相关申请的交叉引用本申请要求于2014年12月12日提交的美国临时专利申请号62/091,431的优先权，其公开内容通过引用并入本申请。发明领域本发明大体上涉及选择性细胞消除。发明背景癌症是世界范围内发病和死亡的主要原因。在2012年，出现了约1400万例新病例和820万癌症相关性死亡，或占全部人类死亡的14.6％(who网站(2014年11月)“癌症”)。癌症的主要特征是具有侵袭或蔓延至机体其它部位的潜能的异常细胞增长。癌症的理想疗法是完全消除所有癌细胞，而使所有健康细胞无恙。然而，经历当前系统性疗法的癌症患者由于治疗剂的非选择性而遭受从恶心至不孕的多种副作用。因此，对于开发用于选择性消除癌细胞但保留非癌细胞的新疗法存在持续需求。发明概述本发明公开大体上涉及适用于选择性杀灭靶细胞，而不影响非靶细胞的组合物和方法。在一个方面，本申请公开了一种组合物，所述组合物包含：a)向导rna，所述向导rna能够与靶细胞的基因组中的靶序列杂交；b)cas蛋白；和c)编码自杀基因的多核苷酸。在一些实施方式中，所述靶序列特定于所述靶细胞。在一个实施方式中，所述靶序列包含所述靶细胞中染色体易位的断点连接。在一个实施方式中，所述靶细胞是癌细胞。在一个实施方式中，所述cas蛋白是cas9蛋白。在一个实施方式中，所述自杀基因选自下组：病毒胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、针对抗氧化酶(aoe)的胞内抗体、细菌硝基还原酶、半胱天冬酶和脱氧核糖核酸酶(dnase)。在一个实施方式中，所述自杀基因可操作地连接至调控元件。在一个实施方式中，所述调控元件是最小启动子。在一个实施方式中，所述自杀基因可操作地连接至癌特异性启动子。在一个方面，本申请公开了一种组合物，所述组合物包含一个或多个载体，所述载体包含：a)编码向导rna的第一核苷酸序列，所述向导rna能够与靶细胞的基因组中的靶序列杂交；b)编码cas蛋白的第二核苷酸序列；和c)编码自杀基因的第三核苷酸序列；其中所述第一、第二和第三核苷酸序列在相同或不同载体中。在一个实施方式中，所述编码cas蛋白的第二核苷酸序列可操作地连接至癌特异性启动子。在一方面中，本申请公开了一种组合物，所述组合物包含：a)第一向导rna，所述第一向导rna能够与靶细胞的基因组中的第一靶序列杂交；b)第二向导rna，所述第二向导rna能够与所述靶细胞的基因组中的第二靶序列杂交；c)cas蛋白；和d)编码自杀基因的多核苷酸。在另一方面中，本申请公开了一种组合物，所述组合物包含：a)编码第一向导rna的第一核苷酸序列，所述第一向导rna能够与靶细胞的基因组中的第一靶序列杂交；b)编码第二向导rna的第二核苷酸序列，所述第二向导rna能够与所述靶细胞的基因组中的第二靶序列杂交；c)编码cas蛋白的第三核苷酸序列；和d)编码自杀基因的第四核苷酸序列；其中所述第一、第二、第三和第四核苷酸序列在相同或不同载体中。在一个方面，本申请公开了一种细胞，所述细胞包含一个或多个载体，所述载体包含：a)编码向导rna的第一核苷酸序列，所述向导rna能够与靶细胞的基因组中的靶序列杂交；b)编码cas蛋白的第二核苷酸序列；和c)编码自杀基因的第三核苷酸序列；其中所述第一、第二和第三核苷酸序列在相同或不同载体中。在一个方面，本申请公开了一种组合物，所述组合物包含：a)第一向导rna，所述第一向导rna能够与多个靶细胞的基因组中的第一靶序列杂交；b)第二向导rna，所述第二向导rna能够与所述多个靶细胞的基因组中的第二靶序列杂交；c)cas蛋白；和d)编码自杀基因的多核苷酸。在另一个方面，本申请公开了一种组合物，所述组合物包含一个或多个载体，所述载体包含：a)编码第一向导rna的第一核苷酸序列，所述第一向导rna能够与多个靶细胞的基因组中的第一靶序列杂交；b)编码第二向导rna的第二核苷酸序列，所述第二向导rna能够与所述多个靶细胞的基因组中的第二靶序列杂交；c)编码cas蛋白的第三核苷酸序列；和d)编码自杀基因的第四核苷酸序列；其中所述第一、第二、第三和第四核苷酸序列在相同或不同载体中。又在另一个方面，本申请公开了一种方法，所述方法包含将组合物引入靶细胞的方法，所述组合物包含：a)向导rna，所述向导rna能够与所述靶细胞的基因组中的靶序列杂交；b)cas蛋白；和c)编码自杀基因的多核苷酸。在一些实施方式中，所述靶序列在对照细胞的基因组中不存在。在一个实施方式中，所述靶细胞是癌细胞且所述对照细胞是健康细胞。在另一个方面，本申请公开了一种方法，所述方法包括将靶细胞与一个或多个载体接触，所述载体包含：a)编码向导rna的第一核苷酸序列，所述向导rna能够与所述靶细胞的基因组中的靶序列杂交的；b)编码cas蛋白的第二核苷酸序列；和c)编码自杀基因的第三核苷酸序列；其中所述第一、第二和第三核苷酸序列在相同或不同载体中。在一个方面，本申请公开了一种方法，所述方法包含将多个靶细胞与组合物接触，所述组合物包含：a)第一向导rna，所述第一向导rna能够与多个靶细胞的基因组中的第一靶序列杂交；b)第二向导rna，所述第二向导rna能够与所述多个靶细胞的基因组中的第二靶序列杂交；c)cas蛋白；和d)编码自杀基因的多核苷酸。在一个方面，本申请公开了一种方法，所述方法包括将多个靶细胞与一个或多个载体接触，所述载体包含：a)编码第一向导rna的第一核苷酸序列，所述第一向导rna能够与所述多个靶细胞的基因组中的第一靶序列杂交的；b)编码第二向导rna的第二核苷酸序列，所述第二向导rna能够与所述多个靶细胞的基因组中的第二靶序列杂交；c)编码cas蛋白的第三核苷酸序列；和d)编码自杀基因的第四核苷酸序列；其中所述第一、第二、第三和第四核苷酸序列在相同或不同载体中。在一个方面，本申请公开了一种用于治疗癌症的方法，所述方法包括将癌细胞与一个或多个载体接触，所述载体包含：a)编码向导rna的第一核苷酸序列，所述向导rna能够与所述癌细胞的基因组中的靶序列杂交；b)编码cas蛋白的第二核苷酸序列；和c)编码自杀基因的第三核苷酸序列；其中所述第一、第二和第三核苷酸序列在相同或不同载体中。在一个实施方式中，所述靶序列特定于所述癌细胞。在另一个方面，本申请公开了一种组合物，所述组合物包含：a)基因靶向核酸酶或其变体；和b)编码自杀基因的多核苷酸；其中所述基因靶向核酸酶能够促进所述自杀基因整合进入靶细胞的基因组中的靶序列。在一个实施方式中，所述基因靶向核酸酶是锌指核酸酶(zfn)、转录激活因子样效应物核酸酶(talen)、cas蛋白或大范围核酸酶。在一个方面，本申请公开了一种向导rna，所述向导rna包含第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列与靶细胞中第一染色体中的序列互补；和第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列与所述靶细胞中第二染色体中的序列互补。在一个方面，本申请公开了一种载体，所述载体包含(a)编码自杀基因的多核苷酸；(b)第一同源臂，所述第一同源臂位于编码所述自杀基因的所述多核苷酸的上游，其中所述第一同源臂包含靶细胞中第一染色体中的序列；和(c)第二同源臂，所述第二同源臂位于编码所述自杀基因的所述多核苷酸的下游，其中所述第二同源臂包含所述靶细胞中第二染色体中的序列。在另一个方面，本发明公开涉及一种用于在包含至少第一细胞和第二细胞的细胞群中选择性消除所述第一细胞的方法，所述方法包括：a)识别所述第一细胞的基因组中的基因座，所述基因座包含多核苷酸序列，其中所述第二细胞在其基因组中不包含所述多核苷酸序列；和b)在所述基因座处整合自杀基因以诱导所述第一细胞的细胞死亡。