑剂，反应时间为4h，反应温度为30°C。
[0084] (6)将步骤（3)中制备得到的纳米纤维置于IOXlOcm2的自制模具内，将步骤（5) 中获得的添加有甘油的微胶囊的凝胶置于该模具中摊开，通过真空干燥法制得成型双层复 合材料；纤维与壳聚糖/海藻酸凝胶质量比例为1:25,真空干燥时间为6h。
[0085] 实施例8
[0086] (1)将胶原蛋白置于质量分数为I. 5mol/L的醋酸溶液中，配制成质量浓度为9% (w/w)的胶原蛋白溶液；
[0087] (2)将步骤⑴中获得的胶原蛋白溶液灌注入IOmL注射器内，控制流速为I. 5mL/ h，静电纺丝的电压为20kV，接收距离为10cm，电纺丝的时间为72h。采用静电纺丝制备胶原 蛋白纳米纤维，静电纺丝的温度和相对湿度分别为15°C和40% ;
[0088] (3)将步骤⑵中制得的纳米纤维膜置于真空干燥箱中，并于28°C下干燥30h以 去除残留溶剂；随后在环氧乙烷蒸汽中交联，环氧乙烷的体积浓度为3%，交联时间为18h ;
[0089] (4)将壳聚糖溶解于质量浓度为2%冰醋酸水溶液中配制成质量浓度为7%的壳 聚糖溶液，将制备的3mg/mL氯化钙水溶液，超声5min后，缓慢加入至上述制备好的壳聚糖 溶液中，35°C水浴中继续搅拌5h，其中0 &(：12与CS的质量百分浓度比为2:3。调节pH至5， 室温下搅拌至完全溶解，静置过夜。海藻酸在超纯水溶解配制质量百分浓度为3 %的海藻酸 钠溶液，搅拌后离心，去除沉淀。
[0090] (5)将壳聚糖和氯化钙的混合溶液直接滴入海藻酸钠溶液中反应形成微胶囊，最 终得到了含有壳聚糖沉积层、壳聚糖/海藻酸钠络合层和海藻酸钙凝聚层共三层，内部是 液态的微胶囊的凝胶，取出用蒸馏水冲洗表面至PH值约为6,用滤纸吸干水份，风干至湿度 约为15%，其中壳聚糖/氯化钙与海藻酸钠质量比为1:4,在所配制的溶液中加入重量比为 0. 4%的山梨醇作为增塑剂，反应时间为10h，反应温度为35°C。
[0091] (6)将步骤（3)中制备得到的纳米纤维置于IOXlOcm2的自制模具内，将步骤（5) 中获得的添加有甘油的微胶囊的凝胶置于该模具中摊开，通过真空干燥法制得成型双层复 合材料；纤维与壳聚糖/海藻酸凝胶质量比例为1:25,真空干燥时间为36h。
[0092] 实施例9
[0093] (1)将胶原蛋白置于质量分数为2mol/L的醋酸溶液中，配制成质量浓度为12% (w/w)的胶原蛋白溶液；
[0094] (2)将步骤⑴中获得的胶原蛋白溶液灌注入IOmL注射器内，控制流速为2mL/h， 静电纺丝的电压为35kV，接收距离为20cm，电纺丝的时间为96h。采用静电纺丝制备胶原蛋 白纳米纤维，静电纺丝的温度和相对湿度分别为35 °C和80% ;
[0095] (3)将步骤⑵中制得的纳米纤维膜置于真空干燥箱中，并于35°C下干燥48h以 去除残留溶剂；随后在环氧乙烷蒸汽中交联，环氧乙烷的体积浓度为5%，交联时间为24h ;
[0096] (4)将壳聚糖溶解于质量浓度为2%冰醋酸水溶液中配制成质量浓度为10%的壳 聚糖溶液，将制备的5mg/mL氯化钙水溶液，超声5min后，缓慢加入至上述制备好的壳聚糖 溶液中，55°C水浴中继续搅拌5h，其中0 &(：12与CS的质量百分浓度比为1: 1。调节pH至5， 室温下搅拌至完全溶解，静置过夜。海藻酸在超纯水溶解配制质量百分浓度为5 %的海藻酸 钠溶液，搅拌后离心，去除沉淀。
