本发明涉及传染病防治技术领域，进一步涉及人类传染病动物模型的建立方法，具体涉及一种人患鼠伤寒沙门氏菌肠炎病动物模型制备方法。
背景技术：
鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)属于沙门氏菌B群，是一群非适应性或泛嗜性的沙门氏菌，具有广泛的宿主。鼠伤寒沙门氏菌能引起各种家禽和哺乳动物的传染病，也可引起人类感染，其临床表现可分为四型，即胃肠炎型、败血症型、病灶感染型和无症状带菌型。其中胃肠炎型最常见，约占80％。潜伏期8～24小时，发病较急，主要症状为发热、腹泻、厌食、呕吐、腹痛、腹胀等，大便次数增多，严重者每日可达数十次，大便性状多样易变，为黄绿色或深绿色水样、粘液样或脓血便。新生儿可间歇排出白色胶冻样便，重症腹泻患儿可迅速出现脱水、电解质紊乱和酸中毒，甚至发生休克。大便显微镜检查可见多数白细胞和红细胞。绝大多数病人大便可培养出鼠伤寒沙门氏菌，为确诊鼠伤寒的主要依据。
由于该疾病症状复杂，而且与其他传染性肠道疾病存在相似的临床表现，因此诊断较为困难；而且由于患病人群多为小儿，因此治疗手段受到一定的限制，再加之不同患者间症状差异较大，因此相关治疗方法普适性较低，疗效难以保证。在这种情况下，为获得更好的治疗手段，现有技术的研究者尝试建立动物模型作为研究对象。在此环节中，首先，所建立的动物模型应当与人类该疾病的病理特征尽可能相似；此外，造模方法应当具有良好的可重复性；同时，动物模型作为该疾病研究对象的性能指标应当明确，并具有确切的评价方法。然而现有技术的造模方法普遍存在缺陷：在动物与病原微生物的接触过程中难以保证得到胃肠炎分型，同时又缺乏明确的筛选手段，因此所得的病患动物很可能不具有人患鼠伤寒沙门氏菌肠炎病的病理特征、无法作为该疾病的研究对象。
技术实现要素：
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种人患鼠伤寒沙门氏菌肠炎病动物模型制备方法，以解决现有技术的造模方法难以保证获得可用动物模型的技术问题。
本发明要解决的另一技术问题是现有技术的人患鼠伤寒沙门氏菌肠炎病动物模型造模方法可重复性较低。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种人患鼠伤寒沙门氏菌肠炎病动物模型制备方法，包括以下步骤：
1)取体重13～16g、3～5周龄的小鼠，以浓度为0.5～1.5×109cfu/mL的鼠伤寒沙门氏菌菌液灌胃处理，每次灌胃280～320uL菌液，每天灌胃2次，持续3天；每次灌胃前小鼠禁食不禁水2小时；
2)步骤1)结束后，在所述小鼠中选取：较步骤1)开始前体重下降10％以上、且较步骤1)开始前血清中IL-6含量升高50％以上、且较步骤1)开始前血清中IL-10含量升高100％以上的个体，即为所述人患鼠伤寒沙门氏菌肠炎病动物模型。
作为优选，所述小鼠的品种是昆明小鼠。
作为优选，步骤2)中所述个体还满足以下条件：其小肠组织中IL-6含量较步骤1)开始前升高200％以上、且其小肠组织中MPO含量较步骤1)开始前下降30％以上。
作为优选，步骤2)中所述个体还满足以下条件：其血清中白细胞含量较步骤1)开始前升高100％以上、且其血清中中性粒细胞含量较步骤1)开始前升高100％以上、且其血清中淋巴细胞含量较步骤1)开始前升高50％以上、且其血清中单核细胞含量较步骤1)开始前升高50％以上。
作为优选，步骤2)中所述个体还可以满足以下任一条件：精神倦怠；毛色失去光泽；腹泻；体重下降；小肠充气肠壁变薄；肠管内充满黄色稀薄的内容物。
在以上技术方案中，采用病原微生物直接灌胃的方式进行造模，操作方式较为简便；在此基础上，本发明进一步针对病原微生物浓度、接触量以及接触频次进行了创新性设计，有效提升了疾病模型效果。此外，本发明发现当接触病菌前控制小鼠的进水、进食状况一方面能够促进鼠伤寒病向胃肠炎分型发展，同时有助于统一动物模型的病理反应。本发明以严谨的技术构思实现了突出的技术效果，同时成本较低、易于实现，因此具有良好的应用前景，为人患鼠伤寒沙门氏菌肠炎病的临床用药提供了可靠的研究对象。
附图说明
图1是本发明实施例1中模型组小鼠与正常组小鼠平均体重变化图；
图2是本发明实施例1中正常组小鼠小肠组织HE染色图；
图3是本发明实施例1中模型组小鼠小肠组织HE染色图。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。
以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。
除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1
本发明模拟人的鼠伤寒病的小鼠细菌性肠炎模型的建立方法，包括以下步骤：
1)通过灌胃法给小鼠喂食鼠伤寒沙门氏菌。
2)通过检测小鼠的体表特征和临床指标来判断小鼠模型是否成功建立。
所述的鼠伤寒沙门氏菌购自中国微生物菌种保藏管理中心菌种编号1.1194。