在某些实施方式中，所述第一细胞是癌细胞。在某些实施方式中，本发明公开提供了一种选择性地消除或减少受试者中癌细胞的方法，所述方法包含a)识别所述受试者中癌细胞的基因组中的靶基因座，所述基因座包含靶多核苷酸序列，其中健康细胞在其基因组中不包含所述靶多核苷酸序列；和b)向所述受试者施用组合物，所述组合物包含：(i)向导rna，所述向导rna能够与所述靶多核苷酸序列杂交，(ii)cas蛋白，和(iii)自杀基因；c)在所述癌细胞的基因组中的所述基因座处整合所述自杀基因；和d)诱导所述癌细胞的细胞死亡。通过考虑以下说明书、所附权利要求和附图，将更好地理解本发明的这些和其它特性、方面和优势。附图简述图1示出在特定于含有染色体易位的靶细胞的靶序列处插入自杀基因。基因1的dna片段易位至基因2的基因座，并融合至基因2的dna片段。基于连接点周围的序列来识别特定于含有染色体易位的细胞的靶序列。图2示出aavs1基因座的序列。用于设计向导rna的序列(t1和t2)用下划线标出。图3示出all患者中t(9；22)中的连接序列。染色体9、9q+、22q-和22代表易位前后断点连接周围的序列。染色体9来源的序列以大写字母标示；染色体22来源的序列以小写字母标示。含有cas9pam序列(加下划线)的靶序列通过crisprgrna设计工具识别。发明详述在以上发明概述和发明详述中，以及以下权利要求书中和附图中，提及了本发明的特定特征(包括方法步骤)。应当理解，说明书中的本发明公开内容包括上述特定特征的全部可能的组合。例如，当特定特征公开于本发明的特定方面或实施方式，或特定权利要求的背景下，此时，，在可能的范围内，该特征也可用于与本发明的其它特定方面和实施方式的背景下，和/或与其组合以及用于本发明整体。本文使用的术语“包含”及其语法等效词是指其它组件、成分、步骤等任选存在。例如，一个“包含”(或“其包含”)组件a、b和c的物品可由组件a、b和c所构成(即仅含有以上组件)，或可不但含有组件a、b和c，还含有一种或一种以上的其它组件。当本文提及一种包含两个或两个以上经定义的步骤的方法时，所述经定义的步骤可以任何顺序进行或同时进行(上下文排除该可能性的情况除外)，且所述方法可包括一个或一个以上的其它步骤，其在任何经定义的步骤之前、两个经定义的步骤之间，或在全部经定义的步骤之后进行(上下文排除该可能性的情况除外)。在提供了数值范围的情况下，应当理解，受限于所述范围中明确排除的界限，介于该范围的上下限之间的每个数值，至下限单位的十分之一(除非上下文另有明确指示)，以及所述范围内的任何其它所述的或介于其中的数值，均涵盖于本公开之内。在所述范围包括一个或两个界限的情况下，本公开也包括排除了上述包括的界限中的一个或两个的范围。应当领会，为了使说明简单清楚，在适当情况下，参考数字在不同图中重复使用以指示对应或类似要素。此外，列出了许多具体细节，以便提供对本文所述实施方式的深入理解。然而，本文描述的实施方式在没有具体细节的情况下也可实施。在其它情况下，未对方法、步骤和组件进行详细描述，以免模糊所涉及的相关所述功能。而且，不应认为说明书是对本文所述实施范围的限制。应当理解，除非另有说明，不应认为本公开中列出的实施方式的描述和表征互相排斥。本发明公开涉及可用于特异性杀灭靶细胞的组合物。在一个方面，本申请公开了一种组合物，所述组合物包含：a)向导rna，所述向导rna能够与靶细胞的基因组中的靶序列杂交；b)cas蛋白；和c)编码自杀基因的多核苷酸。本文所用的“靶序列”是指向导序列被设计为与之具有互补性的序列，其中靶序列和向导序列之间的杂交促进形成crispr(成簇的规律间隔短回文重复)复合物。crispr复合物的组分以及将crispr复合物用于基因编辑的机制已有记述(例如，mjinek等人，science，2012，337:816-821；lcong等人，science，2012，339:819-823；pct公开wo2013176772、wo2013169802、wo2014018423和美国专利号8,697,359)。靶序列可为靶细胞基因组中的任何序列，只要所述靶序列包含前间区序列邻近基序(pam)序列，其是在靶序列的3’末端处形成crispr复合物所需的。示例性的靶序列包括靶细胞基因组中独有的序列。例如，对于化脓性链球菌(s.pyogenes)cas9，基因组中独有的靶序列可包括mmmmmmmmnnnnnnnnnnnnxgg形式的cas9靶位点，其中nnnnnnnnnnnnxgg(n是a、g、t或c；且x可为任何核苷酸)在基因组中仅出现一次。在该情况下，nnnnnnnnnnnn与向导rna互补，且xgg是pam序列。对于嗜热链球菌(s.thermophilus)crispr1cas9，基因组中独有的靶序列可包括mmmmmmmmnnnnnnnnnnnnxxagaaw形式的cas9靶位点，其中nnnnnnnnnnnnxxagaaw(n是a、g、t或c；x可为任何核苷酸；且w是a或t)在基因组中仅出现一次。在每一个这样的序列中，“m”可为a、g、t或c，且在确定序列是否为独有时无需考虑。在一些实施方式中，所述靶序列特定于靶细胞的基因组，即所述靶序列在对照细胞的基因组中不存在。本文所用的“对照细胞”是指其基因组相比于靶细胞的基因组缺乏靶序列的细胞。对照细胞可为任何细胞。对照细胞和靶细胞可以来源于相同或不同的物种。对照细胞可以是与靶细胞相同或不同的类型。在一些实施方式中，对照细胞和靶细胞可以取自相同的动物。在一个实施方式中，靶细胞是癌细胞且对照细胞是健康细胞。在一个实施方式中，所述癌细胞取自癌症患者。在一个实施方式中，癌细胞和健康细胞均取自同一患者。在一些优选实施方式中，对于特定于靶细胞的靶序列，所述靶序列体现出以下特征：1)所述靶序列特定于靶细胞但在非靶细胞中不存在(例如癌细胞中的靶序列是由染色体重排或易位所形成的区域，且因此在非癌细胞中不存在)；2)所述靶序列包括与向导rna序列互补的序列以及pam序列，使得crispr复合物可以在靶序列处形成。靶序列优选地(尽管并不必需)位于靶细胞中染色体的活性或高表达区域中。可以想象，考虑到当前的基因组序列技术(schustersc，next-generationsequencingtransformstoday'sbiology.nat.methods2008，5(1):16–8)，这些序列或者是公共领域中已知的，或者是针对任何给定的靶细胞或靶细胞样本易于定序的。多种特定于靶细胞的dna序列的实例已有记录。例如，在癌细胞背景下，在某些癌症(例如急性髓性白血病和慢性髓性白血病)中已描述了由染色体易位引起的独特的异常dna序列。在此类癌症中，当两个在其它情况下为分离状态的基因，通过易位连接在一起时，可造成基因融合，导致所述基因整合的过度表达以及癌细胞异常增殖。癌症相关性易位的示例性实例包括在伯基特淋巴瘤(8号染色体上的c-myc易位至14号染色体上的免疫球蛋白重基因座)、套细胞淋巴瘤(11号染色体上的cyclind1易位至免疫球蛋白重基因座)、滤泡性淋巴瘤(bcl-2易位至免疫球蛋白重基因座)、滤泡性甲状腺癌(2号染色体上的pax-8基因易位至3号染色体上的ppar-γ1基因，并与其融合)、慢性髓性白血病(cml)和急性淋巴细胞白血病(9号染色体上的abl1基因易位至22号染色体上的bcr(断点簇区)，并与其融合)中的易位。在上述各例中，可基于易位断点连接周围的dna序列来识别特定于癌细胞的靶序列(参见例如，mjvanderfeltz等人，nucleicacidsres.