本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种转移消失蛋白脂质体复合物及其制备方法和应用。
背景技术：
脂质体即人造的磷脂双分子囊泡。脂质体自身可以作为载体，用于养分、药物、疫苗、基因、蛋白等物质的递送。磷脂是构成脂质体的主要化学成分。具有代表性包括磷脂酰胆碱（PC）等，主要来自蛋黄和大豆，制备成本低，性质稳定，属于中性磷脂。磷脂酰胆碱是形成许多细胞膜的主要成分，也是制备脂质体的主要原料。二硬脂酰磷脂酰胆碱是合成磷脂，相对天然磷脂纯度更高、更加稳定。胆固醇也是脂质体另一个重要组成成分，它是许多天然生物膜的重要成分，本身并不形成膜结构，但是能够以1:1甚至2:1的摩尔比插入磷脂膜中。加入胆固醇可以改变脂膜的相变温度，从而影响膜的通透性和流动性，因此胆固醇具有稳定磷脂双分子膜的作用。培化磷脂酰乙醇胺属于长循环脂质体的辅料，该成分可极大延长脂质体循环时间、明显缓解对内皮组织的刺激或显著提高局部生物利用度。
脂质体的疏水性的双分子膜内部包裹着一个水溶液腔，理论上溶解在水中的亲水性物质不能穿过脂质双分子层进入囊泡。同时，亲脂性的化学物质则可以装载在磷脂双分子膜的内部。因此，脂质体既可以装载亲水性的分子，也可以装载亲脂性的物质。脂质体的磷脂双分子膜还可已通过融合的方式与其他双分子层结构融合，如细胞膜等，这样就能实现对装载物质的递送。基于这种原因，用脂质体装载难以吸收的药物或DNA、蛋白等大分子物质，可以实现穿过细胞膜而递送至细胞内部。
目前，长循环脂质体已取得了较长足的发展，但是，进一步通过引入不同性质的磷脂，如培化磷脂酰乙醇胺等，在改善脂质体制品的稳定性、延长包裹药物的脂质体内保留时间方面，已经很难有更明显的提升。磷脂的功能虽有一定多样性，但相对生物大分子的多样性来说，还极其有限，单纯由磷脂复合物制成的脂质体难免面临性能进一步提升的瓶颈。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供了一种稳定性好，药物释放时间长，可长循环的转移消失蛋白脂质体复合物。为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案。
一种转移消失蛋白脂质体复合物，其特征在于脂质体表面吸附或包覆转移消失蛋白。
转移消失蛋白(metastasis suppressor 1 , Mtss1)是一种重要的胞内膜调控蛋白, 属于Bin–Amphiphysin–Rvs 家族成员, 能结合细胞膜并在细胞极化、 运动和内吞作用等过程中发挥调节功能, 其表达异常与多种疾病尤其是肿瘤发生或转移相关, 在神经系统、循环系统和生殖泌尿系统中也有一定作用。本发明所述的转移消失蛋白包含本领域技术人员熟知的不同种属来源的天然或重组转移消失蛋白或其片段。本发明的一个优选方案，转移消失蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：1-8所示，其中SEQ ID No：1-2为人源的转移消失蛋白片段，SEQ ID No：3-4为鼠源的转移消失蛋白片段，SEQ ID No：5-6为猴源的转移消失蛋白片段，SEQ ID No：7-8为牛源的转移消失蛋白片段。