[0097] (5)将壳聚糖和氯化钙的混合溶液直接滴入海藻酸钠溶液中反应形成微胶囊，最 终得到了含有壳聚糖沉积层、壳聚糖/海藻酸钠络合层和海藻酸钙凝聚层共三层，内部是 液态的微胶囊的凝胶，取出用蒸馏水冲洗表面至PH值约为6,用滤纸吸干水份，风干至湿度 约为15%，其中壳聚糖/氯化钙与海藻酸钠质量比为1:5,在所配制的溶液中加入重量比为 0. 5%的乙二醇作为增塑剂，反应时间为15h，反应温度为40°C。
[0098] (6)将步骤⑶中制备得到的纳米纤维置于IOXlOcm2的自制模具内，将步骤（5) 中获得的添加有甘油的微胶囊的凝胶置于该模具中摊开，通过真空干燥法制得成型双层复 合材料；纤维与壳聚糖/海藻酸凝胶质量比例为1:20,真空干燥时间为120h。
[0099] 参见图3至图6,本发明的效果如下：
[0100] 如图3所示，本发明多孔复合凝胶-纳米纤维透氧敷料的透氧性能测试结果显示： 凝胶海绵比纳米纤维具有更高的透氧率，并且本发明多孔复合凝胶-纳米纤维透氧敷料比 两种单独组分具有更好的透氧性能。
[0101] 如图4所示，本发明多孔复合凝胶-纳米纤维透氧敷料对于大肠杆菌（革兰氏阴 性菌）与金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性菌）均具有显著的抑制效果。其中，图4-1反映了 制备的纳米纤维、海绵与复合敷料对大肠杆菌的抑菌效果（以抑菌圈直径显示）；图4-2反 映了这三种材料对金黄色葡萄球菌抑菌效果（以抑菌圈直径显示）。
[0102] 如图5的HE染色结果所示，本发明多孔复合凝胶-纳米纤维透氧敷料具有优良的 体内降解性能，并且在材料植入后有大量新生血管生成。其中，a为胶原蛋白纳米纤维膜，b 为壳聚糖/海藻酸钠复合复合凝胶，c多孔复合凝胶-纳米纤维透氧敷料；实验结果证实： 本发明多孔复合凝胶-纳米纤维透氧敷料比单纯凝胶海绵与纳米纤维在同一植入周期内 具有更好的体内降解性能。
[0103] 如图6所示，不同敷料对于创面愈合得效果存在明显差异，其中，A为胶原蛋白纳 米纤维膜，B为壳聚糖/海藻酸钠复合复合凝胶，C多孔复合凝胶-纳米纤维透氧敷料。结 果显示：经本发明制备的多孔复合凝胶-纳米纤维透氧敷料处理的创面愈合后再上皮化程 度更高，说明该复合敷料对于创面愈合的促进效果最佳。
[0104] 式I分别代表的是壳聚糖与海藻酸的化学结构式，同时代表形成凝胶的结构式， 在化学交联剂钙离子作用下形成凝胶；其中，式I如下：
[0105]
【权利要求】
1. 一种多孔复合凝胶-纳米纤维透氧敷料，其特征在于：包括上层的复合凝胶（1)和 下层的纳米纤维膜（2);复合凝胶和纳米纤维膜上均负载有抗菌药物；复合凝胶在干燥时 为海绵态，吸湿后为凝胶态；复合凝胶由质量比为1:3的壳聚糖和海藻酸钠制成，纳米纤维 膜由胶原蛋白制成。
2. 根据权利要求1所述的多孔复合凝胶-纳米纤维透氧敷料，其特征在于：所述上层 复合凝胶的海绵孔隙率50?85%，下层纳米纤维膜的直径为200?600nm ;制得的敷料透 氧率为50?60 %，吸水率为1000?2500 %。