，1月11日，1989；17(1):1-10；授权于rossi的美国专利号4,874,853和授权于saunders等人的美国专利号5,066,792；以及美国授权前公开号20130209473a1)。在识别可与向导rna杂交的靶序列时，靶序列可选自长度约或超过约5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75个或更多的核苷酸的核苷酸序列，包含所述易位的连接点，并在序列的3’末端处包含cas蛋白的pam序列(例如对于化脓性链球菌cas9是xgg)。可使用crisprgrna设计工具(例如，fengzhang实验室的targetfinder、michaelboutros实验室的targefinder(e-crisp)、rgentools(cas-offinder)、casfinder、crisproptimaltargetfinder，dna2.0)来识别此类靶序列。在一个实施例中，在来自all患者的癌细胞中识别此类靶序列，其中9号染色体上的abl1易位至22号染色体上的bcr，并与其融合。值得注意的是，靶向特异性序列不是在靶细胞和非靶细胞中均存在的序列(例如导致正常细胞转变为癌细胞的癌基因)。靶向特异性序列产生于细胞发育(例如癌症的增长)，其使得基因在癌细胞中突变或者在癌细胞中重排或易位，这两种情况在正常或非癌细胞中均不存在。识别特定于靶细胞的靶序列的方法是现有技术中已知的。示例性方法包括pcr、southern印迹法、微阵列和测序。在一个实施方式中，可对靶细胞和对照细胞的基因组进行测序和比较，以识别特定于靶细胞的序列。例如，garnett等人已系统识别了癌细胞中的突变癌基因(nature，2012，433:570-575)。对于另一个实施例，nwinhold等人对癌症中的非编码调节突变进行了基因组范围的分析，并系统识别了癌症中的非编码突变(naturegenetics，2014，46，1160-1165)。本领域技术人员会想到可用于识别特定于靶细胞的序列的其它方法。在一个实施例中，确认癌症患者，并进行活检以从所述患者获得癌细胞。然后对所述癌细胞的基因组测序并将其与来自相同患者的健康细胞的基因组相比较。然后识别仅存在于所述癌细胞基因组中并在3’末端包含pam序列的序列，并当特征符合本文列出的参量时将其用作靶序列。本文所用的“向导rna”是指指导crispr复合物序列特异性结合于靶序列的rna。通常，向导rna包含(i)与靶多核苷酸序列具有足够互补性以与靶序列杂交的向导序列，和(ii)反式激活cr(tracr)伴侣序列。向导rna可进一步包含融合于3’末端的tracrrna，从而形成单一嵌合向导rna。cas、向导rna、在3’末端具有pam的靶序列和tracrrna(其可与向导rna融合或与向导rna分离)相连接，形成crispr复合物。在一些实施方式中，当使用适当的比对算法进行最优比对时，向导序列和其相应靶序列之间的互补度为约或超过约50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％或更高。可使用用于比对序列的任何适当的算法来确定最优比对，其非限制性的实例包括smith-waterman算法、needleman-wunsch算法、基于以下的算法：burrows-wheeler变换(例如burrowswheeleraligner)、clustalw、clustalx、blat、novoalign(novocrafttechnologies，eland(illumina，加州圣地亚哥)、soap(可在soap.genomics.org.cn可)和maq(可在maq.sourceforge.net获得)。在一些实施方式中，向导序列长度为约或超过约5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75个或更多的核苷酸。在一些实施方式中，向导序列长度约或小于约75、50、45、40、35、30、25、20、15、12个或更少的核苷酸。向导序列指导crispr复合物序列特异性结合于靶序列的能力可通过任何适当的测定来评估。例如，足以形成crispr复合物的crispr系统的组分，包括待测试的向导序列，可被提供至具有相应靶序列的宿主细胞，例如通过采用编码crispr序列组件的载体转染，然后评估靶序列内的优选切割，例如通过如本文所述的surveyor测定。类似地，可在测试管中通过以下方式评估靶多核苷酸序列的切割：提供靶序列、crispr复合物组分，包括待测试的向导序列和不同于测试向导序列的对照向导序列，并比较测试和对照向导序列反应之间靶序列处的结合或切割率。其它测定是可能的，并将被本领域技术人员所想到。在一些实施方式中，选择向导序列以减少向导序列内二级结构的程度。二级结构可通过任何适当的多核苷酸折叠算法确定。一些程序是基于计算最小吉布斯自由能。一个此类算法的实例是如zuker和stiegler所述的mfold(nucleicacidsres.9(1981)，133-148)。另一实例折叠算法是维也纳大学理论化学研究所开发的在线网站服务器rnafold，其使用质心结构预测算法(参见例如a.r.gruber等人，2008，cell106(1):23-24；以及pacarr和gmchurch，2009，naturebiotechnology27(12):1151-62)。本文所用的tracr伴侣序列包括与tracr序列具有足够互补性的任何序列，以促进以下的一项或多项：(1)在含有相应tracr序列的细胞中切除tracr伴侣序列侧接的向导序列；和(2)在靶序列处形成crispr复合物，其中所述crispr复合物包含杂交至tracr序列的tracr伴侣序列。互补度一般参照tracr伴侣序列和tracr序列的最优比对，比对沿两条序列中较短者的长度进行。最优比对可通过任何适当的比对算法来确定，并可进一步解释二级结构，例如tracr序列或tracr伴侣序列内的自我互补。在一些实施方式中，在最优比对时，tracr序列和tracr伴侣序列之间沿着二者中较短者的长度的互补度为约或超过约25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97.5％、99％或更高。在一些实施方式中，向导rna包含融合至tracr序列的向导序列，即tracr序列和tracr伴侣序列包含在单一转录物内，以致二者之间的杂交产生具有二级结构(例如发夹)的转录物。在一些实施方式中，tracr序列的长度为约或超过约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50个或更多的核苷酸。用于发夹结构中的优选的成环序列长度为四个核苷酸，且最为优选地，具有序列gaaa。但也可使用更长或更短的环序列，以及替代序列。序列优选包括核苷酸三连体(例如aaa)，和一个另外核苷酸(例如c或g)。成环序列的实例包括caaa和aaag。在本申请的一个实施方式中，向导rna具有至少两个或更多个发夹。在优选实施方式中，向导rna具有两个、三个、四个或五个发夹。在本发明的进一步实施方式中，向导rna具有至多五个发夹。在一些实施方式中，向导rna进一步包括转录终止序列，优选地为多t序列，例如六个t核苷酸。在一些实施方式中，tracr序列是与包含tracr伴侣序列的转录物分离的转录物。