本发明所述的脂质体涵盖本领域所有的脂质体类型，脂质体由至少一种磷脂和亲脂性化合物组成。所述磷脂选自二硬脂酰磷脂酰胆碱，二棕榈酰磷脂酰胆碱，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，二棕榈酰磷脂酰乙醇胺，二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺，磷脂酰乙醇胺，培化磷脂酰乙醇胺，二硬脂酰磷脂酰甘油，二棕榈酰磷脂酰甘油，二肉豆蔻酰磷脂酰甘油，卵磷脂，氢化蛋黄卵磷脂，大豆磷脂，氢化大豆磷脂，二硬脂酰磷脂酸，二棕榈酰磷脂酸，二肉豆蔻酰磷脂酸，二硬脂酰磷脂酰丝氨酸，二棕榈酰磷脂酰丝氨酸，二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂；所述的亲脂性化合物选自C12-C18直链饱和或不饱和脂肪酸，单甘脂，生育酚，胆固醇，胆固醇半琥珀酸酯。
本发明所述的转移消失蛋白脂质体复合物可以应用在多个技术领域，如制药、医疗器械、检测、造影等，优选的，用于制药领域，所述脂质体内可以包封有天然或人工合成的无机或有机化合物、多肽、蛋白、多糖、RNA、DNA、抗体、纳米颗粒等中的一种或几种复合物。当用于制药领域时，脂质体内包封物为药物。
本发明的一个优选的方案里，脂质体内部包封的药物为阿霉素。
本发明的一个优选的方案里，选用脂质体材料为二硬脂酰磷脂酰胆碱、培化磷脂酰乙醇胺和胆固醇。
优选的，转移消失蛋白、二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇、培化磷脂酰乙醇胺和阿霉素的重量比为0.3-0.7:16-28:5-7:2-3:0.1-0.3；更优选重量比为0.5:22:5.5:3:0.2
本发明的另一目的在于提供本发明所述的转移消失蛋白脂质体复合物在制备药物或保健品制剂中的应用。所述药物的给药方式为静脉注射、口服给药、经皮给药、肺部给药或眼部给药。
本发明的另一目的在于提供本发明述的转移消失蛋白脂质体复合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1) 取适量至少一种磷脂和亲脂性化合物，加入溶剂使其完全溶解；
(2) 减压抽去溶液中的溶剂，形成均匀脂质薄膜；
(3) 加入脂质体包封物，充分水化后获得脂质体，可进一步优选增加整粒步骤；
(4) 将脂质体悬液中加入适量转移消失蛋白溶液，孵育，获得转移消失蛋白脂质体。
上述制备方法中优选步骤（3）加入保护剂，所用保护剂可以为葡萄糖或甘露醇。
本发明的一个具体实施方式，转移消失蛋白阿霉素脂质体通过如下步骤制备得到：
(1) 取适量二硬脂酰磷脂酰胆碱、培化磷脂酰乙醇胺、胆固醇，加入氯仿和少量甲醇使其完全溶解；
(2) 使用旋转蒸发仪减压抽去溶液中的溶剂，形成一层位于容器内壁的均匀脂质薄膜；
(3) 加入阿霉素水溶液，以及适量保护剂，在恒温摇床中充分水化；
(4) 水化后适当加压通过适当孔径的膜进行整粒，获得阿霉素脂质体；
(5) 阿霉素脂质体悬液中加入适量转移消失蛋白片段溶液，摇床孵育0.5~2.5小时，获得转移消失蛋白阿霉素脂质体。
上述制备方法还可以进一步去除多余的药物或脂质体材料，步骤如下：
(6) 转移消失蛋白阿霉素脂质体先使用透析袋于适量保护剂溶液孵育中透析3次，每次1~2小时以除去游离的阿霉素，再使用葡萄糖凝胶柱过滤2~3次分离除去游离的转移消失蛋白，优选的，葡萄糖凝胶柱规格为G-20~G-50，透析袋规格为8000~14000。
上述制备方法步骤（5）优选孵育温度为25~30℃，摇床速度为180-220rpm。
本发明还涉及上述转移消失蛋白阿霉素脂质体在静脉注射、口服给药、经皮给药、肺部给药和眼部给药中的应用。
本发明还涉及上述转移消失蛋白阿霉素脂质体在肿瘤治疗，或抗肿瘤药物的制备中的应用。
本发明利用转移消失蛋白的氮端片段可自发形成一个飞艇状的二聚体形态，可在体内和体外结合并改造磷脂膜的型态的特点，将转移消失蛋白与脂质体相结合，开发出新型的脂质体，相对于传统的脂质体，具有膜曲率更得当，表面电荷更规律，磷脂分子层更致密，尺寸均一性好，包裹药物保留时间更长，制剂更稳定等优点。