所述的喂食小鼠的鼠伤寒沙门菌浓度控制在109个/ml左右。
所述检测小鼠的大体指征是指：精神倦怠、毛色失去光泽、腹泻、体重下降，小肠充气肠壁变薄，肠管内充满黄色稀薄的内容物。
所述进行临床指标检测是指：血常规测定、血清中细胞炎症因子含量测定、小肠组织中炎症因子含量测定、小肠组织病理性切片检测。
所述的临床指标数据均用SPSS17.0软件进行统计，数据用±s表示，数据先做正态性检验和方差齐性检验，组间比较采用方差分析(正态性)或秩和检验(非正态资料)，以P＜0.05为差异有统计学意义。
上述方法的具体操作步骤如下：
一、鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠细菌性肠炎模型建立：
1、取本实验室冻存的鼠伤寒沙门氏菌(购自中国微生物菌种保藏管理中心菌种编号1.1194)。吸取菌悬液移植于BPY液体培养基试管中，菌液置于恒温培养箱中37℃，220rpm振荡培养过夜。得到鼠伤寒沙门氏菌菌液浓度控制在109个/ml。
2、实验动物选用14g左右的4周龄雌性昆明小鼠，军购自天津解放军四所，许可证号SCXK-(军)2009-003，生产合格证号0001906。小鼠在SPF洁净级动物空调房内饲养，实验室适应性饲养两天后用于后续实验。
3、把实验室小鼠随机分组，每组10只。模型组通过灌胃法用12号弯灌胃将活化的鼠伤寒沙门氏菌灌入小鼠胃中，正常组通过灌胃法用12号弯灌胃针将生理盐水灌入小鼠胃中。小鼠每天灌胃2次，每次灌胃300uL/只，连续灌胃3天，每次灌胃前小鼠禁食不禁水2小时。
4、小鼠灌胃三天后第二天摘眼球取血，部分血液加入15％EDTA抗凝剂，进行血常规测定。部分血液置于离心管中，37℃恒温水浴半小时，4℃放置1小时后，3000rpm/min离心10分钟，取上清，-20℃保存备用。断颈法处死小鼠，解剖小鼠胸腹腔，观察小鼠各脏器病变情况，取小肠病变严重部位小肠组织，冰磷酸盐缓冲液清洗后，部分置于4％甲醛固定液中固定，其余置于西林瓶中-20℃保存备用。
二、对造模处理后动物的进一步筛选
1、自攻毒前一天开始每日称量小鼠体重，记录小鼠体重变化，实验结果如图1所示。
2、血常规测定：取各组加入抗凝剂的血液，进行血常规检验。检测结果见表1。
表1血常规测定小鼠白细胞及其分类变化
注：t检验，与正常组相比，*p<0.05。
3、血清中细胞炎症因子含量测定：取各组-20℃保存血清，按照试剂盒说明书ELISA法检测血清中IL-10和IL-6的含量，检测结果见表2。
表2小鼠血清中IL-6，IL-10含量变化
注：t检验，与正常组相比，*p<0.05。
4、小肠组织中炎症因子含量测定取-20℃保存的肠断，快速滤纸吸干后称重，做10％组织匀浆，3000rpm/min离心10分钟，按说明书ELISA法测定组织中IL-6、MPO的含量，检测结果见表3。
表3小鼠小肠中IL-6，MPO含量变化
注：t检验，与正常组相比，*p<0.05。
5、小肠组织病理切片制作：取4％甲醛固定液保存的肠断，常规石蜡包埋，切片用HE染色，光镜下观察小肠组织病理组织学变化，观察结果见图2、图3。
实施例2
一种人患鼠伤寒沙门氏菌肠炎病动物模型制备方法，包括以下步骤：
1)取体重13g、3周龄的小鼠，以浓度为0.5×109cfu/mL的鼠伤寒沙门氏菌菌液灌胃处理，每次灌胃280uL菌液，每天灌胃2次，持续3天；每次灌胃前小鼠禁食不禁水2小时；
2)步骤1)结束后，在所述小鼠中选取：较步骤1)开始前体重下降10％以上、且较步骤1)开始前血清中IL-6含量升高50％以上、且较步骤1)开始前血清中IL-10含量升高100％以上的个体，即为所述人患鼠伤寒沙门氏菌肠炎病动物模型。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
所述小鼠的品种是昆明小鼠。
步骤2)中所述个体还满足以下条件：其小肠组织中IL-6含量较步骤1)开始前升高200％以上、且其小肠组织中MPO含量较步骤1)开始前下降30％以上。
步骤2)中所述个体还满足以下条件：其血清中白细胞含量较步骤1)开始前升高100％以上、且其血清中中性粒细胞含量较步骤1)开始前升高100％以上、且其血清中淋巴细胞含量较步骤1)开始前升高50％以上、且其血清中单核细胞含量较步骤1)开始前升高50％以上。
实施例3
一种人患鼠伤寒沙门氏菌肠炎病动物模型制备方法，包括以下步骤：
1)取体重16g、5周龄的小鼠，以浓度为1.5×109cfu/mL的鼠伤寒沙门氏菌菌液灌胃处理，每次灌胃320uL菌液，每天灌胃2次，持续3天；每次灌胃前小鼠禁食不禁水2小时；
2)步骤1)结束后，在所述小鼠中选取：较步骤1)开始前体重下降10％以上、且较步骤1)开始前血清中IL-6含量升高50％以上、且较步骤1)开始前血清中IL-10含量升高100％以上的个体，即为所述人患鼠伤寒沙门氏菌肠炎病动物模型。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。