在某些实施方式中，tracr序列在与向导rna分离的载体中(参见例如，美国授权前公开号20140068797)。本文所用的“cas蛋白”是指结合向导rna并呈现核酸酶活性的多肽。cas蛋白的非限制性实例包括cas1、cas1b、cas2、cas3、cas4、cas5、cas6、cas7、cas8、cas9(又称csn1和csx12)、cas10、csy1、csy2、csy3、cse1、cse2、csc1、csc2、csa5、csn2.csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmr1、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、csb1、csb2、csb3、csx17、csx14、csx10、csx16、csax、csx3、csx1、csx15、csf1、csf2、csf3、csf4，其同源物，或其修饰版本。这些酶使已知的；例如，化脓性链球菌cas9蛋白的氨基酸序列可在登记号q99zw2下在swissprot数据库中找到。在一些实施方式中，未修饰的cas蛋白具有dna切割活性。在一些实施方式中，cas蛋白指导对一条或两条链在靶序列位置处的切割，如在靶序列内和/或靶序列的补体内。在一些实施方式中，cas蛋白指导在自靶序列的首位或末位核苷酸起约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500或更多碱基对之内，对一条或两条链进行切割。在一些实施方式中，cas蛋白经突变，使得突变的cas蛋白缺乏切割含有靶序列的靶多核苷酸的一条或两条链的能力。例如，来自化脓性链球菌的cas9的ruvci催化域中天冬氨酸至丙氨酸替代(d10a)，将cas9从切割两条链的核酸酶转变为切口酶(切割单链)。将cas9变成切口酶的其它突变实例包括但不限于h840a、n854a和n863a。本文所用的术语，前间区序列邻近基序(pam)是指紧接cas蛋白靶向的dna序列的dna序列。在一些实施方式中，pam序列位于靶序列的3’末端处，并为cas蛋白成功结合靶序列所需。pam序列根据cas蛋白所来源的细菌种类的不同而不同。例如，来自化脓性链球菌的cas9的pam序列是ngg(n可为a、t、c或g中的任意一个)。对于另一实例，脑膜炎奈瑟菌(neisseriameningitides)的pam序列是nnnngatt。嗜热链球菌的pam序列是nnaggaa。齿垢密螺旋体(treponemadenticola)的pam序列是naaaac。本文所用的术语“自杀基因”是指致使细胞杀灭自身的基因。在一些实施方式中，自杀基因致使细胞通过凋亡杀灭自身。自杀基因的非限制性实例包括病毒胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、针对抗氧化酶的胞内抗体(aoes)、细菌硝基还原酶、半胱天冬酶和脱氧核糖核酸酶(参见maleckim.，frontiersinsuicidegenetherapyofcancer，jgenetsyndrgenether.2012(3)，和其中引用的参照)。在一个实施方式中，自杀基因是病毒胸苷激酶(tk)。胸苷激酶是一种将脱氧胸苷转化为脱氧胸苷5’-单磷酸盐的atp-胸苷5’-磷酸转移酶，所述脱氧胸苷5’-单磷酸盐由病毒胸苷激酶进一步磷酸化为脱氧胸苷二磷酸盐，随后由核苷二磷酸激酶磷酸化为脱氧胸苷三磷酸酯。脱氧胸苷三磷酸酯由dna聚合酶并入合成dna分子。一些dntp类似物，例如更昔洛韦(gcv)，一种2’-脱氧鸟苷的合成类似物，一旦其并入合成dna则具有终止dna合成的能力。合成的终止触发凋亡信号级联。虽然gcv不被人胸苷激酶所识别，但被一些病毒胸苷激酶识别为底物，例如单纯疱疹病毒-1胸苷激酶(hsv-tk)。因此，表达hsv-tk的人类细胞将gcv转化为gcv磷酸盐，其被进一步磷酸化并并入合成dna中，导致合成的终止和凋亡。在一个实施方式中，自杀基因是胞嘧啶脱氨酶。胞嘧啶脱氨酶将胞嘧啶水解为尿嘧啶并释放氨。在生理条件下，修饰位点被内切核酸酶识别，然后dna中的磷酸二酯键断裂，通过并入新的胞嘧啶启动修复。然而，胞嘧啶脱氨酶还可将5-氟胞嘧啶转变为5-氟尿嘧啶(5-fu)。因此，一旦提供无毒性前药5-fc，胞嘧啶脱氨酶则将其转变为高毒性的5-fu(一种胸苷酸合成酶的自杀抑制剂)，导致细胞生长抑制和凋亡。在另一方面中，本申请公开了一种组合物，其包含一个或多个载体，所述载体包含：a)编码向导rna的第一核苷酸序列，所述向导rna能够与靶细胞的基因组中的靶序列杂交；b)编码cas蛋白的第二核苷酸序列；和c)编码自杀基因的第三核苷酸序列；其中所述第一、第二和第三核苷酸序列在相同或不同载体中。在一个实施方式中，所述编码cas蛋白的第二核苷酸序列可操作地连接至癌特异性启动子。本文所用的术语“载体”是指包含特别关注的基因或核酸序列的多核苷酸分子。通常，该构建体还包括合适的调控序列。例如，所述多核苷酸分子可包括调控序列，其位于编码向导rna的核苷酸序列、和/或编码cas蛋白的核苷酸序列、和/或编码自杀基因的核苷酸序列的5’-侧翼区中，以能够在宿主细胞中复制并表达期望基因的方式可操作地连接至编码序列。在一些实施方式中，包含自杀基因的载体进一步包含适用于将自杀基因整合至靶序列的核苷酸序列。例如，所述自杀基因侧接两个适用于在靶序列周围重组的区域。典型地，第一区域与由在上游与cas蛋白造成的双链断裂(dsb)紧邻的序列具有高度同源性，而第二区域与在下游与dsb紧邻的序列具有高度同源性。一旦在靶序列处通过cas造成dsb，则靶细胞内源性的同源导向修复(hdr)装置被召集至dsb的基因座，并使用该载体作为适宜的模板以在dsb处如实引入自杀基因。在一个实施方式中，当靶序列为靶细胞中的染色体易位所造成时，dsb上游的序列来自一个染色体，而dsb下游的序列来自另一染色体。如此，所述载体不会被用作非靶细胞中hdr装置的模板，所述非靶细胞不含特定于靶细胞的靶序列。可使用本领域公知的方法制备包含编码向导rna的核苷酸序列、和/或编码cas蛋白的核苷酸序列、和/或编码自杀基因的核苷酸序列的载体。例如，多核苷酸分子可被制备为较大质粒的一部分。此制备允许以如现有技术已知的有效方式克隆和分离正确的构建体。在制备质粒和转化宿主生物体中使用的各种方法是现有技术中已知的(参见例如，molecularcloningalaboratorymanual，第2版，sambrook、fritsch和maniatis编，coldspringharborlaboratorypress，1989)。在一些实施方式中，载体包含编码向导rna的核苷酸序列。在一些实施方式中，向导rna包含tracr序列。在一些实施方式中，向导rna和tracr序列在来自一个或两个载体的两个独立的转录物中表达。在一些实施方式中，编码向导rna的核苷酸序列和编码cas蛋白和/或自杀基因的核苷酸序列可在相同或不同载体中。本文所公开的组合物引入靶细胞中时，可介导在靶序列处整合自杀基因，导致自杀基因的表达并造成靶细胞的死亡。在一个实施方式中，自杀基因被整合至特定于靶细胞的靶序列，导致对靶细胞的特异性杀灭，而不包含所述靶序列的细胞存活。在一个实施方式中，自杀基因可操作地连接至调控元件。在一个实施方式中，调控元件是启动子。在一个实施方式中，调控元件是最小启动子。在一个实施方式中，所述包含自杀基因的多核苷酸不包含可操作地连接至自杀基因的启动子；在此种情况下，自杀基因在并入已为活性基因转录区的靶序列区域之后进行表达。