3. -种多孔复合凝胶-纳米纤维透氧敷料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 将胶原蛋白置于质量分数为〇. 5?2mol/L的醋酸溶液中，配制成质量浓度为4? 12%的胶原蛋白溶液； 2) 将步骤1)中获得的胶原蛋白溶液通过静电纺丝制备成胶原蛋白纳米纤维膜； 3) 将步骤2)中制得的纳米纤维膜进行干燥处理以去除残留溶剂；随后在体积浓度为 0. 5?5%的交联剂蒸汽中进行交联； 4) 将壳聚糖溶解于质量浓度为2%醋酸中配制成壳聚糖溶液，然后向其中加入氯化钙 水溶液，然后在25?60°C水浴中继续搅拌5h，接着调节pH值至5,并于室温下搅拌至完全 溶解，静置过夜，得到壳聚糖和氯化钙的混合溶液；其中，混合溶液中氯化钙与壳聚糖的质 量比为1:2?2:1 ; 5) 将混合溶液直接滴入海藻酸钠溶液中，得到含有壳聚糖沉积层、壳聚糖/海藻酸 钠络合层和海藻酸钙凝聚层的三层结构，且内部是液态的微胶囊凝胶；将微胶囊凝胶取出 冲洗表面至pH值为6,并干燥处理至湿度为15% ;然后，再向其中加入占微胶囊凝胶质量 0. 1?0. 5%的增塑剂；其中，混合溶液中壳聚糖和氯化钙的总质量与海藻酸钠的质量之比 为 1:5 ?5:1 ; 6) 将步骤3)中制备得到的纳米纤维置于10X 10cm2的模具内，将步骤5)中获得的添 加有增塑剂的微胶囊凝胶置于该模具中摊开，通过冷冻干燥或真空干燥方法制得成型双层 复合材料；纤维与壳聚糖/海藻酸凝胶质量比例为1:40?1:20,干燥时间为6?120h。
4. 根据权利要求3所述多孔复合凝胶-纳米纤维透氧敷料的制备方法，其特征在于： 所述步骤2)中，具体静电纺丝是将步骤1)中获得的胶原蛋白溶液灌注入10mL注射器内， 控制流速为〇. 5?2mL/h，静电纺丝的电压为10?35kV，接收距离为5?20cm，电纺丝的时 间为6?96h，静电纺丝的温度和相对湿度分别为5?35°C和20?80%。
5. 根据权利要求3所述多孔复合凝胶-纳米纤维透氧敷料的制备方法，其特征在于： 所述步骤3)中，干燥处理是在温度为25?35°C的真空干燥箱中进行的，干燥时间为1? 48h〇
6. 根据权利要求3或5所述多孔复合凝胶-纳米纤维透氧敷料的制备方法，其特征在 于：所述步骤3)中，交联剂采用戊二醛或环氧乙烷，且交联反应的时间为4?24h。
7. 根据权利要求3所述多孔复合凝胶-纳米纤维透氧敷料的制备方法，其特征在于： 所述步骤4)中，壳聚糖溶液的质量浓度为0. 1?10%，每毫升氯化钙水溶液中含有0. 5? 5mg的氯化妈。
8. 根据权利要求3所述多孔复合凝胶-纳米纤维透氧敷料的制备方法，其特征在于： 所述步骤5)中，将微胶囊凝胶取出用蒸馏水冲洗表面；干燥处理是用滤纸吸干水份，然后 风干。
9. 根据权利要求3所述多孔复合凝胶-纳米纤维透氧敷料的制备方法，其特征在于： 所述步骤5)中，海藻酸钠水溶液的质量浓度为1?5 %，增塑剂采用甘油、聚乙二醇、山梨醇 或乙二醇。
10. 根据权利要求3或8或9所述多孔复合凝胶-纳米纤维透氧敷料的制备方法，其 特征在于：所述步骤5)中，混合溶液与海藻酸钠溶液的反应时间为4?24h，反应温度为 25 ?40°C。
【文档编号】A61L15/42GK104491914SQ201410826196
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月25日 优先权日:2014年12月25日
【发明者】李学拥, 黄容, 李金清, 吕晓星, 蒋立, 李靖 申请人:中国人民解放军第四军医大学