本发明的一个具体的所述的转移消失蛋白阿霉素脂质体，克服了传统阿霉素脂质体的循环时间和生物利用度不高，不利于给药的方便，也不利于减小毒副作用，以及用药量的增加从而增加患者成本的缺点。虽然长循环阿霉素脂质体可将循环时间延长，但是，脂质体磷脂膜稳定性弱，药物往往会因脂质体破碎而释放。本发明所述的转移消失蛋白阿霉素脂质体不仅循环时间长，生物利用度高，并且能够更加稳定的包裹药物，延长释放时间。
附图说明
图1为实施例1制备的转移消失蛋白阿霉素脂质体的透射电镜照片。
图2为实施例1制备的转移消失蛋白阿霉素脂质体与未加入转移消失蛋白片段的阿霉素脂质体相比，其同等时间未释放药物的含量比较。
具体实施方式
实施例1：一种转移消失蛋白阿霉素脂质体制备
(1) 取二硬脂酰磷脂酰胆碱2.2 g、培化磷脂酰乙醇胺550 mg、胆固醇300 mg，加入氯仿和少量甲醇使其完全溶解；
(2) 使用旋转蒸发仪减压抽去溶液中的溶剂，形成一层位于容器内壁的均匀脂质薄膜；
(3) 加入含20 mg阿霉素的水溶液，以及10%蔗糖，在恒温摇床中充分水化；
(4) 水化后适当加压通过0.22 μm规格的聚碳酸脂膜6次，获得阿霉素脂质体；
(5) 阿霉素脂质体悬液中加入含50 mg转移消失蛋白片段的10%蔗糖溶液，摇床孵育1.8小时，获得转移消失蛋白阿霉素脂质体，所使用的转移消失蛋白制备方法参照文献[P.K. Mattila, et al. J Cell Biol, 2007, 176 (7): 953-964]方法获得，氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。
(6) 转移消失蛋白阿霉素脂质体先使用透析袋-10000于适量保护剂溶液孵育中透析3次，每次1.5小时以除去游离的阿霉素，再使用葡萄糖凝胶柱G-50过滤3次分离除去游离的转移消失蛋白片段。
实施例2： 电镜考察本发明所述转移消失蛋白阿霉素脂质体的外观
将实施例1中制备的转移消失蛋白阿霉素脂质体按照1:100纯水稀释，然后滴加一滴悬液于电镜铜网上，使液滴保持稳定不要下渗，避光自然干燥。测试前一小时，在通网上滴加两滴2%磷钨酸溶液负染。自然干燥后，使用JEM-2100透射电镜进行观察。形态见图1。结果表明，脂质体平均粒径320 nm，粒度分布较均一，形态规整，基本为球形，脂质体膜层外圈有较强染色对比，提示形成转移消失蛋白阿霉素脂质体复合物。
实施例3：本发明所述转移消失蛋白阿霉素脂质体药物保留时间的研究
将实施例1制备的转移消失蛋白阿霉素脂质体低速离心后重悬，各取1 ml装入透析袋中，并各保留500 ml样品保存于4℃冰箱。透析袋在室温25℃下于PBS缓冲液中透析24 h。结束后透析袋中悬液的颜色明显变浅。将袋内悬液混匀，各取500 µl，加入500 µl 1% Triton X-100的PBS溶液，混匀后超声处理5 min。4℃冰箱的保留样品同样加入500 µl 1% Triton X-100的PBS溶液，混匀后超声处理5 min，以作对照。超声后的所有样品在13000 xg下高速离心5 min，透析后样品上清液中通过紫外-可见分光光度仪测量500 nm左右处吸收峰来估算阿霉素保留含量。结果如图2所示。结果表明，在制备过程中加入转移消失蛋白，在同等的时间内，药物没能透过脂质体制剂释放至溶液中而保留的量，较在制备过程中未加入转移消失蛋白的脂质体，有明显提高，说明转移消失蛋白可增强脂质体稳定性，使得脂质体不易破壁或药物不易于从脂质体流出，有助于延长药物在制剂中的保留时间，提高生物利用度以及降低药物过早释放带来的非特异性毒性。