术语“可操作地连接”是指元件的排列，其中配置所描述的组件以执行其通常功能。就启动子而言，可操作地连接至编码序列的启动子将指导编码序列的表达。启动子或其它控制元件无需与编码序列相接，只要它们具有指导编码序列表达的功能即可。例如，在启动子序列和编码序列之间可存在插入的未翻译但已转录的序列，而启动子序列仍可被认为“可操作地连接”至编码序列。“启动子”是指启动转录特定基因的dna序列。常用于启动真核细胞中基因转录的启动子的非限制性实例包括：sv40启动子、cmv启动子、ef1a启动子、ubc启动子、人β-肌动蛋白启动子、cag启动子和四环素反应元件(tre)启动子。在一个实施方式中，用于本文所述组合物中的启动子是最小启动子。当编码自杀基因的多核苷酸整合进入靶细胞基因组时，最小启动子启动自杀基因的低转录或无转录。在一个实施例中，最小或核心启动子是位于相对转录起始位点的-35至+35区域之间的启动子的一部分。其具有以下3个保守序列中的一个或多个：即tata框，启动区，rna聚合酶和下游启动子元件的结合位点。在此实施例中，将组合物引入靶细胞中时，除非发生自杀基因整合，否则组合物不会杀灭靶细胞。在一个实施方式中，包含自杀基因的多核苷酸不包含可操作地连接至自杀基因的启动子。在一个实例中，靶序列位于靶细胞基因组中内源性启动子的附近。当自杀基因整合至基因组中靶序列时，自杀基因的转录由于内源性启动子的存在而启动。在另一个实施例中，靶序列位于高活性表达的基因座处(例如b细胞中的免疫球蛋白基因座)。自杀基因仅整合至在高表达基因座时才高度表达并杀灭靶细胞。在一个实例中，chiarle等人已系统识别了b细胞中染色体断裂和重排在基因组范围的易位，并发现易位优先靶向已转录的染色体区域(cell.2011，147(1):107-19)。基于易位断点连接周围的dna序列来识别特定于b细胞的易位的靶序列。当未可操作地连接至启动子的自杀基因整合进入靶序列时，其经表达杀灭b细胞。相反，未整合的自杀基因不表达，即便其被引入细胞。在一些实施方式中，所述靶细胞是真核细胞。在一些实施方式中，所述靶细胞是动物细胞。在一些实施方式中，所述靶细胞是哺乳动物细胞，例如啮齿动物细胞(例如小鼠细胞)和人类细胞。示例性的靶细胞包括上皮细胞，神经细胞(例如神经元、星形胶质细胞)、肝细胞、血细胞、脂肪细胞和肾细胞。在一些实施方式中，所述靶细胞是癌细胞。癌细胞是指以不受调控的、加速的步调生长和分裂的细胞。癌症的实例包括急性淋巴细胞白血病(all)、急性髓性白血病、肾上腺皮质癌、肛门癌、、儿童小脑或大脑星形细胞瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨瘤、脑癌、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、幕上原始神经外胚瘤、视路和下丘脑胶质瘤、乳腺癌、伯基特淋巴瘤、宫颈癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、结肠癌、肺气肿、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、尤因氏肉瘤、成视网膜细胞瘤、胃部(胃)癌、胶质瘤、头颈癌、心脏癌、霍奇金淋巴瘤、胰岛细胞癌(内分泌胰腺)、卡波西肉瘤、肾癌(肾细胞癌)、喉癌、白血病、肝癌、肺癌、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、咽喉癌、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌(肾癌)、成视网膜细胞瘤、尤因氏肿瘤家族、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、喉癌、甲状腺癌、阴道癌。癌症治疗的关键议题是选择性消除癌细胞，这在癌细胞与健康细胞混合的情况下尤为关键。手术切除不可避免地将功能性的健康细胞连同癌细胞一起除去。放射治疗影响所有暴露的细胞。虽然放射治疗依赖于快速增殖的细胞(例如癌细胞)对电离辐射较高的敏感性，但一些健康细胞，包括生殖细胞、免疫细胞和内分泌系统细胞也对此敏感，且因此在放射治疗中受损。同样地，化学疗法渗入并影响所有细胞。大部分化学疗法依赖于快速增殖的细胞较高的摄入率，以及对有丝分裂的阻断，从而导致激活凋亡级联。然而，包括涉及再生和免疫的健康细胞群体，也严重受到影响。本文公开的组合物可用于选择性消除癌细胞。通过识别特定于癌细胞的靶序列，所述组合物能够促进自杀基因选择性地整合于癌细胞中，致使癌细胞杀灭自身。在一个实施方式中，编码cas蛋白的第二核苷酸序列可操作地连接至癌特异性启动子。通过将编码cas蛋白的序列可操作地连接至癌特异性启动子，cas蛋白的表达限于癌细胞。因此，自杀基因整合进入靶细胞的基因组仅发生在癌细胞中。癌特异性启动子的示例性实例包括表皮生长因子受体(egfr)启动子、转铁蛋白受体(tfr)启动子、癌胚抗原(cea)启动子、端粒酶启动子、前列腺特异性抗原(psa)启动子、细胞角蛋白18和19(ck19)启动子和环氧合酶(cox)启动子。在另一实施方式中，自杀基因可操作地连接至癌特异性启动子。如此，经整合的自杀基因仅在癌细胞中表达，尽管可能发生一些脱靶整合。大部分人类癌症是高度异质的。单一细胞在其基因组中可能具有多重突变。因此，在一个方面，本申请公开了一种组合物，所述组合物包含：a)第一向导rna，所述第一向导rna能够与靶细胞的基因组中的第一靶序列杂交；b)第二向导rna，所述第二向导rna能够与靶细胞的基因组中的第二靶序列杂交；c)cas蛋白；和d)编码自杀基因的多核苷酸。该组合物可用于促进自杀基因整合进入靶细胞基因组的多个靶序列。在另一个方面，本申请公开了一种组合物，所述组合物包含一个或多个载体，所述载体包含：a)编码第一向导rna的第一核苷酸序列，所述第一向导rna能够与靶细胞的基因组中的第一靶序列杂交；b)编码第二向导rna的第二核苷酸序列，所述第二向导rna能够与靶细胞的基因组中的第二靶序列杂交；c)编码cas蛋白的第三核苷酸序列；和d)编码自杀基因的第四核苷酸序列；其中所述第一、第二、第三和第四核苷酸序列在相同或不同载体中。癌症异质性不仅存在于单个癌细胞中，还存在于癌组织内的癌细胞群中，即不同癌细胞可显示不同的形态和表型概况，包括细胞形态学、基因表达、代谢、机动性、增殖和转移潜能。因此，癌细胞的异质性为有效治疗策略的设计带来了重大的挑战，因为对于一种癌细胞有效的癌症疗法，对于相同癌组织内的另一癌细胞可能不是有效的。癌症异质性的一个共同特性是基因异质性，其可起因于多种来源。一些癌症是在当外在因素引入突变时起始的，例如紫外辐射(例如皮肤癌)和烟草(例如肺癌)。一种更常见的来源是基因组不稳定性，其经常在细胞中关键调控通路被破坏时出现。一些实例包括受损的dna修复机制，其可导致增加的复制错误和有丝分裂装置中的缺陷，致使整个染色体大规模的增加或丢失。因此，在一个方面，本申请公开了一种组合物，所述组合物包含：a)第一向导rna，所述第一向导rna能够与多个靶细胞的基因组中的第一靶序列杂交；b)第二向导rna，第二向导rna能够与所述多个靶细胞的基因组中的第二靶序列；c)cas蛋白；和d)编码自杀基因的多核苷酸。在另一个方面，本申请公开了一种组合物，所述组合物包含一个或多个载体，所述载体包含：a)编码第一向导rna的第一核苷酸序列，所述第一向导rna能够与多个靶细胞的基因组中的第一靶序列杂交；b)编码能第二向导rna的第二核苷酸序列，所述第二向导rna够与所述多个靶细胞的基因组中的第二靶序列杂交；c)编码cas蛋白的第三核苷酸序列；和d)编码自杀基因的第四核苷酸序列；其中所述第一、第二、第三和第四核苷酸序列在相同或不同载体中。在一些实施方式中，如上所述的组合物可用于杀灭基因异质性的细胞群体，即所述群体中的细胞具有基因变异。在一个实施方式中，如上所述的组合物可用于杀灭基因异质性的癌细胞。在一个实施例中，获取癌细胞的活检并对所述癌细胞的基因组进行测序，识别相比于健康细胞的基因组，特定于癌细胞的基因组学的两个或更多靶核苷酸序列。设计能够与靶核苷酸序列杂交的向导rna。引入癌细胞中后，自杀基因整合至癌细胞基因组中的靶序列，导致所述癌细胞的死亡。如此，尽管癌细胞群体中具有基因异质性，自杀基因仍整合进入该群体的基因组，只要各癌细胞具有至少一个靶序列。在又一个方面中，本申请公开了一种方法，所述方法包括组合物引入靶细胞，所述组合物包含：a)向导rna，所述向导rna能够与靶细胞的基因组中的靶序列杂交；b)cas蛋白；和c)编码自杀基因的多核苷酸。在一些实施方式中，所述靶序列特定于所述靶细胞的基因组。在另一个方面，本申请公开了一种方法，所述方法包括将靶细胞一个或多个载体接触，所述载体包含：a)编码向导rna的第一核苷酸序列，所述向导rna能够与靶细胞的基因组中的靶序列杂交；b)编码cas蛋白的第二核苷酸序列；和c)编码自杀基因的第三核苷酸序列；其中所述第一、第二和第三核苷酸序列在相同或不同载体中。在一个实施方式中，所述第二核苷酸序列可操作地连接至癌特异性启动子。可使用传统的基于病毒和非病毒的转基因方法以在靶细胞中引入载体。可使用此类方法以将编码所述组合物组分的核酸施用于培养中的或宿主生物体中的细胞。非病毒载体递送系统包括dna质粒、rna(例如本文所述载体的转录物)、裸核酸、以及与运载工具复合的核酸，例如脂质体、与运载工具复合的蛋白，例如脂质体。病毒载体递送系统包括dna和rna病毒，其在递送至细胞后具有游离或整合的基因组。基因治疗过程的综述参见anderson，science256:808-813(1992)；nabel&felgner，tibtech11:211-217(1993)；mitani&caskey，tibtech11:162-166(1993)；dillon，tibtech11:167-175(1993)；miller，nature357:455-460(1992)；vanbrunt，biotechnology6(10):1149-1154(1988)；vigne，restorativeneurologyandneuroscience8:35-36(1995)；kremer&perricaudet，britishmedicalbulletin51(1):31-44(1995)；haddada等人，在currenttopicsinmicrobiologyandimmunology中，doerfler和bihm(编)(1995)；和yu等人，genetherapy1:13-26(1994)。核酸的非病毒递送方法包括脂转染、核转染、电穿孔、显微注射、基因枪、病毒体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质：核酸缀合物、裸dna、人工病毒粒子和试剂增强的dna摄取。脂转染描述于例如美国专利号5,049,386、4,946,787；和4,897,355中)且脂转染试剂是市售的(例如，transfectamtm和lipofectintm)。适用于多核苷酸的有效受体识别脂转染的阳离子和中性脂质包括feigner，wo91/17424；wo91/16024中所述的。递送可至细胞(例如体外或离体施用)或靶组织(例如，体内施用)。脂质的制备：核酸复合物，包括被靶向的脂质(例如免疫脂质复合物)，是本领域技术人员公知的(参见例如，crystal，science270:404-410(1995)；blaese等人，cancergenether.2:291-297(1995)；behr等人，bioconjugatechem.5:382-389(1994)；remy等人，bioconjugatechem.5:647-654(1994)；gao等人，genetherapy2:710-722(1995)；ahmad等人，cancerres.52:4817-4820(1992)；美国专利号4,186,183、4,217,344、4,235,871、4,261,975、4,485,054、4,501,728、4,774,085、4,837,028和4,946,787)。使用基于rna或dna病毒的系统递送核酸，利用了将病毒靶向至体内特定细胞，并运送病毒负载至细胞核的高度进化的进程。病毒载体可直接向患者(体内)施用，或者可用于在体外治疗细胞，且经修饰的细胞可以被可选地向患者(体内)施用。传统的基于病毒的系统可包括用于基因转移的逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺病毒相关和单纯疱疹病毒载体。采用逆转录病毒、慢病毒和腺病毒相关病毒基因转移方法在宿主基因组中的整合是可能的，其经常导致经插入转基因的长期表达。此外，在许多不同细胞类型和靶组织中已观测到了高转导效率。如本文所公开的，当自杀基因未整合进入靶序列时，优选地，其表达最小化。在一个实施方式中，使用基于腺病毒的系统，因为在不存在crispr/cas系统的情况下，其使自杀基因整合进入靶细胞基因组的可能性较低。基于腺病毒的载体能够在许多细胞类型中具有非常高的转导效率且不需要细胞分裂。采用此类载体已获得了高效价高水平的表达。该载体可在相对简单的系统中大量生产。腺病毒相关病毒(“aav”)载体也可用于转导具有靶核酸的细胞，例如，在核酸和肽的体外生产中，以及用于体内和离体基因治疗过程中(参见例如，west等人，virology160:38-47(1987)；美国专利号4,797,368；wo93/24641；kotin，humangenetherapy5:793-801(1994)；muzyczka，j.clin.invest.94:1351(1994)。在许多出版物中描述了重组aav载体的构建，包括美国专利号5,173,414；tratschin等人，mol.cell.biol.5:3251-3260(1985)；tratschin等人，mol.cell.biol.4:2072-2081(1984)；hermonat&muzyczka，pnas81:6466-6470(1984)；和samulski等人，j.virol.63:03822-3828(1989)。通常使用包装细胞以形成能够感染宿主细胞的病毒颗粒。此类细胞包括包装腺病毒的293细胞，以及包装逆转录病毒的ψ2细胞或pa317细胞。通常是通过生产将核酸载体包装入病毒颗粒的细胞系，来生成基因治疗中使用的病毒载体。所述载体通常含有用于包装并随后整合进入宿主所需的最小病毒序列，其它病毒序列被用于待表达的多核苷酸的表达盒所替代。缺失的病毒功能通常由包装细胞系反式提供。例如，基因治疗中使用的aav载体通常仅具有用于包装和整合进入宿主基因组所需的、来自aav基因组的itr序列。病毒dna包装于细胞系中，其含有编码其它aav基因(即rep和cap)的辅助质粒，但缺乏itr序列。所述细胞系还被作为辅助病毒的腺病毒感染。辅助病毒促进aav载体的复制，和aav基因从辅助质粒的表达。辅助质粒由于缺乏itr序列而未被大量包装。腺病毒污染可通过例如热处理以减少。腺病毒对热处理比aav更敏感。用于将核酸递送至细胞的其它方法是本领域技术人员公知的。参见例如us20030087817，其通过引用并入本文。在一个方面，本申请公开了一种方法，所述方法包含将组合物引入多个靶细胞，所述组合物包含：a)第一向导rna，所述第一向导rna能够与多个靶细胞的基因组中的第一靶序列杂交的；b)第二向导rna，所述第二向导rna能够与多个靶细胞的基因组中的第二靶序列杂交；c)cas蛋白；和d)编码自杀基因的多核苷酸。在一个方面，本申请公开了一种方法，所述方法包含将多个靶细胞与包含一个或多个载体接触，所述载体包含：a)编码第一向导rna的第一核苷酸序列，所述第一向导rna能够与多个靶细胞的基因组中的第一靶序列杂交；b)编码第二向导rna的第二核苷酸序列，所述第二向导rna能够与多个靶细胞的基因组中的第二靶序列杂交；c)编码cas蛋白的第三核苷酸序列；和d)编码自杀基因的第四核苷酸序列；其中所述第一、第二、第三和第四核苷酸序列在相同或不同载体中。在一个方面，本申请公开了一种用于治疗癌症的方法，所述方法包含将癌细胞与一个或多个载体接触，所述载体包含：a)编码向导rna的第一核苷酸序列，所述向导rna能够与癌细胞的基因组中的靶序列杂交；b)编码cas蛋白的第二核苷酸序列；和c)编码自杀基因的第三核苷酸序列；其中所述第一、第二和第三核苷酸序列在相同或不同载体中。在一个实施方式中，所述靶序列特定于所述癌细胞的基因组。在一个实施方式中，所述方法进一步包括用例如gcv和5-fc的前药治疗癌细胞。在另一个方面，本申请公开了一种组合物，所述组合物包含：a)基因靶向或其变体；和b)编码自杀基因的多核苷酸；其中所述基因靶向或其变体能够促进自杀基因整合进入靶细胞的基因组中的靶序列。在一个实施方式中，基因靶向核酸酶是锌指核酸酶(zfn)、转录激活因子样效应物核酸酶(talen)、cas蛋白或大范围核酸酶。基因靶向核酸酶能够在基因组中期待的位点(例如，靶序列)处生成特定的双链断裂，并利用细胞的内生机制以通过同源重组(hr)和非同源末端连接(nhej)修复所诱导的断裂，使自杀基因整合至期望的位点。在某些实施方式中，基因靶向核酸酶的变体是基因靶向重组酶，例如锌指重组酶(zfr)(proudfoot等人，(2011)zincfingerrecombinaseswithadaptablednaspecificity，plosone6(4):e19537)。在一个方面，本申请公开了一种方法，所述方法通过将一个或多个载体引入被怀疑患有癌症的受试者以治疗所述受试者癌症，追述载体包含：a)编码向导rna的第一核苷酸序列，所述向导rna能够与癌细胞的基因组中的靶序列杂交；b)编码cas蛋白的第二核苷酸序列；和c)编码自杀基因的第三核苷酸序列；其中所述第一、第二和第三核苷酸序列在相同或不同载体中。在一些实施方式中，受试者是动物，例如，哺乳动物(例如啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、兔)、猫、狗、牛、灵长类和人)。在一些实施方式中，所述方法进一步包括从受试者获得癌细胞样本以进行基因组测序，以识别特定于所述癌细胞的靶序列。在一些实施方式中，所述方法进一步包括向受试者施用化合物，所述化合物杀灭基因组中整合了自杀基因的癌细胞，但不杀灭非癌细胞。在一个实施例中，自杀基因是hsv-tk时所述化合物是gcv。在另一实施例中，自杀基因是胞嘧啶脱氨酶时所述化合物是5-fc。在一个方面，本申请公开了用于如本文所公开的组合物中的向导rna。在一个实施方式中，所述向导rna包含互补于靶细胞中第一染色体中序列的第一核苷酸序列；和互补于所述靶细胞中第二染色体中序列的第二核苷酸序列。通常，第一核苷酸序列长度约为或超过5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸，且第二核苷酸序列长度约为或超过5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸。在一个实施方式中，所述向导rna包含互补于染色体易位的断点连接周围的序列的核苷酸序列。在一个方面，本申请公开了一种载体，所述载体包含：(a)编码自杀基因的多核苷酸；(b)第一同源臂，所述第一同源臂位于编码所述自杀基因的所述多核苷酸的上游，其中所述第一同源臂包含靶细胞中第一染色体中的序列；和(c)第二同源臂，所述第二同源臂位于编码所述自杀基因的所述多核苷酸的下游，其中所述第二同源臂包含所述靶细胞中第二染色体中的序列。本文所用的“同源臂”是指适于通过同源重组将基因靶向至基因组的多核苷酸。通常，两条同源臂与待整合进入基因组的基因侧接，其中各同源臂包含位于整合基因座上游和下游的序列。通常，第一同源臂长度约为或超过50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000个碱基对，且第二同源臂长度至少为50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000个核苷酸。实施例1以下是将自杀基因插入细胞中的靶序列以诱导细胞死亡的实施例。为测试本申请中所公开策略的功能性，将hsv-tk整合至位于hek293t细胞19号染色体上ppp1r12c基因中的aavs1(腺病毒相关病毒整合位点1)基因座。制备cas9和grna表达构建体从addgene(idno：48140)获得质粒px330，其包含两种表达盒：人密码子优化的化脓性链球菌cas9表达盒，和表达单一向导rna的u6启动子驱动盒。将编码针对两个cas9靶标，t1和t2(参见图2)的向导rna的dna序列，分别克隆入px330质粒的向导rna表达盒(参见ran等人(2013)genomeengineeringusingthecrispr-cas9system，natureprotocols8，2281-2308)。制备包含hsv-tk基因的靶质粒使用multisitegatewaythree-fragment载体构建试剂盒(lifetechnologies)制备包含hsv-tk基因的靶质粒的(参见boudabe和okkenhaug(2013)aprotocolforconstructionofgenetargetingvectorsandgenerationofhomologousrecombinationescells，methodsmolbiol.1064:337-354)。简而言之，将对应于aavs1基因座周围序列的5’同源臂和3’同源臂，分别插入入门载体。然后将hsv-tk基因插入含有5’同源臂的入门载体。将所得入门载体与目的载体重组以生成靶载体ptarget-hsv-tk-1。作为对照，生成带有gfp(绿色荧光蛋白)基因的靶载体(ptarget-gfp)，gfp基因与5’和3’同源臂侧接。该对照靶载体还含有位于gfp基因的3’下游，且在ires(内部核糖体进入位点)序列之后的前间区2序列。通过在载体骨架中接近一个同源臂的限制位点处切割一次来线性化靶质粒。将crispr质粒和供体dna共转染进入hek293t细胞根据制造商的建议维持hek293t细胞(lifetechnologies)并在37℃和5％co2下在d10培养基(补充了glutamax和10％(体积/体积)fbs的dmem培养基)中培养。混合crispr质粒(500ng)和线性化靶质粒(500ng)并使用amaxasf细胞系4d-nucleofectorx试剂盒s(lonza)制备转染溶液。将转染溶液加至细胞并通过使用amaxa，cm-130(lonza)电穿孔所述细胞。将自杀基因插入aavs1基因座共转染三天后，将g418(400ug/ml)加至细胞培养物以选择包含靶载体的细胞。选择7天后，克隆并扩增细胞。通过pcr或测序确定各克隆aavs1基因座处的序列，以确认hsv-tk基因的插入。结果显示t1和t2grna二者均可诱导同源重组以及hsv-tk基因插入aavs1基因座。对于对照靶载体，使用相同实验方案克隆在aavs1处插入gfp基因的细胞。选择性消除插入自杀基因的细胞对于含有hsv-tk插入的各克隆，加入更昔洛韦(0.5ug/ml)。三天后，在含有hsv-tk的克隆中未发现活细胞。作为对照，更昔洛韦在插入gfp基因的细胞中未诱导细胞死亡。为证实对插入自杀基因的细胞的选择性消除，将含有hsv-tk插入的细胞与含有gfp基因的细胞混合。在更昔洛韦处理后，细胞培养物中仅存活表达gfp的细胞。实施例2以下是选择性消除所关注细胞的实施例。在该实施例中，将hsv-tk基因插入含有前间区序列的细胞并诱导所述细胞死亡。如实施例1中公开的插入gfp基因的细胞在gfp基因的下游处还含有前间区2序列(seqidno:5)，其在该实施例中用于插入自杀基因。根据前间区2序列设计向导rna并将其插入px330载体以生成crispr质粒px330-p。靶载体如实施例1中公开的方式构建，并且含有hsv-tk基因，其与由gfp基因构成的5’同源臂和与实施例1中所用相同的3’同源臂侧接。由此，若通过同源重组插入靶载体，则不会扰乱gfp的表达。为显示对含有前间区序列的细胞的选择性消除，将插入了gfp-前间区序列的hek293t细胞(参见实施例1)与未修饰的hek293t细胞混合。将混合的细胞群分入两个皿中。一个皿与crispr质粒px330-p和靶质粒ptarget-hsv-tk-2共转染。另一个皿作为对照，与px330和靶质粒ptarget-hsv-tk-2共转染。三天后，将更昔洛韦加至两个皿中。再一天后使用facs计算各皿中表达gfp的细胞的数目。观测到在px330-p转染的皿中，表达gfp的细胞的百分比显著下降，表明含有前间区序列的细胞被选择性消除。实施例3以下是在费城阳性急性淋巴细胞白血病(all)受试者中消除癌细胞的实施例。在成人all中最常观测到的染色体畸变是t(9；22)(q34；q11)易位。通过克隆和限制性内切图谱表征来自一个患者的dna的断点连接片段(nucleicacidsres.jan1989，17(1):1-10)。连接位于外显子ia和共有外显子(a2)之间的abl内含子中。22号染色体上的断点位于第一内含子中。使用crisprgrna设计工具(dna2.0)来确定(图3)和分析连接周围的序列。识别潜在向导序列(图3)。获得受试者的血样。通过pcr和测序来表征断点连接周围的序列。基于断点连接周围的序列设计向导序列。将向导序列克隆入腺病毒相关病毒(aav)/crispr载体(senise等人，biotechnolj.2014，9:1402-12)。将经克隆的aav/crispr载体连同aav/hsv-tk载体(kanazawat等人，genether2003，10:51-58)一起包装进入重组aav。aav/hsv-tk载体含有侧接hsv-tk基因的两条同源臂，然而各同源臂包含在上游和下游紧邻断点连接的序列。aav载体中的hsv-tk可操作地连接至最小启动子以确保在未整合进入断点连接的基因座时，hsv-tk的表达最小化。然后将重组aav递送入受试者。获得受试者的血样以确认hsv-tk基因在费城阳性癌细胞中断点连接的基因座处的整合和表达。然后向受度者施用更昔洛韦(gcv)。观测到费城阳性癌细胞的细胞死亡，而健康细胞未受损伤。序列表<110>朱坚<120>用于选择性消除所关注细胞的方法和组合物<130>063148-8002wo01<150>62/091,431<151>2014-12-12<160>5<170>patentinversion3.5<210>1<211>1368<212>prt<213>化脓性链球菌<400>1metasplyslystyrserileglyleuaspileglythrasnserval151015glytrpalavalilethraspglutyrlysvalproserlyslysphe202530lysvalleuglyasnthrasparghisserilelyslysasnleuile354045glyalaleuleupheaspserglygluthralaglualathrargleu505560lysargthralaargargargtyrthrargarglysasnargilecys65707580tyrleuglngluilepheserasnglumetalalysvalaspaspser859095phephehisargleuglugluserpheleuvalglugluasplyslys100105110hisgluarghisproilepheglyasnilevalaspgluvalalatyr115120125hisglulystyrprothriletyrhisleuarglyslysleuvalasp130135140serthrasplysalaaspleuargleuiletyrleualaleualahis145150155160metilelyspheargglyhispheleuilegluglyaspleuasnpro165170175aspasnseraspvalasplysleupheileglnleuvalglnthrtyr180185190asnglnleupheglugluasnproileasnalaserglyvalaspala195200205lysalaileleuseralaargleuserlysserargargleugluasn210215220leuilealaglnleuproglyglulyslysasnglyleupheglyasn225230235240leuilealaleuserleuglyleuthrproasnphelysserasnphe245250255aspleualagluaspalalysleuglnleuserlysaspthrtyrasp260265270aspaspleuaspasnleuleualaglnileglyaspglntyralaasp275280285leupheleualaalalysasnleuseraspalaileleuleuserasp290295300ileleuargvalasnthrgluilethrlysalaproleuseralaser305310315320metilelysargtyraspgluhishisglnaspleuthrleuleulys325330335alaleuvalargglnglnleuproglulystyrlysgluilephephe340345350aspglnserlysasnglytyralaglytyrileaspglyglyalaser355360365glnglugluphetyrlyspheilelysproileleuglulysmetasp370375380glythrglugluleuleuvallysleuasnarggluaspleuleuarg385390395400lysgl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